Über die chromatographische auftrennung sowie aktivierung und inaktivierung der alkalischen phosphatase aus hühnerdarm

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BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA BBA

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~3BER DIE CHROMATOGRAPHISCHE AUFTRENNUNG SOWIE AKTIVIERUNG UND INAKTIVIERUNG DER ALKALISCHEN PHOSPHATASE AUS Ht3HNERDARM

HELGA SCHt3SSLER

Institut fi~r Strahlenbiologie, Kernforschungszentrum, Karlsruhe (Deutschland) (Eingegangen am I8.September, i967)

SUMMARY

The chromatographic separation, the activation and inactivation of alkaline phosphatase from chicken intestine A procedure for purification and separation of four isoenzymes of alkaline phosphatase (orthophosphoric monoester phosphohydrolase, EC 3.1.3. I) from chicken intestine is described. Gel filtration on Sephadex G-2oo and ion-exchange chromatography on DEAE-Sephadex A-25 with NaCl-gradient in Tris buffer were used. In the presence of Mg~+ all four of the isoenzymes are activated, while Na2H2EDTA inhibits them in a two-step process. This result provides further proof that two metal atoms per enzyme molecule are present. Only one of the isoenzymes is inactivated by Na2CaEDTA. Since the other three phosphatases are not inhibited by Na2CaEDTA, it is supposed that Ca2+ is exchanged for Zn 2+ and that the calcium phosphatases are more active than the original enzymes.

EINLEITUNG

Die alkalische Phosphatase (Orthophosphors~ure Monoester Phosphohydrolase, EC 3.1.3.1) ist sowohl in tierischen als auch pflanzlichen Geweben weit verbreitet und dient h~tufig als Objekt ffir Untersuchungen tiber die Aktivierung und Inaktivierung der enzymatischen Katalyse durch Metallionen und Chelatbildner. Allerdings sind wegen der mangelnden Reinheit der EnzymprAparate und der unterschiedlichen Verunreinigungen h~tufig eindeutige und reproduzierbare Ergebnisse kaum m6glich. Aul3erdem konnten mehrere Autoren 1-7 nachweisen, dab die alkalische Phosphatase bei Chromatographie an Ionenaustauscher-Cellulose oder bei Elektrophorese sich als heterogen erweist und eine Auftrennung in Isoenzyme m6glich ist. Es schien sehr wahrscheinlich, dab diese chromatographisch trennbaren Enzyme sich auch bei der Hemmung und Aktivierung verschieden verhalten und dab folglich die Gewinnung chromatographisch einheitlicher Enzymfraktionen eine wesentliche Voraussetzung ffir eine Untersuchung fiber die Einwirkung von Metallionen bzw. Chelatbildner ist. Biochim. Biophys. Acta, 151 (1968) 383-393

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H. SCH ("SSLIVR

Da eine aus Htihnerdarm gewonnene Phosphatase als weitgehend gereinigtes Prtiparat im Handel ist, kommt ihrer Reindarstellung und Auftrennung, die bis jetzt, soweit uns bekannt ist, noch nieht beschrieben ist, gr6Bere Bedeutung zu. In der vorliegenden Arbeit wird eine Methode zur pr~iparativen chromatographischen Auftrennung eines konunerziell erh/iltlichen Phosphataseprtiparates aus Htihnerdarm in vier Isoenzyme angegeben. Das Verhalten der gewonnenen Enzyme bei Einwirkung von Mg "+- und Ca 2-}-Ionen sowie von ]XAhylendiamintetraessigstiure (EDTA) wird beschrieben. MATERIAI.IEN UND METHODEN

Alkalische Phosphatase aus Htihnerdarm von Worthington Biochemical Corporation, Freehold, N.J. Sephadex G-25 rein, G-Ioo, G-2oo und DEAE-.Set)hadex A-25 yon der Deutschen Pharmacia, Frankfurt. Biochemica-Test-Combination ftir alkalische Phosphatase TC-P von Boehringer, Mannheim. Alle tibrigen Chemikalien von Merck, Darmstadt. Die chromatographischen Trennungen erfolgten unter sterilen Bedingungen in einem Kiihlraum (4°). Die Pufferl6sungen und Dextrangele wurden 2o Min bei 12o' autoklaviert. Zur Prtifung auf Keimfreiheit wurden o. I ml der L6sung auf Agarptatten aufgetragen und 24 Std bei 37 ° inkubiert.

Gelfiltration iiber Sephadex G-2oo 200 mg des Rohenzyms wurden in 15 ml o.oi M Trispuffer, der einen Salzgehatt von o.05 M NaC1 und einen pH-Wert von 8.0 hat, gel6st, auf eiue S~ule yon G-2oo (2.5 cm × 12o cm) aufgetragen und mit dem bereits genannten Puffer eluiert. Das Eluat wurde mit einem FraktionssaInmler in 3.0 ml-Fraktionen aufgefangen, in denen die Absorption bei 280 m#, die enzymatisehe Aktivit~tt und der Kohlenhydratgehalt bestimmt wurden. Die Fraktionen mit hoher enzymatischer Aktivit/it wurden gesammelt und tiber Ionenaustauseher-Sephadex welter aufgetrennt. Die Gelfiltration tiber G-Ioo wurde entsprechend ausgeftihrt.

Chromatographische Trennung iiber DEAE Sephadex A-2 5 Das durch (;elfiltration vorgereinigte Enzym wurde auf eine S/~ule wm D E A E Sephadex A-25 (2.0 cm × 12o crn), die IO Std mit dem Anfangspuffer (O.Ol MTris+ o.o5 M NaC1) vorgesptilt worden war, aufgetragen. Als Elutionsgradient diente o.oi M Trispuffer (pH 8.o), dessen NaC1-Gehalt yon o.o5 bis o.I6 M linear anstieg. Die Gr6Be der Fraktionen betrug 3 ml. Es wurden die Absorption bei 28o m# und die enzymatische Aktivit/it nach den beiden angegebenen Methoden bestimmt. Die Fraktionen einer Komponente mit hoher Enzymaktivit/it wurden gesammelt und reehromatographiert.

Rechromatographie Um die getrennten Enzyme rechromatographieren zu k6nnen, wurden sie durch Gelfiltration tiber eine S/iule von Sephadex G-25 fein (3 cm × 40 cm) wieder in den Anfangspuffer tiberftihrt. Die Enzym16sung wurde dann ohne vorhergehendes Einengen auf eine A-25-S/iule aufgetragen und mit dem oben genannten Gradienten rechromatographiert. 13iochim. Biophys. Acla, 151 (1968) 383--393

ALKALISCHE PHOSPHATASE

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Bestimmung der enzymatischen A ktivitdt (A) Die enzymatische Aktivit/it bestimmten wir nach der Methode y o n BESSEY, LOWRY UND BROCKs mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat in Glycinpuffer (Test16sung von Boehringer & S6hne, Mannheim) : 0.02 ml Enzyml6sung wurden in I.O ml Substratl6sung bei 37 ° inkubiert. Nach 30 Min wurde die Reaktion mit IO m! 0.05 M N a O H abgestoppt und die Absorption des freigesetzten p-Nitrophenol bei 400 m/~ bestimmt. (B) Die Bestimmung hoher Enzymaktivit/iten erfolgte nach der Methode von GAREN END LEVINTHAL9. Als Substrat diente eine 5 mMp-Nitrophenylphosphatl6sung in o.oi M Trispuffer, der I mM Magnesiumacetat enthielt. Der Verlauf der Hydrolyse bei p H lO.2 innerhalb I Min durch 0.05 ml Enzyml6sung bei 25 ° wurde bei 400 m# gemessen und automatisch registriert.

Bestimmung des Kohlenhydratgehalts Der Kohlenhydratgehalt der Enzyml6sung wurde in je o. 5 ml einer Fraktion mit Anthron nach der Methode yon LOEWUS1° bestimmt. Durch Inkubieren der Reaktionsl6sung bei IOO° konnte die Empfindlichkeit des Nachweises erh6ht werden. Nachweisgrenze : 5 y/ml.

Bestimmung des Proteingehalts Der Proteingehalt der Fraktionen wurde durch Messung der Ultraviolett-Absorption bei 280 m# in I cm-Ktivetten bestimlnt. Nach dem Rechromatographieren wurde der Proteingehalt durch die Messung der Intensit/it der Ninhydrinf/irbung nach alkalischer Hydrolyse bestimmt (HIRs, MOORE UND STEINll). 0. 5 ml einer Probe wurde mit I.O m! 2.5 M NaOH 2.5 Std bei 99 ° hydrolysiert, mit 0.3 ml Essigs/iure conc. neutralisiert und mit I.O ml Ninhydrinl6sung ~2versetzt. Nachdem die Reaktions16sung 15 Min auf IOO° erhitzt und mit 2.0 m150% )~thanol verdiinnt wurde, bestimmten wir die Extinktion bei 570 m/~.

Messung der Aktivierung bzw. Inaktivierung dutch Metallionen oder Chelatbildner Um die Einwirkung yon Metallionen und Chelatbildnern auf die alkalische Phosphatase zu prtifen, wurde die Enzymbestimmung nach GAREN END LEVINTHAL9 ausgefiihrt. Zur Substratl6sung (5 mM p-Nitrophenylphosphat in o.oi M Tris p H IO.O) wurde die entsprechende Menge der zu priifenden Substanz angegeben. Der Verlauf der Hydrolyse bei 300 durch o.I ml Enzyml6sung wurde bei Gegenwart von Metallionen nach i Min eine Minute lang und bei Einwirkung yon Chelatbildnern nach 2 Min zwei Minuten lang verfolgt und registriert. ERGEBN ISSE

Chromatographische A uftrennung Als ersten Schritt far die Reinigung des Rohenzyms benutzten wit die Gelfiltration. Wird Sephadex G-ioo ftir diese Trennung verwendet, so h~ilt das Dextrangel nur geringe Mengen an Verunreinigungen zurtick, und das Enzym wird mit der Hauptmenge der Verunreinigungen ohne Verz6gerung eluiert. Benutzt man hingegen zur Gelfiltration Sephadex G-2oo, so wird eine Trennung der Hauptmenge des verunreinigenden Ultraviolett-absorbierenden Materials und des Kohlenhydrats yon dem Biochim. Biophys. Acta, 151 (1968) 383-393

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Enzym erreicht (s. Abb. I). Der erste Peak (Frakt. 50 65) enth< bei sehr geringer enzymatischer Aktivitfit grol3e Mengen an Kohlenhydrat und zeigt starke Absorption bei 28o mr. Ein zweiter kleiner Peak der Ultraviolett-Absorption (Frakt. 72-94 ) hat nur einen geringen Gehalt an Kohlenhydrat, jedoch hohe enzymatische Aktivit~it.

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A b b . 2. Auftrennung des vorgereinigten E n z y m s iiber D E A E S e p h a d c x A - z 5 (2.0 c m × ~ -,0 c m ) mit einem NaC1-Gradienten y o n o . o 5 b i s o . 1 6 M i n o . o i M T r i s p u f f e r y o n p H 8.o.

Biochim. Biophys. Acla, I 5 i (T9683 3 8 3 "393

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ALKALISCHE PHOSPHATASE

Das Maximum des Aktivitiitspeaks tritt erst auf, wenn der gr6Bte Teil des Ultraviolettabsorbierenden Materials eluiert ist. Da beim Gefriertrocknen eine starke Denaturierung des Enzyms auftrat, wurde die vorgereinigte alkalische Phosphatase ohne vorhergehendes Einengen auf eine S~tule von DEAE-Sephadex A-25 aufgetragen und mit einem NaC1-Gradienten in Tris-Puffer vom pH 8.0 eluiert (s. Abb. 2). Eine geringe Enzymmenge wurde unter diesen Bedingungen nicht absorbiert. Mit Anstieg des Gradienten beginnt die Elution des Enzyms, das sich in diesem Verfahren in 4 Peaks auftrennen l~Bt. In den Fraktionen, die maximale Enzymaktivit~tt zeigten, konnte mit der Anthronmethode kein Kohlenhydrat mehr nachgewiesen werden. Alle vier Isoenzyme, die mit AP I, AP II, AP III und AP IV bezeichnet werden, lieben sich in dem gleichen Trennsystem rechro-

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Abb. 3. R e c h r o m a t o g r a p h i e der g e t r e n n t e n P h o s p h a t a s e n tiber D E A E S e p h a d e x A-25 (2.0 c m X 12o cm) m i t e i n e m NaC1-Gradienten y o n 0.o 5 bis o.16 M in o.oi M Trispuffer y o n p H 8.0.

Biochim. Biophys. Acta, 151 (1968) 383-393

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Froktionsnummer A b b . 4. 2. R e c h r o m a t o g r a p h i e y o n A_P [ [ 1 i~ber D E A E - S e p h a d e x A - 2 5 (z.o cm. X 12o c m ) m i t e i n e m N a C I - G r a d i e n t e n y o n o . o 5 b i s o . o 8 6 M in o . o t M T r i s p u f f e r v o n p H 8.o.

matographieren und eluieren in der gleichen Reihenfolge mit steigender Salzkonzentration (s. Abb. 3). Da die Fraktionen nur noch geringe Ultraviolett-Absorption batten, wurde der Proteingehalt mit der Ninhydrinmethode nach alkalischer Hydrolyse bestilnmt. Dabei zeigte sich, dab die alkalische Phosphatase I n und IV noch Verunreinigungen yon Proteinen aufwies, die init einer Salzkonzentration von etwa o.I M v o n d e r S~iule eluiert wurden. Durch nochmaliges Chromatographieren tiber D E A E Sephadex A-25 mit einem Gradienten, dessen Endkonzentration von o.16 M auf o.o86 M NaC1 herabgesetzt worden war, lie[} sich auch die alkalische Phosphatase I I I , die den gr6Bten Anteil an der Gesamtaktivit~it hat, als chromatographisch einheitliches E n z y m erhalten (s. Abb. 4)-

Akdviermzg mid Inaklivierung Um zu prtifen, ob die vier erhaltenen Isoenzyme Unterschiede in ihren enzymatisehen Eigenschaften aufweisen, wurde die Einwirkung yon Magnesium- und Calciumacetat sowie von den Natrium- und Calciumverbindungen der EDTA auf die AktivitSt der Enzyme bei p H IO.O untersucht. Dutch Zusatz yon Magnesiumacetat zur Substratl6sung wird die enzymatische Hydrolyse aller alkalischen Phosphatasen beschleunigt (s. Abb. 5). Die st~irkste Aktivierung erffihrt AP I, bei der die Anfangsgeschwindigkeit der hydrolytischen Spaltung den I8-fachen Wert der Kontrolle annimmt. I m Gegensatz zu den tibrigen alkalischen Phosphatasen wird bei AP I I I mit o.I mM Magnesiumacetat bereits das Maximum der Aktivierung erreicht. Bei weiterer Erh6hung der Salzkonzentration tritt eine Abnahme der Aktivit~tt ein. Die Steigerung der Katalyse von AP I I und IV durch Magnesiumacetat ist bedeutend geringer als die bei AP I u n d I n ; am schwS.chsten ist die Aktivierung des Rohenzyms. Biochim. Bioph),s. ,tcta, 15 [ (t9(~8) 3 8 3 3 9 3

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Abb. 5- Einwirkung yon Magnesiumacetat auf alkalische Phosph&tase bei pH io.o. Abb. 6. Einwirkung yon Na2H2EDTA auf alkalische Phosphatase bei pH io.o.

In Gegenwart yon Na2H2EDTA wird die Katalyse aller alkalischen Phosphatasen gehemmt, und zwar ist der Verlauf der Inaktivierungskurve mit zunehmender Konzentration an Cholatbildner sehr ~hnlich (s. Abb. 6). Bei einer Konzentration yon I/~M Na2H2EDTA betr~gt der Aktivit~tsverlust aller alkalischen Phosphatasen etwa 20 %. Bei Erhfhung der Chelatbildnerkonzentration auf 5/aM tritt eine starke Hemmung auf, die bei den einzelnen Isoenzymen einen unterschiedlichen Wert erreicht und bis zu einer Konzentration von 0.5 mM NazH2EDTA unver~ndert bleibt. Erst wenn der Gehalt an Chelatbildnern tiber 0.5 mM ansteigt, tritt bei allen Enzymen erneut ein weiterer Abfall der Aktivit~tt ein. Das Rohenzym zeigt bei 50 #M noch keinen Aktivitittsverlust, erst oberhalb von o.I mM Na2H2EDTA tritt eine Hemmung yon 30% auf, die dann bei einer Konzentration yon 5 mM Na~H2EDTA 90% erreicht. Die einzelnen Enzyme weisen ein sehr unterschiedliches Verhalten bei tier Einwirkung yon Na2CaEDTA auf (s. Abb. 7). Nur AP III wird durch das Calciumchelat der EDTA stark gehemmt. Diese Hemmung tritt aber erst bei Konzentrationen auf, die um eine Gr68enordnung h6her liegen als die des Natriumsalzes und erreicht ebenfalls bei I mM einen Weft von etwa 90%. AP I und II werden mit o.I mM Na2CaEDTA geringffigig aktiviert, bei Erhfhung der Chelatbildnerkonzentration geht diese Aktivierung jedoch wieder zurtick. AP IV zeigt bei Einwirkung von Na2CaEDTA eine Aktivierung, die ab o.I mM mel3bar ist und bei I mM das 2.3-fache der Ausgangsaktivitltt erreicht. Na2CaEDTA bewirkt bei dem Rohenzym eine bedeutend St~rkere Aktivierung als bei AP IV, bei I mM ist die Hydrolysegeschwindigkeit des Rohenzyms 6 mal so groB wie bei der Kontrolle. Um zu untersuchen, inwieweit diese Effekte auf der Wirkung des Ca 2+ beruhen, wurden Messungen in Gegenwart von Ca u+, jedoch bei Abwesenheit yon EDTA durchgeffihrt. Dabei ergab sich ftir alle alkalischen Phosphatasen mit Ausnahme der AP III eine Aktivierung, die bei i mM Ca 2÷ etwa das Dreifache der ursprfinglichen Aktivit~t erreicht und somit nur ein Zehntel der Aktivierung betr~gt, die durch Mg 2+ bewirkt wird. Die enzymatische Katalyse des AP III wird durch Ca 2+ nicht beeinflul3t. Biochim. Biophys. Acta, i5i (I968) 383-393

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W eiter e E ig e~zschafle~z Das Verhalten der vier Enzyme gegeniiber/~,nderungen des pH-Wertes ist weitgehend/ihnlich, hn neutralen pH-Bereich zeigen sie nur geringe enzymatische Aktivit~it, die mit Anstieg des pH-Wertes bis auf lO.2 stark zunimmt. Denaturierung der alkalischen Phosphatasen tritt sehr schnell beim Ansfiuern wie auch beim (;efriertrocknen der neutralen und alkalischen Enzyml6sungen ein.

DISKUSSION

Das Molekulargewicht der alkalischen Phosphatase wird nach den bisherigen Bestimmungen mit 8o ooo angegeben 9,1a. Den gleichen Wert fanden wir auch nach der Methode wm WHITAKERI<1'~.Mit dem ftir diesen Bereich empfohlenen Dextrangel Sephadex G-zoo konnte aber keine Trennung zwischen h6hermolekularen Verunreinigungen und Enzym erzielt werden, wie auch CSOPAK16bei Anwendung des gleichen Trennverfahrens auf alkalische Phosphatasepr~iparate aus B/ickerhefe zeigen konnte. Ein Grund daftir kann die starke Assoziation des Enzyms an Verunreinigungen, besonders an Kohlenhydrate, sein. Bei der beschriebenen Trennung fiber Sephadex G-2oo enthielt der erste Peak geringe enzymatische Aktivit~it, die yon kleinen Mengen an Verunreinigungen assoziierter Enzyms oder von aggregierten Enzymmolektilen herriihren kann. Vergleichbar mit diesem Ergebnis ist die Auftrennung der alkalischen Phosphatase aus Rindergalle (PETERLIK17). Die in der Auftrennung tiber D E A E Sephadex nachgewiesene Heterogenit~it der alkalischen Phosphatase kann auf Grund der Gelfiltration nicht auf unterschiedlichem Molekulargewicht beruhen; auch die bl6glichkeit, dab unterschiedlicher Kohlenhydratgehalt das Vorhandensein von Isoenzymen bewirkt, wie es v o n PORTMANN 18 angenommen wird, mug ausgeschlossen werden, gs ist vielmehr anzunehmen, dab geringe chemische Anderungen in der Sequenz des Enzyms, die evtl. auch durch die Aufarbeitung des Pr~tparats hervorgerufen werden k6nnten, vorliegen. Biochim. 13iophys..-t c/a, ~51 ( 1 9 6 8 ) 3 8 3 - 3 9 3

ALKALISCHE PHOSPHATASE

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Die aktivierende Wirkung der Mg 2+ auf verschiedene alkalische Phosphatasen ist schon vielfach nachgewiesen wordenS,9,19-~3. Von CLARK UND PORTEUS2~ wie auch von PLOCKE UND VALLEE21 wurde gezeigt, dab es nicht m6glich ist alkalische Phosphatase, die mit E D T A inaktiviert wurde, allein mit Mg 2+ zu reaktivieren. Dies ist nut dutch Zugabe von Metallionenpaaren wie Zn 2+ und Mg 2+, Co 2+ und Mg 2+, Zn ~+ und Co s+ oder Mg 2+ und Co 2+ m6glich. Eine Steigerung der enzymatischen Aktivit~it dutch Magnesium ist nut bei dem nativen Zn-haltigen E n z y m zu erzielen. Da alle vier von uns isolierten Isoenzyme durch Mg 2+ aktiviert werden k6nnen, mtissen sie alle bereits als Bestandteil ihres Molektils zweiwertige Metallionen enthalten. Damit ist auch die Annahme von CLOETENS24,25sowie CLARKUND PORTEUS23besttttigt, dab zur Entfaltung der vollen Aktivittit auBer den zur Aufrechterhaltung der Struktur notwendigen Metallen noeh weitere metallbindende Gruppen besetzt sein mtissen. Die geringe Aktivierung des Rohenzyms, aber auch yon AP I I und AP IV, k6nnte ihren Grund darin haben, dab die metallbindenden Gruppen bereits dutch Fremdionen besetzt oder aber ftir Magnesium schwer zugtinglich sind. Auch die Untersuchung der Inaktivierung durch Na~H~EDTA ftihrt zu der Annahme, dab das Rohenzym noch viele Fremdionen enthttlt. Da zuntichst die nicht an Protein gebundenen Metallionen durch EDTA abgefangen werden, mul3 die Konzentration an Chelatbildnern, die einen mel3baren Abfall der Aktivitttt verursacht, bedeutend hSher sein als bei den gereinigten Enzymen. Die Abht~ngigkeit der Inaktivierung der gereinigten alkalischen Phosphatasen yon der Na2H2EDTA-Konzentration bei p H IO.0 zeigt zwei Stufen (s. Abb. 6). Der erste Verlust der Aktivittit aller gereinigten Enzyme tritt bei einer Konzentration yon 5 /~M auf, und eine weitere H e m m u n g wird bei > 0 . 5 mM gemessen, die dann 9O~o erreicht. Diese zweistufige Kurve legt die Annahme nahe, dab die isolierten alkalischen Phosphatasen pro Molektil zwei Metallatome mit unterschiedlicher Stabilit~itskonstante enthalten. Dabei k6nnte es sich entweder um zwei verschiedene Metallatome handeln oder um zwei gleiche Metallatome, deren Bindung an das Protein verschieden stark ist. Da bereits von KUNITZ26 nachgewiesen wurde, da/3 die alkalische Phosphatase des Htihnerdarms ein Zinkenzym ist, liegt es nahe die Ergebnisse dieser Versuche in Analogie zu den Befunden v o n PLOCKE UND VALLEE 21 s o w i e SCHLESINGER UND BARRETT 13 bei der alkalischen Phosphatase aus Escherichia coli zu deuten, dab nttmlich pro Enzymmolektil zwei Zinkatome gebunden werden. Geht man v o n d e r Annahme aus, dab die Enzymaktivitttt dem Zinkgehalt proportional ist, so mtil3te nach Entfernung des ersten Zinkatoms noch 50 To Aktivit~it vorhanden sein. Bei allen gereinigten Enzymen tritt aber eine H e m m u n g auf, die gr613er als 50% ist. Daraus kann man schliei3en, dab das Zink nicht nur eine Rolle im enzymatischen Prozel3 spielt, sondern--da es eine Quervernetzung im Molektil bildet--auch von Bedeutung ftir die Aufrechterhaltung der Struktur ist. Durch Entfernen eines Zinkatoms k6nnte sich die Konformation verschieden stark iindern, und zwar in Abht~ngigkeit davon, in welchem MaBe sie durch weitere Quervernetzungen, wie Disulfid-, Salz- oder Wasserstoffbrticken oder hydrophobe Bindungen stabilisiert sind. Da die Erhaltung der Struktur durch das umgebende Medium und durch Fremdstoffe stark beeinflul3t wird, kann durch Entfernen eines Zinkatoms auch eine schw~ichere Inaktivierung auftreten. Unsere Resultate werden durch Arbeiten und Ergebnisse y o n SCHLESINGER tiber die alkalische Phosphatase aus E.coli untersttitzt. In diesen Untersuchungen 13 wird die St~uredenatmierung studiert, die unter Freisetzung des Zinks verlttuft, und zwar stellt diese Inaktivierung Biochim. Biophys. Acta, 151 (1968) 383-393

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H. SCH()SSLI{R

ebenfalls wie bei der Einwirkung von Na2H2EDTA einen zweistufigen Prozel3 dar. Bei weiteren Versuchen `,7 fiber die Aktivierung einer mutationsver/inderten Form der alkalischen Phosphatase, die kein Zink enth~ilt, wird keine Korrelation zwischen gebundenem Zink und erhaltener Aktivitfit, sondern eine Abhiingigkeit des Aktivit~itsgrades bei einer konstanten Zinkkonzentration wm dem pH-Wert und der lonenkonzentration gefunden. Diese Ergebnisse ffihren aueh zu der Ansicht, dab (tie wesentliehe Aufgabe des Zinks die Aufreehterhaltung der nativen Konfl)rmation ist. Weiteren Aufschlu[3 fiber das Metall im Molekiil der alkalischen Phosphatase geben die Versuche fiber die Einwirkung von Na2CaEDTA. In diesem Fall tritt nut bei AP I I I eine Inaktivierung auf, wShrend die anderen drei Isoenzwne eine geringe Aktivierung zeigen. Eine Inaktivierung durch NazCaEDTA sollte nur (taml m6glich sein, wenn das Metall eine h6here Affinit~tt zu EDTA hat als Ca" 4. I)a bei den Versuchen mit Na2H`,EDTA gezeigt werden konnte, dab die Stabilit/itskonstanten des Metallproteinkomplexes in den vier gereinigten Enzymen ungef/ihr gleich ist, mu[3 man annebmen, daI3 nicht nur bei AP I I I das urspriingliche Metall aus deln Enzymmolekfil, sondern auch bei den anderen Enzymen entfernt wird. Im (;egensatz zu AP I I I scheint bei den anderen Isoenzymen ein Ersatz des Zinks durch Calcium ohne Verlust der enzymatischen Aktivit~it mSglich zu sein. DaB diese Erhaltung der AktivitSt nicht auf einer Aktivierung yon nativem E n z y m durch Ca 'a~ beruhen kann, wodurch die Inaktivierung durch EDTA kompensiert wfirde, ergibt sich aus den Versuchen tiber die Einwirkung yon Ca"~. Um eine mel3bare Aktivierung zu erreichen, mul3 eine ('a`, < Konzentration yon IO IlM vorliegen, (tie aber bei der Einwirkung yon NaeCaEDTA wegen der hohen Stabilit~itskonstanten und bei Annahme eines Austausches yon ('a`, gegen das Zink wegen der niedrigen Enzymkonzentration nicht erreicht wird. So bleibt nur die Erkl~irung, daI3 bei den alkalischen Phosphatasen auf.]er bei AP Ill bei Einwirkung yon Na.,CaEDTA das Zink im Enzym gegen Calcium ausgetauscht wird und dab die Calciuan-phosphatase etwas hShere Aktivifftt als das native Enzym zeigt. Die Aktivierung des Rohenzwns erkliirt sieh durch Komplexierung v~m Fremdionen und gleichzeitigen Ersatz yon Calcium. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie stark die Verunreinigungen eines Enzympr/iparates die Ergebnisse bei Prfifung der enzymatischen Eigenschaften verf~lschen k6nnen und dab der (;rad der Aktivierbarkeit und Hemmung vom Reinheitsgrad abh~ingt. Die vier isolierten Isoenzyme aus der alkalischen Phosphatase ties Hfihnerdarms zeigen Unterschiede in ihrem Verhalten gegen Metallionen und Chelatbildner. Auf Grund der beschriebenen Versuche kann angenommen werden, dab jedes Enzymmolekfil zwei Metallatome, wahrscheinlich Zink, enth/ilt, die sich durch die Festigkeit ihrer Bindung an das Protein unterscheiden. Aus dem Verhalten der alkalischen Phosphatasen gegen Metallionen und Chelatbildner kann man schliegen, dal3 die wesentliche Aufgabe der Metallionen die Stabilisierung der Proteinstruktur ist. DANK

Herrn Prof. Dr. A. CATSCHdanke ich fiir die Anregung zu dieser Arbeit und fiir sein fSrderndes Interesse, Frfiulein H. RECK>;RT, R. MODEST und E. K~TSS~Nt;ffir ihren groBen Fleil3 und ihre Sorgfalt bei der Durchffihrung der Experimente.

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ALKALISCHE PHOSPHATASE

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ZUSAMMENFASSUNG

Es wird eine Methode zur Reinigung und Trennung von vier Isoenzymen aus alkalischer Phosphatase von Hfihnerdarm mittels Gelfiltration fiber Sephadex G-2oo und anschlieBender Ionenaustauscherchromatographie fiber DEAE-Sephadex A-25 mit einem NaC1-Gradienten in Trispuffer angegeben. Alle vier Isoenzyme werden in Anwesenheit von Mg2÷ aktiviert, wtthrend Na2H2EDTA bei allen Enzymen einen Inaktivierungsprozel3 hervorruft, der in zwei Stufen verlttuft und damit einen weiteren Beweis ftir das Vorhandensein yon zwei Metallatomen pro Enzymmolektil liefert. Bei einer Phosphatase erfolgt durch Na2CaEDTA ebenfalls Verlust der enzymatischen AktivittEt. Drei der alkalischen Phosphatasen zeigen bei Einwirkung von Na2CaEDTA keine Hemmung. Es mul3 angenommen werden, dal3 in diesen Fttllen Zink gegen Calcium ausgetauscht wird und dab die Calcium-Phosphatase eine etwas h6here Aktivitttt als das native Enzym hat. LITERATUR i A. L. GROSSBERG, E. H. HARRIS UND M. SCHLAMOWITZ, Arch. Biochem. Biophys., 93 (1961) 267 . 2 W. LANDAU UND 1V[. SCHLAMOWITZ, Arch. Biochem. Biophys., 95 (1961) 474. 3 D. W. Moss, Biochem. J., 94 (1965) 458. 4 D. W. M o s s UND E. J. KING, Biochem. J., 84 (1962) 192. 5 L. ENGSTR6M, Biochim. Biophys. Acta, 52 (1961) 36. 6 F. J. BEHAL UND M. CENTER, Arch. Biochem. Biophys., IiO (1965) 500. 7 D. DABICH UHD O. W. INIEUHAUS, J. Biol. Chem., 241 (1966) 415. 8 0 . A. BESSE¥, O. H. LOWRY UND M. J. BROCK, J. Biol. Chem., 164 (1946) 321. 9 A. GAREN UND C. LEVINTHAL, Biochim. Biophys. Acta, 38 (196o) 47 o. IO F. A. LOEWUS, Anal. Chem., 24 (1952) 219. II C. H. W. HIRS, S. MOORE UND W. H. STEIN, J. Biol. Chem., 219 (1956) 623 . 12 S. MOORE UND W. H. STEIN, J. Biol. Chem., 211 (1954) 907. 13 M. J. SCHLESINGER UND K. BARRETT, J. Biol. Chem., 24 ° (1965) 4284. 14 J. R. WHITAKER, Anal. Chem., 35 (1963) 195o. 15 A. A. LEACH UND P. C. O'SHEA, J . Chromatog., 17 (1965) 245. 16 H. CSOPAK, Acta Chem. Scand., 18 (1964) 2414. 17 M. PETERLIK, Monatsh. Chem., 96 (1965) 1261. 18 P. PORTMANN, Z. Physiol. Chemie, 309 (1957) 87. 19 J. C. MATHIES, J. Biol. Chem., 233 (1958) 1121. 20 S. TRUBOWlTZ, D. FELDMAN, S. W. MORGENSTERN UND V. M. HUNT, Biochem. J., 80 (1961) 369. 21 D. J. PLOCKE UND B. L. VALLEE, Biochemistry, I (1962) lO39. 22 D. J. PLOCKE, C. LEVINTHAL UND B. L. VALLEE, Biochemistry, 1 (1962) 373. 23 B. CLARK UND J. W. PORTEUS, Bioehem. J., 95 (1965) 475. 24 R. CLOETENS, Biochem. Z., 308 (1941) 3725 R. CLOETENS, Biochem. Z., 31o (1941) 42. 26 M. KUNITZ, J. Gen. Physiol., 43 (196o) 1149. 27 M. J. SCHLESINGER, J. Biol. Chem., 241 (1966) 3181.

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