Über den Stoffwechsel von Harnstoff-Herbiciden in der ratte. 2. Mitteilung. Diuron und Afalon

Fd Cosmet. Toxicol. Vol. 3, pp. 797-802. Pergamon Press 1965. Printed in Great Britain

Uber den Stoffwechsel yon Harnstoff-Herbiciden in der Ratte. 2. Mitteilung. Diuron und Afalon C. B"HME und W. ERNST* Bundesgesundheitsamt, Max yon Pettenkofer-lnstitut, Laboratoriumfiir Ernahrungshvgiene, 1 Berlin-33, Deutschland (Eingegangen am 31 Dezember 1965)

Zusammenfassung--Es wurde der Stoffwechsel von N-(3.4-Dichlorphenyl)-N'. N'-dimethylharnstoff (Diuron) und N-(3.4-Dichlorphenyl)-N'-methyl-N'-methoxyhamstoff (Afalon) im Rattenorganismus untersucht. Die Umwandlungen dieser Pflanzenschutzmittel erfolgen im wesentlichen auf dem gleichen Wege wie bei Monuron bzw. Are.sin (s. 1. Mitteilung; Ernst u. B6hme, 1965. Die Mehrzahl der im Ham gefundenen Metaboliten besitzen noch die Struktur eines Hamstoffs und sind durch Entalkylierung und Hydroxylierung aus den verfiitterten Substanzen entstanden. Die Synthesen einiger bisher unbekannter Vergleichssubstanzen werden beschrieben. EXPERIMENTELLER TEIL N~ihere Angaben s. 1. Mitteilung (Ernst u. B6hme, 1965). Versuchstiere und Dosierung. Die Herbicide wurden als Erdnuss/51-Suspensionen (50 mg Wirkstoff in 1 ml Ol pro Tier) mit der Schlundsonde an m~innliche Albinoratten aus der Laboratoriumszucht verabreicht. Aufarbeitung des Hams. Die Gewinnung der Metaboliten aus dem H a m erfolgte nach dem Extraktionsschema in Abbildurtg. 1 der 1. Mitteilung (Ernst u. B~Shme, 1965). Diinnschichtchromatographie und Nachweisreagenzien. Als Adsorptionsmittel in der Diinnschichtchromatographie wurden Kieselgel-G und K J e s e l g e l - G F ~ benutzt. D a alle gefundenen Metaboliten eine Fluorescenzl6schung bewirken, war durch die Verwendung des Kieselgels-GF2s 4 die diinnschichtchromatographische Isolierung der Metaboliten wesentlich erleichtert. Die Fliessmittel sowie die Rr-Werte und Farbreaktionen mit den verschiedenen Spriihreagenzien sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Trennung und Identifizierung isomerer Verbindungen (z.B. N-(2-Hydroxy-3.4-dichlorphenyl)- und N-(2-Hydroxy-4.5-dichlorphenyl)-harnstoff) war nur mit Hilfe zweidimensionaler Chrom a t o g r a m m e mit den Fliessmitteln H I und IV m~Sglich. lsolierung der Metaboliten. Die bei Monuron bzw. Aresin benutzten Verfahren wurden urn die Verteilungschromatographie an Kieselgur erweitert, wodurch einige phenolische Metaboliten isoliert werden konnten. 12 g Kieselgur wurden mit 6 ml Borax-Puffer v o m p H 8,5 verrieben und in eine kleine S~ule yon 1 cm Durchmesser eingeschl~immt. Die Elution erfolgte nacheinander mit Cyclohexan, Cyclohexan/Chloroform 75:25, 50:50, 25:75, Chloroform und Chloroform/Athanol 90:10.

*Jetzige Adresse: Chemische Abteilung, lnstitut fur Meeresforschung, 285 Bremerhaven, Am Handelshafen 12. 797

798

C.

BOHME und

w.

ERNST

Tabelle 1. RF Werte und Farbreaktionen RF-Werte in Fliessmittel II

III

IV

0,10

0,32

0,57

0,79

--

0,22 0,77

0,52 0,79

0,76 0,93

0,91 0,89

---

0,37

0,60

0,70

0,75

0,29

0,57

0,68

0,53

-gelborange dunkel- gelbgrau orange blau --

0,05

0,24

0,32

0,38

blau

0,16

0,50

0,54

0,65

blau

0,28

0,60

0,69

0,42

blau

0,05

0,21

0,37

0,21

blau

0,16

0,37

0,53

0,43

blau

Metabolit N-(3.4-Dichlorphenyl)harnstoff N-(3.4-Dichlorphenyl)N'-methylharnstoff 3.4-Dichloranilin 2-Amino-4.5-dichlorphenol " 2-Acetamido-4.5-dichlorphenol N-(2-Hydroxy-4.5-dichlorphenyl)-harnstoff N-(2-Hydroxy--4.5-dichlorphenyl)-N'-metbylharnstoff 6-Acetamido-2.3-dichlorphenol N-(2-Hydroxy-3.4-dichlorphenyl)-harnstoff N-(2-Hydroxy-3.4-dichlorphenyl)-N'-methylharnstoff

Farbreaktion mit a

b

c

d

FL:]:

gelb

gelb

e

--

orange

schwarz* rotbraun

FL FL FL FL

grau*

--

FL

--

grau*

--

FL

--

braun'l-

--

FL

schwarzt

--

FL

grau*

--

FL

gelb --

Fliessmittel. (I) Chloroform/Athanol = 97:3 ;

(I1) Chloroforrn/.A.thanol = 90:10; (IV) Chloroform/.~thanol/konz. Ammoniak =50:50:5. Spriihreagenzien. (a) 2.6-Dichlorchinonchlorimid; (b) p-Dimethylaminobenzaldehyd; (c) Silbernitrat; (d) Diazotieren-Kuppeln; (e) Betrachtung von Ki~selgel-GF254-Platten im UV-Licht. *Eintritt der F~irbung sofort oder innerhalh yon 2 Min. Nach Entwicklung mit Fliessmittel III tritt die Farbung erst sp/iter ein. "l'Eintritt der F~rbung nach ca. 10 Min. :I:FL = Fluorescenzl6schung. (lid Chloroform/~thanol/Eisessig = 90:5:5 ;

Quantitative Bestimmungen. D a s Verfahren zur mengenm~issigen Erfassung der ausgeschiedenen M e t a b o l i t e n w u r d e v o m M o n u r o n bzw. A r e s i n i i b e r n o m m e n . Darstellung der Vergleichssubstanzen. Ein Teil d e r Vergleichssubstanzen w u r d e n a c h L i t e r a t u r a n g a b e n dargestellt: N - ( 3 . 4 - D i c h l o r p h e n y l ) - N ' - m e t h y l h a r n s t o f f (Todd, 1953), 2 - A m i n o - 4 . 5 - d i c h l o r p h e n o l (Acheson u. T a y l o r , 1956). V o n d e n F a r b w e r k e n H o e c h s t A . G . , F r a n k f u r t ( M ) - H o e c h s t w u r d e n uns folgende V e r b i n d u n g e n zur Verfiigung gestellt: N-(3.4-Dichlorphenyl)-harnstoff, N-(3.4-Dichlorphenyl)-N'-methoxyharnstoff, N-(3.4Dichlorphenyl)-N'-hydroxyharnstoff, N-(3.4-Dichlorphenyl)-N'-methyl-N'-hydroxyharnstoff. 2 - C h l o r - 5 - a c e t a m i d o p h e n o l (XI): 718 m g 5 - A m i n o - 2 - c h l o r p h e n o l (5mmol) w e r d e n m i t 10 ml Essigs~iureanhydrid-L~Ssung (1,2 ml Essigs~iureanhydrid in 50 ml Eisessig) 30 Min. i m siedenden W a s s e r b a d erkitzt. D a s R e a k t i o n s p r o d u k t wird m i t W a s s e r gef~illt. F. 2 1 0 212°C (aus 50% igem -~thanol). A n a l y s e : - b e r e c h n e t : 51,77~/o C, 4,34% H, 7,55% N ; g e f u n d e n : 51,07~/o C, 4,36% H, 7,55% N.

UBER DEN STOFFWECHSEL VON DIURON UND AFALON

799

N-(2-Hydroxy-4-chlorphenyl)-N'-methylharnstoff(XII): 718 mg 2-Amino-5-chlorphenol (5 mmol), geltSst in absolutem Benzol, werden mit 5 rnmol Methylisocyanat in 10 ml absolutem Benzol versetzt. Nach 4-sttindigem Stehen bei Raumtemperatur wird der kristaUine Niederschlag abgesaugt.F. 172-173°C (aus50 ~igem ~,thanol).Analyse:- berechnet: 47,89% C, 4,52% H, 13,96% N; gefunden: 48,15% C, 4,77% H, 13,24% N. N-(3-Hydroxy-4-chlorphenyl)-N'-methyl_harnstoff: Analog vorstehender Verbindung aus 5-Amino-2-chlorphenol. F. 184-186°C (aus 50 ~igem Nthanol). Analyse :- berechnet: 47,89~ C, 4,52~o H, 13,96~ N; gefunden: 47,81 ~ C, 4,82~o H, 13,48~o N. 6-Nitro-2.3-dichlorphenol: Zu 4,9 g 2.3-Dichlorphenol (30 mmol) in 30 ml Eisessig werden bei Raumtemperatur 1,2 ml Salpeters~iure (D. 1,52) unter Rfihren zugetropft, das Gemisch wird 5 Min. im siedenden Wasserbad erhitzt und auf Eis gegossen. Aus dem Niederschlag wird dutch Wasserdampfdestillation das 6-Nitro-2.3-dichlorphenol gewonnen. F. 71-73°C (aus 50°oigem Athanol). Analyse:-berechnet: 34,65% C, 1,45% H, 6,73% N; gefunden: 34,93% C, 1,67% H, 6,97% N. 6-Amino-2.3-dichlorphenol (XIII): 2,1 g vorstehender Nitroverbindung (10 mmol) werden mit Natrium dithionit reduziert. F. 93°C (aus Wasser). Analyse :- berechnet: 40,48% C, 2,83% H, 7,87% N; gefunden: 39,86% C, 2,99% H, 7,92% N. 6-Acetamido-2.3-dichlorphenol: Diese Verbindung wird analog XI aus 360 mg vorstehenden Aminophenols (2 retool) dargestellt. F. 156-157°C (aus Dioxan/Wasser). Analyse :berechnet: 43,66°~ C, 3,21°/"o H, 6,37% N; gefunden: 43,02% C, 3,39% H, 6,18% N. N-(2-Hydroxy-3.4-dichlorphenyl)-harnstoff (X): 360 mg XIII (2 mmol) werden mit tiberschtissiger Salzs~iure zur Trockne gebracht, und das Hydrochlorid wird mit der berechneten Menge Kaliumcyanat in wenig Wasser 15 Min. auf 60-80°C erhitzt. F. 183°C (aus Wasser). Die Schmelze erstarrt bei weiterem Erhitzen. Analyse:- berechnet: 38,03% C, 2,74% H, 12,67% N; gefunden: 37,82% C, 2,99% H, 11,84% N. N-(2-Hydroxy-3.4-dichlorphenyl)-N'-methylharnstoff: Die Darstellung erfolgte analog XII aus 360 mg XIII. F. 171-173°C (aus 50%igem )~thanol). Analyse:- berechnet: 40,88% C, 3,43% H, 11,82% N; gefunden: 40,63% C, 3,67% H, 11,76% N. 2-Acetamido-4.5-dichlorphenol: Analog XI aus 530 mg 2-Amino-4.5-dichlorphenol (3 mmol). F. 235-236°C (aus Toluol). Analyse :-berechnet: 43,66% C, 3,21% H, 6,37% N; gefunden: 43,17% C, 3,17% H, 6,24% N. N-(2-Hydroxy-4.5-dichlorphenyl)-harnstoff. Analog X aus 710 mg 2-Amino-4.5-dichlorphenol (4 mmol). F. 173-176°C (aus Wasser). Analyse :- berechnet (als Hydrat): 35,17% C, 3,37% H, 11,72% N; gefunden: 35,01% C, 2,90% H, 11,66% N. N-(2-Hydroxy-4.5-dichlorphenyl)-N'-methylharnstoff. Analog XII aus 710 mg 2-Amino4.5-dichlorphenol. F. 179-180°C (aus 50%igem _~thanol). Analyse :-berechnet (als Hydrat): 37,96% C, 3,98% H, 11,07% N; gefunden: 38,52% C, 3,98% H, 10,60% N. ERGEBNISSE UND DISKUSSION Einen Oberblick tiber die Anzahl der durch Ratten ausgesckiedenen Metaboliten gaben Diinnschichtchromatogramme der verschiedenen Harnextrakte. Die Reaktion mit den einzelnen Spriihreagenzien lieferte Anhaltspunkte fiber den chemischen Aufbau der Stoffwechselprodukte. Unverandertes Diuron bzw. Afalon konnte nicht gefunden werden. Die Metaboliten waren in der Hauptsache Harnstoffderivate, daneben traten 3.4-Dichloranilin und dessen Derivate auf.

8oo

c. BiSHME und w. ERNST

Die in der 1. Mitteilung (Ernst u. B6hme, 1965) aufgezeigten Umwandlungsmechanismen gelten auch Ftir D i u r o n und Afalon. Bei beiden Herbiciden Liberwiegt die teilweise oder vollst~indige Entmethylierung (bzw. "Entmethoxylierung" beim Afalon) mit gleichzeitiger Hydroxylierung des Benzolkerns. D a n e b e n wird beim D i u r o n eine betrtichthche Menge N-(3.4-Dichlorphenyl)-harnstoff durch die Ratte ausgeschieden, der beim Afalon fast keine Rolle spielt. In Tabelle 2 sind die gefundenen Metaboliten und ihre mengenm~issige Ausscheidung zusarnmengefasst. Die Identifizierung der einzelnen Stoffwechselprodukte erfolgte durch IR-Spektroskopie, Schmelzpunkte und ihr chromatographisches Verhalten. Fiir die Hydroxylierung der Harnstoff-Herbicide (N-(3.4-Dichlorphenyl)-harnstoffDerivate) a m Benzolkern stehen 3 freie Stellen zur Verfiigung. Von den drei theoretisch m~Sglichen isomeren Hydroxyverbindungen konnten zwei mit Sicherheit identifiziert werden. Die quantitative Bestimmung ergab, dass die 6-Stellung--wahrscheinlich aus sterischen G r i i n d e n - - stark bevorzugt wird. Hydroxylierung in der 2-Stellung tritt nur in untelgeoldnetem Masse auf, w~hrend 5-Hydloxyverbindungen nur in Spuren v o r h a n d e n sein k6nnen. So konnten in den Extrakten des Afalon-Harns geringe Mengen einer Substanz nachgewiesen welden, deren chromatographisches Verhalten ( R r - W e r t , Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd und 2.6-Dichlorchinonchlorimid) a u f N-(5-Hydroxy-3.4dichlorphenyl)-harnstoff hinweist. Tabelle 2. Ubersicht iiber Art und Menge der nach Verjiitterung yon Diuron und Afalon ausgeschiedenen Metaboliten

Diuron Metabolit N-(3.4-Dichlorphenyl)-hamstoff (a) N-(3.4-Dichlorphenyl)-N'methylharnstoff (a) 3.4-Dichloranilin (b) 2-Amino-4.5-dichlorphenol (b) 2-Acetamido-4.5-dichlorphenol (a) N-(2-Hydroxy-4.5-dichlorphenyl)harnstoff (a) N-(2-Hydroxy-4.5-dichlorphenyl)N'-methylharnstoff (a) 6-Acetamido-2.3-dichlorphenol Co) N-(2-Hydroxy-3.4-dichlorphenyl)harnstoff (a) N-(2-Hydroxy-3.4-dichlorphenyl)N'-methylharnstoff (b) N-(5-Hydroxy-3.4-dichlorphenyl)hamstoff (7)

frei

Afalon

gebunden* gesamt

frei

gebunden*

gesamt

8,2%

--

8,2%

0,3%

--

0,3%

+ + + --

--0,7% +

n.b. n.b. 0,7% n.b.

+ 0,2% + +

--1,5% +

n.b. 0,2% 1,5% n.b.

6,6%

4,9%

11,5%

0,8%

7,3%

8,1%

+ --

+ +

n.b. n.b.

---

+ +

n.b. n.b.

0,2%

0,6%

0,8%

0.1%

0,6%

0,7%

--

+

n.b.

--

--

--

+

n.b.

.

.

.

.

Die ausgeschiedenen Mengen beziehen sich auf je insgesamt 1,5 g verffitterte Substanz in einem Zeitraum yon 6 Tagen. (a) = Isolierte Verbindung; (b) = Nicht isoliert, aber chromatographisch identisch mit entsprechender authentischer Substanz; (?) = Mutmasslicher Metabolit; n.b. = Nicht bestimmt (<1%). #Als Glucuronid oder Sulfat.

UBER DEN STOFFWECHSEL VON DIURON UND AFALON Abbildung]l.

801

Obersicht iiber die wichtigsten Abbaureaktionen der untersuchten Herbicide Entalkylierung und Entalkoxylierung ohne Kernhydroxylierung

/CH3 --CO-N

Cl

/OCH3 NH--CO-N

(11

Ct

/CH~ NH--CO--lq

(V)

NH--CO-NH z

8.2% "\CL

CL 0 . 3 - / . ~

(m)

Ct

Ct ([l)

Ct

(3/:I)

,OCHj NH--CO--N'

CL CL (IV)

Entalkylierung und Entalkoxylierung mit Kernhydroxylierung --CO-

I 2-2%//~

oH

Ct

/

NHz

(IX)

"'--%

/CH3 CH~ ~ O H I~

6"5%__

Ct

I

3

12"2%

(I)

Cl

('~II)

(HI

Ct

NH~O_/CH:s \

~.

CH, . 0

NH--CO--NH

~.

z

'CH3 CL

Ct

CI

(ITr) "~*

,OCH} .-co-~

C(.

(]~]/I)

(/~)

INH_CO._.NHz ~ / ' / "

Ct

I:HI: V: VII: IX:

Monuron Diuron N-(4-Chlorphenyl)-harnstoff N-(2-Hydroxy-4-chlorphenyl)-harnstoff N-(3-Hydroxy-4-chlorphenyl)-harnstoff

II: IV: VI: VIII: X:

Aresin Afalon N-(3.4-Dichlorphenyl)-harnstoff N-(2-Hydroxy-4.5-dichlorphenyl)-harnstoff N-(2-Hydroxy-3.4-dichlorphenyl)-harnstoff

Einen ~berblick tiber die wichtigsten Abbaureaktionen der untersuchten Herbicide vermittelt die Abbildung 1. Der gr6sste Tell der hydroxylierten Metaboliten wurde in Form yon Konjugaten mit Glucuron- und Schwefels[iu re ausgeschieden. Die Konjugate wurden enzymatisch gespalten. H

802

C. BOHME u r t d w . ERNST

Anerkennungen--Wir danken den Farbwerken Hoechst A.G., vormals Meister Lucius & Briining, Frankfurt/M.-Hoechst, f'tir die L'rberlassung des Wirkstoffs Afalon und verschiedener Vergleichssubstanzen sowie

der Firrna Du Pont De Nemours International S.A., Genf, for die Bereitstellung des Wirkstoffs Diuron. Herrn Diplom-Chemiker W. Grunow danken wir fiir zahlreiche Anregungen zur Synthese der Vergleichssubstanzen sowie Frau O. Ebert, Fr~iulein S. Strauss un Frau R. Zimmermann f~ir ihre Mitarbeit.

LITERATUR Acheson, R. M., Taylor, N. F. (1956). Two hypothetical metabolites of Proguanil ("Paludrine"). J. chem. Soc, p. 4727. Ernst, W. u. Brhme, C. (1965). ~ b e r den Stoffwechsel von Harnstoff-Herbiciden in der Ratte. 1. Mitteilung. Monuron und Aresin. Fd Cosmet. ToxicoL 3, 789. Todd, C. W. (1953). Substituted ureas as herbicides. US Patent No. 2,655,447 (E. J. Du Pont De Nemours & Co.).

The metabolism of urea herbicides in the rat. P a r t II. Diuron and Afalon Abstract--The metabolism of N-(3,4-dichlorophenyl)-N',N'-dimethylurea (Diuron) and N-(3,4-dichlorophenyl)-N'-methyl-N'-methoxyurea (Afalon) has been studied in the rat. These compounds are metabolized in essentially the same way as Monuron and Aresin (Ernst & Brhme, 1965). The majority of the metabolites excreted in the urine retained the urea moiety and resulted from hydroxylation and dealkylation of the administered compounds. The syntheses of previously unknown reference compounds are described.

Le m~tabolisme des herbicides ur~iques ehez le rat. 2~me Partie. Diuron et Afalon R~sum~---Le mrtabolisme du N-(3,4-dichlorophrnyle)-N'.N'-dim~thylur~e (Diuron) et du N-(3,4-dichlorophrnyle)-N'-m~thyl-N'-methoxyur~e (Afalon) a ~t~ ~tudi6 chez le rat. Ces compos~s sont mrtabolis~s d'une fa~on tout ~. fait semblable au Monuron et ~ l'Aresin (Ernst et Brhme, 1965). La majeure partie des mrtabolites excretes dans les urines conservent la portion mol&:ulaire ur~ique et provient de l'hydroxylation et de la d~salkylation des compos~s administrrs. La synth~e de compos~s types de rrfrrence, inconnus auparavant, est d&:rite.