Extraktion und chromatographische Auftrennung der Nukleinsäuren aus Photosynthese-Organismen

502

SHORT COMMUNICATIONS

5 C. SCHOLTISSEK, Biochem. Z., 332 (196o) 458. J. N. DAVIDSON AND It. M. S. SMELLIE, Bioehem. J., 52 (1952) 594. A. J. THOMAS AND H. S. A. SHIgRRATT,Biochem. J., 62 (1956) I. 8 R. B. HURLBERT, in S. P. COLOWICK AND N. O. KAPLAN, Methods in Enzymo!ogy, Vol. 3, Academic Press, New York, 1957, p. 785 • W. E. COHN AND E. VOLKIN, Nature, 167 (1951) 483 . 10 S. PETROVId AND V. JANKOVId, Bull. Boris Kidrich Inst. Nuclear Sci. (Beograd-Vincha), 13, No. 3 (1962) 47. 11 R. MARKHAM,in K. PEACH AND i . V. TRACEY, Modern Methods o[ Plant Analysis, Vol. 4, Springer, Berlin, 1955, P. 246. 12 p,. LIPSHITZ AND E. CHARGAFF,Biochim. Biophys. Acta, 19 (1956) 256. 13 M. LJ. YIIHAILOVId, M. ANTId AND D. HAD:~IJEV, Glas Acad. Serbe Sci. Art., Classe Sci. Math. Nat., 259, No. 25 (1964) 59.

Received February 6th, 1964 Biochim. Biophys. Acta, 87 (1964) 499-5o2

SC 93002

Extraktion und chromatographische Auftrennung der Nukleinsiiuren aus Photosynthese-Organismen W~ihrend ftir Bakterien und tierische Zellen brauchbare Methoden zur quantitativen Extraktion und Isolierung nativer Nukleinsiiuren vorliegen, st6sst die Anwendung dieser Verfahren bei pflanzlichen Zellen wegen ihrer abweichenden Wandstruktur auf Schwierigkeiten. Die Isolierung von Transfer-RNA und DNA aus Euglena ist von BRAWERMAN et al. 1 beschrieben worden; die Anwendung dieser Methode auf unsere Organismen erbrachte jedoch unbefriedigende Ergebnisse. l~ber eine Technik zum schonenden Aufschluss verschiedener Algen-Spezies und zur quantitativen Extraktion und Fraktionierung ihrer Nukleinsiiuren soll bier berichtet werden. Als Versuchsobjekte dienten die photoautotrophe Blaualge Anacystis nidulans, die thermophile Rotalge Cyanidium caldarium, sowie die einzellige Grtinalge Chlorella pyrenoidosa (Stature 2II-8b, G6ttingen). Die Anzucht der Algen erfolgte bei IO ooo lux im Licht-Thermostaten 2 bei der jeweiligen Optimaltemperatur in sterilen anorganischen N~thrl6sungen3-5 unter Begasung mit 2 % CO2 in Luft. Um die Zellen quantitativ aber schonend aufzuschliessen, wurden sie nach dem Waschen suspendiert (0.05 lV[ Tris-Puffer, pH 7.6 und 2 mSI MgSQ) und mit Glasperlen (o.12 bzw. 0.35 mm Durchmesser) 2 rain in einer Vibrogen-Zellmtihle (Fa. E. Biihler, Tiibingen) unter Kiihlung geschtittelt. Nach Entfernung unzerst6rter Zellen (3-5 %) wurde das Homogenat mit einem gleichgrogen Volumen wasserges~ittigten Phenols ftir 5 min von Hand gesch/ittelt. Die wiissrige Phase wurde durch Zentrifugation abgetrennt, die Phenolphase zweimal mit 0.05 M Tris-Puffer von pI-I 7.6 bzw. 9.0 extrahiert. Die F~tllung der Nukleins~iuren in den vereinigten wS.ssrigen Phasen erfolgte mit der dreifachen Menge Athanol bei --20°; das Pr~izipitat wurde mit *thanol gewaschen und in o.I M NaC1 (mit 0.05 M Phosphat auf pH 6. 7 gepuffert) gel6st. Die Ausbeute an Nukleins/iuren betrug 75-80 % der in den intakten Zellen mel3baren Menge. Die Behandlung nicht-homogenisierter Algen mit 2 °/o Natriumdodecylsulfat in der W/trine oder mit w/issrigem Phenol ftihrte nur zur Freisetzung geringer Mengen an Nukleins~turen. Proben der isolierten Nukleins~iuren (2-4 rag) Biochim. Biophys. Acta, 87 (1964) 5o2-5o5

503

SHORT COMMUNICATIONS

o6I

Anacystis

0.5

hochmolekulare RNA

0.4 A

0.3

0.2

0.1I

0

L

I

20

i

I

30

l

I

40

i

I

50

i

1 ~

60

70

uO

70

I

i

80

Fraktion 0.6. Cyanidiurn 0.5'

0.4. A

0.3

0,2

0.1

¸

o

oot

20

30

40

50 FPaktion

LI Chlorella

is

,x.x

i

1500

l

L

0.5

ei

°4t

•~

.....~" ~

,-

'L

k

f

/

/ \"

0.3-

s

x o:,,.,x,-~~

0.2" i

x" ,

"x,

x.

x'x-

i I

x~

0,1

0

+1000 .g

;

I

20

l

30

I

~

I

0

40

50 60 70 80 groktion Fig. IA, B u n d C. F r a k t i o n i e r u n g v o n 16slicher R N A , D N A u n d h o c h m o l e k u l a r e r R N A a u s Photosynthese-Organismen mittels S&ulenchromatographie an methyliertem Serumalbumin. 5 ml pro Gef~iB in 2 rain w u r d e n bei Z i m m e r t e m p e r a t u r g e s a m m e l t . 0 - 0 : A b s o r p t i o n bei 254 m/z; x - x : I m p u l s e pro rain.

Biockim. Biophys. Acta, 87 (1964) 502-505

504

SHORT COMMUNICATIONS

wurden mit o.I M NaC1 auf 7 ° ml verdtinnt und an eine S~iule (1.8 X lO.5 cm) adsorbiert, welche ungef~ihr 2.5 mg Inethyliertes Serumalbumine, 7 pro g Kieselgur enthielt und zuvor mit 15o ml o.I M NaC1 gewaschen worden war. 3-5 % der aufgebrachten Nukleins~iuren waren nicht adsorbierbar. Eluiert wurde mit einem logarithmischen Konzentrationsgradienten von o.I M his 1.5 M NaC1, gepuffert mit 0.05 ~ Phosphat auf pH 6. 7. Die Absorption der Proben bei 254 m# wurde automatisch registriert ("Uvicord", LKB Stockholm). Bei Untersuchung 3~p-markierter Nukleins~turen erfolgte die Messung der Radioaktivit~it in den Eluaten automatisch mit einem Ratemeter (FlY 49, Frieseke und Hoepfner, Erlangen). Sie wurden dann im Fraktionssammler aufgefangen. Unter den gew~ihlten Versuchsbedingungen erfolgte die Auftrennung der Nukleins,iuren aus Anacystis in 16sliche RNA, DNA und hochmolekulare RNA sukzessiv mit Maxima bei Salzkonzentrationen yon 0.5 M, o.72-0.77 M, 0.85-0.90 M bzw. 0.94-0.97 M; bei den Pr~iparationen aus Cyanidium und Chlorella traten jeweils zus~itzliche Fraktionen bei der 16slichen RNA (0.62 M) und der hochmolekularen RNA (1.o5 M) auf (Fig. I). Bei entsprechender Auftrennung der Nukleins~iuren aus langfristig 32p-markierten Zellen von Chlorella zeigte sich, dab die Maxima von Absorption und Radioaktivit~it gleichlagen im Bereich der RNA-Fr~ktionen, ftir DNA jedoch verschoben waren (Fig. I, unten). Diese offensichtliche Inhomogenit~it der DNA-Fraktion ist Gegenstand weiterer Untersuchungen. Fiir die beiden lyauptfraktionen der hochmolekularen RNA aus Chlorella (Elution bei 0.85-0.95 M bzw. o.94-o.97MNaC1 ) wurden Sedimentationskoeffizienten von 17 S und 25 S ermittelt (Medium: 0.85 bzw. 0.95 M NaC1 in 0.05 M Phosphatpuffer, pH 6.7). Eine wesentliche Voraussetzung ftir die Gewinnung nativer Nukleins~turen bildete der schonende Aufschlul3 tier Algenzellen. Wurden diese l~inger als 2 min mit Glasperlen geschtittelt, so kam es in steigendem Mage zu einer ZerstSrung von 16slicher RNA und vor allem yon DNA, w~ihrend die hochmolekulare RNA weitgehend unversehrt blieb. Bei Chlorella waren nach IO rain AufschluBzeit bis zu 60 % der alkoholgef~illten Nukleins~iuren nicht mehr adsorbierbar. Bei der Chromatographie wurden zuniichst weitere Nukleins~iure-B1uchstticke bei ungef~ihr 0.25 M NaC1 eluiert; w~thrend die typischen Fraktionen der 16slichen RNA und der DNA nahezu fehlten, traten die der hochmolekularen RNA normal aut (Fig. 2). Die Beteiligung

0.41Chlorelro (10rnin)

oi/ o 0

10

20

30

40

50 Fraktion

60

70

80

Fig. 2. Die Wirkung verl~ngerter AufschluBzeit (io min) auf die Fraktionierung nativer Nukleins~uren aus Chlorella. O - Q : Absorption bei 254 m/2.

Biochim. Biophys. Acta, 87 (1964) 502 505

SHORT COMMUNICATIONS

505

von RNAasen konnte insofern ausgeschlossen werden, als dieser Abbau auch in Gegenwart von Bentonit und Phenol im gleichen Ausmal3 stattfand. Mit Hilfe der beschriebenen Methoden der Extraktion und Fraktionierung sind die Voraussetzungen zum Studium von RNA-Fraktionen mit "messenger"-Charakter gegeben; hierfiber soll an anderer Stelle berichtet werden. Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wit ffir die Gew~hrung einer Sachbeihilfe, den Herren Dr. K. K~SHLERund Dr. R. S0ss vom Max-Planck-Institut ffir Virusforschung, Ttibingen, ffir ihre Unterstfitzung der Arbeit, sowie fiir die Durchftihrung der Ultrazentrifugation.

Botanisches Institut und Lehrstuhl /iir Chemische Planzenphysiologie, Universitgt Tiibingen, Tiibingen (Deutschland)

GERHARD

RICHTER

HORST SENGER

1 G. BRAWERMAN, D. A. HUFNAGEL UND E. CHARGAFF, Biochim. Biophys. Acta, 61 (1962) 34 o. 2 A. KUHL UND H. LORENZEN, in D. M. PRESCOTT, Methods in Cell Physiology, Academic Press, New York, 1964, chapt, io. 3 W. A. KRATZ UND J. MYERS, Am. J. Botany, 42 (I955) 282. 4 M. B. ALLEN, Arch. Mikrobiol., 32 (1959) 270. 5 H. SENGER, Arch. Mikrobiol., 4 ° (1961) 47. e j . D. MANDELL UND A. D. HERSHEY, Anal. Biochem., I (196o) 66. 7 N. SUEOKA AND T. Y. CHENG, J. Mol. Biol., 4 (1962) 161.

Eingegangen am 23. M~rz, 1964 Biochim. Biophys. Acta, 87 (1964) 5o2-5o5

SC 93000

The action of guanidine hydrochloride on salmon-sperm DNA. Guanidine hydrochloride was found to denature DNA 1. This activity was however noted only at high guanidine hydrochloride concentrations; no data appear to have been published for low concentrations. Now, several substances have been stated to exhibit denaturing activity when used at high, but not at low, concentrations, e.g. alcohols~,3. Indeed, denaturing activity at high concentrations is not necessarily symptomatic of the substance being an H-bond denaturant, in competing for the WATSON--CRICK H-bonds 4 which contribute to the stability of the double-helix, but rather as a dehydration activity arising out of conditions in which pronounced competition for water can exist between the DNA and the added substance. Such dehydration activity can result in adverse effects on the double-helix3, 5. For example, NaC1 in low concentrations, by virtue of the electrostatic field exerted by its ions which reduces the repulsion exerted by the negatively charged phosphate groups, exerts a protective influence on the double-helix. However, at high concentrations such as those above I M it results in pronounced hyperchromicity of DNA n,7 which effect is generally accepted as evidence of denaturation. The ionic nature of guanidine hydrochloride and the above considerations, prompted us to investigate the possibility that its denaturing activity at high concentrations may well mask its intrinsic double-helix protective influence at lower Biochim. Biophys. Acta, 87 (1964) 5o5-5o7