Sarkom 180: Wachstum und Regression Vergleichende Messungen mit dem Impuls- und Scanningzytophotometer sowie histologische, zytologische und autoradiographische Untersuchungen

Beitr. Path. Bd. 158,255-286 (1976) Aus dem Institut fur Medizin der Kernforschungsanlage Julich GmbH (Direktor: Professor Dr. L. E. Feinendegen) und dem Pathologischen Institut der Universitat Dusseldorf (Direktor: Professor Dr. H. Meessen)

Sarkom 180: Wachstum und Regression Vergleichende Messungen mit dem Impuls- und Scanningzytophotometer sowie histologische, zytologische und autoradiographische Untersuchungen Sarcoma 180: Growth and Regression Comparative Investigations Using Flow-through and Scanning Cytophotometers as Well as Histological, Cytological and Autoradiographic Techniques G. STECHER, H. BLOEMERTZ und P. PFITZER Mit 7 Abbildungen und 6 Tabellcn . Eingegangen am 30. Oktober 1975 . Angenommen in revidierter Form am 15. Marz 1976

Key 'Words: Sarcoma 180 - Growth and Regression - DNA Cytophotometry - 3H-TdR Autoradiography

Abstract Material and methods: The growth and the regression of the experimental tumor S ISO was investigated by volume measurements and by cytophotometric studies on 50 mice in each of a pilot and in the present main experiment. In addition, histological, cytological and cytokinetic examinations were performed. Results and Discussion: Beginning on day IS, a spontaneous regression of the tumor was found in 20% and 3S% of the animals, respectively. DNA-measurements were performed with a scanning-microspectrophotometer on tumor tissue imprints and tumor cell suspensions and were also carried out with a flow-through cytophotometer ICP on suspensions. DNA-histograms were plotted on days 4, 7, 12, IS, 20, 22, 26 and 29 after the transplantation. These revealed a constant position of the maxima at 2C for normal cells and at 4C and 8C for the tumor cells. In particular, by measuring a large total number of 4,968,000 nuclei with the ICP, distinct changes were found in the proportion of the

25 6

. G. Stecher, H . Bloemertz und P. Pfitzer

single nuclei classes during growth and spontaneous regression. This technique also enables a quantitative measurement to be made of the DNA of cell debris from necrosis. With growing tumos, the proportion of the tumor cells increased to a maximum of 65% on day 18 and decreased to 37% on day 29. The DNA of cell debris grew from 8% to 47%. The proportion of normal cells was only 100/0 to 15% in the final phases. In tumors with a spontaneous regression the proportion of the tumor cell nuclei was 200/0 on day 18 and IIO/o on day 29. The proportion of the DNA of cell debris was again about 45%. The proportion of normal nuclei was greatly increased to 45%. Histological and cytological evidence together with measurements of the areas of nuclei and incorporation of 3H-T dR confirmed that the normal cells, the number of which increased during spontaneous regression were cells of a fibrovascular granulation tissue. While the rate of the DNA-synthesis of growing tumors continously decreased with age there was also a rapid decrease of the labelling index of spontaneously regressing tumors between days 12 and 18. In the final phase only the nuclei of the granulation tissue were labelled.

Das Verhalten von Tumorzellpopulationen transplantierter Tiertumoren laBt sich mit verschiedenen Methoden untersuchen bzw. verfolgen. Eine Tumorzellpopulation kann z. B. durch den Karyotop, den DNA-Gehalt der Kerne oder zellkinetisch mit Hilfe markierter DNA-Bausteine charakterisiert werden. Besonderes Interesse gilt dabei der Beeinflussung des Wachstums durch auBere Faktoren wie ionisierende Strahlen oder chemische Substanzen. In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse einer Untersuchung vorgelegt, die sich mit dem DNA-Verteilungsmuster der soliden Form des Experimentaltumors S 180 in verschiedenen Stadien des unbeeinfluBten Wachtums und der Spontanregression befaBte. Gepruft wurde speziell die Frage, ob die Volumenzu- und -abnahme des Tumors mit einer Anderung der DNA-Werte einhergeht. Fur die zytophotometrischen Bestimmungen stehen zwei Systeme zur Verfugung, namlich Scanningzytophotometer und DurchfluBzytophotometer. Beide Systeme weisen sich weitgehend kompensierende Vor- und Nachteile auf (Stohr et aI., 1973; Pfitzer, 1975). Die von uns mit beiden Methoden gewonnenen Ergebnisse wurden verglichen und gepriift, inwieweit sie sich entsprechen oder ggf. erganzen. Zusatzlich wurden zellkinetische sowie histologische und zytologische Untersuchungen durchgefiihrt. Das Crocker-Sarkom 180 entstand 19 14 im Axillarbereich einer wei Ben Maus als Karzinom, ohne daB ein epithelialer Primartumor registriert worden ware. Ab 19 I 9 wurde es als pleomorphes Sarkom beschrieben. Der Nachweis von epithelialen Charakteristika wie zapfenformigem Wachstum und Desmosomen (Zuckerberg, 1972, 1973; Sohdi u. Aggarwal, 1974) spricht gegen seine Einstufung als Sarkom. Die Zuordnung zur Gruppe der nichtklassifizierten Tumoren, wie sie die Autoren des Armed Forces In-

Sarkom 180 . 257

stitute of Pathology vornahmen (Stewart et al., 1959) erscheint somit vorerst als die beste Lasung. In der vorliegenden Arbeit wurde jedoch der Verstandlichkeit wegen die eingefiihrte Bezeichnung S 180 beibehalten.

Material und Methode I.

Versuchstiere

Fur die Untersuchungen verwendeten wir flir einen Vor- und den Hauptversuch je 50 weibliche weiGe Mause des Verkaufsstammes NMRI (Versuchstierfarm Hartmut VoG, Tuttlingen). Die Tiere waren 8 bis 12 Wochen alt und wogen 20 bis 25 g. Sie waren in Sechsergruppen aufgeteilt und wurden mit Wasser und Futter (Altromin) ad libitum ernahrt. 2.

Experimentaltumor

Ais Experimentaltumor verwendeten wir die solide Form des S 180. Den Tumor verdanken wir der Firma Grunenthal, Stolberg. Er wird seit etwa zwei Jahren im Institut fur Medizin der Kernforschungsanlage Julich serientransplantiert. 3. Transplantation

Zur Transplantation wurden 7 Tage alte Tumoren verwendet. Wir injizierten pro Tier etwa 500000 in Fischers Medium suspendierte Tumorzellen subkutan in den rechten hinteren Oberschenkel.

4. Volumenmessungen Das Wachstum der Tumoren wurde durch regelmaGige Volumenmessungen verfolgt. Mit der Schublehre wurden in drei Ebenen die Durchmesser (D) des Tumors gemessen und daraus das Tumorvolumen nach folgender von Porschen und Feinendegen (1969) angegebenen Beziehung ermittelt: V = 0,525 X Dl X D2 X D3 - V gesundes Bein. Das Volumen des gesunden Beins wurde konstant mit 60 mm3 angesetzt. Die Messungen wurden am 4., 7., 12., 18., 20., 22., 26. und 29. Tag durchgefuhrt. Aus den Einzelvolumina der Tumoren wurde jeweils ein Mittelwert errechnet und drei Tiere getotet, deren Tumorvolumina den Mittelwerten am nachsten kamen. Ab dem 18. Tag lieGen sich zwei Gruppen von Tieren unterscheiden, wobei in der einen das Tumorvolumen weiterhin zunahm, wahrend es in der anderen allmahlich zuruckging. Am 18., 20., 22., 26. und 29. Tag nach Transplantation faGten wir daher die Tumorvolumina in je zwei Gruppen zusammen und toteten drei Tiere pro Gruppe.

5. 3H-TdR-Markierung Jedes Tier bekam 40 Minuten vor der Totung 40 !-lCi 3H-TdR in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlosung in die Schwanzvene injiziert. Das zur Markierung benutzte 3H-TdR hatte eine spezifische Aktivitat von 20 bis 30 Ci/mMol (Radiochemical Center Amersham, England). 17 Beitr. Path. Bd. 158

258 . G. Stecher, H. Bloemertz und P. Pfitzer 6. Praparation der Tumoren

Die Tumoren der getoteten Tiere wurden aus ihren Kapseln herausprapariert. Wir hetupften mit der Schnittflache eines jeden Einzeltumors mehrere Ohjekttrager. Anschliefiend mischten wir annahernd gleich grofle Gewehsanteile aller drei Tumoren, zerkleinerten das Gewehe mit einer Schere so Fein wie moglich und gahen I ml Fischers Medium hinzu. Dieses Gemisch wurde durch ein Drahtsieh mit einer Maschenweite von 0,25 mm filtriert und der Oherstand verworfen. Von der Zellsuspension wurden einige Tropfen auf Objekttrager gebracht. Der Rest der Suspension wurde mit Ioo%igem Alkohol im Verhaltnis I : 10 versetzt und zu impulszytophotometrischen Untersuchungen verwandt. Material fur histologische Schnitte wurde in ublicher Weise in Formalin fixiert und mit Hamotoxylin-Eosin, Elastica van Gieson oder nach Feulgen gefarbt. 7. Zytophotometrie 7. I Scanningszytophometrie

Die Tupfpraparate und die Praparate von Suspensionen wurden kurze Zeit luftgetrocknet, 30 Minuten in absolutem Methanol fixiert, in der uhlichen Weise mit der Feulgen-Reaktion hei Kurzzeithydrolyse gefarbt und in Eukitt (nD = 1,49) eingehettet. In diesen Praparaten bestimmten wir mit dem Scanningzytophotometer UMSP I (ZEISS) den DNA-Gehalt der einzelnen Tumorzellkerne. Registriert wurde durch den digitalen Schnellmeflsatz XD 50 die Gesamtextinktion in relativen Arbeitseinheiten (AE) und die Flache der Kerne durch die Zahl der Meflfelder pro Kern. Gemessen wurde bei einer Wellenlange von 570 nm, der Dampfung 2 und dem Schwellenwert von 0,02. Der Durchmesser der Meflblendc betrug I ~lm, ein Me£feld entsprach somit beim maanderformigen Messen der Kernflache I [lm2; Optik: Ultrafluar IOOir,25, Glyzerinimmersion. Ein Histogramm entspricht 50 Kernen. Als diploider Standard 2C wurde ein Wert angenommen, der 10% uher dem mittleren Extinktionswert von 10 Lymphozytenkernen lag. 7.2 Impulszytophotometrie Verwandt wurde das Gerat ICP I I Phywe. Die in Alkohol fixierten Tumorzellen wurden zweimal in physiologischer Kochsalzlosung gewaschen und eine Stunde mit 1%iger RNase-Losung hei 37° C hehandelt. Anschlieflend wurde das Zytoplasma durch eine I5minutige Behandlung mit Pepsin (MERCK I 000 IE) bei 37° C verdaut. Die Farbung erfolgte mit Ethidiumbromid bei Zimmertemperatur. Vor der Messung wurde die Zellsuspension durch ein Netz mit 70 ftm Maschenweite filtriert und 10 Sekunden mit Ultraschall behandelt, urn Verklumpungen zu IOsen. Verwandt wurden als Erregungsfilter BG 12 und BG 38, als Sperrfilter OG 550. In Vorversuchen wurden von 6 Proben 2 543 807 Impulse registriert, die Zellkernen oder Kerntrlimmern entsprechen. Von den 15 Prohen des Hauptversuchs wurden 2424213 Impulse aufgezeichnet. Die vom Synchronschreiher geschriebenen Histogramme des Hauptversuchs wurden planimetriert. Dabei ergaben sich Flachenwene von 2072900 Impulsen gegenuher den vom Zahlwerk registrierten 2424213 Impulsen. Diese Differenz erklart sich durch die Stufenschaltung im Vielkanalanalysator. Da die Differenz von 351 3I 3 Impulsen oder 14,5% der Messungen aile heteiligten Kanale hetrifft, mu~ sie den auf viele Kanale entfallenden Tumoranteil wesentlich starker belasten als die normalen Zellen, die nur in wenigen Kanalen registriert werden. Es wurde daher eine Flachenkorrektur in der Form vorgenommen, dafl fur jedes Histogramm das Defizit

Sarkom 180 . 259 gleichmaBig auf die jeweils benutzten Kanale aufgeteilt wurde. Das Resultat ergab 2 406 900 Impulse und somit ein Defizit von nur 0,7010.

8. Autoradiographie Von den nach Feulgen gefarbten Praparaten wurden Autoradiogramme hergestellt. Wir verwendeten dabei die "Kodak" autoradiographischen Stripping-Filme AR 10. Die Praparate wurden 28 Tage bei 4° C exponiert. Entwickelt wurde mit "Kodak" D 19 und fixiert mit "Kodak" Unifix. Der Markierungsindex wurde an 500 bis I 000 Kernen bestimmt. Dabei wurden als markiert die Kerne mit 6 und mehr Silberkornern gewertet.

Ergebnisse I.

Volumenmessungen

Aus den Volumenmessungen ergab sich die in Abbildung I dargestellte Volumenwachtums- und Regressionskurve. In dieser Abbildung sind die

5000

................. 9. .....

M100 0

A HAUPTVERSUCH C PORSCHEN

E

~

w

B VORVERSUCH

E

C)

« .!: t:

+

FEINENDEGEN

z 500

'u

N

w

Vl

~

:>

"" "

J

0

0

~

C)

A

100

:>

10

...J Q. Q.

0

0

0:

:>

~

Z

A

D

>

a:

...... ....... ..............

UJ

50

5 >

10~~~-L.-~--r-~~--~~--r-~~--~~--~~--~

2

10

14

18

22

TAGE NACH TRANS PLANTATION

26

30

Abb.1. S 180: Volumenwachstums- und Regressionskurven sowie Tumorverdoppelungszeiten nach verschiedenen Autoren. Wachstumskurven: A Hauptversuch, B Vorversuch, C Porschen und Feinendegen (1969), D Tisljar und Kronenberger (1973); Regressionskurven: AO Hauptversuch, DO Tisljar und Kronenberger (1973); Tumorverdoppelungszeiten (T2): A' Hauptversuch, C' Porschen und Feinendegen (1969). Fig.

1.

Tumor growth (A, B, C, D), tumor doubling time T2 (A', CO) and tumor regres-

sion (A 0, DO) as function of time. A present investigation and B pilot study, C Porschen und Feinendegen (1969), D Tisljar und Kronenberger (1973).

260 .

G. Stecher, H . Bloemerrz und P. Pfitzer

Wachstumskurven un seres Vor- und Hauptversuchs den Werten gegeniibergestellt, die von Porschen und Feinendegen 1969 und von Tisljar und Kronenberger 1973 in unserem Institut an dem gleichen Tumor ermittelt worden waren. Die sogenannte Tumorverdopplungszeit kann aus der Wachstumskurve entnommen werden. Sie betragt am 4. Tag nach der Transplantation 1,8 Tage, am 7. Tag 4 Tage und steigt weiter an, bis sie schlieBlich ab dem 20. Tag groBer wird als 10 Tage. Wie Tabelle I zeigt, ist bei den Tumoren mit Spontanregression das Volumen am 18. Tag auf etwa die Halfte des Wertes yom 12. Tag zuriickgegangen und ist am 29. Tag wieder ebenso groB wie am 4. Tag nach der Transplantation. Am Versuchsende waren vier Tiere vorhanden, bei denen sich der Tumor vollsrandig zuriickgebildet hatte und auch bei weiterer Beobachtung iiber einen Zeitraum von zwei Monaten nicht erneut wuchs. Dabei waren keine Sequestrierungen durch die Haut nach Ulzeration des Tumors aufgetreten. Bei zwei Tieren hatte das Tumorvolumen nach anfanglicher Riickbildung erneut zugenommen. Eine Spontanregression der Tumoren wurde bei insgesamt 38% der Tiere beobachtet.

Tabelle I. Mittlere Tumorvolumina von S ISO in den einzelnen Stadien des stetigen Wachstums und der Spontanregression Table I. Mean tumor volume of S ISO at various stages of growth and regression after transplantation Tag nach Transplantation

Mittlere Tumorvolumina (mm 3) Tumoren ohne Spontanriitkbildung

Tumoren mit Spontanriitkbildung

4·

7·

730

12 .

1600

IS.

2800

20.

35 00

600

22 . 26.

7 20

5 100 6200

Sarkom 2.

180 . 261

Scanningzytophotometrie

2.1 Histogramme der Tumoren ohne Ruckbildung (Abb. 2) Der DNA-Gehalt der Kerne verteilte sich in allen Stadien des Tumorwachstums zwischen 2C und 8C, nur vereinzelt wurden Kerne mit hoheren DNA-Werten gefunden. Der Hauptanteil der Kerne lag mit 80% bis 100% zwischen 4C und sc. 1m 2C-Bereich fanden sich zwischen 0% und 20% der Kerne. Ziwschen 2C und 4C konnten entweder keine oder nur vereinzelte Kerne registiert werden. Dabei waren sowohl in den Tupftpraparaten als auch in den Suspensionsausstrichen breite Gipfel bei 4C und SC zu erkennen, so z. B. im Tupfpraparat eines 4 Tage alten Tumors und in der Suspension 20 Tage alter Tumoren. In einem Teil der Falle zeigten die Histogramme nur angedeutete Gipfel, bzw. nur einen Gipfel bei 4C mit anschlid~endem Plateau bis SC, wie z. B. bei der Suspension IS Tage alter Tumoren. Derartige Profile fanden wir auch bei den Tumoren, die nach anfanglicher Spontanregression erneut gewachsen waren. Ein Teil der Profile zeigte uberhaupt keine Gipfel, die Kerne verteilten sich in einem Plateau zwischen 4C und sc. Sie wurden sowohl in Tupfpraparaten als auch in Suspensionsausstrichen - z. B. am 26. Tag - gefunden. Wenn Gipfel in den Profilen vorhanden waren, so lagen sie meist genau bei 4C und Sc. In einigen Fallen waren sie etwas nach rechts oder links, also in den hyper- oder hypotetraploiden bzw. hyper- oder hypooktoploiden Bereich verschoben. Die Histogramme der Tumoren mit zunehmendem Volumen lid~en keine Unterschiede zwischen den fruhen und den spaten Stadien des Tumorwachstums erkennen. Eine einheitliche Veranderung im Verlauf des Tumorwachstums fand nicht statt. Die Profile von Suspensionen und Tupfpraparaten derselben Tumoren zeigten haufig Unterschiede in bezug auf Hohe und Breite der Gipfel und in der Zahl und Lage der Zwischenwerte. Eine vollstandige Dbereinstimmung im DNA-Verteilungsmuster wurde nur selten beobachtet. Wenn die DNA-Werte samtlicher Suspensionen und aller Tupfpraparate in je einem Profil zusammengefaBt wurden (Abb. 3), ergab sich, daB die 2C-Kerne in beiden Profilen als schmale Gipfel von den hoheren DNA-Werten zu trennen waren. In dem Profil der Suspensionen kamen zwei Gipfel im Bereich von 4C und SC zur Darstellung, wahrend das Profil der Tupfpraparate einen Gipfel bei 4C mit anschlieBendem Plateau und stufenformigem Abfall der Werte bei SC zeigte. 2.2 Histogramme der Tumoren mit Spontanregression (Abb. 2) Wie bereits beschrieben, waren am 18. Tag nach der Transplantation zwei Gruppen von Tumoren zu unterscheiden, und auch beim Vergleich

262 .

G. Stecher, H. Bloemertz und P . Pfitzer

il.J IJI..t.

T

nD• 2e

..l....IJ~ •

S

1.1• 1.1 ...

T

~n

n

5[

Un 2e

4e

n

5[ n

5[

2e

8e AE

4e

8e AE

4c

8e

AE

n

5[ 2e

....

7. TAG

....

7. TAG

.... 12. TAG

AE

8e

4. TAG

S

...II......J. •.. 4e

....

n

S

n

5f

n ••

2e

~. . 4e

III

.1.....1

.... 18 . TAG ~

AE

8e

lO r

n

"I . .!. . I_~. 2c

4e

R.. l. 2e

4e

S n •••

8e

AE

n

s .... 20. TAG

8e AE

~

"I r\• J. 2e

4e

s WII •

•

8e AE

lL n

S

n

5[

S

DD .... 11...&. ....

2e

....26.TAG~

8e AE

4e

2e

4c

8e AE

n

ll_

T

n

5[

.""1. h ...

[In 2e 4e

8e

T ... 26. TAG

AE

~

2e

4e

AE

n

20

n

5[

[] 2e

.h........... 4c

8e AE

S

S ....

29.TAG~

Abb.2

2e

4e

8e AE

Sarkom 180 . 26 3

der Histogramme fiel ein deutlicher Unterschied auf. Das DNA-Profil der Suspension von Tumoren, bei denen das Volumen zuriickgegangen war, zeigte einen ausgepragten 2C-Gipfel, einen angedeuteten Gipfel bei 4C und vereinzelte Zwischenwerte bis in den oktoploiden Bereich. 1m weiteren Verlauf des Volumenriickgangs nahm der Gipfel bei 2C mit der einen Ausnahme der 20 Tage alten Tumoren zu. Die Basis des 2C-Gipfels war bei den 22 und 26 Tage alten Tumoren noch breit und verschmalerte sich bei

20

n

35

Abb.3. Tumoren ohne Spontanregression. Oben: DNA-Histogramm von 9 Suspensionen, unten: DNA-Histogramm von 19 Tupfpraparaten. Aile iibrigen Details entsprechen der Legende von Abbildung 2. Fig. 3. Non regressing tumors. Top: Compiled DNA histogram of 9 tumor cell suspensions, bottom: Compiled DNA histogram of 19 tumor tissue imprints (details see fig. 2).

Abb.2. Scanningzytophotometrie. Links: DNA-Histogramme der Tumoren ohne ~pon­ tanregression, rechts: DNA-Histogramme der Tumoren mit Spontanregression. h Anzahl der Zellkerne, AE = Arbeitseinheiten (relative DNA-Mengen), 2C, 4C, 8C = DNA-Gehalt, der einem di-, tetra-, oktoploiden Chromosomensatz entspricht, S = Suspensionsausstrich, T = Tupfpraparat. WeiGe DNA-Werte entsprechen diploiden Kernen normaler Zellen. Schwarze DNA-Werte entsprechen Tumorzellkernen. Fig. 2. Scanning cytophotometry. Left: DNA histograms of non regressing tumors, right: DNA histograms of regressing tumors. n = number of nuclei, AE = arbitrary unit of relative DNA content, 2C, 4C 8C = DNA content corresponding to a diploid, tetraploid and octoploid chromosome set, S = suspension of tumor cells, T = imprint of tumor tissue. White DNA values correspond to diploid nuclei of normal cells. Black DNA values correspond to nuclei of tumor cells.

.. TAG

12 lA C 230 4 191 MI'UlS f

'8 TA G

6918S 1.. .. U15E

20 T AO

20 'AG

13' 652 I M'U lS(

2ft lA G

71 681 1M rtJlSf

19016 1 I M PULSE

29 'Ae

19 f AG

3883 1 . M'U l $E

209:1811 IM'UlS(

120 !CANAL

Abb·4

.0

60

80

100

120 Ji:ANAl

Sarkom

180 .

265

den 29 Tage alten Tumoren. Kerne mit hoheren DNA-Werten wurden nur noch ganz vereinzelt gefunden. Die Ergebnisse der Tupfpraparatmessungen entsprachen den zugehorigen Suspensionen, d. h., mit zunehmender Verkleinerung des Tumorvolumens zeigte sich eine Konzentration der Kerne im 2C-Bereich bei fast volligem Fehlen von hoheren DNA-Werten. 3. Impulszytophotometrie

3.1 Histogramme der Tumoren ohne Spontanregression (Abb. 4) Bei dieser Gruppe von Tumoren waren in allen Stadien des Wachstums vier Gipfel vorhanden, die sich stets an der gleichen Stelle befanden, jedoch in den verschiedenen Stadien des Tumorwachstums verschiedene Hohen hatten. Der erste Gipfel zeigt den Anteil an zerfallenden Kernen, also den DNA-Schutt, der zweite schlanke Gipfel den Anteil an 2C-Kernen und der dritte und vierte Gipfel entsprechen den G r und Gz-Werten des Tumors. 3.2 Histogramme der Tumoren mit Spontanregression (Abb. 4) Bei dieser Gruppe Hillt ab dem 18. Tag der Gipfel bei 8C weg, es sind in allen Stadien des Volumenriickgangs nur die drei Gipfel des DNASchutts, der 2C-Gipfel und der 4C-Gipfel in unterschiedlicher Hohe vorhanden. Der Gipfel bei 2C ist stets sehr hoch, wahrend im DNA-Profil der 29 Tage alten Tumoren ein 4C-Gipfel kaum noch zu erkennen ist. 3.3 Prozentuale Anteile von DNA-Schutt, 2C-Kernen und 4C- und

8C-Tumorkernen Aus den Flachenwerten unter den Gipfeln lassen sich die prozentualen Anteile des DNA-Schutts, der 2C-Kerne und der Tumorzellkerne errechnen, indem die Kurven verlangert werden, urn Oberlagerungen auszugleichen. Diese entsprechend den in Material und Methode dargelegten Oberlegungen korrigierten Werte gibt Tabelle 2 wieder. Die graphische Darstellung der Werte (Abb. 5) zeigt, daB der Anteil an DNA-Schutt bei den Tumoren ohne Spontanregression im Verlaufe des Tumorwachstums von 8% bis auf 47% ansteigt. Eine Ausnahme bilden die vier Tage alten Tumoren mit einem relativ hohen Anteil von 24%. Umgekehrt sinkt der Anteil

Abb. 4. Impulszytophotometrie. Links: DNA-Histogramme der Tumoren ohne Spontanregrcssion, reclns: DNA-Histogramme der Tumoren mit Spontanregression. Fig. 4. Flow-through-cytophotometry. Left: DNA histograms of non regressing tumors, right: DNA histograms of regressing tumors.

266 . G. Stecher, H . Bloemertz und P . Pfitzer Tabelle 2. Tumorvolumen und prozentuale Anteile von DNA-Schutt, 2C-Kernen und 4C- und 8C-Tumorkernen der Tumoren ohne (links) und mit Spontanriickbildung (rechts). Prozentuale Anteile pro Zeitpunkt berechnet aus den Flachenwerten des ICP-Histogramms der aus jeweils drei Tumoren gepoolten Suspension Table 2. Tumor volume and ~/o DNA of cell debris, 2C nuclei and tumor cell nuclei (4C and 8C) of non regressing tumors (left) and regressing tumors (right) Tumoren ohne Spontanregression

Tag nachli Transplant.

,j 1/

II

Tumorvol. (mm3)

DNASchutt (U/ o)

4·

lC-

Tumoren mit Spontanregression

Kerne

Tumorkerne

(0/0)

(u/ o)

23,6

7·

i

J 2.

,I

1600

il

2800

1

(0/0)

I (0/0)

(~/o)

56,6

13,8

149,2

, 11,2

II

I:

55>3

22,8

I 84 0

j,

'I

II

20.

3 500

32,0

22 .

3900

40 ,8

26.

5 100

4 2 ,6

29.

, Tumor2CKerne Kerne

DNASchutt

Ii,!

8,3

73 0

Tumorvol. (mm 3)

20

I 7 I 600

II 34 0

12,1

6200

II 24 0

,

I

- "." ' - ---

- " ' _ _ _ _ _' 0

%

~

~

TUMOR

20

~ ~

TUMOR

4

7

12

1a

20

22

26

29

18

20

22

26

29 TAGE

Abb.5. Prozentuale Verteilung von DNA-Schutt, 2C-Kernen und 4C- und 8C-Tumorkernen, links: der Tumoren ohne Spontanregression, rechts: der Tumoren mit Spontanregression (siehe Legende zu Tab. 2). Fig. 5. Per cent DNA of cell debris, 2C nuclei and tumor cell nuclei (4C and 8C), left: non regressing tumors, right: regressing tumors.

Sarkom 180 .

26 7

an 2C-Kernen von 47010 am 4. Tag nach der Transplantation in den spat en Stadien auf etwa 10010 bis 15%' Der Anteil an Tumorkernen steigt dagegen vom 4. Tag bis zum 18. Tag auf etwa das Doppelte, namlich 65% an, und geht dann wieder bis zum 29. Tag auf 37% zuruck. Bei den Tumoren mit Spontanregression (Abb. 5) bleibt der DNASchutt mit etwa 30% bis 40% annahernd gleich hoch, eine Ausnahme bilden lediglich die 22 Tage alten Tumoren mit einem Anteil von nur 12%. Der prozentuale Anteil der 2C-Kerne in 18 Tage alten Tumoren ist mit 45% doppelt so groB wie am 12. Tag und beansprucht im Verlauf der Volumenabnahme stets den groBten Teil der gesamten DNA. Der Anteil der Tumorzellkerne ist am 18. Tag im Vergleich zum 12. Tag urn mehr als die Hilfte auf etwa 20% abgesunken und betragt bei den 29 Tage alten Tumoren nur noch 11 % • 3.4 Histogramme der Tumoren, deren Volumina nach anfanglicher Regression erneut zugenommen hatten Die Tumorvolumina dieser Tiere, die am 35 . bzw. am 40. Tag getotet wurden, entsprachen annahernd dem Volumen der 12 Tage alten Tumoren. Dasselbe gilt fUr die ICP-Histogramme und damit die prozentualen Anteile von DNA-Schutt, 2C-Kernen und Tumorkernen (Tab. 3).

4. Kernflachen in Beziehung zum DNA-Gehalt der Kerne Yom 4. Tag bis zum 29. Tag nach der Transplantation lagen die Flachen der Kerne mit einem DNA-Gehalt zwischen 4C und 8C stets im gleichen Bereich von 80 ~tm2 bis 250 f.!m 2 • Die uberwiegend in den Tumoren mit Regression registrierten 2C-Kerne hatten eine Flache von 40 f.!m 2 bis 70 f.!m 2 •

Tabelle 3. Prozentuale Anteile von DNA-Schutt, 2C-Kernen und Tumorkernen der Tumoren, deren Volumina nach anfanglicher Regression erneut zugenommen hatten im Vergleich zu den 12 Tage alten Tumoren Table 3. Tumor regression followed by tumor growth. Tumors at day 35 and 40 compared with tumors at day 12 with continuous growth - - - - - - . - - - - --

Tage nach Transplant.

Volumen mm 3

12.

1600

21,9

22,8

35·

2000

26,7

21,5

2000

22,2

20,0

DNA-Schutt Ofo 2C-Kerne Ofo

-- - - - - -

Tumorkerne °/0

- - - -- - --- - - --

51,8

268 . G. Stecher, H. Bloemertz und P. Pfitzer

Die FHichen der Lymphozyten betrugen 20 flm 2 bis 30 flm 2• 1m Bereich zwischen 4C und SC der Tumoren ohne Spontanregression bestand zwischen DNA-Gehalt und Flache der Kerne, wie anhand der Regressionsgeraden festgestellt wurde, eine lineare Abhangigkeit. Der Steigungskoeffizient der Regressionsgeraden L Flache bzw. Volumen/L DNA war konstant 0,7 wahrend aller Phasen des Tumorwachstums, d. h. die Zunahme der Flache pro Einheit DNA betrug 0,7 Flachen/Einheit. 5. Zellkinetische Untersuchungen

Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, betrug der Markierungsindex 38,6010 am 4. Tag nach der Transplantation, II,3% am IS. Tag und 1,6010 am 29. Tag. In den Tumoren mit Spontanregression dagegen wurden am I S. Tag nur noch 5,S% markierte Kerne registriert. Am 29. Tag fand sich mit 2,6010 annahernd der gleiche Prozentsatz markierter Kerne wie in den Tumoren ohne Spontanregression. In beiden Gruppen zeigte sich teils eine gute Obereinstimmung, teils eine geringe Abweichung zwischen dem Markierungs-

Tabelle 4. 3H-TdR Markierungsindex (%) von Suspensionsausstrichen und Tupfpdiparaten der Tumoren ohne Spontanregression und der Tumoren mit Spontanregression Table 4. 3H-TdR labelling index (0/0) of tumor cell suspensions (S) and tumor tissue imprints (T) of non regressing tumors (left) and regressing tumors (right) Tumoren ohne Spontanregrcssion

I

Tag Susnach IpenT rans- I sion plant. I I ,S

einzeln

,T1 ..

_

....

36,0

12.

I~--~I--

TupfpraparateJ~~~:el- !~~~ I

-

7.

Tumoren mit Spontanregression

:

_

..

IT~ _---_.

I 1

__ ... -

Mittel-l wert

iT;)

SlOn

S 37,6

43,0

33 ,7

Tupfprapara~ ~~~:el-

+T

1

38 ,6

1

21 ,8

einzeln

Mittelwert

S

I

22,0

26,0

22,J

1

13,6

1

9,0

1

13,0

29,6

27,0

1

12 ,8

20,3

120,J

I

!23,1

17 ,5

1,7

6,8

13,6

I4,J

7,0

1

0,8

1,6

°

°

5,8

IS, 5 1°, 12 5 I

. ~,63 j

Sarkom

26 9

180 •

•\ • b

•

c

Abb. 6, I a. Frisches Tumorgewebe mit angrenzendem Granulationsgewebe Tag. HE; X 800. Fig. 6, I a. Tumor with granulation tissue on day 12. HE; X 800.

am

12.

Abb.6, I b. Infiltration von Tumorgewebe zwischen Muskelbiindeln am 7. Tag. HE; X 300. Fig. 6, I b. Infiltrating tumor on day 7. HE; X 300. Abb. 6,

I

c.

Mitosen (t) im infiltrativ wachsenden Tumorgewebe am 7. Tag. Feulgen;

X 800.

Fig. 6,

I

c.

Mitoses (t) in infiltrating tumor tissue on day 7. Feulgen; X

800.

270 .

G. Stemer, H . Bloemertz und P. Pfitzer

index der Suspension und dem Mittelwert der zugehorigen Tupfpraparate. In den einzelnen Tupfpraparaten gleichaltriger Tumoren schwankte der Markierungsindex - wie z. B. am 7. Tag - allerdings betrachtlich. Der Anteil proliferierender Zellen, d. h. die Growth Fraction, wurde nach Frindel et al. (1967) aus dem Verhaltnis von gemessenem zu errechnetem Markierungsindex bestimmt, wobei sich der errechnete Markierungsindex aus dem Verhaltnis von Synthesedauer zu Gesamtzyklusdauer ergab. Die Zykluszeiten des S 180 am 5. und 8. Tag sind aus den Untersuchungen von Simpson-Herren et al. (1968) und Simpson-Herren und Lloyd (1970) bekannt. Nach diesen Autoren betragen die Synthesedauer und die Gesamtzyklusdauer am 5. Tag 8 Stunden und 14 Stunden bzw. am 8. Tag 14 Stunden und 26 Stunden. Vnter Beriicksichtigung dieser Daten und der von uns am 4. und 7. Tag festgestellten Markierungsindizes betrug die Growth Fraction zu diesen beiden Zeitpunkten jeweils 68% und 41%.

on day

12.

HE; X30o.

Sarkom

180 . 271

Abb. 6, 2 b. Tumorgewebe zwischen ausgedehnten netzformigen Nekrosen am HE; X 100. Fig. 6, 2 b. Tumor with reticular necrotic areas on day 26. HE; X 100.

26.

Tag.

6. Histologische Befunde Histologische Kontrollen wurden an allen im Versuchsplan aufgeflihrten Terminen vorgenommen. 4 Tage nach der Transplantation finden sich zwischen den Muskelblindeln nur kleine Verbande von Tumorzellen. Nach 7 Tagen liegen groBe Komplexe eines Tumorgewebes mit stark anisometrischen, blasigen Zellkernen, groBen Nukleolen und segelformigem, relativ hellem Zytoplasma vor (Abb. 6, I a). Das Gewebe wachst infiltrativ zwischen die verschmalerten Muskelblindel ein (Abb. 6, I b). lmmer wieder finden sich normale und atypische Mitosen (Abb. 6, I c). Auffallend ist in den Randgebieten des Tumors eine granulomatose Reaktion des interstitiellen Bindegewebes mit einer schiitteren Infiltration von Rundzellen (Abb. 6, I a). Diese Reaktion tritt nicht nur im Interstitium der Muskulatur, sondern auch im Grenzbereich zum umgebenden Fett- und Bindegewebe auf. Sie ist sehr unterschiedlich ausgepragt und fehlt an vielen Stell en vollig. Vom 7. Tag an liegen die Zellen des Tumorgewebes in 2 Formen vor (Abb. 6, 2 a). Neben unterschiedlich groBen Komplexen der oben beschriebenen Form treten abgerundete Tumorzellen mit kleineren, meist chromatindichten, pyknotischen Zellkernen auf. In diesen Zellen finden sich je-

272 .

G. Stecher, H. Bloemertz und P. Pfitzer

Abb. 6, 2 c. Pyknotische Kerne mit zusammengesinterten Feulgen-positiven Massen am 18. Tag. HE; X 800. Fig. 6, 2 c. Pyknotic nuclei and Feulgen-stained masses on day 18. HE; X 800.

doch gelegentlich noch Mitosen (Abb. 6, 2 a). Spater treten auEerdem Nekrosen in netzformiger Anordnung auf, in denen die Zellkerne nicht mehr erkennbar sind (Abb. 6, 2 b). Die Tumotzellen der dazwischen liegenden, noch erhaltenen Bezirke entsprechen dem abgerundeten Typ. Ferner werden gelegentlich diffuse netzige Feulgen-positive Strukturen in den Nekrosen beobachtet, die zusammensintern (Abb. 6, 2 c). Nur selten lassen sich Stellen ausfindig machen, die eine schiittere Infiltration mit segmentkernigen Leukozyten zeigen. In histologischen Schnitten von Tumoren mit Spontanregression finden sich ausgedehnte Areale eines Granulationsgewebes und nur wenige Tumorzellkomplexe (Abb. 6, 3 a-c). Eine leukozytare Infiltration fehlt auch hier. Von 17 Tumoren, die zwischen dem 18. und 29. Tag nach der Transplantation fixiert worden waren, erfolgte die histologische Auswertung, ohne daE bekannt war, ob es sich urn weiter wachsende Tumoren oder urn soIehe mit spontaner Regression handelte. In einem Teil der Falle iiberwog das Tumorgewebe in seiner abgerundeten Zellform mit netzformig angeordneten Nekrosen, in einem zweiten lag iiberwiegend Granulationsgewebe vor. Der Versuch, diese letztgenannten Falle der Spontanregression zuzu-

,. ,

,'1 .. I

"

,

." ,

•

'J

":i ..~

"f ..

..

\

'.'

,\

, \

"

..

\

Abb. 6, 3 a

- . .• .

J",

~

-~-

Abb. 6, 3 b 18 Beitr. Path . Bd. 158

Sarkom 180 . 273

,

',.

274

G. Ste<.ner, H . Bloemertz uncl P. Pfitzer

Abb. 6, 3 c Abb. 6,3. Granulationsgewebe in einem Tumor mit Spontanregression am 18. Tag. a) Ubersicht, Feulgen; X 1 0 0; b) Ausschnitt, Feulgen; X 300 ; c) Ausschnitt, Feulgen; X 800. Fig. 6, 3. Granulation tissue in a case of spontaneous regression on day 18. a) Feulgen; X 1 0 0; b) Feulgen; X 300 ; c) Feulgen; X 800.

ordnen, erwies sich in 6 Fallen als richtig. Von zwei weiteren Fallen mit Spontanregression lag nur sehr wenig Material vor, das wohl zufallig Tumorgewebe, jedoch kein Granulationsgewebe enthielt. Diese zwei Falle wurden deshalb falsch klassifiziert und nicht als Tumoren mit Spontanregression erkannt. Samtliche weiterwachsenden Tumoren wurden richtig eingeordnet. 7. Zytologische Befunde

Wie in den histologischen Schnitten liel~en sich auch in den Feulgengefarbten Ausstrichen verschiedene Kerntypen unterscheiden. In den friihen Phasen des Wachstums iiberwogen gro~e, runde oder ovale, locker strukturierte Kerne mit gro~en Nukleolen und Flachen von etwa 200 flm 2 bis 300 flm 2 (Abb. 7, I). Der nukleare DNA-Gehalt dieser Kerne entsprach 4C bis 8C, und nur selten enthielt ein Kern mehr als Sc. Mit fortschreitender Volumenzunahme der Tumoren wurden haufiger kleinere, dichte,

Sarkom 180 . 275

,-

..

2

.:.. -J ~

.

t

., .'

,: .

.

.. "'I •

t"

'....

:..

It '

••

,

.to

3

4

Abb. 7, I. 7. Tag. Vorwiegend Tumorzellkerne mit DNA-Werten im oktoploiden Bereich und Fla'chen von 200 flm 2 bis 300 flm 2 Mitose). Feulgen; X I 000. Fig. 7, r. Day 7: Large octoploid tumor cell nuclei (nuclear area 200 /tm2 to 300 flm 2) Mitosis). Feulgen; X 1,000. Abb. 7, 2. 12. Tag. GroBe lockere Tumorkerne mit Fla'chen von 200 flm 2 bis 250 flm 2 und kleine pyknotische Tumorkerne mit Fla'chen von 65 flm 2 bis 150 flm 2. DNA-Werte im oktoploiden Bereich. Feulgen; X I 000. Fig. 7, 2. Day I2: Octoploid tumor cell nuclei of varying size (nuclear area 200 flm 2 to 250flm2 and 65 flm 2 to 150 f.lm 2). Feulgen; X 1,000.

(t

(t

Abb. 7, 3· 20. Tag. Tumoren ohne Spontanregression. Autoradiogramm nach Pulsmarkierung mit 3H-TdR. Markierte und unmarkierte Tumorkerne. Feulgen; X I 000. Fig. 7, 3· Day 20: Non regressing tumor. Autoradiographs of labelled and unlabelled tumor cell nuclei (3H-TdR). Feulgen; X 1,000. Abb. 7, 4. 20. Tag. Tumoren ohne Spontanregression. Markierte Kerntriimmer. Feulgen; X 100'0. Fig. 7, 4. Day 20: Non regressing tumor. Labelled cell debris. Feulgen; X 1,000. Abb. 7, 5· 29· Tag. Tumoren mit Spontanregression. Vorwi egend diploide Kerne mit Fla'chen von 40 f.lm2 bis 70 f.lm 2. Feulgen; X I 000. Fig. 7,5, Day 29: Regressing tumor. Diploid nuclei (nuclear area 50 flm 2 to 60 f.lm2). Feulgen; X 1,000.

276 . G. Stecher, H. Bloernertz und P. Pfitzer

chromatinreiche Kerne mit Flachen von ca. 80 flm 2 bis 200 flm 2 gefunden, deren DNA-Gehalt gleichfalls zwischen 4C und 8C schwankte (Abb. 7, 2). Mitosen und 3H-TdR-Markierung fanden sich vorwiegend in den groGen Tumorkernen (Abb. 7, I; 7, 3). Die Beobachtung uber Konglomerate von netzig Feulgen-positiven Strukturen in den Schnittpdparaten lieG sich auch in den Ausstrichen der Suspensionen bestatigen, wobei in diesen Bezirken haufig eine deutliche Markierung mit 3H-TdR zu sehen war (Abb. 7,4)· In den Tumoren, deren Volumen sich ab dem 12. Tag rasch verkleinerte, fan den sich vorwiegend Kerne mit lockerer Struktur, mit Flachen zwischen 40 flm 2 und 70 Itm2 und DNA-Werten von 2C bis 4C (Abb. 7, 5). Sie waren groGer als Lymphozyten, aber deutlich kleiner als die oben beschriebenen zwei Typen von Tumorzellen, von denen sie sich morphologisch unterschieden. Diese kleinen Kerne waren ganz vereinzelt auch in den Tumoren ohne Spontanregression vorhanden und lassen sich somit dem histologisch und zytophotometrisch nachgewiesenen Granulationsgewebe zuordnen.

Diskussion Wachstumskurven von Experimentaltumoren lassen in der Regel drei Phasen unterscheiden. Die erste Phase des exponentiellen Wachstums ist gekennzeichnet durch eine rasche Volumenzunahme, die Tumorverdopplungszeit fiir das Tumorvolumen ist konstant und entspricht in etwa der Generationszeit der Tumorzellen. In der zweiten, der sogenannten Bremsphase steigt die Tumorverdopplungszeit an, die Wachstumsgeschwindigkeit vermindert sich. In der dritten Phase schliemich nimmt die Tumorverdopplungszeit noch weiter zu, andert sich aber zuletzt nur noch wenig. Dementsprechend zeigt die Kurve ein Plateau. Die genannten drei Phasen konnen auch in den Wachstumskurven des von uns in zwei Experimenten untersuchten S 180 nachgewiesen werden. Tisljar und Kronenberger (1973) ermittelten in ihren Untersuchungen bei Verwendung der gleichen Anzahl von Tumorzellen zur Transplantation kleinere Volumina der Tumoren. Dabei setzte die Spontanregression zwischen dem 10. und 12. Tag, also etwas fruher als in unseren Experimenten ein. Die Wahrscheinlichkeit der Regression schien fUr die anfanglich rasch wachsenden Tumoren groGer zu sein als fur langsam wachsende. Diese Beobachtung konnte von uns bestatigt werden. Eine Spontanregression des S 180 ist seit langem bekannt (Andervont, 1932). Ihre Haufigkeit schwankt in den Experimenten verschiedener Untersucher zwischen 6010 und 40010 (Tab. 5). Dabei bleibt unberucksichtigt,

Sarkom 180 . 277 Tabelle 5. Hiiufigkeit der Spontanregression bei S 180 nach verschiedenen Autoren Table 5. Per cent regression of S 180 as reported in the literature in comparison to the results of the present investigation Bradner et al. 1958 Old et al. 1959 18%

Pasqualini et al. 196 I Bradner und Pindell 1965

26%-32~/O

Shoat und Joshua 1969

15%-4 0 %

Tisljar und Kronenberger 1973 Tarnowski et al. 1973 Stecher, Bloemertz und Pfitzer 1975

ob es sich urn die Absto6ung des ulzerierten Tumorgewebes nach au6en handelt oder urn eine echte Riickbildung im Karper des Empfangertieres. In zahlreichen Experimenten war es gelungen, die Regressionsrate zu beeinflussen. Sie wird gesteigert durch Zymosan, wenn es in niederen Dosen alteren Tieren verabreicht wird (Bradner et al., I 9 58; Bradner und Clarke, I 9 59). Eine besonders ausgepragte Steigerung auf 70% bis IOO% la6t sich durch eine BCG-Impfung erreichen (Old et al., I959). Durch Vitamin-B-6-freie Ernahrung der Empfangertiere wird das Tumorwachstum gehemmt; diese Wirkung wird durch Pyridoxin substitution wieder aufgehoben (Mihich und Nichol, I959; Mihich, I962). Eine Steigerung der Regressionsrate konnte mit 6-Mercaptopurin, Actinogan und Phleomycin (Bradner und Pindell, I 96 5), mit Basidiomyceten-Mucopolysaccharid (Tarnowski et al., I973) und mit cis-Dichlorodiamin-Platin (Sodhi und Aggarwal, I974) erzielt werden. Eine gesteigerte Tumorriickbildung bei Strahlenbehandlung in Kombination mit Rutinon (Barth und Graebner, I96I; Barth et al., 1964) und Actihamyl (Barth et al., I965) wurde ebenfalls nachgewiesen. Die Senkung der Regressionsrate trat nicht nur nach Thymektomie junger Tiere, sondern auch nach Gabe von Hydrokortison oder Zymosan in hohen Dosen (Bradner und Clarke, I9 59) sowie nach Rantgenbestrahlung (Ferrer und Mihich, I 96 5) ein. Ein Thymustransplantat vermochte die Wirkung der Thymektomie wieder aufzuheben (Ferrer und Mihich, I967). Eine Reimplantation des Tumors ist in der Regel erfolglos (Andervont, 1932; Mihich und Nichol, 1959; Pasqualini et al., 1961). In Parabiosever-

278 . G. Stecher, H. Bloemertz und P. Pfitzer

suchen lie~ sich zeigen, da~ die zu Grunde liegende Immunisierung ubertragbar ist (Shoat und Joshua, 1969). Auch die meisten der anderen angefuhrten Beobachtungen sprechen fUr die Bedeutung von immunologischen Prozessen fur die Regression von S 18o. Die Rolle der zellularen Abwehr wird durch die positive Wirkung einer intraperitoneal en Obertragung von Milzzellen von Tieren mit Spontanregression unterstrichen (Shoat und Joshua, 1969). Nach erfolgreicher Regression wurden jedoch vermehrt Leukamien beobachtet (Pasqualini et al., 196 I), und Leukamieviren lie~en sich sowohl elektronenmikroskopisch nachweisen als auch experimentell ubertragen (Sodhi und Aggarwal, 1974). Das Auftreten und die Beeinflussung der Spontanregression sind eindeutig an den Zuchtstamm der verwendeten Empfangertiere gebunden (Old et al., 1959; Bradner und Pindell, 1965; Tarnowski et al., 1973). Diese Beobachtung spricht fur die Bedeutung der Histoinkompatibilitat fUr die Regression. Die in der Literatur vorliegenden Berichte uber zytophotometrische Messungen des DNA-Gehalts transplantabler Tiertumoren sind auf Befunde wahrend des exponentiellen Wachstums beschrankt und betreffen nicht das Stadium der Regression (Habicht et al., 1964; Lampert und Sandritter, 1966; Lala und Patt, 1968; Peel und Fletcher, 1969; Desaive und Bassleer, 1970; Gyesko und Sugar, 1970; Klein et al., 1970; Gohde und Dittrich, 1970, 1971; Bassleer und Desaive, 1971; Shackney und Ford, 1974; Stohr et al., 1973; Zywietz et al., 1974). Diese Untersuchungen wurden vorwiegend an rein en Aszitestumoren ohne Normalzellen, gelegentlich an soliden Tumoren mit 2C-Stroma und Blutzellen durchgefuhrt. In der vorliegenden Arbeit wird der Versuch unternommen, mit Hilfe der Zytophotometrie die nukleare DNA wahrend verschiedener Wachstums- und Regressionsstadien des S 18o zu erfassen. Die Interpretation der Ergebnisse erfordert einige Oberlegungen methodischer und theoretischer Art (Vyska et al., in Vorbereitung). Die Zytophotometrie ist ein Verfahren, das lediglich die Quantitat, nicht aber die Qualitat der DNA erfa~t. Prinzipiell stehen fur die quantitative Bestimmung der DNA zwei Systeme zur Verfugung - die Scanningzytophotometer und die Durchflu~zytophotometer. Sie besitzen jeweils verschiedene Vor- und Nachteile (Pfitzer, 1975). Unabhangig von der Art des verwendeten Zytophotometers ist bei der Beurteilung der Histogramme zu bedenken, da~ sich die Zellen zum Zeitpunkt der Messung in jeder der drei Phasen G h Soder G 2 befinden konnen. Daraus ergibt sich, da~ nur fur synchrone Zellpopulationen ein DNA-Histogramm mit einem einzigen Gipfel zu erwarten ist. Eine Schwierigkeit fur die Deutung der DNA-Histogramme besteht in der Tatsache, da~ es fur die Zytophotometrie keine eigene Terminologie

Sarkom

180 .

279

gibt. Der einzige Begriff, der ausschlieBlich fUr die quantitative DNAMessung gepragt wurde, ist der des Coder Content. Er entspricht einem haploiden Chromosomensatz bei der Maus. Die meisten Bezeichnungen wurden aus der Chromosomenanalyse iibernommen (Rieger et aI., 1968). Bei der Interpretation der Histogramme iiberlagern sie sich mit Begriffen der Zellkinetik. Hieraus ergeben sich Mi6verstandnisse. 1m DNA-Histogramm kann nicht unterschieden werden, ob es sich urn die G 2-Zellen eines normalen Gewebes oder urn die G1-Zellen eines Tumors mit tetraploidem Chromosomensatz handelt. Prinzipiell konnen zwei Gipfel im Verhaltnis von I : 2 sowohl polyploid en Zellen als auch einer G 1- und G 2 -Phase derselben Zellrasse entsprechen. Zwischenwerte konnen sowohl auf Synthesekerne als auch auf Kerne mit aneuploidem Chromosomensatz zuriickgehen. Vor- und Nachteile der beiden Zytophotometersysteme und die Problematik bei der Beurteilung der Histogramme spiegeln sich auch in den Befunden, die am Experimenta.1tumor S 180 erhoben wurden. Obereinstimmung besteht in der Lage von unterschiedlich hohen Maxima bei 2C, 4C und 8C sowie in einem Plateau von Zwischenwerten zwischen 4C und Wahrend in den einzelnen Histogrammen wachsender Tumoren, die mit dem Scanningzytophotometer gewonnen wurden, infolge der kleinen Zahl von je 50 Messungen kein einheitliches Bild in Erscheinung tritt, werden die Maxima bei Zusammenfassung aller Werte deutlich. Sie entsprechen dann den Histogrammen, die mit dem Durchflu6zytophotometer an einer sehr gro6en Zahl von Zellen registriert werden. In ihnen wird au6erdem eine Verschiebung der Anteile normaler 2C-Zellen des ersten und des zweiten Maximums sowie der Zwischenwerte des Tumors deutlich. Ferner la6t sich eine Zunahme des DNA-Schuttes mit dem Alter des Tumors belegen. Mit dem Durchflu6zytophotometer lassen sich also iiber die Befunde des Scanningverfahrens hinaus (Lampert und Sandritter, 1966) Anderungen in der Zusammensetzung des Tumors wahrend seiner Entwicklung belegen. Tumoren mit Spontanregression zeigen demgegeniiber in beiden Histogrammen einen Riickgang der hohen DNA-Werte und eine Zunahme der Werte zwischen 2C und 4C im Verlauf der Volumenabnahme. Diese 2CKerne unterschieden sich beim Scanningverfahren nach Feulgenfarbung in ihrer Morphologie und Flache deutlich von den Lymphozyten, jedoch weniger deutlich von den 4C-Kernen der Tumorstammlinie. In den Autoradiogrammen sind im Endstadium der Regression vorwiegend diese kleinen Kerne markiert. Aus diesen Beobachtungen ergibt sich zusammen mit den histologischen Befunden, da6 die diploide Population aus Granulationsgewebe besteht. Es fand sich vor aHem bei regressiven Tumoren eine gute Obereinstimmung zwischen den dominierenden 2C-Gipfeln im DNA-Ver-

se.

280 . G. Stecher, H. Bloemertz und P. Pfitzer

teilungsmuster und den in histologischen Schnittpraparaten vorherrschenden ausgedehnten Bezirken von Granulationsgewebe. Bei der Betrachtung der mittels Scanningzytophotometrie gewonnenen Tumorhistogramme ohne Spontanregression fallt die unterschiedliche Gipfelbildung bei Tupfpraparaten und Suspensionsausstrichen auf. Da sich das kombinierte Histogramm der Suspensionen mit dem Ergebnis der ICPMessungen deckt, kann die Diskrepanz nur methodisch erklart werden. Sicher ist die Tupfmethode das schonendste Verfahren, Praparate herzustellen. Die Diskrepanzen zwischen verschiedenen nur mit dieser Technik gewonnenen Praparaten yom selben Tumor, wie sie im Vorversuch auftraten, diirften auf tatsachliche lokale Unterschiede zuriickgehen, wie sie auch das histologische Bild belegt. Fa6t man jedoch alle Histogramme von Tupfpraparaten zusammen und stellt sie der Summe der Histogramme der Suspensionspraparate gegeniiber, so zeigt sich bei letzteren eine deutlich geringere Zahl an Werten zwischen 4C und 8C. Zur Erklarung ist in erster Linie an ein Defizit an synthetisierenden Kernen zu denken. DNA-Synthesen finden vorwiegend in den Zellkomplexen mit segelformig ausgebreitetem Plasma statt. Diese Zellen diirften bei der mechanischen Zerkleinerung und Isolierung der Zellen, wie sie fiir die Herstellung der Suspensionen verwandt werden, leichter beschadigt werden als die bereits abgerundeten Tumorzellen mit mehr oder weniger pyknotischen Kernen. Diese Annahme wird unterstiitzt durch die Tatsache, da6 in den Autoradiogrammen zerstorte Kerne mit 3H-Thymidin-Markierung gefunden wurden. Man mu6 also damit rechnen, da6 in den Histograrnmen aller Suspensionen ein Teil der im Tumor vorhandenen Zwischenwerte fehlt. Da die histologischen Schnitte aber belegen, da6 der Anteil der noch nicht abgerundeten Tumorzellen ab dem 12. Tag gering ist, diirfte dieser durch die Praparation bedingte Fehler klein bleiben. Hinweise auf den Zeitpunkt der Regression liefern die autoradiographischen Untersuchungen. Der Markierungsindex, Indikator fiir die Produktionsrate des Tumors, ging yom 4. Tag bis zum 18. Tag urn rund 50% zuriick und sank weiter kontinuierlich auf 1,6%. In der Gruppe der Tumoren mit Spontanriickbildung nahm der Markierungsindex zu Beginn der Riickbildung, also zwischen dem 12. und 18. Tag, steil abo Auch nach dem Verlauf der Wachstumskurve beider Gruppen von Tumoren ist anzunehmen, da6 die Spontanregression am Ende der Bremsphase einsetzte. Die Zellkinetik des Sarkom 180 am 5. und 8. Tag nach Transplantation ist von Simpson-Herren et al. (1968) und Simpson-Herren und Lloyd (1970) untersucht worden. In Tabelle 6 sind die von uns am 4. und 7. Tag ermittelten Tumorverdopplungszeiten und Markierungsindizes sowie die nach Frindel et al. (1967) berechnete Growth Fraction den Daten von Simpson-Herren

Sarkom 180 . 281 Tabelle 6.

Zykluszeiten, Tumorverdopplungszeiten, Markierungsindex und Growth Frac-

tion von S ISO >:< Werte des Hauptversuchs Werte von Simpson-Herren et al. (1968) und Simpson-Herren und Lloyd (1970) Werte von Pittner (1971). Growth Fraction berechnet nach Steel unter Verwendung von 12 aus cler von Porschen und Feinendegen (1969) veroffentlich,ten Wachstums-

*

o

kurvedes S 18'0 • Growth Fraction berechnet nach Frindel et al. (1967) Table 6. Cell cycle (h), tumor doubling time (T2, h), 3H-TdR labelling index (0/0) and growth fraction (0/0) -~-~--

Tag nach Transplant.

*

4. Tag

*

5. Tag

*

7. Tag

*

8. Tag

TG1 (Stunden)

3

T8

8

TG2

2,5

3,5

TM

0,5

1,0

Tc

12. Tag

6

23,1

*

14

26

14 43

3°

96

64

Markierungsindex (0/0)

38,6

33

21,8

12

67,6

56

40 ,5

22

Growth Fraction (0/0)

*

7,5

T2 (Stun den)

•

11. Tag

o Growth

Fraction (0/0)

54

gegeniibergestellt. Die Ergebnisse weichen am 4. bzw. 5. Tag wenig, am 7. bzw. 8. Tag starker voneinander abo Dbereinstimmend findet sich ein Riickgang der DNA-Syntheserate und der Growth Fraction mit zunehmendem Wachstum des Tumors. Ahnliche Ergebnisse wurden auch von anderen Autoren beschrieben (Frindel et al., I 967; Lala und Patt, I 968; Schiffer et al., I973). Unterschiede innerhalb ein und desselben Tumors (Hermens und Barendsen, I967; Simpson-Herren et al., I968; Denekamp und Kallmann, I 973) werden bei der Verwendung von Zellsuspensionen aus gemischtem Tumorgewebe weitgehend ausgeschaltet. Neben der DNA-Syntheserate und dem Anteil proliferierender Zellen muB ein dritter, das Tumorwachstum beeinflussender Faktor beriicksichtigt

282 .

G. Stecher, H. Bloemertz und P. Pfitzer

werden, der Zellverlust. Die Zellverlustrate zu verschiedenen Zeiten des Tumorwachstums kann z. B. aus dem Vergleich zwischen der potentiellen und der tatsachlichen Tumorverdopplungsdauer berechnet werden (Steel, 1968). Porschen und Feinendegen (1969) bestimmten die Zellverlustrate in vivo unter Verwendung von 125Jod-Desoxyuridin (einem Thymidin-Analog). Aus diesen Untersuchungen ergibt sich, dag der Zellverlust gering ist bei kleinen, rasch wachsenden Tumoren und groger wird, wenn sich das Tumorwachstum verlangsamt. Wenn wir den in unseren Untersuchungen mit dem Impulszytophotometer registrierten DNA-Schutt dem Zellverlust gleichsetzen, so finden auch wir, dag er in der Plateauphase des Wachstums zunimmt. Zu berucksichtigen ist dabei, dag der zytophotometrisch bestimmte DNA-Schutt aus zerfallenden Kernen stammt und dabei aus technischen Grunden kleinere Kernfragmente nicht erfagt werden. Die tatsachliche Gesamtmenge mug somit groger sein, als sie aus den Histogrammen errechnet wurde. Zur Frage des Zellverlustes durch Abwanderung aus dem Tumor konnen wir nicht Stellung nehmen. Die Knderungen des histologischen Bildes wahrend des Wachstums von S 180 sind aus den Arbeiten von Barth et al. (1961, 1964, 1965) bekannt, wobei drei verschiedene Zustande der Tumorzellen unterschieden wurden: Intaktes Tumorgewebe, beginnende Nekrosen und fortgeschrittene Nekrosen ohne anfarbbare Zellkerne. Drei verschiedene Bezirke im Tumorgewebe bestatigen auch die Untersuchungen von Sodhi und Aggarwal (1974). Unsere Befunde an wachsenden Tumoren entsprechen diesen Beobachtungen. Von besonderem Interesse ist das Verhalten des Tumorbettes. Perivaskulare Monozyten (Shoat und Joshua, 1969) sowie einzelne Makrophagen (Woodruff und Dunbar, 1974) wurden fur die Abstogungsreaktion verantwortlich gemacht. Ein Fehlen der fibrovaskularen Reaktion konnte die Ursache fur das Ausbleiben einer Regression bei der flussigen Form des S 180 im Aszites sein (Tarnowski et al., 1973). Diese Oberlegung wird durch unsere Beobachtungen bestatigt. Ein fibrovaskulares Granulationsgewebe trat in unterschiedlicher Auspragung schon 7 Tage nach der Transplantation auf, also wesentlich fruher als eine Spontanregression makroskopisch erkennbar wird. Dieses Granulationsgewebe konnte auch die Ursache fur das anfanglich starkere Wachstum der Tumoren mit spaterer Spontanregression sein. In den Tumoren mit Spontanregression ist das Granulationsgewebe die histologisch auffallendste Komponente, die eine Klassifizierung der Schnitte ohne Vorkenntnis des makroskopischen Befundes erlaubt. Entzundungszellen waren wahrend aller Stadien des Tumorwachstums, der Ruckbildung und der Nekrose nur in geringer Anzahl zu beobachten. Die Regression ist somit nicht von ihrem Vorhandensein abhangig. Ihr vermehrtes Auftreten nach einmaliger Injektion einer Platinverbindung und die an-

Sarkom ISO· 283

schlieBende v611ige Riickbildung der Tumoren (Sodhi und Aggarwal, 1974) diirften dennoch in einem ursachlichen Zusammenhang stehen.

Zusammenfassung In einem Vor- und dem Hauptversuch wurde bei je 50 Mausen das Wachstum und die Regression des Experimentaltumors S I So durch Volumenmessungen sowie durch zytophotometrische, histologislche, zytologische und zellkinetische Untersuchungen beobachtet. Vom IS. Tag an fand sich bei 20010 bzw. 3S0f0 der Tiere eine spontane Regression des Tumors. DNA-Messungen wurden mit dem Scanningmikroskopphotometer an Tupfpraparaten und Ausstrichen von Suspensionen sowie mit dem Durchflulhytophotometer ICP an Suspensionen durchgefuhrt. DNA-Histogramme wurden am 4., 7., 12., IS., 20., 22., 26. und 29. Tag nach der Transplantation erstellt. Sie zeigten eine konstante Lage von Maxima bei 2C fur normale Zellen und bei 4C und SC fur die Tumorzellen. Insbesondere bei der Messung der grollen Zahl von insgesamt 4 96S 000 Kernen mit dem ICP ergaben sich deutliche Veranderungen im Anteil der einzelnen Kernklassen wahrend des Wachstums und der Spontanregression. Diese Technik erlaubt aullerdem den DNASchutt aus Nekrosen quantitativ zu erfassen. Bei wachsenden Tumoren steigt der Anteil der Tumorzellen auf maximal 65010 am I S. Tag an und geht auf 37010 am 29. Tag zuruck. Gleichzeitig nimmt der DNA-Schutt von SOlo auf 47010 zu. Der Anteil normaler Zellen betragt dann nur 10010 bis 15010. Bei Tumoren mit Spontanregression betragt der Anteil der Tumorzellkerne 20% am I S. Tag und IIOfo am 29. Tag. Der DNA-Schutt liegt wiederum bei etwa 450/0. Demgegenuber ist der Anteil normaler Zellkerne mit 45010 stark erhoht. Histologische und zytologische Befunde sowie Messungen der Kernflachen und der Einbau von 3H-TdR bestatigen, dall die Zunahme der normalen Zellen wahrend der Spontanregression durchein fibrovaskulares Granulationsgewebe bedingt ist. Wahrend die DNA-Syntheserate bei wachsenden Tumoren mit dem Alter kontinuierlich abnimmt, findet sich bei Spontanregression ein rascher Abfall des Markierungsindexes zwischen dem 12. und IS. Tag. In den Endstadien sind nur die Zellkerne des Granulationsgewebes markiert.

Literatur 1.

2. 3.

4.

5.

Andervont, H. B.: Studies on Immunity Induced by Mouse Sarcoma I So. Pub!. Hlth Rep. (Wash.) 47, IS59-IS77 (1932) Andreeff, M.: Impulscytophotometrie. Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York (1975) Bassleer, R, and Desaive, c.: Contribution to the Study of the Ehrlich-Ascites Tumor Cells. A Cytological and Cytochemical Analysis of the Effects of Sarcolysine. Europ. J. Cancer 7, 441-450 (197 1) Barth, G, und Graebner, H.: Zusatzliche medikamentose Behandlung des Tumorbettes. II. Mitteilung: Tierexperimentelle Untersuchungen zur Frage der Wirkung von Rutin bei der Strahlentherapie von Tumoren unter besonderer Berucksichtigung der Injektion in das Tumorbett. Strahlentherapie I I 5, 310-319 (196 I) Barth, G., Carl, M., Graebner, H., und Winter, M.: Zusatzliche medikamentose Behandlung des Tumorbettes. VII. Mitteilung: Histologische Untersuchung des Crocker-

284 . G. Stecher, H. Bloemertz und P. Pfitzer

6.

7.

8.

9.

10. I I.

12.

Sarkoms 180 unter kombin ierter Rutin-Strahlenbehandlung. Strahlentherapie 125, 567-581 (19 64) Barth, G., Graebner, H., Carl, M., und Ponath, H.: Zusatzliche medikamentose Behandlung des Tumorbettes. X. Mitteilung: Histologische Untersuchungen des CrockerSarkoms 180 unter kombinierter Actihaemyl-Strahlenbehandlung. Strahlentherapie 127,418-429 (1965) Barth, G., Graebner, H., und Winter, M.: Zusatzliche medikamentose Behandlung des Tumorbettes. VIII. Mitteilung: Tierexperimentelle Untersuchungen zur Frage der paratumoralen und tumorfernen Nikotinsaurewirkung auf das Crocker-Sarkom 180 unter optimaler Rontgenbestrahlung. Strahlentherapie 126, 70-86 (1965) Bradner, W. T., Clarke, D. A., and Stock, C. c.: Stimulation of Host Defence against Experimental Cancer. I. Zymosan and Sarcoma 180 in Mice. Cancer Res. 18, 347-351 (195 8) Bradner, W. T., and Clarke, D. A.: Stimulation of Host Defence against Experimental Cancer. II. Temporal and Reversal Studies of the Zymosan Effect. Cancer Res. 19,673-67 8 (1959) Bradner, W. T., and Pindell, M. H.: Strain Specificity of Stimulated Regression of Sarcoma 180. Cancer Res. 25 , 859-864 (1965) Denekamp, ]., and Kallmann, R. F.: In Vitro and in Vivo Labelling of Animal Tumours with Tritiated Thymidine. Cell Tissue Kinet. 6, 217-227 (1973) Desaive, c., et Bassleer, R.: CANCEROLOGIE. - Comparaison de deux souches de tumeur ascitique d'Ehrlich: etude du caryotype, de la teneur en acides desoxyribonucleiques et du volume cellulaire. C. R. Acad. Sci. (Paris) 270, 436-439 (1970)

13. Ferrer, ]. F., and Mihich, E.: Reduced Incidence of Regression of Sarcoma 180 in Vitamin B6 deficient Mice Thymectomized at Birth. Proc. Amer. Ass. Cancer Res. 6,18 (1965) 14. Ferrer, ]. F., and Mihich, E.: Dependence of the Regression of Sarcoma 180 in Vitamin B6-deficient Mice upon the Immunologic Competence of the Host. Cancer Res. 27,45 6-4 61 (19 67) 15. Frindel, E., Malaise, E. P., Alpen, E., and Tubiana, M.: Kinetics of Cell Proliferation of an Experimental Tumor. Cancer Res. 27, I l l l - I I J I (1967) 16. Gohde, W., and Dittrich, W.: Simultane Impulsfluorimetrie des DNS- und Proteingehaltes von Tumorzellen. Z. analyt. Chern. 252, 328-330 (1970) 17. Gohde, W., and Dittrich, W.: Die cytostatische Wirkung von Daunomycin im Impulscytophotometrie-Test. Arzneimittel-Forsch. 21, 1656-1658 (1971) 18. Gorysch, H., and Pfitzer, P .: Vergleichende Messungen an Ergiissen mit dem Impulscytophotometer und dem Scanning-Mikroskopphotometcr. In: Impulscytophotometrie, Hrsg.: M. Andreeff, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York (1975) 19. Gyesko, A., and Sugar, ].: Quantitative Cytochemical Investigations on NK/LY Mouse Ascites Tumour Cells Treated with Degrano!. I. Feulgen Cytophotometric and Polarization Optical Investigations. Virchows Arch. Abt. B Zellpath. 5, 60-69 (1970) 20. Habicht, W., Lennartz, K . J., Simoneit, K. D., Bahntje, K. U., Eder, M., und Gross, R.: Cytophotometrische und autoradiographische Untersuchungen zur Wirkung von Cyclophosphamid auf den Desoxyribonucleinsaure-Gehalt und die 3H-Thymidin-Einbaurate bei Ehrlich-Ascitestumoren unterschiedlicher Ploidie. Arzneimittel-Forsch. 20, 60 7-60 9 (197 0) 21. Hermens, A. F., and Barendsen, G. W.: Cellular Proliferation Patterns in an Experimental Rhabdomyosarcom in the Rat. Europ. ]. Cancer 3,361-369 (1967)

Sarkom 180 . 285 22. Klein, H. 0., Lennartz, K. J., Habicht, W., Eder, M., und Gross, R.: Synchronisation von Ehrlich-Ascites Tumorzellen und ihre Bedeutung bei der Anwendung eines alkylierenden Cytostaticums. Klin. Wschr. 48, 1001-1005 (1970) 23. Lala, P. K., and Patt, H. M.: A Charakterisation of the Boundary Between the Cycling and Resting States in Ascites Tumor Cells. Cell Tissue Kinet. I, 137-146 (1968 ) 24. Lampert, F., und Sandritter, W.: Die Wirkung von Tryptophan-N-Lost auf DNAund Histonproteingehalt isolierter Tumorzellkerne. Klin. Wschr. 15, 895-898 (1966) 25. Mihich, E.: Host Defence Mechanism in the Regression of Sarcoma 180 in Pyridoxinedeficient Mice. Cancer Res. 22, 218-227 (1962) 26. Mihich, E., and Nichol, Ch. A.: The Effect of Pyridoxine Deficiency on Mouse Sarcoma ISO. Cancer Res. 19, 279-28 4 (1959) 27. Old, L. J., Clarke, D. A., and Benacerraf, B.: Effect of Bacillus Calmette-Guerin Effection on Transplantated Tumours in Mouse. Nature 184, 291-292 (1959) 28. Pasqualini, C. D., Holmberg, E. A. D., Rabasa, S. L., and Pavlovsky, A.: Immunity to Sarcoma 180 and the Induction of Leukemia. Cancer Res. 21, 387-389 (1961) 29. Peel, S., and Fletcher, P. A.: Changes Occuring During the Growth of Ehrlich Ascites Cells in vivo. Europ. J. Cancer 5, 581-589 (1969) 30. Pfitzer, P.: Die Charakterisierung von Tumorzellpopulationen durch DNA-Messungen. Zbl. Path. (im Druck, 1975) 31. Pittner, W.: Strahlenempfindlichkeit in Abhangigkeit vom Zellzyklus. In vivo Untersuchungen am transplantierten Sarkam 180 mit 125 Jod-Desoxyuridin und 15 MeV Neutronen. Inaugural-Dissertation, Universitat Dusseldorf (1971) 32. Porschen, W., und Feinendegen, L. E.: In-vivo-Bestimmung der Zellverlustrate bei Experimentaltumoren mit markiertem Joddesoxyuridin. Strahlentherapie 137, n8723 (19 6 9) 33. Rieger, R., Michaelis, A., and Green, M. M.: A Glossary of Genetics and Cytogenetics. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New Yark (1968) 34. Schiffer, L. M., Nelson, J. S. R., Dilettuso, B., Migliorato, D., and Randolph, W.: Cytokinetics of the S-I80 Ascites Tumor System. Cell Tissue Kinet. 6, 165-172 (1973) 35. Shackney, S. E., and Ford, S. S.: Correlations between the DNA Content Distribution and Tritiated Thymidine Studies in Relation to Population Size in Sarcoma 180 in Vitro. Cancer Res. 34,1401-1407 (1974) 36. Shoat, B., and Joshua, H.: Host Defence Mechanisms in the Spontaneous Regression of S-I80. Europ. J. Cancer 5, 69-75 (1969)

37. Simpson-Herren, L., Blow, J. G., and Brown, P. H.: The Mitotic Cycle of Sarcoma 180. Cancer Res. 28, 724-726 (1968) 38. Simpson-Herren, L., and Lloyd, H. H.: Kinetic Parameters and Growth Curves for Experimental Tumor Systems. Cancer Chemother. Rep. 54, 143-174 (1970) 39. Smets, L. A.: Activation of nuclear chromatin and the release from contactinhibition of 3T3 cells. Exp. Cell Res. 79, 239-243 (1973) 40. Sodhi, A. and Aggarwal, S. K.: Effects of cis-Dichlorodiamine Platinum (II) in the Regression of Sarcoma 180: A fine Structural Study. J. Nat. Cancer Inst. 53, 85-89 (1974) 41. Steel, G. G.: Cell Loss From Experimental Tumours. Cell Tissue Kinet. I, 193-207 (1968 )

286 . G. Stecher, H. Bloemertz und P. Pfitzer 42. Stewart, H. L., Snell, K. c., Dunham, L. ]., and Schlyen, S. M.: Transplantable and Transmissible Tumors of Animals. In: Atlas of Tumor Pathology Section I2, Fascicle 40, 324-329. Armed Forces Institute of Pathology, D. C. Washington (1959) 43. Stohr, M., Gehring, H. D., und Petrova, L.: Uber Xnderungen der Phasenverhaltnisse im Zellcyclus von Transplantattumoren. Virchows Arch. Abt. B Zellpath. 14, 247-2 58 (1973) 44. Tarnowski, G. S., Mountain, I. M., and Stock, C. c.: Influence of Genotype of Host on Regression of Solid and Ascitic Forms of Sarcoma 180 and Effect of Chemotherapy on the Solid Form. Cancer Res. 33,1885-1888 (1973) 45. Tisljar-Lentulis, G., und Kronenberger, P. H.: Personliche Mitteilung (1973) 46. Vyska, K., Pfitzer, P., und Stecher, G.: Die statistische Analyse von DNA-Histogrammen. In Vorbereitung 47. Woodruff, M. F. A., and Dunbar, N.: The Effect of Cell Dose and Distribution on the Development of a Transplanted Tumour. Europ.]. Cancer 10,533-537 (1974) 48. Zuckerberg, c.: Ultrastructure of Sarcoma 180. Cancer Res. 33, 2278-2282 (1973) 49. Zuckerberg, c.: Estrucura e Histoquimica del Sarcoma 180. Ph. D. thesis, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires (1972) 50. Zywietz, F., Wehbe, S., Linden, W. A., Baisch, H., und Straatmann, ].: Impulscytophotometrische Untersuchungen zur Synchronisation des Walker-Karzinoms der Ratte mit Daunomycin. Strahlentherapie 147,514-520 (1974) Dr. Gisela Stecher, Institut flir Medizin der Kernforschungsanlage Jiilich, D-5170 Jiilich