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Association de mRNA avec des phosphoprotéines dans la fraction détachée par le KCl des ribosomes de plasmocytome de souris
BIOCHIMIE, 1973, 55, 653-659.
Association de mRNA avec des phosphoprotdines dans la fraction ddtachde par le KCI des ribosomes de plasmocytome de souris. M. SCHMITT, .L M. EGLY, P. MANDEL, J'. KEMPF et C. QUIRIN-STRICKER (*) (**).
Institut de Chimie Biologique de la Facultd de M~decine de l'Ufffversit~ Louis Pasteur et Unit~ de R e c b e r c h e s Fondamentales sur la B i o c h i m i e de la Cellule Cancdreuse de I'INSERM, 11 rue H u m a n n , 67085 Strasbourg Cedex. (23-2-1973). Summary. - - Purified mouse p l a s m o c y t o m a ribosomes u n c o n t a m i n a t e d w i t h free m R N P particles xvere prepared. After t r e a t m e n t w i t h 0.5 M KC1 a complex c o n t a i n i n g b o t h dRNA a n d p r o t e i n s was released (FKC1). This c o n t a i n e d nearly 6 p. 100 dRNA ; in the protein f r a c t i o n the presence of p h o s p h o p r o t e i n s was detected. The density of tbis s t r u c t u r e was 1.18 g / n i l in a sucrose g r a d i e n t and 1.3 g / m l in a CsCI gradient. This m a t e r i a l w a s different f r o m the m a t e r i a l released f r o m r i b o s o m e s a f t e r EDTA t r e a t m e n t (polysomal mRNP). The eleetrophoretic p r o t e i n p a t t e r n s in SDS-potyaerylamide gels showed t h r e e m a i n protein b a n d s of high m o l e c u l a r weight (89,000, 100,000 a n d 105,000 dalton) a n d also some m i n o r bands. The a d d i t i o n of the (( FKCI )) f r a c t i o n to a cell-free system c o n t a i n i n g w a s h e d KC1 ribosomes, s u p e r n a t a n t f r a c t i o n $200 and polyU, m a r k e d l y s t i m u l a t e d the i n c o r p o r a t i o n of 14C p h e n y l a l a n i n e into polypeptides. The possibility of a n association between one or a n o t h e r i n i t i a t i o n factors with the i n i t i a t i o n sites present on mRNA s suggested.
INTRODUCTION. D a n s les c e l l u l e s e u c a r y o t e s le KC1 h f o r c e i o n i q u e 61ev6e d 6 t a c h e d e s r i b o s o m e s d e s f a c t e u r s prot6iques intervenant dans la biosynth6se des p r o t 6 i n e s . L a f r a c t i o n e x t r a i t e a 6t6 d 6 s i g n 6 e p a r M i l l e r et S c h w e e t [1] <~F a c t e u r KCI )). Les fact e u r s p r o t 6 i q u e s d e cet e x t r a i t , iso16s et p u r i f i 6 s partiellement par plusieurs auteurs jouent un rSle i m p o r t a n t d a n s l ' i n i t i a t i o n d e l a t r a d u c t i o n [l, 2, 3, 4, 5]. N o u s a v o n s m o n t r 6 q u e l ' a d d i t i o n d e (( F a c t e u r KC1)> h u n s y s t 6 m e a c e l l u l a i r e d e f o i e de r a t s c a r e n c 6 s e n p r o t 6 i n e s p r o v o q u a i t u n e stim u l a t i o n i m p o r t a n t e d e la s y n t h 6 s e d e s p o l y p e p t i d e s [6]. D a n s le p r 6 s e n t t r a v a i l , n o u s a v o n s a n a l y s 6 la f r a c t i o n d 6 t a c h 6 e d e s r i b o s o m e s p a r le KCI ((( F a c (*) Charg6e de Recherche au CNRS. (**) Avee la c o l l a b o r a t o n t e c h n i q u e de N. Pfleger. Abrdviations utilis6es : dRNA : RNA dont la c o m p o s i t i o n en bases est analogue fi celle du DNA. dRNP : partieules ribonucl6oprotdiques c o n t e n a n t du dRNA associd fi des protdines. m R N P : particules ribonucl6oprot6iques c o n t e n a n t dn RNA messager associ6 h des protdines. rRNA : RNA r i b o s o m i q u e . TEA c h l o r h y d r a t e de t r i 6 t h a n o l a m i n e .
t e u r KC1 >>) et s 6 p a r 6 e p a r u n e c e n t r i f u g a t i o n d e s r i b o s o m e s a i n s i t r a i t 6 s fi t r a v e r s u n g r a d i e n t c o n t i n u d e s a c c h a r o s e c o n t e n a n t d u KC1 0,5 M. N o u s a v o n s c o n s t a t e q u e le KC1 0,5 M d 6 t a c h e n o n s e u l e ment des prot6ines, mats 6galement une faible q u a n t i t 6 d e d R N A s o u s la f o r m e d ' u n c o m p l e x e d R N A - p r o t 6 i n e s . P a r m i les p r o t 6 i n e s d e ce c o m p l e x e n o u s a v o n s n t i s e n 6 v i d e n c e ]a p r 6 s e n c e d e phosphoprot6ines qui pourraient 6ventuellement intervenir au niveau de la r6gulation de la bios y n t h 6 s e d e s p r o t 6 i n e s [7].
METHODES
ET TECHNIQUES.
Les e x p 6 r i e n c e s o n t 6t6 r g a l i s d e s s u r les t u m e u r s plasmocytaires RPC 5 ou ~PC11 transplant6es sur d e s s o u r i s B a l b C. N o u s a v o n s e f f e c t u 6 le d o u b l e marquage suivant : un marquage de longue dur6e (24 h o u 48 h) p a r i n j e c t i o n i n t r a p ~ r i t o n 6 a l e d e 0,3 m C i d ' u r i d i n e t r i l i 6 e p a r s o u r i s p e r m e t de m a r q u e r le r R N A et les r i b o s o m e s ; u n m a r q u a g e d e c o u r t e d u r 6 e (30 r a i n o u 1 h ) o u u n m a r q u a g e d e 3 h p a r i n j e c t i o n d e 2 m C i p a r s o u r i s d e [32P~ orthophosphate apr6s un Iraitement pr6alable pend a n t 30 m i n fi l ' a c t i n o m y c i n e D (100 ug p a r s o u r i s ) 43
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M. S c h m i t t et coll.
p e r m e t de localiser le dRNA. Dans ce d e r n i e r cas, l ' a c t i n o m y c i n e D i n h i b e totalement la synth~se de rRNA alors q u ' u n e synth~se r6siduelle i m p o r t a n t e de mRNA ou dRNA persiste [8].
tage c o r r e s p o n d au [32p]-dRNA a c t i n o m y c i n o r6sistant, la diff6rence entre le second et le prem i e r comptage c o r r e s p o n d aux [a2P~phospholipides.
Preparation de ribosomes en gradient discontinu de saccharose D,O.
Analyse de la fraction <> en gradient de CsCl. Les fractions du gradient de saccharose corresp o n d a n t ~ u n pie de radioactivit6 dans la zone de densit6 entre 1,15 et 1,20 sont r6unies et d6pos6es apr~s fixation au formol h 5 % sur u n g r a d i e n t pr~6tabli de CsC1 de densit6 1,25 h 1,65 dans le t a m p o n A e t centrifug6 h 145 000 × g p e n d a n t 14 h dans le rotor Spinco SW 65 h 10 °.
Les tunleurs pr61ev~es sont broy6es dans u n homog6n6iseur Potter Elvehjem, dans 2 volumes de t a m p o n A : TEA 0,02 M pH 7,6 ; KC1 0,15 M ; AczMg 0,0,04 M ; ~-mercapto6thanol 0,006 M ; saccharose 1,1 M. L'homog6nat est centrifug6 20 000 × g p e n d a n t 15 rain. Le s u r n a g e a n t est d6pos6 sur u n g r a d i e n t d i s c o n t i n u de saccharose dissous dans le t a m p o n A c o n t e n a n t du D20 d'apr6s la t e c h n i q u e d6crite a n t 6 r i e u r e m e n t [9]. Une c e n t r i f u g a t i o n "h 200 000 × g (rotor 65) pendant 20 h f o u r n i t u n culot constitu6 p a r les ribosomes el les polysomes purifi6s. D~s le broyage la t e m p 6 r a t u r e est m a i n t e n u e entre 0 et 4 °.
Preparation et analyse de la fraction <> en gradienl continu de saceharose. Nous appelons fraction <> le mat6riel d6tach6 des ribosomes comme suit : Le culot de ribosomes et de polysomes est rinc6, remis en s u s p e n s i o n dans le t a m p o n A c o n t e n a n t du saceharose 0,26 M e t 0,0,01 M d'ac6tate de magn6sium fi raison de 1 0 - 1 2 mg de r i b o s o m e s / ml ( E ] ~ ~t fi 260 n m : 125) puts a d d i t i o n n 6 de KC1 3 M jusqu"h l ' o b t e n t i o n d ' u n e c o n c e n t r a t i o n finale de 0,5 M. Le m61ange est agit6 d o u c e m e n t p e n d a n t 10 rain et gard6 au repos 30 rain au froid, puts soumis fi n n e centrifugation i s o p y c n i q u e clans u n gradient c o n t i n u de saccharose de 1 M h 1,8 M dissous dans le t a m p o n B : Tris-HCl 0,0'5 M pH 7,4 ; KC1 0,5 M, Ac~Mg 0,00.1 M ; ~-lnercapio6thanol 0,0'06 M fi 200 00,0 × g p e n d a n t 14 h dans le rotor Spinco I~6'5 h 2 ° . Les gradients sont recueillis p a r fractions de 0,7 ml. La radioactivit6 des 6chantillons de 50 al pr61ev6s sur chaque fraction est mesur6e selon la m6thode de Mans et Novelli modifi6e colnme nous l ' a v o n s d6crit et compt6e dans u n spectrombtre I n t e r t e c h n i q u e ABA~C S,L40 [10]. Les compos6s acido-insolubles sont pr6cipit6s p a r i m m e r s i o n des p a p i e r s (2 × 4 cm) dans du TCA 10 p. cent glac6 et lav6s 3 fois dans du TCA 5 p. cent froid. Aprbs u n p r e m i e r comptage de la radioactivit6 des p a p i e r s s6ch6s, ceux-ci sont extraits deux fois avec le m61ange chloroforme-m6thanol (2:1, v/v) h 54 °. Apr6s n n deuxi~me comptage les p a p i e r s rehydrat6s sont trait6s par le TCA 5 p. cent h 95 ° p e n d a n t 15 rain. Le troisi6nle comptage c o r r e s p o n d h la radioactivit6 r6siduelle due au [a2p] p h o s p h o p r o t 6 i n e s [10]. La diff6rence entre le troisi6me et ]e second comp-
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Traitement des ribosomes par I'EDTA. Les ribosomes sont trait6s sous agitation p a r le t a m p o n C : TEA 0,02 M pH 7,6 ; K C1 0,05 M ; saccharose 0,25 M et c o n t e n a n t 0,02 M d'EI)TA, puts d6pos6s sur u n gradient de saccharose 1 M h 1,8 M comme d6crit ci-dessus. Les fractions h m a r q u a g e r a p i d e et de faible densit~ sont analys~es sur g r a d i e n t de CsC1. Ddtermination de la composition en bases des RNA. La c o m p o s i t i o n en bases du RNA de la fraction <>, du rRNA et du tRNA de t u m e u r est d6termin6e sur les RNA marqu6s in vivo au 32p : a) p e n d a n t 60 lnin en l'absence d ' a c t i n o m y cine D p o u r (> ; b) p e n d a n t 24 h p o u r les rRNA et p e n d a n t 3 h p o u r ]e tR~NA. On RNA mine aprbs pier.
proc6de "h l ' e x t r a c t i o n et h l ' h y d r o l y s e des selon la m6thode d6crite [11] et on d6terla radioactivit6 des nucl6otides obtenus f r a c t i o n n e m e n t ~lectrophor6tiquc sur pa-
Electrophor~se des prot~ines en gel de polgacrylamide. La t e c h n i q u e utilis6e est celle d6crite p a r W a e h n e l d t [12] modifi6e p o u r o b t e n i r u n e c o n c e n t r a t i o n de SDS 0,1 p. cent dans des gels /i concent r a t i o n d i s c o n t i n u e en a c r y l a m i d e /L r a i s o n de 8 p. cent d ' a c r y l a m i d e dans la partie sup6rieure et 10 p. cent dans la partie i n f 6 r i e u r e du gel. Le d6p6t est de 80 "~ 120 ~g de prot6ines p a r gel de 0,6 cm de diam~tre et de 8 cm de longueur. Les 61ectrophor6ses sont r6alis6es ~ la t e m p 6 r a t u r e o r d i n a i r e p e n d a n t 7 h h r a i s o n de 1,5 mA/gel et dans ]e t a m p o n Tris 0,0,1 M pH 7. Apr6s coloration au Coomassie Brilliant Blue R la d6eoloration est effectu6e p a r ]e m61ange acide ac6tique-m6thanol-eau.
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mRNA-phosphoprotdines el facteur KCI des ribosomes. RESULTATS. N o u s a v o n s p r 6 p a r 6 les r i b o s o m e s en u t i l i s a n t une technique de gradient discontinu d'une solut i o n d e D 2 0 - s a c c h a r o s e (? : 1 , 1 5 / 1 , 2 6 / 1 , 2 9 ) . C e t t e technique nous a pernfis d'obtenir un culot de ribosomes hautement purifi6s, tr6s peu contamin6s p a r d e s f r a g m e n t s de m e m b r a n e s , des prot6ines
s o l u b l e s o u p a r d e s p a r t i c u l e s <> l i b r e s d e t y p e <> [13!. E n effet, u n e g r a n d e p a r t i e de c e s p a r t i c u l e s d R N P c o s 6 d i m e n t e n t a v e c les r i b o s o m e s d a n s l e s c o n d i t i o n s h a b i t u e l l e s d e s 6 d i m e n t a t i o n e n g r a d i e n t d e s a c c h a r o s e 10-30 p. p
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Fro. 1. - - P, ofil de s d d i m e n t a l i o n des r i b o s o m e s frait~s au KCI 0,5 M e n gradient de saccharose. Les r i b o s o m e s , a p r 6 s u n t r a i t e m e n t a u KC1 0,5 M, s o n t c e n t r i f u g e s d a n s u n g r a d i e n t c o n t i n u de s a c c h a rose 1 M & 1,8 M p e n d a n t 14 h St 50.000 t o u r s / m i n ( r o t o r R 65) St 2 ° . Les RNA s o n t d o u b l e m e n t m a r q u d s in r i o • p a r l ' u r i d i n e 3H p e n d a n t 24 h e t p a r le 32p p e n d a n t 3 h a p r 6 s a d m i n i s t r a t i o n de l ' a c t i n o m y c i n e D. ................ m a r q u a g e p a r u r i d i n e 3H, l a v a g e s TCA 0 °. . . . . . . . . . . . . m a r q u a g e p a r u r i d i n e 3H, l a v a g e s TCA 0 ° et t r a i t e m e n t TCA 95 ° p e n d a n t 15 m i n . o---o m a r q u a g e p a r 32p, l a v a g e s TGA 0 °, HC1 0,01 N. x x m a r q u a g e p a r 82p, l a v a g e s TCA 0 ° et traitement mdthanol-chloroforme. [] [] m a r q u a g e p a r 32p, l a v a g e s TCA 0 ° et t r a i t e m e n t TCA 95 ° 15 m i n . L ' a i r e c o m p r i s e e n t r e la c o u r b e 1 et 2 r e p r g s e n t e la r a d i o a c t i v i | d c o r r e s p o n d a n t aux p h o s p h o l i p i d e s , celle c o m p r i s e e n t r e la c o u r b e 1 et 3 r e p r 6 s e n t e la r a d i o activit6 c o r r c s p o n d a n t a n dRNA. La c o u r b e 3 reprdsente la r a d i o a c t i v i t d c o r r e s p o n d a n t a u x p h o s p h o p r o t6ines.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 6-7.
,~/ ~
20 30 40 n o m b r e de t r a c t i o n s
~
50
Fit;. 2. - - P r o f i l de s d d i m e n t a l i o n de la fraction <> en gradient de CsCI. Les f r a c t i o n s du g r a d i e n t de s a c c h a r o s e c o r r e s p o n d a n t a u x 6 c h a n t i l l o n s 10 /t 15 de la Fig. 1 s o n t fix6es p a r le f o r m o l /t 5 p. cent et c e n t r i f u g d e s d a n s u a g r a d i e n t de densit6 de CsC1 (~ : 1,25 h 1,65) p e n d a n t 14 h & 45.000 t o u r s / m i n ( r o t o r Sw 65) h 10 ° . Les RNA s o n t d o u b l e m e n t m a r q u d s in oivo p a r l ' u r i d i n e 3H p e n d a n t 24 h et p a r le 32p p e n d a n t 3 h a p r 6 s a d m i n i s t r a t i o n de ] ' a c t i n o m y c i n e D. .................. m a r q u a g e p a r u r i d i n e 3H, l a v a g e s TCA 0 °. . . . . . . . . . . . . m a r q u a g c p a r u r i d i n e 3H, lavages TCA 0 ° et t r a i t e m e n t TCA 95 ° 15 m i n . o - - o m a r q u a g e p a r 32p, lavages TCA 0 °, HCI 0,01 N. x - - × m a r q u a g e p a r 32p, l a v a g e s TCA 0 ° et trai-tement m6thanol-chloroforme. n - - n m a r q u a g e p a r 32p, l a v a g e s TCA 0 ° et t r a i t e m e n t TCA 95 ° 15 m i n . E v a l u a t i o n des a i r e s c o m m c d a n s la figure 1.
c e n t [14, 15]. L e s r i b o s o m e s o b t e n u s d a n s n o s conditions pr6sentent un rapport D O 260 n m / D O 280 n m d e 1,85.
E f [ e t d u K C I 0,5 M s u r les r i b o s o m e s . A 4 °, e n p r 6 s e n c e d e 1 o u d e 4 m M Mg e+, o n o b t i e n t p a r F a c t i o n d u KCI 0,5 M s u r l e s r i b o s o m e s
656
M. Schmitt
p u r i f i 6 s , ~ c6t6 d e s s o u s - u n i t 6 s r i b o s o m i q u e s , u n complexe nucl6oprot6ique qne nous avons d6sign6 p a r f r a c t i o n ¢ F KC1 >>. Celle-ci c o n t i e n t h l a fois d e s p r o t 6 i n e s et u n R N A i~ m a r q u a g e r a p i d e . A n a l y s e d e << F K C l >> p a r s ~ d i m e n t a t i o n d i e n t d e s a c c h a r o s e et d e CsCl.
en gra-
Analys6 en gradient de saccharose continu 1 M h 1,8 M la f r a c t i o n <> c a r a c t 6 r i s 6 e p a r s o n marquage rapidc, s6dimente h l'6quilibre avec une d e n s i t 6 a p p a r e n t e d e 1,18 (fig. 1) a l o r s q u e les s o u s - u n i t 6 s et les r i b o s o m e s se t r o u v e n t d a n s le c u l o t et 1 6 g b r e m e n t a u - d e s s u s . E n g r a d i e n t d e s a c c h a r o s e 1.0-30 p. c e n t les c o n s t i t u a n t s d e <> s6dimentent avec une constante de s6dimentation d ' e n v i r o n 8-10 S. A n a l y s 6 p a r s 6 d i m e n t a t i o n isop y c n i q u e e n g r a d i e n t p r 6 ~ t a b l i d e CsC1, << F KCI >> se c a r a c t ~ r i s e p a r u n e d e n s i t 6 d e 1,3 (fig. 2). D a n s les m 6 m e s c o n d i t i o n s , les s o u s - u n i t 6 s r i b o s o m i ques s6dimentent avec des densit~s respectivement d e 1,5.1 et 1,58 p o u r les p a r t i c u l e s 40 S e t 60 S. L a d e n s i t 6 p l u s f a i b l e d e << F KCI >> o b s e r v ~ e e n .gradient de saccharose r6sulterait d'une plus forte h y d r a t a t i o n d e s p a r t i c u l e s d a n s le s a c c h a r o s e q u e d a n s le c h l o r u r c d e c 6 s i u m .
et coll. L a f i g u r e 3 m o n t r e le p r o f i l d e s ~ d i m e n l a t i o n a i n s i o b t e n u . A l a d i f f 6 r e n c e d e <> q u i est h o m o g b n e (fig. 1), le c o m p l e x e d 6 t a c h 6 p a r I ' E D T A e s t h 6 t 6 r o g b n e et p r 6 s e n t e a p r ~ s c e n t r i f u g a t i o n l ' 6 q u i l i b r e d e s d e n s i t 6 s c o m p r i s e s e n t r e 1,3 et 1,45. E n o u t r e , le m a r q u a g e l o n g p a r l ' u r i d i n e t r i ti6e i n d i q u e la p r 6 s e n c e d e r i b o s o m e s o u d e s o u s unit6s ribosomiques dans cette dernibre fraction. E n e x a m i n a n t le p r o f i l d e r a d i o a c t i v i t 6 d u z~P
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E f f e t d e I ' E D T A s u r les r i b o s o m e s . N o u s a v o n s c o m p a r 6 le m a t 6 r i e l d 6 t a c h 6 d e s r i b o s o m e s p a r le KCA 0,5 M e t c e l u i e n l e v 6 d e s r i b o s o m e s p a r I ' E D T A 0,02 M. E n effet, il est b i e n c o n n u q u e I ' E D T A agit s u r les r i b o s o m e s e n l i b 6 r a n t d e s s o u s - u n i t 6 s r i b o s o m i q u e s ct d u m R N A sous forme de particules ribonucl6oprot6iques. Ces s t r u c t u r e s o n t 6t6 d 6 c r i t e s d a n s d i v e r s t i s s u s a n i m a u x [14, 16-22]. A i n s i , p a r a l l b l e m e n t a u x r i b o s o m e s t r a i t 6 s p a r le KC1 0,5 M, d e s r i b o s o m e s trait6s ~ I'EDTA 0,02M sont d6pos6s sur un ~ad i e n t c o n t i n n d e s a c c h a r o s e 1 M h 1,8 M. L e m a t 6 r i e l d e d e n s i t 6 f a i b l e e n t r e 1,15 et 1,20 et m a r q u 6 a u a-~P est r e c u e i l l i et a n a l y s 6 e n g r a d i e n t d e CsCl. TABLEAU I. C o m p o s i t i o n e n b a s e s d a R N A d e <>, d u r R N A et d u t R N A d e p l a s m o c y t o m e d e S o u r i s .
f
"1000
-~ --"
\ c r .~. . . .P. . . .
, ..........
--m,
..........
10
20 30 40 50 nombre de [roctions Fro. 3. - - P r o f i l de s~dimentation en gradient de CsCl de la fraction <~m R N P >> ddtachde des ribosomes par I'EDTA. Les ribosomes trait6s p a r I'EDTA 0,02 M sont d~-pos~s snr u n g r a d i e n t de saecharose 1 M h 1,8 M e t centrifuges d a n s les conditions d~crites dans la Fig. l. Les conditions de m a r q u a g e des RNA sont identiques h celles de la Fig. 2. Les f~Iactions m a r q u 6 e s a u 32p et de faible dcnsit~ sont fix~es p a r le f o r m o l 5 p. cent et centrifug6es dans u n g r a d i e n t de densit~ de CsCl p e n d a n t 14 h h 45.000 t o u r s / m i n (rotor SW 65) "~ 10 °. Marquages identiques h ceux de la figure 2.
Nucl~otides (moles p. cent) Fractions de RNA
RNA de " F K C I " 18 S . . . . . . r R N A 28 S . . . . . . tRNA ............
rRNA
c
A
[
o 24
29 {20,4{30 29,5{18,3135,, 30,2 / 1 9 , 2 1 2 9 , 8
u 27
o_
c
0,80
20,0 1,43 17,, ,,s2 20,8/1,50
La c o m p o s i t i o n en bases est estim6e selon la radioaetivit6 des nuel6otides apr~s u n m a r q u a g e au 32p selon les m~odalit6s d6erites dans <>. BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 6-7.
a v a n t et a p r ~ s d ~ l i p i d a t i o n , n o u s c o n s t a t o n s q u e ce m a t 6 r i e l c o n t i e n t t r ~ s p e u d e p h o s p h o l i p i d e s . P a r a i l l e u r s , l ' a c t i v i t ~ r ~ s i d u e l l e d u 32p a p r ~ s h y d r o l y s e a u T C A 5 p. c e n t h 9'5 ° et c o r r e s p o n d a n t a u x p h o s p h o p r o t 6 i n e s est f a i b l e . C a r a c t ~ r i s t i q u e s d u R N A d e <>. N o u s a v o n s i d e n t i f i 6 le R,NA d e la f r a c t i o n <> s o i t p a r s o n m a r q u a g e a u 32p a p r ~ s a d -
mRNA-phosphoprotdines
el f a c t e u r KC1 des r i b o s o m e s .
m i n i s t r a t i o n d ' a c t i n o m y c i n e D, suit apr6s un m a r quage p e n d a n t 20 rain p a r l ' u r i d i n e triti6e. P a r ailleurs, nous avons 6tabli, d'apr6s la r a d i o a c t i v i t 6 des nucl6otides marqu6s au 32p, la c o m p o s i t i o n en bases p u r i q u e s et p y r i m i d i q u e s du RNA de <>, ainsi que celle du rRNA et du tR,NA du p l a s m o c y t o m e de souris. Les r6sultats obtenus sont consign6s dans le tableau I ; la c o m p o s i t i o n en bases du RNA de ¢ F KC1 >> est analogue h celle du DNA, ee qui justifie sa d 6 n o m i n a t i o n de dRNA. En effet, le r a p p o r t C + G/A + U = 0,80. Ainsi, le d 6 t a c h e m e n t h p a r t i r de pulysumes, la d i s t r i b u t i o n des bases, le m a r q u a g e r a p i d e an 3--p ou h l ' u r i d i n e triti6e et l ' a b s e n c e de rRNA et de tRNA p l a i d e n t en f a v e u r du caractbre m e s s a g e r de ce RNA. Analys6 en g r a d i e n t de saccharose, le dRNA e x t r a i t de cette f r a c t i o n pr6sente une h6t6rog6n6it6 (6 h 20 S) avec une esp6ce p r 6 d o m i n a n t e ayant une constante de s6dimentatiun de 8 S. Cette
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d e r n i e r e p o u r r a i t r6sulter d ' u n e 6ventuelle fragm e n t a t i o n du dRNA lors de la p r 6 p a r a t i o n . Caract~ristiques des prot~ines de ¢ F KCl >>. 1) Mise en 6 v i d e n c e de p h o s p h u p r o t 6 i n e s : d'apr6s la valeur de la densit6 apr6s centrifugation h l ' 6 q u i l i b r e dans un g r a d i e n t CsC1 (~ : 1,3), ¢ F KC1 )> est cunstitu6e en g r a n d e p a r t i e de prot6ines. En effet, d'apr6s la f o r m u l e e m p i r i q u e de Spirin, ce c o m p l e x e contient plus de 90 p. cent de prot6ines, et m o i n s de I0 p. cent de RNA. Afin de s a v o i r si ce mat6riel c o n t i e n t des p h u s p h o l i p i d e s ou des lipoprot6ines, nous avons proc6d6 h une e x t r a c t i o n de <> p a r le m61ange m6thanolc h l o r o f o r m e . Dans les figures 1 et 2 nous r e m a r quons que le trac6 de a2p avant et aprbs t r a i t e m e n t au m 6 t h a n o l - c h l o r o f o r m e est s e n s i b l e m e n t identique : <> ne c o n t i e n t d o n c pas ou tr6s peu de compos6s p h u s p h o l i p i d i q u e s . E n v i r o n 50 p. cent de la r a d i o a c t i v i t 6 totale de <> disparait lors de l ' h y d r o l y s e au TCA 5 p. cent h 95 ° , celle-ci c o r r e s p o n d au dRNA. P a r ailleurs, e n v i r o n 50 p. cent de la r a d i o a c t i v i t 6 totale de la fractiun <> r6siste h l ' h y d r o l y s e au TCA 5 p. cent h 95" p e n d a n t 15 rain. Cette activit6 r6siduelle est due "~ la pr6sence de p h o s p h u p r o t 6 i n e s (fig. 1 et 2). Nous avons identifi6 dans ces prot6ines la !32p]phosphos6rine et la [ a : P ] p h o s p h o t h r 6 o n i n e , c o m m e nous l ' a v o n s d6crit p r 6 c 6 d e m m e n t [10]. 2) E l e c t r o p h o r b s e des prot6ines sur gel de p o l y a c r y l a m i d e : nous avons caract6ris6 les prot6ines de c o n s t i t u t i o n de <) p a r leur cump o r t e m e n t 61ectrophor6tique en gel de p o l y a c r y l amide. Nous avons analys6 parall61ement les prot6ines c o r r e s p o n d a n t au <, F a c t e u r KCI >> brut nun f r a c t i o n n 6 sur g r a d i e n t de s a c c h a r u s e 1 M - 1 , 8 M. Ce f a c t e u r est obtenu h p a r t i r de p o l y s o m e s trait6s p a r le KC1 0,5 M, et centrifug6s p e n d a n t 3 h 197 000 × g. Dans la figure 4 sont repr6sent6s les divers proills d e n s i t o m 6 t r i q u e s des p r o t 6 i n e s ubtenus en gel de p u l y a c r y l a m i d e - S D S h p a r t i r de <> brut e x t r a i t de p o l y s u m e s et des p u l y s o m e s trait6s au KC1 0,5 M e t res6diment6s.
¢
GEL 8%
GEL 10%
FIG. 4. Tracds densitomdtriques de gels mixtes de polyacrylamide 8 et 1,0 p. cent en prdsence de SDS. Les diffdrentes fractions sont pr6par6es eomme il est d6crit dans ¢ Mdthodes >>. A : prot6ines du <>brut des ribosomes. B : prot6ines de la fraction ¢ F KC1 • s6parde des ribosomes. C : prot6ines restantes des ribosomes apr/~s traitement au KC1 0,5 M. -
-
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P o u r la f r a c t i o n <> nous distinguons nett e m e n t trois bandes prot6iques p r i n c i p a l e s et plusieurs bandes m i n e u r e s . Nous avuns d6termin6 le p o i d s m o l 6 c u l a i r e de ces prot6ines d'apr6s la m6t h o d e d6crite p a r S h a p i r o et coll. [22] en utilisant c u m m e r6f6rence des prot6ines de p o i d s mol6culaire connu. Le p o i d s m o l 6 c u l a i r e trouv6 p o u r les 3 bandes m a j e u r e s ffig. 4) c o r r e s p o n d a p p r o x i m a t i v e m e n t "~ 10,5 000, 100 000 et 89 000. Les bandes m i n e u r e s c o r r e s p o n d e n t ~ des prot6ines dont le p o i d s mol6culaires p o u r l ' u n e est d ' e n v i r o n
M. S c h m i t t el coll.
658 140 000 83 000. bandes certain taires.
et p o u r les a u t r e s c o m p r i s e n t r e 38 000 et Le <> b r u t m o n t r e , fi c6t6 des p r o t 6 i q u e s p r 6 s e n t e s d a n s <>, u n n o m b r e de b a n d e s p r o t b i q u e s s u p p l 6 m e n -
Il est h n o t e r q u e les r i b o s o m e s d 6 b a r r a s s 6 s de la f r a c t i o n <) ne c o n t i e n n e n t p l u s les b a n d e s p r o t 6 i q u e s c a r a c t 6 r i s t i q n e s de <> a l o r s que les b a n d e s s n p p 1 6 m e n t a i r e s d u ¢ F a c t e u r KC1 >> b r u t s o n t p r 6 s e n t e s (2 ~ p a r t i e d u gel). De plus, en 6 t u d i a n t la r 6 p a r t i t i o n de la r a d i o a c t i v i t 6 du ' ~ P d a n s les d i f f 6 r e n t e s b a n d e s p r o t 6 i q u e s du gel de p o l y a c r y l a m i d e , n o u s a v o n s not6 la pr6s e n c e de .32p d a n s routes les b a n d e s dbcelbes. C e p e n d a n t , la r a d i o a c t i v i t 6 t o t a l e des b a n d e s c a r a e t 6 r i s t i q u e s de <> (celles p r 6 s e n t e s d a n s le gel de p o l y a c r y l a m i d e "~ 8 %) est b e a u c o u p m o i n s 61ev6e q u e c e l l e des b a n d e s du gel de p o l y a c r y l a m i d e fi 10 p. c e n t q u i c o r r e s p o n d e n t A des p r o t 6 i n e s de p o i d s m o l 6 c u l a i r e i n f 6 r i e u r 65 0,0'0.
Stimulation, par la fraction <>, de l'incorporation de ph~nylalanine 1~C dans un syst~me acellulaire de t u m e u r plasmocytaire. E n p r 6 s e n c e de la f r a c t i o n s o l u b l e $20 . de foie de s o u r i s et de p o l y U , les r i b o s o m e s de p l a s m o e y t o m e lav6s an KCI 0,5 M i n e o r p o r e n t tr6s p e u de p h ~ n y l a l a n i n e ~4C d a n s les p r o t ~ i n e s . L o r s q u ' o n TABLEAU II.
Stimulation par la fraction ¢ F KCI de l'incorporalion de phd.n!tlalanine L~C en p r e s e n c e de polyU. Incorporation de ~C Phe coups/min/mg de ribosomes
Syst6me acellulaire Cotnpi~t - - 1' KCI Sans ribosomes
+
F
KCI
Complet --~ F KC1 - - Exp. 1 - - Exp. 2 - - Exp. 3
14.400 90 54.000 69.000 38.000
Le syst~me acellulaire complet contient 0,2 D.O. de polysomes laves au KC1 ; 0,35 mg de prot6ines $200, 40 ~±g de prot6ines ¢ F KC1 ~ et 10 ~u.g de polyU. Les autres constituants sont GTP 1 m M ; ATP 0,2 InM; phospho6nolpyruvale 5 mM, pyruwtte kinasc 20 .~tg/m], Tris-HC1 pH 7,4 35 mM, 14C ph6nylalanine 0,5 ~,Ci/ml ; KCI 100 mM et Mg2÷ 5 mM. Les incubations ont 6t6 e f f e c t u 6 e s h 37 ° pendant 30 rain e t l e m a t 6 r i e l a c i d o i n s o l u b l e trait6 comme d6crit p r6alablement. i n t r o d u i t d a n s le s y s t b m e la f r a c t i o n ¢ F KC1 ~> ( p r 6 p a r 6 e e o n l m e d 6 e r i t d a n s ¢ M6thodes >>), h r a i son de 40 ~g de p r o t 6 i n e s , c e l l e - c i p r o v o q u e u n e s t i m u l a t i o n de 2,5 h 5 fois de l ' i n c o r p o r a t i o n de p h 6 n y l a l a n i n e 1~C d a n s les p r o t 6 i n e s ( T a b l e a u H).
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55, n ° 6-7.
DISCUSSION. A f o r c e i o n i q u e 61ev6e el en p r 6 s e n e e de Mg 2~, le KCI d i s s o c i e des r i b o s o m e s purifi6s de t u m e u r p l a s i n o c y t a i r e u n e f r a c t i o n p r o t 6 i q u e et r i b o n u c l 6 i q u e . U n e g r a n d e p a r t i e du m a t 6 r i e l a i n s i d6tach6 a pn 6tre isolge sous f o r m e d ' u n e o m p l e x e n u c l 6 o p r o t 6 i q u e h o m o g + n e (<~ F KC1 >>) a y a n t u n e densit6 de 1,18 en g r a d i e n t i s o p y e n i q u e de s a e e h a r o s e et u n e d e n s i t 6 de 1,3,0 en g r a d i e n t de CsC1. C o m m e ee c o m p l e x e s t i m u l e la s y n t h + s e de p o l y p h ~ n y l a l a n i n e "h 5 mM de m a g n 6 s i u m et en pr6s e n e e d ' a c i d e p o l y u r i d y l i q u e , il e o n t i e n t v r a i s e m b l a b l e m e n t ]es f a c t e n r s d ' i n i t i a t i o n . C e c i p a r a n a l o g i e a v e e les f a e t e u r s d ' i n i t i a t i o n o b t e n u s d a n s des c o n d i t i o n s s e m b l a b l e s h p a r t i r de r i b o s o m e s d'au~res e e l l n l e s e u e a r y o t e s [3, 4, 51. N o u s m o n t r o n s q u ' u n e p a r t i e au m o i n s des p r o t~ines p r 6 s e n t e s d a n s <> est associ6e ~ du dRNA, ~ l ' e x c l n s i o n de tout a u t r e t y p e de RNA, et d ' a u t r e p a r t , q u ' i l e x i s t e p a r m i elles des p h o s p h o p r o t 6 i n e s d o n t le g r o u p e m e n t p h o s p h o r y l e est a c t i v e m e n t r e n o u v e l & N o u s a v o n s not6 q u e F e n seinble des l)rot6ines r e s t e f o r t e m e n t associ~ au d R N A m 6 m e en a b s e n c e de Mg ~°* ou en p r 6 s e n c e de KC1 1 M (r6sultats n o n publi6s). Le KCI h f o r t e c o n c e n t r a t i o n n ' a y a n t pas r o m p u les l i a i s o n s d R N A - p r o t 6 i n e s d a n s ce c o m p l e x e , c e l l e s - c i ne p a r a i s s e n t pas r 6 s u l t e r d ' a r t e f a c t s dus ~ des p r o t6ines solubles ou en v o l e de s y n t h b s e et a d s o r b6es de f a c o n n o n s p 6 c i f i q u e s u r le dRNA. D'ailleurs, la b o n n e r e p r o d u c t i b i l i t 6 des p r o f i l s 61ect r o p h o r 6 t i q u e s des p r o t 6 i n e s de <> aprbs la p u r i f i c a t i o n du m a t 6 r i e l e o m m e n o u s l ' a v o n s d6erite, e o n t r i b u e 'h 6 c a r t e r cette h y p o t h + s e . R a p p e l o n s q u ' a p r b s l ' a e t i o n du KC1 0,5 M, la m a j e u r e p a r t i e du m R N A ( m a r q u 6 p a r le 32p) reste assoei6 aux sous-nnit6s r i b o s o m i q u e s et aux r i b o s o m e s et se l o c a l i s e d a n s le f o n d et la z o n e i n f 6 r i e u r e du g r a d i e n t de s a e e h a r o s e 1 M h 1,8 M (Fig. 1). A la f r a c t i o n <> d 6 c r i t d a n s le eas du foie de rat [19], de la t h y r o i d e de m o u t o n I21], du r 6 t i e u l o c y t e de l a p i n [16], des 6ryt h r o e y t e s de c a n a r d [17~, du p l a s m o c y t o m e de s o u r i s [14] el des c e l l u l e s L [22]. Ces p a r t i e u l e s n u e l 6 o p r o t 6 i q u e s o n t u n e densit6 a p p a r e n t e de 1,4 h 1,4.5 en g r a d i e n t de CsC1, et le m R N A y est assoel6 ~ un p e t i t n o m b r e de p r o t 6 i n e s .
mRNA-phosphoprol~ines Or, le c o m p l e x e d R N A - p r o t 6 i n e s de f a i b l e d e n sit6 d 6 t a c h 6 p a r le KC1 se r 6 v b l e t r b s d i f f 6 r e n t d u m a t 6 r i e l c o r r e s p o n d a n t d i s s o c i 6 p a r I ' E D T A , "h la fois p a r le c a r a c t b r e d ' h o m o g 6 n 6 i t 6 , la d e n s i t 6 e n g r a d i e n t d e CsC1, l a t e n e u r e n p h o s p h o p r o t 6 i n e s et, d a n s le c a s d e I ' E D T A , l a p r 6 s e n c e d e R N A ribosomique. I1 f a u t e n c o r e n o t e r q u e l ' u t i l i s a t i o n d e ]a t e c h nique du gradient discontinu en saccharose dans l ' e a u l o u r d e p o u r la p u r i f i c a t i o n d e s r i b o s o m e s polysomes nous a permis d'61iminer la quasitotalit6 des particules ribonucl6oprot6iques du t y p e <> l i b r e s [9], c ' e s t - ~ - d i r e n o n ]i6es a u x r i b o s o m e s . D a n s les r i b o s o m e s t r a i t 6 s a u KC1 et r e s 6 d i m e n t6s, l ' a b s e n c e d e s b a n d e s p r o t 6 i q u e s m a j e u r e s et m i n e u r e s d a n s l a p a r t i e s u p 6 r i e u r e d u gel ( b a n d e s c a r a c t 6 r i s t i q u e s d e F KCl) s u g g ~ r e q u e ces p r o t6ines correspondent aux faeteurs d'initiation. Les b a n d e s m i n e u r e s d a n s l a p a r t i e i n f 6 r i e u r e d u gel p o u r r a i e n t 6tre a t t r i b u 6 e s ~ d e s p r o t 6 i n e s d e c o n t a m i n a t i o n d o n t l a n a t u r e et l ' o r i g i n e n ' o n t p a s 6t6 d 6 t e r m i n 6 e s . O n p o u r r a i t s u p p o s e r q u e c e r t a i n e s d e ces p r o t 6 i n e s o n t 6t6 d 6 t a c h 6 e s d e s p a r t i c n l e s <> o u d e s r i b o s o m e s s o u s l ' e f f e t d u KC1. C e s o b s e r v a t i o n s p o s e n t le p r o b l ~ m e d e l a s i g n i f i c a t i o n p h y s i o l o g i q u e d e la f a i b l e q u a n t i t 6 d e d R N A p r 6 s e n t d a n s <> et p a r c o n s 6 q u e n t associ6 trbs vraisemblablement ~un ou plusieurs facteurs d'initiation ainsi qu'h des phosphoprot 6 i n e s fi r e n o u v e l l e m e n t r a p i d e . N o u s p e n s o n s p a r c e t t e m 6 t h o d e a v o i r isol6 d e s facteurs d'initiation sous une forme relativement p u r e s a n s a v o i r eu r e c o u r s h u n fractionnement c h r o m a t o g r a p h i q u e s u r c o l o n n e . De p l u s , il a p p a r a i t q u e c e s f a e t e u r s p r o t 6 i q u e s d ~ t a c h 6 s p a r le KC1 d e s r i b o s o m e s r e s t e n t a s s o e i 6 s h u n e f a i b l e f r a c t i o n de d R N A . U n e h y p o t h ~ s e a t t r a y a n t e s e r a i t d'envisager la possibilit6 d'une association de Fun o u l ' a u t r e d e s f a c t e u r s d ' i n i t i a t i o n a v e c les s i t e s d ' i n i t i a t i o n p o r t 6 s p a r le m R N A . R~SUMI~. Des ribosomes purifi~s de p l a s m o c y t o m e de sonris n o n eontanfin6s p a r des partieules m R N P libres ont
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el [acteur KCI des ribosomes.
659
6t6 pr6par6s. Apr~s u n t r a i t e m e n t p a r du KC1 0,5 M on a d6taeh6 u n complexe c o n t e n a n t h la fois du dRNA et des prot6ines ( ¢ F KCI~). I1 e o n t i e n t environ 6 p. cent de dRNA et p a r m i les prot~ines on a m i s en 6videnee la pr6senee de phosphoprot6ines. Cette structure s6dimente avec une densit4 h l'6quilibre de 1,18 e n g r a d i e n t de saeeharose et de 1,3 en CsC1. Ce mat6riel est diff6rent de eelui d6taeh6 des ribosomes sous l'effet de I'EDTA (mRNP polysomiques). L'analyse du profil 61eetrophor6tique des prot~ines sur gel de polyaerylamide-SDS r~v~le trois b a n d e s prot6iques m a j e u r e s de h a u t poids mol~culaire (89.000, 100.000 105.000) et plusieurs b a n d e s m i n e u r e s . Additionn~ u n syst~me aeellulaire e o n t e n a n t la f r a c t i o n soluble $200, des ribosomes laves au KC1 et du polyU, le eomplexe <~F KC1 >> provoque u n e s t i m u l a t i o n i m p o r t a n t e de l ' i n e o r p o r a t i o n de 14C-ph~nylalanine dans les polypeptides. La possibilit~ d ' u n e association de l ' u n ou l ' a n t r e des faeteurs d ' i n i t i a t i o n avee les sites d ' i n i t i a t i o n p o r t , s p a r le mRNA est sugg~r~e. BIBLIOGRAPHIE. 1. Miller, R. L. & Schweet, R. (1968) Arch. Biochem. Biophys., 125, 632. 2. Cohen, B. B. (1968) Biochem. J., 110, 231. 3. Godin, C., Kruh, J. ,~ Dreyfus, J. C. (1969) Biochim. Biophys. Acta, 182, 175. 4. Priehard, P. M., Gilbert, J. M., Shafritz, D. A. ~ Anderson, V¢. F. (1970) Nature, 226, 511. 5. Heywood, S. M. (1970) Nature, 225, 696. 6. Quirin-Stricker, C., Gross, M. & Mandel, P. (1970) B u l l Soc. Chim. Biol., 52, 1315. 7. Loeb, J. E. & Blatt, C. (1971) FEBS Lett., 18, 124. 8. Kempf, J. & Mandel, P. (1969) Bull. Soe. Chim. Biol., 51, 1121. 9. Kempf, J., Egly, J. M., Qurin-Strieker, C., Schmitt, M. & Mandel, J. (1972) FEBS Left., 26, 130. 10. Egly, J. M., J o h n s o n , B. C., Qurin-Strieker, C., Mandel, P. -~ Kempf, J. (1972) FEBS Lelt., 22, 181. 11. Kempf, J. a Mandel, P. (1969) Eur. J. Biochem., 8, 376. 12. W a e h n e l d t , T. V. ~ Mandel, P. (1970) FEBS Lelt., 9, 209. 13. Spirin, A. S. (1969) Eur. J. Biochem., 10, 20. 14. Kempf, J., Zahnd, J. P. e, Mandel, P. (1970) Eur. J. Biochem., 17, 124. 15. Lissitzky, S., Poir6e, J. C., Cartouzou, G. ~ Gr6goire, J. (1970) Eur. J. Biochem., 12, 104. 16. Lebleu, B., Marbaix, G., Huez, G., T e m m e r m a n , J., Burny, A. a C h a n t r e n n e , H. (1971) Eur. J. Biochem., 19, 264. 17. Morel, C., K a y t b a n d a , B. ,~. Seherrer, K. (1971) FEBS Lett., 18, 84. 18. Blobel, G. (1972) Biochem. Biophlls. Res. Commun., 47, 88. 19. Henshaw, E. C. (1968) J. Mol. Biol., 36, 401. 20. Olsnes, S. (1971) Eur. J. Biochem., 18, 242. 21. Cartouzou, G., Poir~e, J. C. & Lissitzky, S. (1969~ Eur. J. Bioehem., 8, 357. 22. Perry, R. P. & Kelley, D. E. (1968) J. Mol. Biol., 35, 37. 23. Shapiro, A. L., Vinuela, E. & Maizel, J. V. Jr. (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun., 28, 815.
Association de mRNA avec des phosphoprotdines dans la fraction ddtachde par le KCI des ribosomes de plasmocytome de souris. M. SCHMITT, .L M. EGLY, P. MANDEL, J'. KEMPF et C. QUIRIN-STRICKER (*) (**).
Institut de Chimie Biologique de la Facultd de M~decine de l'Ufffversit~ Louis Pasteur et Unit~ de R e c b e r c h e s Fondamentales sur la B i o c h i m i e de la Cellule Cancdreuse de I'INSERM, 11 rue H u m a n n , 67085 Strasbourg Cedex. (23-2-1973). Summary. - - Purified mouse p l a s m o c y t o m a ribosomes u n c o n t a m i n a t e d w i t h free m R N P particles xvere prepared. After t r e a t m e n t w i t h 0.5 M KC1 a complex c o n t a i n i n g b o t h dRNA a n d p r o t e i n s was released (FKC1). This c o n t a i n e d nearly 6 p. 100 dRNA ; in the protein f r a c t i o n the presence of p h o s p h o p r o t e i n s was detected. The density of tbis s t r u c t u r e was 1.18 g / n i l in a sucrose g r a d i e n t and 1.3 g / m l in a CsCI gradient. This m a t e r i a l w a s different f r o m the m a t e r i a l released f r o m r i b o s o m e s a f t e r EDTA t r e a t m e n t (polysomal mRNP). The eleetrophoretic p r o t e i n p a t t e r n s in SDS-potyaerylamide gels showed t h r e e m a i n protein b a n d s of high m o l e c u l a r weight (89,000, 100,000 a n d 105,000 dalton) a n d also some m i n o r bands. The a d d i t i o n of the (( FKCI )) f r a c t i o n to a cell-free system c o n t a i n i n g w a s h e d KC1 ribosomes, s u p e r n a t a n t f r a c t i o n $200 and polyU, m a r k e d l y s t i m u l a t e d the i n c o r p o r a t i o n of 14C p h e n y l a l a n i n e into polypeptides. The possibility of a n association between one or a n o t h e r i n i t i a t i o n factors with the i n i t i a t i o n sites present on mRNA s suggested.
INTRODUCTION. D a n s les c e l l u l e s e u c a r y o t e s le KC1 h f o r c e i o n i q u e 61ev6e d 6 t a c h e d e s r i b o s o m e s d e s f a c t e u r s prot6iques intervenant dans la biosynth6se des p r o t 6 i n e s . L a f r a c t i o n e x t r a i t e a 6t6 d 6 s i g n 6 e p a r M i l l e r et S c h w e e t [1] <~F a c t e u r KCI )). Les fact e u r s p r o t 6 i q u e s d e cet e x t r a i t , iso16s et p u r i f i 6 s partiellement par plusieurs auteurs jouent un rSle i m p o r t a n t d a n s l ' i n i t i a t i o n d e l a t r a d u c t i o n [l, 2, 3, 4, 5]. N o u s a v o n s m o n t r 6 q u e l ' a d d i t i o n d e (( F a c t e u r KC1)> h u n s y s t 6 m e a c e l l u l a i r e d e f o i e de r a t s c a r e n c 6 s e n p r o t 6 i n e s p r o v o q u a i t u n e stim u l a t i o n i m p o r t a n t e d e la s y n t h 6 s e d e s p o l y p e p t i d e s [6]. D a n s le p r 6 s e n t t r a v a i l , n o u s a v o n s a n a l y s 6 la f r a c t i o n d 6 t a c h 6 e d e s r i b o s o m e s p a r le KCI ((( F a c (*) Charg6e de Recherche au CNRS. (**) Avee la c o l l a b o r a t o n t e c h n i q u e de N. Pfleger. Abrdviations utilis6es : dRNA : RNA dont la c o m p o s i t i o n en bases est analogue fi celle du DNA. dRNP : partieules ribonucl6oprotdiques c o n t e n a n t du dRNA associd fi des protdines. m R N P : particules ribonucl6oprot6iques c o n t e n a n t dn RNA messager associ6 h des protdines. rRNA : RNA r i b o s o m i q u e . TEA c h l o r h y d r a t e de t r i 6 t h a n o l a m i n e .
t e u r KC1 >>) et s 6 p a r 6 e p a r u n e c e n t r i f u g a t i o n d e s r i b o s o m e s a i n s i t r a i t 6 s fi t r a v e r s u n g r a d i e n t c o n t i n u d e s a c c h a r o s e c o n t e n a n t d u KC1 0,5 M. N o u s a v o n s c o n s t a t e q u e le KC1 0,5 M d 6 t a c h e n o n s e u l e ment des prot6ines, mats 6galement une faible q u a n t i t 6 d e d R N A s o u s la f o r m e d ' u n c o m p l e x e d R N A - p r o t 6 i n e s . P a r m i les p r o t 6 i n e s d e ce c o m p l e x e n o u s a v o n s n t i s e n 6 v i d e n c e ]a p r 6 s e n c e d e phosphoprot6ines qui pourraient 6ventuellement intervenir au niveau de la r6gulation de la bios y n t h 6 s e d e s p r o t 6 i n e s [7].
METHODES
ET TECHNIQUES.
Les e x p 6 r i e n c e s o n t 6t6 r g a l i s d e s s u r les t u m e u r s plasmocytaires RPC 5 ou ~PC11 transplant6es sur d e s s o u r i s B a l b C. N o u s a v o n s e f f e c t u 6 le d o u b l e marquage suivant : un marquage de longue dur6e (24 h o u 48 h) p a r i n j e c t i o n i n t r a p ~ r i t o n 6 a l e d e 0,3 m C i d ' u r i d i n e t r i l i 6 e p a r s o u r i s p e r m e t de m a r q u e r le r R N A et les r i b o s o m e s ; u n m a r q u a g e d e c o u r t e d u r 6 e (30 r a i n o u 1 h ) o u u n m a r q u a g e d e 3 h p a r i n j e c t i o n d e 2 m C i p a r s o u r i s d e [32P~ orthophosphate apr6s un Iraitement pr6alable pend a n t 30 m i n fi l ' a c t i n o m y c i n e D (100 ug p a r s o u r i s ) 43
654
M. S c h m i t t et coll.
p e r m e t de localiser le dRNA. Dans ce d e r n i e r cas, l ' a c t i n o m y c i n e D i n h i b e totalement la synth~se de rRNA alors q u ' u n e synth~se r6siduelle i m p o r t a n t e de mRNA ou dRNA persiste [8].
tage c o r r e s p o n d au [32p]-dRNA a c t i n o m y c i n o r6sistant, la diff6rence entre le second et le prem i e r comptage c o r r e s p o n d aux [a2P~phospholipides.
Preparation de ribosomes en gradient discontinu de saccharose D,O.
Analyse de la fraction <
Les tunleurs pr61ev~es sont broy6es dans u n homog6n6iseur Potter Elvehjem, dans 2 volumes de t a m p o n A : TEA 0,02 M pH 7,6 ; KC1 0,15 M ; AczMg 0,0,04 M ; ~-mercapto6thanol 0,006 M ; saccharose 1,1 M. L'homog6nat est centrifug6 20 000 × g p e n d a n t 15 rain. Le s u r n a g e a n t est d6pos6 sur u n g r a d i e n t d i s c o n t i n u de saccharose dissous dans le t a m p o n A c o n t e n a n t du D20 d'apr6s la t e c h n i q u e d6crite a n t 6 r i e u r e m e n t [9]. Une c e n t r i f u g a t i o n "h 200 000 × g (rotor 65) pendant 20 h f o u r n i t u n culot constitu6 p a r les ribosomes el les polysomes purifi6s. D~s le broyage la t e m p 6 r a t u r e est m a i n t e n u e entre 0 et 4 °.
Preparation et analyse de la fraction <
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 6-7.
Traitement des ribosomes par I'EDTA. Les ribosomes sont trait6s sous agitation p a r le t a m p o n C : TEA 0,02 M pH 7,6 ; K C1 0,05 M ; saccharose 0,25 M et c o n t e n a n t 0,02 M d'EI)TA, puts d6pos6s sur u n gradient de saccharose 1 M h 1,8 M comme d6crit ci-dessus. Les fractions h m a r q u a g e r a p i d e et de faible densit~ sont analys~es sur g r a d i e n t de CsC1. Ddtermination de la composition en bases des RNA. La c o m p o s i t i o n en bases du RNA de la fraction <
proc6de "h l ' e x t r a c t i o n et h l ' h y d r o l y s e des selon la m6thode d6crite [11] et on d6terla radioactivit6 des nucl6otides obtenus f r a c t i o n n e m e n t ~lectrophor6tiquc sur pa-
Electrophor~se des prot~ines en gel de polgacrylamide. La t e c h n i q u e utilis6e est celle d6crite p a r W a e h n e l d t [12] modifi6e p o u r o b t e n i r u n e c o n c e n t r a t i o n de SDS 0,1 p. cent dans des gels /i concent r a t i o n d i s c o n t i n u e en a c r y l a m i d e /L r a i s o n de 8 p. cent d ' a c r y l a m i d e dans la partie sup6rieure et 10 p. cent dans la partie i n f 6 r i e u r e du gel. Le d6p6t est de 80 "~ 120 ~g de prot6ines p a r gel de 0,6 cm de diam~tre et de 8 cm de longueur. Les 61ectrophor6ses sont r6alis6es ~ la t e m p 6 r a t u r e o r d i n a i r e p e n d a n t 7 h h r a i s o n de 1,5 mA/gel et dans ]e t a m p o n Tris 0,0,1 M pH 7. Apr6s coloration au Coomassie Brilliant Blue R la d6eoloration est effectu6e p a r ]e m61ange acide ac6tique-m6thanol-eau.
655
mRNA-phosphoprotdines el facteur KCI des ribosomes. RESULTATS. N o u s a v o n s p r 6 p a r 6 les r i b o s o m e s en u t i l i s a n t une technique de gradient discontinu d'une solut i o n d e D 2 0 - s a c c h a r o s e (? : 1 , 1 5 / 1 , 2 6 / 1 , 2 9 ) . C e t t e technique nous a pernfis d'obtenir un culot de ribosomes hautement purifi6s, tr6s peu contamin6s p a r d e s f r a g m e n t s de m e m b r a n e s , des prot6ines
s o l u b l e s o u p a r d e s p a r t i c u l e s <
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; nombr'e
10 1; de Fr'aci'ions
Fro. 1. - - P, ofil de s d d i m e n t a l i o n des r i b o s o m e s frait~s au KCI 0,5 M e n gradient de saccharose. Les r i b o s o m e s , a p r 6 s u n t r a i t e m e n t a u KC1 0,5 M, s o n t c e n t r i f u g e s d a n s u n g r a d i e n t c o n t i n u de s a c c h a rose 1 M & 1,8 M p e n d a n t 14 h St 50.000 t o u r s / m i n ( r o t o r R 65) St 2 ° . Les RNA s o n t d o u b l e m e n t m a r q u d s in r i o • p a r l ' u r i d i n e 3H p e n d a n t 24 h e t p a r le 32p p e n d a n t 3 h a p r 6 s a d m i n i s t r a t i o n de l ' a c t i n o m y c i n e D. ................ m a r q u a g e p a r u r i d i n e 3H, l a v a g e s TCA 0 °. . . . . . . . . . . . . m a r q u a g e p a r u r i d i n e 3H, l a v a g e s TCA 0 ° et t r a i t e m e n t TCA 95 ° p e n d a n t 15 m i n . o---o m a r q u a g e p a r 32p, l a v a g e s TGA 0 °, HC1 0,01 N. x x m a r q u a g e p a r 82p, l a v a g e s TCA 0 ° et traitement mdthanol-chloroforme. [] [] m a r q u a g e p a r 32p, l a v a g e s TCA 0 ° et t r a i t e m e n t TCA 95 ° 15 m i n . L ' a i r e c o m p r i s e e n t r e la c o u r b e 1 et 2 r e p r g s e n t e la r a d i o a c t i v i | d c o r r e s p o n d a n t aux p h o s p h o l i p i d e s , celle c o m p r i s e e n t r e la c o u r b e 1 et 3 r e p r 6 s e n t e la r a d i o activit6 c o r r c s p o n d a n t a n dRNA. La c o u r b e 3 reprdsente la r a d i o a c t i v i t d c o r r e s p o n d a n t a u x p h o s p h o p r o t6ines.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 6-7.
,~/ ~
20 30 40 n o m b r e de t r a c t i o n s
~
50
Fit;. 2. - - P r o f i l de s d d i m e n t a l i o n de la fraction <
c e n t [14, 15]. L e s r i b o s o m e s o b t e n u s d a n s n o s conditions pr6sentent un rapport D O 260 n m / D O 280 n m d e 1,85.
E f [ e t d u K C I 0,5 M s u r les r i b o s o m e s . A 4 °, e n p r 6 s e n c e d e 1 o u d e 4 m M Mg e+, o n o b t i e n t p a r F a c t i o n d u KCI 0,5 M s u r l e s r i b o s o m e s
656
M. Schmitt
p u r i f i 6 s , ~ c6t6 d e s s o u s - u n i t 6 s r i b o s o m i q u e s , u n complexe nucl6oprot6ique qne nous avons d6sign6 p a r f r a c t i o n ¢ F KC1 >>. Celle-ci c o n t i e n t h l a fois d e s p r o t 6 i n e s et u n R N A i~ m a r q u a g e r a p i d e . A n a l y s e d e << F K C l >> p a r s ~ d i m e n t a t i o n d i e n t d e s a c c h a r o s e et d e CsCl.
en gra-
Analys6 en gradient de saccharose continu 1 M h 1,8 M la f r a c t i o n <
et coll. L a f i g u r e 3 m o n t r e le p r o f i l d e s ~ d i m e n l a t i o n a i n s i o b t e n u . A l a d i f f 6 r e n c e d e <
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E f f e t d e I ' E D T A s u r les r i b o s o m e s . N o u s a v o n s c o m p a r 6 le m a t 6 r i e l d 6 t a c h 6 d e s r i b o s o m e s p a r le KCA 0,5 M e t c e l u i e n l e v 6 d e s r i b o s o m e s p a r I ' E D T A 0,02 M. E n effet, il est b i e n c o n n u q u e I ' E D T A agit s u r les r i b o s o m e s e n l i b 6 r a n t d e s s o u s - u n i t 6 s r i b o s o m i q u e s ct d u m R N A sous forme de particules ribonucl6oprot6iques. Ces s t r u c t u r e s o n t 6t6 d 6 c r i t e s d a n s d i v e r s t i s s u s a n i m a u x [14, 16-22]. A i n s i , p a r a l l b l e m e n t a u x r i b o s o m e s t r a i t 6 s p a r le KC1 0,5 M, d e s r i b o s o m e s trait6s ~ I'EDTA 0,02M sont d6pos6s sur un ~ad i e n t c o n t i n n d e s a c c h a r o s e 1 M h 1,8 M. L e m a t 6 r i e l d e d e n s i t 6 f a i b l e e n t r e 1,15 et 1,20 et m a r q u 6 a u a-~P est r e c u e i l l i et a n a l y s 6 e n g r a d i e n t d e CsCl. TABLEAU I. C o m p o s i t i o n e n b a s e s d a R N A d e <
f
"1000
-~ --"
\ c r .~. . . .P. . . .
, ..........
--m,
..........
10
20 30 40 50 nombre de [roctions Fro. 3. - - P r o f i l de s~dimentation en gradient de CsCl de la fraction <~m R N P >> ddtachde des ribosomes par I'EDTA. Les ribosomes trait6s p a r I'EDTA 0,02 M sont d~-pos~s snr u n g r a d i e n t de saecharose 1 M h 1,8 M e t centrifuges d a n s les conditions d~crites dans la Fig. l. Les conditions de m a r q u a g e des RNA sont identiques h celles de la Fig. 2. Les f~Iactions m a r q u 6 e s a u 32p et de faible dcnsit~ sont fix~es p a r le f o r m o l 5 p. cent et centrifug6es dans u n g r a d i e n t de densit~ de CsCl p e n d a n t 14 h h 45.000 t o u r s / m i n (rotor SW 65) "~ 10 °. Marquages identiques h ceux de la figure 2.
Nucl~otides (moles p. cent) Fractions de RNA
RNA de " F K C I " 18 S . . . . . . r R N A 28 S . . . . . . tRNA ............
rRNA
c
A
[
o 24
29 {20,4{30 29,5{18,3135,, 30,2 / 1 9 , 2 1 2 9 , 8
u 27
o_
c
0,80
20,0 1,43 17,, ,,s2 20,8/1,50
La c o m p o s i t i o n en bases est estim6e selon la radioaetivit6 des nuel6otides apr~s u n m a r q u a g e au 32p selon les m~odalit6s d6erites dans <
a v a n t et a p r ~ s d ~ l i p i d a t i o n , n o u s c o n s t a t o n s q u e ce m a t 6 r i e l c o n t i e n t t r ~ s p e u d e p h o s p h o l i p i d e s . P a r a i l l e u r s , l ' a c t i v i t ~ r ~ s i d u e l l e d u 32p a p r ~ s h y d r o l y s e a u T C A 5 p. c e n t h 9'5 ° et c o r r e s p o n d a n t a u x p h o s p h o p r o t 6 i n e s est f a i b l e . C a r a c t ~ r i s t i q u e s d u R N A d e <
mRNA-phosphoprotdines
el f a c t e u r KC1 des r i b o s o m e s .
m i n i s t r a t i o n d ' a c t i n o m y c i n e D, suit apr6s un m a r quage p e n d a n t 20 rain p a r l ' u r i d i n e triti6e. P a r ailleurs, nous avons 6tabli, d'apr6s la r a d i o a c t i v i t 6 des nucl6otides marqu6s au 32p, la c o m p o s i t i o n en bases p u r i q u e s et p y r i m i d i q u e s du RNA de <
657
d e r n i e r e p o u r r a i t r6sulter d ' u n e 6ventuelle fragm e n t a t i o n du dRNA lors de la p r 6 p a r a t i o n . Caract~ristiques des prot~ines de ¢ F KCl >>. 1) Mise en 6 v i d e n c e de p h o s p h u p r o t 6 i n e s : d'apr6s la valeur de la densit6 apr6s centrifugation h l ' 6 q u i l i b r e dans un g r a d i e n t CsC1 (~ : 1,3), ¢ F KC1 )> est cunstitu6e en g r a n d e p a r t i e de prot6ines. En effet, d'apr6s la f o r m u l e e m p i r i q u e de Spirin, ce c o m p l e x e contient plus de 90 p. cent de prot6ines, et m o i n s de I0 p. cent de RNA. Afin de s a v o i r si ce mat6riel c o n t i e n t des p h u s p h o l i p i d e s ou des lipoprot6ines, nous avons proc6d6 h une e x t r a c t i o n de <
¢
GEL 8%
GEL 10%
FIG. 4. Tracds densitomdtriques de gels mixtes de polyacrylamide 8 et 1,0 p. cent en prdsence de SDS. Les diffdrentes fractions sont pr6par6es eomme il est d6crit dans ¢ Mdthodes >>. A : prot6ines du <
-
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P o u r la f r a c t i o n <
M. S c h m i t t el coll.
658 140 000 83 000. bandes certain taires.
et p o u r les a u t r e s c o m p r i s e n t r e 38 000 et Le <
Il est h n o t e r q u e les r i b o s o m e s d 6 b a r r a s s 6 s de la f r a c t i o n <
Stimulation, par la fraction <
Stimulation par la fraction ¢ F KCI de l'incorporalion de phd.n!tlalanine L~C en p r e s e n c e de polyU. Incorporation de ~C Phe coups/min/mg de ribosomes
Syst6me acellulaire Cotnpi~t - - 1' KCI Sans ribosomes
+
F
KCI
Complet --~ F KC1 - - Exp. 1 - - Exp. 2 - - Exp. 3
14.400 90 54.000 69.000 38.000
Le syst~me acellulaire complet contient 0,2 D.O. de polysomes laves au KC1 ; 0,35 mg de prot6ines $200, 40 ~±g de prot6ines ¢ F KC1 ~ et 10 ~u.g de polyU. Les autres constituants sont GTP 1 m M ; ATP 0,2 InM; phospho6nolpyruvale 5 mM, pyruwtte kinasc 20 .~tg/m], Tris-HC1 pH 7,4 35 mM, 14C ph6nylalanine 0,5 ~,Ci/ml ; KCI 100 mM et Mg2÷ 5 mM. Les incubations ont 6t6 e f f e c t u 6 e s h 37 ° pendant 30 rain e t l e m a t 6 r i e l a c i d o i n s o l u b l e trait6 comme d6crit p r6alablement. i n t r o d u i t d a n s le s y s t b m e la f r a c t i o n ¢ F KC1 ~> ( p r 6 p a r 6 e e o n l m e d 6 e r i t d a n s ¢ M6thodes >>), h r a i son de 40 ~g de p r o t 6 i n e s , c e l l e - c i p r o v o q u e u n e s t i m u l a t i o n de 2,5 h 5 fois de l ' i n c o r p o r a t i o n de p h 6 n y l a l a n i n e 1~C d a n s les p r o t 6 i n e s ( T a b l e a u H).
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55, n ° 6-7.
DISCUSSION. A f o r c e i o n i q u e 61ev6e el en p r 6 s e n e e de Mg 2~, le KCI d i s s o c i e des r i b o s o m e s purifi6s de t u m e u r p l a s i n o c y t a i r e u n e f r a c t i o n p r o t 6 i q u e et r i b o n u c l 6 i q u e . U n e g r a n d e p a r t i e du m a t 6 r i e l a i n s i d6tach6 a pn 6tre isolge sous f o r m e d ' u n e o m p l e x e n u c l 6 o p r o t 6 i q u e h o m o g + n e (<~ F KC1 >>) a y a n t u n e densit6 de 1,18 en g r a d i e n t i s o p y e n i q u e de s a e e h a r o s e et u n e d e n s i t 6 de 1,3,0 en g r a d i e n t de CsC1. C o m m e ee c o m p l e x e s t i m u l e la s y n t h + s e de p o l y p h ~ n y l a l a n i n e "h 5 mM de m a g n 6 s i u m et en pr6s e n e e d ' a c i d e p o l y u r i d y l i q u e , il e o n t i e n t v r a i s e m b l a b l e m e n t ]es f a c t e n r s d ' i n i t i a t i o n . C e c i p a r a n a l o g i e a v e e les f a e t e u r s d ' i n i t i a t i o n o b t e n u s d a n s des c o n d i t i o n s s e m b l a b l e s h p a r t i r de r i b o s o m e s d'au~res e e l l n l e s e u e a r y o t e s [3, 4, 51. N o u s m o n t r o n s q u ' u n e p a r t i e au m o i n s des p r o t~ines p r 6 s e n t e s d a n s <
mRNA-phosphoprol~ines Or, le c o m p l e x e d R N A - p r o t 6 i n e s de f a i b l e d e n sit6 d 6 t a c h 6 p a r le KC1 se r 6 v b l e t r b s d i f f 6 r e n t d u m a t 6 r i e l c o r r e s p o n d a n t d i s s o c i 6 p a r I ' E D T A , "h la fois p a r le c a r a c t b r e d ' h o m o g 6 n 6 i t 6 , la d e n s i t 6 e n g r a d i e n t d e CsC1, l a t e n e u r e n p h o s p h o p r o t 6 i n e s et, d a n s le c a s d e I ' E D T A , l a p r 6 s e n c e d e R N A ribosomique. I1 f a u t e n c o r e n o t e r q u e l ' u t i l i s a t i o n d e ]a t e c h nique du gradient discontinu en saccharose dans l ' e a u l o u r d e p o u r la p u r i f i c a t i o n d e s r i b o s o m e s polysomes nous a permis d'61iminer la quasitotalit6 des particules ribonucl6oprot6iques du t y p e <> l i b r e s [9], c ' e s t - ~ - d i r e n o n ]i6es a u x r i b o s o m e s . D a n s les r i b o s o m e s t r a i t 6 s a u KC1 et r e s 6 d i m e n t6s, l ' a b s e n c e d e s b a n d e s p r o t 6 i q u e s m a j e u r e s et m i n e u r e s d a n s l a p a r t i e s u p 6 r i e u r e d u gel ( b a n d e s c a r a c t 6 r i s t i q u e s d e F KCl) s u g g ~ r e q u e ces p r o t6ines correspondent aux faeteurs d'initiation. Les b a n d e s m i n e u r e s d a n s l a p a r t i e i n f 6 r i e u r e d u gel p o u r r a i e n t 6tre a t t r i b u 6 e s ~ d e s p r o t 6 i n e s d e c o n t a m i n a t i o n d o n t l a n a t u r e et l ' o r i g i n e n ' o n t p a s 6t6 d 6 t e r m i n 6 e s . O n p o u r r a i t s u p p o s e r q u e c e r t a i n e s d e ces p r o t 6 i n e s o n t 6t6 d 6 t a c h 6 e s d e s p a r t i c n l e s <
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el [acteur KCI des ribosomes.
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6t6 pr6par6s. Apr~s u n t r a i t e m e n t p a r du KC1 0,5 M on a d6taeh6 u n complexe c o n t e n a n t h la fois du dRNA et des prot6ines ( ¢ F KCI~). I1 e o n t i e n t environ 6 p. cent de dRNA et p a r m i les prot~ines on a m i s en 6videnee la pr6senee de phosphoprot6ines. Cette structure s6dimente avec une densit4 h l'6quilibre de 1,18 e n g r a d i e n t de saeeharose et de 1,3 en CsC1. Ce mat6riel est diff6rent de eelui d6taeh6 des ribosomes sous l'effet de I'EDTA (mRNP polysomiques). L'analyse du profil 61eetrophor6tique des prot~ines sur gel de polyaerylamide-SDS r~v~le trois b a n d e s prot6iques m a j e u r e s de h a u t poids mol~culaire (89.000, 100.000 105.000) et plusieurs b a n d e s m i n e u r e s . Additionn~ u n syst~me aeellulaire e o n t e n a n t la f r a c t i o n soluble $200, des ribosomes laves au KC1 et du polyU, le eomplexe <~F KC1 >> provoque u n e s t i m u l a t i o n i m p o r t a n t e de l ' i n e o r p o r a t i o n de 14C-ph~nylalanine dans les polypeptides. La possibilit~ d ' u n e association de l ' u n ou l ' a n t r e des faeteurs d ' i n i t i a t i o n avee les sites d ' i n i t i a t i o n p o r t , s p a r le mRNA est sugg~r~e. BIBLIOGRAPHIE. 1. Miller, R. L. & Schweet, R. (1968) Arch. Biochem. Biophys., 125, 632. 2. Cohen, B. B. (1968) Biochem. J., 110, 231. 3. Godin, C., Kruh, J. ,~ Dreyfus, J. C. (1969) Biochim. Biophys. Acta, 182, 175. 4. Priehard, P. M., Gilbert, J. M., Shafritz, D. A. ~ Anderson, V¢. F. (1970) Nature, 226, 511. 5. Heywood, S. M. (1970) Nature, 225, 696. 6. Quirin-Stricker, C., Gross, M. & Mandel, P. (1970) B u l l Soc. Chim. Biol., 52, 1315. 7. Loeb, J. E. & Blatt, C. (1971) FEBS Lett., 18, 124. 8. Kempf, J. & Mandel, P. (1969) Bull. Soe. Chim. Biol., 51, 1121. 9. Kempf, J., Egly, J. M., Qurin-Strieker, C., Schmitt, M. & Mandel, J. (1972) FEBS Left., 26, 130. 10. Egly, J. M., J o h n s o n , B. C., Qurin-Strieker, C., Mandel, P. -~ Kempf, J. (1972) FEBS Lelt., 22, 181. 11. Kempf, J. a Mandel, P. (1969) Eur. J. Biochem., 8, 376. 12. W a e h n e l d t , T. V. ~ Mandel, P. (1970) FEBS Lelt., 9, 209. 13. Spirin, A. S. (1969) Eur. J. Biochem., 10, 20. 14. Kempf, J., Zahnd, J. P. e, Mandel, P. (1970) Eur. J. Biochem., 17, 124. 15. Lissitzky, S., Poir6e, J. C., Cartouzou, G. ~ Gr6goire, J. (1970) Eur. J. Biochem., 12, 104. 16. Lebleu, B., Marbaix, G., Huez, G., T e m m e r m a n , J., Burny, A. a C h a n t r e n n e , H. (1971) Eur. J. Biochem., 19, 264. 17. Morel, C., K a y t b a n d a , B. ,~. Seherrer, K. (1971) FEBS Lett., 18, 84. 18. Blobel, G. (1972) Biochem. Biophlls. Res. Commun., 47, 88. 19. Henshaw, E. C. (1968) J. Mol. Biol., 36, 401. 20. Olsnes, S. (1971) Eur. J. Biochem., 18, 242. 21. Cartouzou, G., Poir~e, J. C. & Lissitzky, S. (1969~ Eur. J. Bioehem., 8, 357. 22. Perry, R. P. & Kelley, D. E. (1968) J. Mol. Biol., 35, 37. 23. Shapiro, A. L., Vinuela, E. & Maizel, J. V. Jr. (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun., 28, 815.