Autoradiographische, histologische und histochemische Untersuchungen an der Rattenleber nach lokaler Gefrierung

Pathologisches Institut der Universitat Bonn (Direktor: Prof. Dr. P. GEDIGK) und Abteilungen fUr Pathologie (Vorstand: Prof. Dr.]. SCHOENMACKERS) sowie fUr Urologie (Vorstand: Prof. Dr. W. LUTZEYER) der Medizinischen Fakultat an der Rheinisch-Westfalischen Technischen Hochschule Aachen

Autoradiographische, histologische und histochemische Untersuchungen an der Rattenleber nach lokaler Gefrierung* ** Autoradiographic, Histological and Histochemical Investigations on Livers of Rats Following Local Freezing B.

HELPAP, H. BREINING

und S.

LYMBEROPOULOS

Mit 6 Abbildungen . Eingegangen am 9. August 1972 . Angenommen am 10. Oktober 1972

Abstract Introduction: Histological, histochemical and autoradiographic studies were performed to investigate the changes on wound healing in liver of rats after deep localized freezing. Material and Methods: On 48 female Wistar-rats, liver localized freezing up to 180° C about 30 sec. was performed. The experimental time was 15 min. up to 180 days. One hour before death, rats received one injection of H 3-thymidine (3,0 [J.C/ I g) to measure the labeling index of hepatocytes and mesenchymal cells in the liver and in the cryonecrosis during wound healing. Results and Discussion: I hour after freezing the injured area of the liver is characterized by pycnotic nuclei and an extensive loss of glycogen and PAS-positive substances. After 12-24 hours the "cryonecrosis" is complete with leucocytic demarcation, and without any reaction for lactatealdehydrogenase (LDH) and succinicdehydrogenase (SDH). Five days later widespread granulation tissue developed in the marginal zone of the cryonecrosis, sometimes with liquefaction of central parts of the necrosis. Two-three weeks after freezing mesenchymal cell proliferation produces small residual scars. The autoradiographic studies show-compared with results after partial hepatectomy- that cryonecrosis induces cell proliferation of the hepatocytes and mesenchymal

* Herrn Prof. Dr. ]. SCHOENMACKERS zum 60. Geburtstag. ** Mit UnterstUtzung des Landesamtes fUr Forschung Nordrhein-Westfalen in DUsseldorf.

166 . B. HELPAP, H. BREINING und S. LYMBEROPOULOS cells within the parenchyme only in a small 200 iJ. marginal zone near the cryonecrosis. The maximum of the H3-labeling index is in the second day as well as for hepatocytes, bile duct cells, Kupffer-cells and fibroblasts in the granulation tissue. These results are similar to the cell proliferation after mechanical-traumatic injuries of the liver. After 30 days there are no differences between the proliferating activity in frozen and non-frozen livers. The advantage of local freezing of parenchymal organs is a well demarcated necrosis with rapid repair within 2-3 weeks without any functional lesions of the organ.

Die physikalischen Grundlagen der Kryochirurgie sind in den letzten Jahren eingehend und griindlich experimentell erforscht worden (Dbersicht bei LYMBEROPOULOS, 1970). An zahlreichen Organen ist diese moderne chirurgische Methode bereits mit Erfolg eingesetzt worden, z. B. am Auge (MOORMANN, 1967; LINCOFF, 1968), am ZNS (COOPER, 1962; 1968; COOPER und STELLAR, 1963), im Hals-Nasen-Ohren-Bereich (v. LEDEN, 1968; LENZ, 1971), an der Leber (COOPER und HIROSE, 1966; FISH et aI., 1967; NEEL et aI., 1971), an den Nieren, Harnblase und Prostata (SIGEL und SCHROTT, 1967; HASCHEK, 1968; LUTZEYER et aI., 1968; 1970; LYMBEROPOULOS, 1968, 1969, 1970; HOCHBERG und BLEYL, 1969) sowie an bosartigen Tumoren (CAHAN, 1965; Cooper, 1963, 1965). Auf anatomischem bzw. pathologisch-anatomischem Gebiet haben sich die bisherigen Untersuchungen im wesentlichen auf histologische, rustochemische und biochemische Befunde erstreckt (STUCKE, 1966; STUCKE und CIROTH, 1967; FRASER und GILL, 1967; Buss, 1969; STUCKE und KAHLERT, 1969; BREINING et aI., 1970). Quantitative Untersuchungen iiber das AusmaB und die Lokalisation der proliferativ-reparativen Vorgange an parenchymatosen Organen nach einer lokalen Gefrierung sind bislang nicht beschrieben worden. Wir haben daher an der Rattenleber nach lokaler Vereisung neb en histologischen und histochemischen auch autoradiographische Untersuchungen mit radioaktiv-markiertem H3-Thymidin durchgefiihrt (HELPAP et aI., 1972). Hierdurch wollten wir auf zellkinetischer Basis einen Einblick in die GroBe, in die Lokalisation und in die zeitlichen Ablaufe der proliferativen Vorgange bei der Wundheilung von Kryonekrosen an parenchymatosen Organen gewinnen.

Methodik 48 weiblichen Wistar-Ratten mit einem Durchschnittsgewicht von 170 ± 16 g wurde in Athernarkose nach Eroffnung des Bauchraumes der nachstgelegene Lebedappen (Hnke Seite) mit einem Kryoskalpell 30 Sek. einer Vereisung von -180°C ausgesetzt (technische Einzelheiten s. LYM-

Rattenleber nach lokaler Gefrie rung .

167

BEROPOt:LOS, 1970; BREINING et aI., 1970). D er Wundverschluf3 erfolgte durch Catgut-Knopfnahte. Die Uberlebenszeiten derTiere betrugen 15 Min., 1,2,4, 12 und 15 Std. sowie 1,2, 3, 5, 10, 14, 30 und 180 Tage. J eweils 1 Std. vor der Totung erhielt ein Teil der Ratten 3,0 fLC H3-Thymidin pro I kg Korpergewicht (spezifische Aktivitat 20 CfmMol; NEN Chemicals, Boston, Mass., USA) intraperitoneal injiziert. Nach D.:kapitation in Athernarkose wurden die vereisten und die ungeschadig ten Anteile der Leber entnommen und in 6% Formalin-Trichloressigsaure 24 Std. fixiert. Nach I 2stundiger Wasserung und Einbettung in Paraffin wurden von 5 fL dicken Schnitten Autoradiogramme mit Strippingfilm (AR 10, Kodak) angefertigt. Die Expositionszeiten bei 4°C betrugen 19 Tage. Die Autoradiogramme wurden mit Haematoxylin-Eosin gefarbt. Nicht autoradiographisch verarbeitete Paraffinschnitte wurden ebenfalls mit Hamatoxylin-Eosin sowie nach Gomori, Elastica-van-Gieson, Azan, Goldner, PAS ur:d Best-CaliTI.in gefarbt. An unfixierten Kryostatschnitten wurden die A ktivitaten der Laktatdehydrogenase (LDH) (SPANNHOF) und die der Succincdehydrogenase (SDH) (PEARSE) bestimmt. In den Autoradiogrammen wurde mit Hilfe cines Okular-Zahlnetzes der Firma Leitz bei 1000facher VergroBerung die Anzahl der radioaktiv markierten Hepatocyten und Sternzellen, bezogen auf die Gesamtzellzahl (H3-Thymidin-Markierungsindex) bestimmt, und zwar: 1. in einer 0-100 fL breiten Zone von der Kryonekrose entfernt; 2. in einer 100-200 fL breiten Zone von der Kryonekrose entfernt; 3. in d::n weiter cntfernt liegenden Abschnitten des geschadigten Leberlappens ; 4. in den ungcschadigten ubrigen Leberlappen. AuBerdem wurden die H 3-Indices der Fibroblasten in der Nekrosezone bzw. in dem sich spater entwickelnden Granulations- und Narbengewebe gemessen. Die Anzahl der markierten Zellen bezieht sich pro Autoradiogramm auf eine Gesamtzahl von 10000 Zellen.

Ergebnisse 1.

Makroskopische Befunde

Sofort nach dem Wiederauftauen verfarbt sich der gefrorene Leberbezirk dunkelblau-rot. Die Konsistenz ist weicher als im nicht gefrorenen Lebergewebe. Nach 4 Std. fiirbt sich der gefrorene, im Durchmesser bis 6 mm grof3e Bezirk hellgelb-braun und hebt sich scharf gegen das nicht gefrorene Lebergewebe abo A m 2.-5. Tag ist der geschadig te Leberbezirk gelblichweil) gefarbt und besitzt eine festere Konsistenz. 10 Tage nach dem Ver12

Beitr. Path. Bd. 148

168 . B. HELPAP, H. BREINING und S. LYMBEROPO ULOS

b

d

Abb. 1. a) und b) Rattenleber I Std. nach Vereisung mit Kernpyknose und weitgehendem Glykogenverlust bzw. Schwinden der PAS-positiven Substanzen aus den Hepatocyten. a) HE, b) PAS, 20 x . c) Ausgedehnte Koagulationsnekrose ("Kryonekrose") 24 Std. nach Vereisung. HE, 20 x . d) 5 Tage nach Vereisung breiter Granulationsgewebssaum mit Gallengangssprossungen und beginnender zentraler Verfhissigung der Nekrose. HE,20 x . Fig. 1. a) and b) I hr. after deep freezing, liver with pyknotic nuclei and complete loss of glycogen and PAS substances. a) HE, b) PAS, X 20. c) Complete cryonecrosis 24 hrs. after freezing. HE, X 20. d) Liver, 5 days after freezing with wide spread granulation tissue and central liquefaction of the necrosis. HE, X 20.

Rattenleber nach lokaler Gefrierung . 169

suchsbeginn ist der gefrorene Leberbezirk erheblich kleiner als zu Beginn der Schadigung. Nach 4 Wochen imponiert eine feine grau-weiBe, derbe Narbe, die im Niveau der Oberflache des erhaltenen Lebergewebes liegt. 2.

Histologische Befunde

Etwa 15 Min. nach dem Wiederauftauen ist die Struktur des gefrorenen Lebergewebes gut erhalten; es faUt lediglich im Hamatoxylin-Eosin-gefarbten Schnitt eine leichte Abblassung auf. Nach 1 Std. kommt es zu einem erheblichen Glykogenverlust und zu einem nahezu volligen Schwinden P AS-positiver Substanzen im gefrorenen Lebergewebe. Die Leberzellkerne lassen eine Pyknose erkennen (Abb. 1 a, b). Die ZeUgrenzen erscheinen verwaschen. 1m weiteren Verlauf dissoziieren die Leberzellbalken, die Sinusoide enthalten vermehrt Erythrocyten, ebenso die Zentralvenen und die GefaBe der portalen Felder. Vereinzelt sind hyaline Thromben in den GefaBen nachweisbar. Bereits nach 2 Std. beginnt eine leukocytare Emigration aus den BlutgefaBen. Nach 4 Std. findet sich eine erhebliche leukocytare Demarkation. Nach 12-24 Std. hat sich eine ausgedehnte koagulative Parenchymnekrose unter teilweiser Einbeziehung der Leberkapsel ausgebildet. Nur noch schattenhaft sind nekrotische Hepatocyten und nekrotische mesenchymale (Stern-)Zellen zu erkennen (Abb. 1 c). In der Nahe zum erhaltenen Lebergewebe finden sich in unterschiedlicher Dichte Leukocytenansammlungen, die sich bandformig in die Nekrose vorschieben und am 3. postoperativen Versuchstag ihre groBte Dichte aufweisen. Das Leberparenchym an der unmittelbaren Grenze zur Nekrose (0-100 [L bzw. 100-200 [L) laBt reichlich EinzelzeUnekrobiosen und Nekrosen, ein interstitielles Odem und Sternzellaktivierungen erkennen. Nach 24 Std. bis zum 3. Versuchstag bildet sich ein schmaler Granulationsgewebssaum mit Histiocyten, Fibroblasten, polymorphkernigen Leukocyten und Lymphocyten aus. Am 5. Versuchstag hat das Granulationsgewebe seine groBte Breite erreicht. Randstandig finden sich vermehrt Gallengangsproliferationen. In weiter entfernt liegenden Nekrosebezirken beginnt jetzt eine zunehmende Auflockerung und Verflussigung der Nekrose im Sinne einer Kolliquationsnekrose (Abb. I d). Nach dem 10. Versuchstag sind nur noch kleine Einsenkungen im Leberparenchym an stelle der ursprunglichen Nekrose zu beobachten. Hier findet sich jetzt ein unterschiedlich zellreiches Narbengewebe, das sich bis zum 14. Versuchstag weiter retrahiert und nach dieser Zeit nur noch als schmale Narbe und Kapselfibrose imponiert. Die Oberflache der Leber im Bereich der fruheren Kryonekrose liegt wieder im Kapselniveau der ubrigen Leber (Abb. 2). Lichtmikroskopisch sind im erhaltenen Leberparenchym keine morphologischen Besonderheiten mehr erkennbar.

I70 .

B. HELPAP, H. BREIN IN G

und S.

LY MBEROPO UL OS

Abb. 2. Rattenleber 14 Tage nach Vereisung mit schmalem Narbenfeld. HE, Fig. 2 . Liver 2 weeks after freezing with residual scar. HE, X 20.

20

x.

Abb. 3. Vollstandiger Verlust der enzymatischen Aktivitaten im Bereich der Kryonekrose (LDH, I. Tag). Fig. 3. Complete loss of lactatedehydrogenesis activity (LDH) I day after freezing.

Rattenleber nach lokaler Gefrierung . 50

171

%

3 H-Index von mesenchymalen Zellen (Leber) Granulationsgewebe -*Stern-u. Portal feld - Zellen Randzone().J) 0-100-+100-200 - 0 - ubrige Leber _.G).25

10

K

2

3

5

10

14

>30 Tage

p. op.

Abb. 4. Zeitlicher Verlauf des H 3-Markierungsindex der Fibroblasten im Granulationsgewebe sowie der mesenchymalen Zellen in der Leberrandzone sowie im ubrigen Gewebe der Leber nach Vereisung. Standardabweichung 2 s = 95% Wahrscheinlichkeit. Fig. 4. H 3-thymidine labeling index of fibroblasts in the granulation tissue and of mesenchymal cells of the liver in the marginal zone of the cryonecrosis and in other parts of the liver after freezing. Standard deviation 2 s.

3. Histochemische Befunde I -2 Std. nach Gefrierung ist im gefrorenen Leberbezirk ein weitgehender Enzymverlust eingetreten. Die LDH- und SDH-Aktivitaten werden zunehmend schwacher. Nach 12 Std. sind keine Enzymaktivitaten mehr nachweisbar (Abb. 3). Nach der I. Versuchswoche, besonders aber innerhalb der 2. Versuchswoche, ist eine zunehmende Aktivitat der LDH im Granulationsgewebe in den mesenchymalen Zellelementen nachweisbar. 4 Wochen nach Versuchsbeginn ist die LDH im Narbengewebe deutlich positiv, wahrend die SDH negativ bleibt. Die enzymatischen Reaktionen im erhaltenen, nicht gefrorenen Lebergewebe gleichen denen der Kontrollebern.

4. Autoradiographische Befunde Die Ergebnisse der Proliferationsverhaltnisse der mesenchymalen und epithelialen Zellen in der Nekrosezone sowie in den Randgebieten und ubrigen Parenchymabschnitten sind in den Abbildungen 4 und 5 dargestellt.

172 .

10

B. HELPAP, H. BREINING und S. LYMBEROPOULOS

%

30

%

3 H_ Index % Leberepithelien

3H-Index % Gallengangsepithelien Leberrandzone

15

5 1 2 3

K

2

3

5

5

10

10

14 Tage P.op.

14

>30 Tage p.op.

Abb. 5. H 3-Thymidin-Markierungsindex der Gallengangsepithelien und der Leberzellen (Hepatocyten) am Randgebiet der Kryonekrose; -X-O-IOO [1.; ---0--- 100-200 [1. sowie in den iibrigen Leberabschnitten-o-nach Vereisung. Standardabweichung 2S = 95% Wahrscheinlichkeit. Fig. 5. H 3-thymidine labeling index of bile duct cells and of hepatocytes in the perifocal zone of the cryonecrosis; 0-100 [1. - X - , 100-200 [1. ---0--- and in other parts of the liver after freezing - 0 - . Standard deviation 2S.

a) Die mesencrymalen Zel!en im Granulationsgewebe der Nekrose und in der Leber: Wie aus den Kurven der Abbildung 4 ersichtlich, treten bereits 12-24 Std. nach der Vereisung in der Leberrandzone an der Nekrose radioaktiv markierte mesenchymale Zellen und in der Nekrosezone einzelne markierteFibroblasten auf. Am 2. Versuchstag findet sich ein Maximum proliferierender, DNS-synthetisierender, mesenchymaler Zellen sowohl im Granulationsgewebe als auchin den 0-100 bzw. I 00-200 fL breiten Gewebsrandzonen in der nicht gefrorenen Leber (Abb. 6). Die Wundfibroblasten zeigen die hochsten Indexwerte. Auch in den ubrigen Leberlappen steigen die Prozentsatze radioaktiv markierter Sternzellen und mesenchymaler Elemente in den Portalfeldern zu diesem Zeitpunkt geringfUgig an. Nach dem 2. Versuchstag fallt der H 3-Markierungsindex proliferierender Zellen zunachst steil, nach dem 5. Versuchstag Hacher abo 14 Tage nach der Vereisung sieht man nur noch geringfUgig erhohte H 3-Indices in der Narbenzone. Auch in den Wundrandbezirken der Leber (bis 200 fL) sind noch Proliferationsaktivitaten feststellbar, wahrend das ubrige Mesenchym der Leber den Kontrollwerten gleicht.

Rattenleber nach lokaler Gefrierung .

173

b) Die epithelialen Elemente der Leber: Die Hepatocyten in der 0-200 fL breiten Randzone sowie die Gallengangsepithelien zeigen einen gleichartigen Verlauf hinsichtlich ihrer Markierungsindices wie die mesenchymalen Zellen. Am 2. postoperativen Versuchstag besteht ein Maximum (Abb. 5). Nach dem 2. Versuchstag tritt wiederum ein starker Abfall ein. Auch in den weit von der Nekrose entfernten Bezirken des geschadigten Leberlappens sowie in den ubrigen Leberlappen liegen etwas vermehrt DNS-synthetisierende Hepatocyten gegenuber den Kontrollen vor. Am 14. Versuchstag besteht eine leichte Erhohung des H 3-Index der Hepatocyten sowohl in der 200 fL breiten Randzone an dem Vereisungsbezirk als auch in den ubrigen nicht gefrorenen Leberabschnitten. Nach 30 und mehr Tagen gleichen die Werte den Lebern der Kontrolltiere.

Diskussion I.

Histologisches Schick sal der Kryonekrose der Leber

Grundlegende biologische Reaktionen von Zellen und Gewebe nach Gefrierung sind von zahlreichen Autoren ausfiihrlich untersucht und beschrieben worden (HASS und TAYLOR, 1948; MERYMAN, 1956; TAYLOR, 1957; COOPER, 1963a, b; TRUMP et aI., 1964, 1965; MELNICK, 1965; PENNELL, 1965; STOWELL et aI., 1965; GERLACH, 1966a, b; REBHUN, 1965; LYMBEROPOULOS, 1970). Die Gewebsreaktion hangt wesentlich vom Kaltegrad, der Dauer der Gefrierung, der Geschwindigkeit der Temperatursenkung und der Auftaugeschwindigkeit abo Bei schneller und tiefer Temperatursenkung sowie bei langsamem Auftauen kommt es zu einer irreversiblen Schadigung samtlicher Zellstrukturen (sog. homo gene Nukleation) (MERYMAN, 1956, 1960, 1968). Dieser Vorgang spielt sich in den Zellschichten ab, die der Vereisung am nachsten liegen. In den tieferen und peripheren Gewebszonen tritt die sog. heterogene Nukleation auf. In diesem Bereich sind Erholungsvorgange moglich (BREINING et aI., 1970). Bei schneller und tiefer Vereisung umschriebener Bezirke der Rattenleber und nachfolgender langsamer Auftaugeschwindigkeit haben sich in den eigenen Experimenten Befunde ergeben, die mit denen der Literatur iibereinstimmen (FRASER und GILL, 1967; STUCKE und CIROTH, 1967; STUCKE und KAHLERT, 1969; BREINING et aI., 1970; NEEL et aI., 1971 a, b). Die dutch das Kryoskalpell erzeugten, ausgedehnten Koagulationsnekrosen werden innerhalb von 5 Tagen von einem zellreichen Granulationsgewebe durchsetzt. Bereits nach 2-3 Wochen ist es zu einer weitgehenden

174' B. HELPAP, H. BREINING und S. LYMBEROPOULOS

Abb. 6. Autoradiogramm einer Rattenleber 3 Tage nach Vereisung mit H 3-Thymidin markierten Hepatocyten in der Leb~rrandzone und reichlich markierten Fibroblasten im Granulationsgewebe. HE, Strippingfilm, 320 X . Fig. 6. H 3-thymidine-autoradiogramm of 3 days old liver-cryonecrosis with labelled hepatocytes in the marginal zone and labeled fibroblasts in the gran:llation tissue. HE, Stripping-film; X 320.

narbigen Abheilung der Kryonekrose gekommen. Dieser Wundheilungsablauf entspricht den resorptiven und reparativen V organgen einer parenchymatosen Infarktnekrose und den zellularen Reaktionen von mechanischen Lasionen parenchymatoser Organe (HELPAP und CREMER, 1970, 1972). Die bei uns nachgewiesene Auflockerung und Verfhissigungstendenz der Kryonekrose vom 5. postoperativen Versuchstag an ist auch von FRASER und GILL (1967) beobachtet worden. Die Autoren sahen zudem die Ausbildung sog. Pseudozysten sowie die Neigung zur Abschnurung des nekrotischen Parenchymbezirkes. Auch in anderen Organen, wie z.B. den Tonsillen, kommt es nach lokaler Vereisung zwischen dem 5. und 8. Versuchstag zur AbstoBung der nekrotischen Gewebsanteile (LENZ, 1971). Diese Reaktion entwickelt sich in der Leber unseres Erachtens offenbar jedoch nur dann, wenn Parenchymbezirke der Leber im Spitzenbereich geschadigt werden und das Kapselgefuge geschwunden ist. In den meisten Fallen werden die nekrotischen Parenchymbezirke durch erhebliche Kapselzellproliferationen mit entsprechender Faserneubildung vor dem AbstoBen bewahrt.

Rattenleber nach lokaler Gefrierung . 2.

175

Die histochemische Reaktion nach der Parenchymvereisung

Entsprechend den morphologischen Befunden sind auch histochemisch und biochemisch fruhzeitig nach der Vereisung des Leberparenchyms Veranderungen festzustellen. Die eigenen Untersuchungen haben gezeigt, daB die Laktatdehydrogenase- und die Succinodehydrogenase-Aktivitaten kurz nach der Vereisung in dem betroffenen Leberbezirk abnehmen und nach 12 Std. vollstandig geschwunden sind. Die Grenzen zum nicht gefrorenen Lebergewebe sind, ebenso wie bei der PAS-Reaktion bzw. bei der BestCarmin-Farbung, relativ scharf. Dieser enzymatische Verlust entspricht der sog. homogenen Nukleation nach ME RYMAN (1956, 1960, 1968). Ebenso wie nach mechanischen und hamodynamischen Lasionen der Leber steigen auch die Serumtransaminasen (SGOT und SGPT) massiv an, wobei der SGPT-Anstieg gegenuber dem SGOT-Verlauf etwas verzogert ist (STUCKE und C1ROTH, 1960). Nach 10-14 Tagen entsprechen die Serumtransaminasen den praoperativen Kontrollwerten (NEEL et al., 1971 a, b, c).

3. Die Proliferationsverhaltnisse in der durch Vereisung geschadigten Leber Die reparativ-proliferative Reaktion der Leberzellen bzw. die Hohe der Prozentsatze radioaktiv markierter, DNS-synthetisierender Hepatocyten und ihr zeitliches Maximum hangt von der Menge des geschadigten bzw. resezierten Lebergewebes ab (PODWYSSOZK1, 1886; GRUNDMANN und SEIDEL, 1969). Nach Zweidrittel-Teilhepatektomie beginnt die reparative DNSSynthese der Hepatocyten bei der Ratte nach 16-18 Std. Das Maximum des H 3-Index liegt zwischen 24 und 28 Std. nach der Teilhepatektomie (STOKKER, 1966). Nach Entfernung von nur 10-30% des Lebergewebes erfolgt ein vergleichsweise geringer Anstieg der H 3-Indices (HEINE und STOCKER, 1968; Ubersicht bei GRUNDMANN und SEIDEL, 1969). Bei unserem Vereisungsverfahren wurden nur sehr kleine Parenchymbezirke geschadigt. Wie zu erwarten, kommt es nicht, wie bei der Zweidrittel-Teilhepatektomie, zu einer massiven Steigerung des H 3-Markierungs index der Hepatocyten im Gesamtparenchym. Bis zum 14. Versuchstag ist jedoch gegenuber den Kontrolltieren bei gleicher tageszeitlicher Untersuchung eine geringfUgige Erhohung des Markierungsindex im Gesamtparenchym feststellbar. Bei mechanisch bedingten Leberlasionen haben wir einen derartigen Befund nicht erheben konnen (HELPAP und CREMER, 1970). Erst nach dem 30. Versuchstag entsprechen die proliferativen Werte wieder denjenigen der unbehandelten Tiere.

176 . B. HELPAP,

H. BREINING

und S.

LYMBEROPOULOS

In dem bis 200 fL breiten, nicht gefrorenen Randbezirk an der Kryonekrose beginnt jedoch eine deutliche Steigerung der reparativen DNSSynthese der Hepatocyten bereits 12 Std. nach der Schadigung. Das Maximum des H 3-Index liegt am 2. Versuchstag. Ein ahnlicher Zeitablaufwurde auch an den Tubulusepithelien der Rattenniere nach Punktion sowie nach mechanischer Lasion an der Mauseleber festgestellt (KRANZ et aI., 1968; HELPAP und CREMER, I97ob). Der Gipfel der Proliferation mesenchymaler Zellen im Granulationsgewebe und der Gallengangsepithelien in der Leberrandzone am 2. postoperativen Versuchstag entspricht den Werten nach Zweidrittel-Teilhepatektomie (GRISHAM, 1962; OEHLERT et aI., 1962; GRUNDMANN und SEIDEL, 1969)' Auch an Hautwunden von Ratten (BUCHNER, 1971) sowie im Granulationsgewebe der Leber nach Catgut-Implantation (HELPAP und CREMER, 1970) liegen die maximalen H 3-Markierungsindices der zu einem hohem Prozentsatz hamatogen abstammenden Wundfibroblasten (BUCHNER, 1971; HELPAP und CREMER, I972a, b) bzw. der Sternzellen am 2. postoperativen Versuchstag. DITSCHERLEIN und KRANZ (1969) sowie KRANZ et aI. (1968) sahen dagegen die hochsten Markierungsindices der Bindegewebszellen im Wundbereich der Rattenniere nach Punktion am 3. Versuchstag. 1m Gegensatz zu den Proliferationsverhaltnissen im Fremdkorpergranulationsgewebe in der Leber nach Catgut-Implantation haben sich im Granulations- bzw. Narbengewebe der Kryonekrose die proliferativen Aktivitaten nach 2-3 Wochen bereits weitgehend normalisiert (HELPAP und CREMER, 1970). AbschlieBend laBt sich also feststellen, daB eine lokale Vereisung an der Leber ahnlich wie mechanische Lasionen innerhalb weniger Stunden zu irreversiblen Zellschadigungen mit Ausfall der enzymatischen Leistungen fUhren. Die anschlieBende Wundheilung verlauft im Gegensatz zur Heilung von Parenchymwunden, die mit Nahtmaterial verschlossen werden, sehr rasch. Die "Kryonekrosen" in der Rattenleber werden leukocytar demarkiert und fiihren - und das ist charakteristisch fUr die lokalen thermischen und mechanischen Parenchymschadigungen - nur zu einer Proliferation der Hepatocyten im Leberwundrand. Eine allgemeine epitheliale Zellproliferation, wie nach groBen Gewebsverlusten (Teilhepatektomie), setzt nicht ein. Innerhalb von 14 Tagen werden die Kryonekrosen von einem Narbengewebe durchsetzt und sind nach 3-4 Wochen eben noch wahrnehmbar.

Zusammenfassung An 48 Rattenlebern wurden mit einem Kryoskalpell eine umschriebene Gewebsvereisung gesetzt (-I8oDC/30 Sek.) und autoradiographische Untersuchungen mit H3-

Rattenleber nach lokaler Gefrierung . 177 Thymidin zum zeitlichen Verlauf der reparativen Vorgange durchgefiihrt. Die Versuchszeiten betrugen 15 Min. bis 180 Tage. Bereits I Std. nach der Vereisung tritt eine Abblassung des Leberbezirkes auf. Die Leberzellen zeigen einen fast vollstandigen Glykogenverlust. Nach IZ - Z4 Std.liegt eine leukocytar demarkierte Kryonekrose ohne zelluliire LDH- oder SDH-Aktivitaten vor. Nach 5 Tagen begrenzt ein breiter Granulationsgewebssaum die Kryonekrose. Nach Z-3 Wochen sind lediglich noch kleine Narbenfelder erkennbar. Autoradiographisch findet sich nur in einer schmalen bis zoo f1. breiten Leberrandzone an der Nekrose eine Proliferation von Hepatocyten und Sternzellen mit einem Maximum ihrer Markierungsindices am 2. postoperativen Versuchstag. Zum gleichen Zeitpunkt sind auch die hochsten Prozentsatze markierter Fibroblasten im Granulationsgewebe nachweisbar. Nach 14 Tagen sind nur noch geringfiigig erhohte Indices erkennbar. Die Gewebsvereisung an der Leber fuhrt somic zu einer rasch abheilenden Nekrose, wobei der proliferativ-reparative Wundheilungsvorgang sich im Gegensatz zu den Vorgangen nach einer Teilhepatektomie nur auf einen schmalen Gewebsbezirk unmittelbar an der Vereisungszone beschrankt. Wir dank en Fraulein U. MERKEL, Frau K. SCHUURMANN und Frau E. ZOLLNER fUr die technische Assistenz.

Literatur BREINING, H., LYMBEROPOULOS, S. und LANGER, ST.: Beitr. Path. 142,71 (1970) BREINING, H., HELPAP, B. und LYMBEROPOULOS, S.: Dtsch. med. Wschr. 97,1519 (l97z) BUCHNER, TH.: Entziindungszellen im Blut und im G ewebe. Veroffentlichungen aus der morphologischen Pathologie 86. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1971) Buss, H. : Virchows Arch. Abt. B. Zellpath. J, ZZ9 (1969) CAHAN, W. G.: Fed. Proc. 2412, Supp!. Z4I (1965) COOPER, 1. S.: ]. Neurosurg. 10, 853 (I96z) COOPER, 1. S.: New Eng!. ]. Med. 268, 743 (1963) COOPER, 1. S.: Fed. Proc. 2412, Supp!. z37 (1965) COOPER, 1. S.: Cryothalamectomy-Surgical technique, Cryosurgery, p. 187-z06. C. C. Thomas Publishers, Springfield/Il!. (1968) COOPER, 1. S. and STELLAR, S.:]. Neurosurg. 20, 9ZI (1963) COOPER, 1. S. and HIROSE, T.: New Eng!.]. Med. 214, 15 (1966) DITSCHERLEIN, G. und KRANZ, D.: Exp. Path. J, 1 (1969) FISH,]. G., EDWARDS, R. L. and HOLDAY, W. ]. : ]. Trauma 7,456 (1967) FRASER, ]. and GILL, W.: Brit.]. Surg. 54, 770 (1967) GERLACH, ]. : Arztl. Mitt. (Koln) 6J, Z717 (1966) GERLACH, ]., MEINHARDT, D., PESCHEL, G., SPULER, H . und STUCKE, K.: Z. ges. expo Med. 140, z30 (1966) GRISHAM,]. W.: Cancer Res. 22,842 (196z) GRUNDMANN, E. und SEIDEL, H. ].: Die reparative Parenchymregeneration am Beispiel der Leber nach Teilhepatektomie. Hdb. aUg. Path. Bd. VI/z. Springer-Verlag, BerlinHeidelberg-New York (1969) HASCHEK, H.: Urologe 7, 103 (1968)

178 . B. HELPAP, H. BREINING und S. LYMBEROPOULOS HASS, G. M. and TAYLOR, C. B.: Arch. Path. 4!, 563 (1948) HEINE, W.-D. und STOCKER, E.: Klin. Wschr. 46, 395 (1968) HELPAP, B. und CREMER, H.: Virchows Arch. Abt. B. Zellpath. 6, 365 (1970) HELPAP, B. und CREMER, H.: Virchows Arch. Abt. B. Zellpath. 10, 134 (1972) H ELPAP, B. und CREMER, H.: Virchows Arch. Abt. B. Zellpath. 10, 145 (1972) HELPAP, B., BREINING, H. und LYMBEROPOULOS, S.: Naturwissenschaften !9, 369 (1972) HOCHBERG, K . und BLEYL, U.: Urologe 3,211 (1969) KRANZ, D ., DITSCHERLEIN, G. und KUNZ, J . : Beitr. path. Anat. 1 j1, 51 (1968) V. LED EN, H.: Cryosurgery of head and neck diseases. Cryosurgery, p. 296-308 . C. C. Thomas Publishers, Springfield, Ill. (1968) LENZ, H.: Arch. klin. expo Ohr.-, Nas.- u. Kehlk.-Heilk. 199, 523 (1971) LINCOFF, H. A.: The cryosurgical treatment of intraocular tumors. Cryosurgery, p. 275 - 287. C. C. THOMAS Publishers, Springfield, Ill. (1968) LUTZEYER, W., LYMBEROPOULOS, S., BREINING, H. und LANGER, ST.: Langenbecks Arch. klin. Chir. 322, 843 (1968) Ln.IBEROPOULOS, S.: Urologe 7, 224 (1968) LYMBEROPOULOS, S.: Kryochirurgie parenchymatoser Organe insbesondere der Niere in Experiment und Klinik. Habil.-Schrift, Aachen (1970) LYMBEROPOULOS, S., L UTZEYER, W. und BREINING, H.: Urologe 3, 156 (1969) MOORMANN, L. T .: Trans . Pacif. Cst oto-ophthal Soc. 43, 155 (1967) MELNICK, P. J.: Fed. Proc. 24/ 2, Suppl. 259 (1965) ME RYMAN, H. T.: Science 124, 515 (1956) MERYMAN, H. T.: The mechanisms of freezing in biological systems. In: A. S. PARKES and A. U. SMITH, Recent research in freezing and drying, p. 23-39. Blackwell Scientific Publications, Oxford (196o) MERYMAN, H. T.: Nature 213, 333 (1968) NEEL, H. B., KETCHAM, A. S. and HAMMOND, W. G.: Cancer 23, 12II (1971) NEEL, H. B., KETCHAM, A. S. and HAMMOND, W. G.: Ann. Surg. [74, 309 (1971) N EEL, H . B., KETCHA M, A. S., and HAMMOND, W. G.: Arch. Surg. [02,45 (1971) OEHLERT, W., HAMMERLlNG, W. und BUCHNER, F. : Beitr. path. Anat. 126,91 (1962) PEARSE, A. G. E.: Histochemistry. Theoretical and applied. Little, Brown & Co., Boston (1961 ) PENNELL, R. B.: Fed. Proc. 24/ 2, Suppl. 269 (1965) V. PODWYSSOZKI, W.: Beitr. path. Anat. Physiol. 1, 259 (1886) REB HUN, L. I.: Fed. Proc. 24/2, Suppl. 217 (1965) SIGEL, A. und SCHROTT, K. M.: Urologe 6, 190 (1967) SPANNHOF, L.: Einfiihrung in die Praxis der Histochemie. Gustav Fischer Verlag, Jena (19 6 7) STOCKER, E.: Verh. dtsch. Ges. Path. !O, 53 (1966) STOWELL, R. E ., YOUNG, D. E. ARNOLD, E. A., and TRUMP, B. F.: Fed. Proc. 24/ 2, Sup pI. 115 (1965) STUCKE, K.: Langenbecks Arch. klin. Chir. jI6, 914 (1966) STUCKE, K. und CIROTH, c.: Acta hepato-splenol. (Stuttg.) 14,326 (1967) STUCKE, K. und KAHLERT, F.: Acta hepato-splenol. (Stuttg.) 16, 3 II (1969) TAYLOR, A. c.: Proc. roy. Soc. B (London) 147,466 (1957) TRUMP, B. F., GOLDBLATT, P. J., GRIFFIN, C. c., WARAVDEKAR, V. S. and STOWELL, R. E.: Lab. Invest. 1 j, 967 (1964)

Rattenleber nach lokaler Gefrierung . 179 TRUMP, B. F., YOUNG, D. E., ARNOLD, E. A. and STOWELL, R. E.: Fed. Proc. 24/2, Suppl. 144 (1965) Prof. Dr. B. HELPAP, Pathologisches Institut, D-53 Bonn, Prof. Dr. H. BREINING, Abt. Pathologie der Med. Fakultat, D-5 I Aachen, Goethestr. 27-29 Priv.-Doz. Dr. S. LYMBEROPOULOS, Abt. Urologie der Med. Fakultat, D-5 I Aachen, Goethestr. 27-29