Über die Kerne der ganglien- und gliazellen und ihre veränderungen in Rohrzuckerlösungen

Experimental

Cell Research, 8, 523-532

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(lY55)

UBERDIEKERNEDERGANGLIEN-UNDGLIAZELLENUND IHREVER~NDERUNGENINROHRZUCKERL&WNGEN~2 E. ALBERT Institut

und K. FELIX

fiir vegetative Physiologic der Universitiit und Frankfurter Forschungsstelle ftir Gehirnpathologie und Psychopathologic, Frankfurt a. M., Deutschland Eingegangen am 27. August, 1954

NACH unserer heutigen Ansicht hahen die Zellkerne zweierlei Aufgaben zu erfiillen, 1) bei der Teilung die Erbeigenschaften auf die Tochterzellen zu iibertragen und 2) in den Zeiten dazwischen die Funktionen des manchmal such erst zu ermiiglichen, indem Zytoplasmas zu unterstiitzen, sie ihm Proteine und Fermente liefern. Die beiden Miiglichkeiten schliessen sich bis zu einem gewissen Grade aus. Wenn die Zelle sich zur Teilung anschickt, dann stellt der Kern seine Mitwirkung an den Aktivitlten des Zytoplasmas voriibergehend ein und umgekehrt ruht sein genetischer Apparat, wenn er Proteine und Fermente fiir das Zytoplasma synthetisieren muss. Der sichtbare Ausdruck fiir seine Mitwirkung an den Aufgaben des Zytoplasmas ist das KernkGrperchen, das wghrend der Teilung in der Regel verschwindet. Man darf wohl vorwegnehmen, dass die Kerne der einzelnen Gewebe sich unterscheiden, je nachdem, welche der beiden Tltigkeiten vorwiegt. Die beiden denkbaren Extreme werden durch den Kern der Spermatozoen und den der Ganglienzellen reprssentiert. Jener hat nur die vlterlichen Erbqualitlten zu iibertragen und beteiligt sich nicht an den Aufgaben des Zytoplasmas. Das Spermatozoon lebt nur kurze Zeit, sezerniert nicht, legt keine Reserven an und tut such sonst nichts, woran sich der Kern durch Lieferung von Proteinen und Fermenten beteiligen kiinnte. Seine einzige Aufgabe ist, sich weiter zu bewegen und auf ein Ei zu treffen. Die Nervenzelle teilt sich nicht mehr. Der Genapparat ihres Kerns scheint stillgelegt, der synthetische hingegen versorgt das Zytoplasma laufend mit Material und das Kernkijrperchen ist entsprechend gross. Aus der Analyse des Ganglienzellkerns kann man vielleicht etwas Grundsltzliches iiber diesen synthetischen Apparat des Zellkerns erfahren. Die graue Substanz e&halt mehrere Zellarten, Ganglien-, Glia- und Mesenchymzellen und ausserdem marklose, aber such markhaltige Nerven1 Herrn Professor Karl Kleist zum 75. Geburtstag 2 Mit Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft 33 - 553X3

gewidmet. ausgefiihrt. Experimental

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fasern. Das Homogenat ist somit ein Gemisch aus den Partikeln der verschiedenen Zellarten und den Bruchstiicken der Fasern und es gilt, die Ganglienzellkerne hieraus zu isolieren. Von den verschiedenen Verfahren, die zur Isolierung von Zellkernen aus solchen Gemischen empfohlen werden, erschien uns die Homogenisierung in Rohrzuckerlosung und das fraktionierte Zentrifugieren am geeignetsten (9). Es fiihrt rasch zum Ziel; die damit gewonnenen Kerne sollen homogen sein und sich von denen in der intakten Zelle nicht unterscheiden. Einige Autoren haben allerdings such morphologische Verlnderungen (1) und den Austritt von Inhalt beobachtet (5, 7, 13, 2, 6, 11). Unseres Wissens haben bis jetzt nur D. Richter und R. P. Hullin (15) versucht, Nervenzellkerne zu isolieren. Sie homogenisierten menschliches Leichengehirn und Tiergehirne in verdiinnter Zitronensaure von pH 6,06,2. Ihr Praparat enthielt zu 40 y0 Ganglienzellkerne, zahlreiche Gliakerne, ganze Zellen und Kapillarendothelien. Uber etwaige morphologische VerLnderungen der Kerne wird nichts berichtet. Unser Endsediment in Zuckerlosung (vergleiche experimentellen Teil) besteht zu etwa 70 ‘$& aus Ganglienzellkernen und zu etwa 30 % aus Gliazellkernen. Daneben sieht man krumelige Anhlufungen von ausgetretenem Kerninhalt. Bei diesem Verfahren der Darstellung bewahrt ein Teil der Nervenzellkerne sein urspriingliches Aussehen. Sie sind gross (O 12 p), rund und haben ein zentral gelegenes, grosses, Unter dem Phasenkontrastmikroskop scharf begrenztes KernkGrperchen. erscheint der Kernleib homogen oder hochstens ganz zart gekornelt. Lasst man die Kerne sich im Fhissigkeitsstrom drehen, so bieten sie sich von allen Seiten als glatte Kugeln dar, die manchmal etwas abgeplattet sind. Die Gliakerne sind deutlich kleiner (0 5-6 p) und kompakter als die Nervenzellkerne; ein Nucleolus ist nicht zu erkennen. Weder im ungefarbten noch im gefarbten Praparat zeigen sie Strukturen. Ihre Gestalt ist ebenfalls die einer glatten Kugel. Je hautlger man das Prlparat mit Zuckerlosungen wgscht, desto starker werden die Kerne durch das fremde Milieu, die osmotischen und mechanischen Einwirkungen verandert. Friiher oder spater wird ihr Inhalt kornig. Die Konzentration des Rohrzuekers hat darauf nur insofern einen Einfluss, als dies bei niedriger Konzentration (s-12 %) langsamer und bei hoherer (30-40 %) rascher geschieht. Dafur sind sie in diinneren Zuckerlosungen empfindlicher gegen mechanische Einflusse. Schliesslich gehen sie zugrunde unter anderen Erscheinungen als die Experimental

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Kerne der Ganglien- und Gliazellen Gliakerne. Im wesentlichen tritt hei beiden der Inhalt aus und 1Sst sich der Kern auf. Bei den Nervenzellkernen erscheint im ungeflrbten Prlparat die vorher glatte Oberfllche mit einem Ma1 gewellt, der Kern wird grijsser (bis 20 p) und der Inhalt erst fein- und dann grobkarnig. Die Kerne werden immer durchsichtiger und heben sich kaum noch von der Umgebung ab. Gleichzeitig tritt der Inhalt aus, fast fliissig in isotonischer und kiirnig und f5dig in konzentrierteren Liisungen. Entsprechend lassen sie sich immer weniger mit Toluidinblau anfgrben und die Ftirbbarkeit mit Methylgriin-Pyronin 5ndert sich zunehmend von griin zu rot. Die Existenz einer Membran oder Hiille gibt sich am ungefgrbten, intakten Kern nur indirekt in der glatten Begrenzung zu erkennen. Auch am frischen, geflrbten Kern hebt sich keine Membran ab. Geht dagegen der Kern zugrunde, dann wird mit einem Male die Lussere Begrenzung als dunkler, mit Toluidinblau fgrbbarer Reif sichtbar, der sich bald in einzelne Perlen aufliist, die zungchst ganz dicht stehen und dann auseinander riikken. Durch die Zwischenr5ume tritt ftirbbare Substanz aus. Wir konnten nicht entscheiden, ob das, was sich fsrbt, wirklich die Membran selbst ist oder Kernmaterial, das sich hinter ihr angesammelt hat. Vielleicht besteht die Membran aus einem dehnbaren Netzwerk, dessen Maschen bei der Denaturierung weiter werden. Dehnbar deswegen, weil bei den angeschwollenen Kernen die Hiille gefaltet ist und zu weit aussieht. Die Kerne der Gliazellen gehen rascher zugrunde als die der Nervenzellen. Schon im ersten Sediment sind sie hlufig vergndert, vergrgssert (0 7 p) und gekiirnt und nach dem dritten Waschen sieht man nur noch wenige unveranderte Gliakerne. Die Kernsubstanz tritt aber hier nicht diffus aus, sondern quillt nur an einzelnen, umschriebenen Stellen in cumulusartigen steifen Massen hervor. Der Inhalt des Gliakerns hat offenbar eine festere Konsistenz als der des Ganglienzellkerns. Im ungefsrbten Prtiparat blitzen jene Ausstiilpungen hell auf, sind also stark lichtbrechend. An ihnen hlngt wie ein Schatten die blasse, leere Kernhiille. Mit Toluidinblau fgrbt sich nur der Kernrest blau an, die Ausstiilpungen bleiben ungefLrbt. Mit Methylgriin-Pyronin dagegen f5rbt sich der Kernrest griin und die Ausstiilpungen rot. Letztere legen sich manehmal urn die Aussenflache des Kerns herum und kiinnen dann mit Pyronin f5rbbare Plasmaslume vort5uschen (18). Mit weiterem Auswaschen tritt die griine Komponente immer mehr zuriick und das Kernfragment flrbt sirh in schillerndem Rot bis Gelb, manchmal gl5nzend wie Ezperimentnl

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ein Metallblattchen. Doch kann es schliesslich such jede Flrbbarkeit verlieren. Wenn es zutrifft, dass Desoxyribonucleinslure von Methylgriin und Ribonucleinslure von Pyronin selektiv angefarbt werden (4), spricht der eben bkschriebene Wechsel in der Farbbarkeit dafiir, dass bei der Kernauflosung zunlchst die Desoxyribonucleinslure verschwindet, oder vielleicht such nur in nicht farbbare Produkte aufgespalten wird. Die Ribonucleinsaure dagegen bleibt vie1 linger erhalten und nimmt nur ganz allmlhlich ab. Die aus dem Innern der Gliakerne vorquellenden Massen scheinen vorwiegend aus Ribonucleinslure zu bestehen. Somit ergibt sich aus unseren Versuchen; dass Rohrzuckerlijsungen, nicht imstande sind, die Struktur der gleichgiiltig welcher Konzentration, Kerne der Nerven- und Gliazellen llngere Zeit unverandert zu bewahren, im Gegensatz zu dem, was in der Literatur iiber das Verhalten anderer Kerne aus pflanzlichen und tierischen Geweben berichtet wird (10 u. a.). Im wesentlichen entmischen die Rohrzuckerlijsungen den Inhalt des Kerns und erhiihen die Durchllssigkeit der Hiille. Diese entmischende Wirkung konnten wir such an Forelleneiern und den Dottern des Hiihnereis beobachten. Von verschiedenen Autoren wird der Zusatz anorganischer Salze zu In einer Reihe von Versuchen haben der Rohrzuckerliisung empfohlen. wir Rohrzucker zu 12-30 y0 in Phosphat-Bicarbonatpuffer von N. G. Anderson und K. M. Wilbur (1) (0,0094 m. KH,POI, 0,0125 m. K,HPO,, 0,0015 m. NaHCO,) gel&t. Er wirkte aber stark hypertonisch, die Kerne schrumpften und verloren den Inhalt schneller als in reiner Rohrzuckerlosung. Noch ungiinstiger wirkte der Zusatz von 0,0018 m. (18) bis 0,009 m. Calciumchlorid. Die Kerne schwollen an und wieder trat der Inhalt aus. Da nach Versuchen verschiedener Biologen korpuskulare Elemente aus Pflanzen- und Tierzellen ihren Inhalt in Losungen hochmolekularer Stoffe besser behalten als in Rohrzuckerlosungen (8, 12, 18), verwandten wir in einer weiteren Versuchsreihe als Medium Losungen von Gummi arabicurn, Amylose, Dextrin und Glykogen. Lediglich in der Glykogenlosung blieben die Kerne einigermassen unverandert. Weiter versuchten wir noch ein synthetisches Kolloid, das Polyvinylpyrrolidon, das uns die Badische Anilin- und Sodafabrik in den Molekiilgriissen 10000, 28000, 260 000 und 500 000 freundlicherweise iiberliess. Es ist der Hauptbestandteil des Blut.ersatzmittels Periston. Wir verwandten lO%ige Liisungen in W’asser und in isotonischer Rohrzuckerliisung. In beiden Medien hielten sich die Kerne jedoch nicht so lang als in reinen Rohrzuckerlosungen. Experimental

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Kerne der Ganglien-

und Gliazellen

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Solange der Kern noch unverandert ist, lassen sich weder im gewohnlichen noch im Phasenkontrastmikroskop ausser dem Kernkbrperchen Strukturelemente erkennen. Vielleicht wlren solche mit der RontgenInterferrenz-Analyse doch nachzuweisen. Wenn man unverlnderte Kerne zerquetscht, tritt aus ihnen eine scheinbar homogene Fliissigkeit aus, in der gelegentlich einzelne Flden vorkommen. Erst wenn sie mehrmals mit der Rohrzuckerliisung behandelt und mechanischen Einwirkungen (Zentrifugieren, Homogenisieren) ausgesetzt worden sind, verwandelt sich ihr Inhalt in kriimelige und fhdige Strukturen. W7ir glauben nicht, dass diese Strukturen etwas mit den Chromosomen (17) zu tun haben, sondern halten sie nur fiir den Ausdruck kolloidchemischer Verlnderungen. In den bisher beschriebenen Versuchen wurde die graue Substanz sofort verarbeitet. Lasst man sie dagegen vor dem Homogenisieren etwa vier Stunden im Kiihlraum (unter +4”C) liegen, so erweisen sich die Kerne als bedeutend widerstandsflhiger gegen mechanische Einfliisse und Anderungen des Milieus. Schliesslich gehen sie aber, wenn such langsamer, auf die gleiche Weise zugrunde. Wenn es darauf ankommt, die Zusammensetzung der Kerne zu analysieren, wird man abgelagertes Gewebe vorziehen. Zur Untersuchung des Fermentgehaltes diirfte frisches Gewebe geeigneter sein. Allerdings muss man dann Verluste in Kauf nehmen.

EXPERIMENTELLER

Entblutung

TEIL

des Gehirns

Es wurde das Gehirn von geschachteten oder durch Genickschuss getiiteten Rindern genommen, weil Rinde und Grosshirngefasse unverletzt sind. Der Kopf wird rasch abgetrennt, sofort Kaniilen in die Carotiden eingebunden und unter Druck (I,80 m Wasserslule) mit je 10 1 eiskalter physiologischer Kochsalzliisung durchstromt, die zur besseren Gefasserweiterung mit Kohlensaure angereichert wird. Der Druck in der Durchstriimungsleitung wird dadurch erzeugt, dass wir die Wassersacke, in die die Kochsalzliisung eingeftillt wurde, in die Hohe ziehen. Das ausgewaschene Gehirn wird aus dem SchHdel entnommen, auf Eis transportiert und im Kiihlraum (unter +4X) weiterverarbeitet. Homogenisieren Die Grosshirnrinde wird nach Entfernung der Hirnhtiute mit einem Skalpell sanft abgeliist und gewogen. Von einem ganzen Gehirn erhalt man im Durchschnitt etwa 120 g Rinde. Es lasst sich nicht vollig vermeiden, dass an der Basis der abgetraExperimental

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Abb. 1. Gut erhaltene Nervenzellkerne, dazwischen einige Gliazellkerne und Myelin. Phasenkontrast, 8,6%ige Saccharoselosung. Abb. 2. Kriimelige Substanz tritt in Form kleiner Kiigelchen ringsum aus den Kernen aus. Phasenkontrast 15/23/30%ige Saccharose. Abb. 3. Dick aufgebhihte Kerne neben solchen von normaler Grosse. Toluidinblau 10/20%ige Saccharose. Abb. 4. Gebllhte Kerne in Auflosung. Die Lage der Kernhtille wird durch dunkle Slume angezeigt, durch die Substanz nach aussen hindurchgetreten ist. Toluidinblau 15/24/32%ige Saccharose. Abb. 5. Riesige ausgelaugte Kernschatten ohne Membran mit Resten des dunklen Saums in Gestalt einiger schwarzer Perlen im Innern. Toluidinblau 15/23%ige Saccharose. Abb. 6. Gliakern mit mehreren aus dem Kerninnern hervorbrechenden, gllnzenden Prolapsen. Phasenkontrast 15/23/30%ige Saccharose. Experimental

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Kerne der Ganglien- und Gliazellen

Abb. 7. Hell aufblitzende, nach aussen gestiilpte Gliakerne zwischen unveranderten Nervenzellkernen. Phasenkontrast 10/20%ige Saccharose. Abb. 8. Deutliche Schrumpfung der Nervenzellkerne im Phosphat-Bicarbonatpuffer. Phasenkontrast 18/25%ige Saccharoseliisg. Abb. 9. Kerne in 8,6%iger Saccharose gequetscht durch Druck auf das Deckglas. Zerfliessende ohne erkennbare Figuren Strukturen im Innern. Die kriimeligen Beimengungen lagen schon vorher zwischen den Kernen, Phasenkontrast. aus im Homogenisator zerriebenen Nervenzellkernen. Phasenkon-

Abb. 10. Grosse Krisselfelder trast 20/30/40%ige Saccharose. Abb. 11. Erhaltene doch abgeplattete blau 10/19/28%ige Saccharoselosg.

Nervenzellkerne

aus abgelagertem

Hirngewebe.

Toluidin-

genen Kuppe noch etwas weisse Substanz mit abgehoben wird. Die Rindenbrockthen werden mit der 10fachen Menge 15%iger eiskalter Rohrzuckerlosung durch ein Haarsieb gestrichen. Dann wird das so vorzerkleinerte Gewebe homogenisiert. Wir verwenden den Homogenisator nach Potter-Elvehjem (14), und zwar ein Modell, dessen Stempel vie1 Spielraum hat. Urn das Schlagen zu vermeiden, wurden Experimental

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am Stiel zwei durchlocherte Ftihrungsringe aus Metal1 angebracht. Der Stempel wird im allgemeinen bis zu lOma langsam auf und abbewegt (Drehzahl des Motors bis zu 1500/Min). Das Homogenat wird dreimal coliert, erst durch doppelten Mull, dann durch sechsfachen Mull und schliesslich durch zwei Lagen Watte.

Isolierung der Kerne aus den Homogenat Das rohe Homogenat wird zuntichst 5 Min bei 1800 UpM (500 x mittlere Endbeschleunigung) zentrifugiert und der Uberstand verworfen. Bei hoherer Geschwindigkeit setzen sich noch andere Partikel ab (bes. Myelinschollen, Bruchstticke von Nervenfasern und Nisslschollen), die spater nur mehr unvollkommen aus dem Sediment zu entfernen sind. Das erste Sediment resuspendieren wir in reichlicher Menge 15%iger Rohrzuckerlijsung und schichten es vorsichtig tiber eine Schicht 22%iger Rohrzuckerlosung, in Analogie zu den Angaben von G. H. Hogeboom, W. C. Schneider und M. J. Striebich (IO), und zentrifugieren dann von neuem. Diese konzentriertere Rohrzuckerlosung hat die Funktion einer Behrensschen Sperrschicht (3) und l&St nur die spezifisch schwereren Teile durchtreten. An der Grenzflgche bildet sich ein dichter Trtibungsring von kleineren Zellbestandteilen, die nicht tibertreten konnen. Das 2. Sediment wird in der 22%igen Saccharose resuspendiert und tiber eine Schicht von 30Qger Zuckerlosung tibergeschichtet. Die Kerne, die sich nach der zweiten Unterschichtung abgesetzt haben, werden noch einmal mit 30%iger Rohrzuckerlosung gewaschen, wobei etwas ktirzer, nur 4 Min, zentrifugert wird, wtihrend vorher die Laufzeit immer 5 Min war. Die Gliakerne werden dadurch, dass sie sich ausstiilpen und Inhalt verlieren, leichter und konnen such aus diesem Grunde von den Nervenzellkernen besser abzentrifugiert werden. Im allgemeinen arbeiteten wir in den angegebenen St&ken der Rohrzuckerlosung, doch verwandten wir such manchmal andere Konzentrationen zwischen

S-70 %. Wenn wghrend der Verarbeitung viele Kerne zugrunde gehen, kann man das schon makroskopisch daran erkennen, dass feine, braunliche Flockchen in der Suspension herumschwimmen, die nur z. T. an der Sperrzone zurtickbleiben, zum Teil such hindurchtreten und sich oft am ganzen Glas entlang wie fettige Schuppen absetzen. Mikroskopisch sind es ausgedehnte Felder krisseliger Kernreste.

Mikroskopische

Prtiparate

Ausstriche eignen sich fiir die morZur morphologischen Beobachtung. phologische Untersuchung der Kerne nicht, da beim Ausstreichen die empfindlichen Kerne noch zusatzlich geschadigt werden. Wir geben vielmehr eine Suspension der Kerne in RohrzuckerlGsung auf den Objekttrager, legen das Deckglas dariiber und beobachten im gewiihnlichen Lichtmikroskop und im Phasenkontrastmikroskop. Zur Farbung mischen wir eine Ose des SediExperimental

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Kerne der Ganglien- und Gliazellen mentes auf dem Objekttrlger mit einem Tropfen der Farbliisung (1 %ige wlssrige Toluidinblaulosung oder eine 5 %ige wlssrige Methylgriin-Pyroninliisung von Griibler / Leipzig und Bad Cannstadt) und betrachten unter dem Deckglas mit olimmersion bei 600-bis 1OOOfacher Vergrosserung. Diese Methode erlaubt es, die Kerne von allen Seiten zu betrachten. Man braucht nur mit einem Stlbchen auf das Deckglas aufzutippen oder leicht daran zu schieben, so bilden sich in der Fliissigkeitsschicht Stromungen, in der die Kerne mitgerissen werden und sich dabei von allen Seiten darbieten. So kann man am besten die Formverbiegungen beurteilen. Das ungeflrbte Bild ist wichtiger als das geflrbte, weil hier die Kerne noch ganz unverlndert sind. Durch Zutropfen der Farblosung werden die Ganglienzellkerne kleiner, stark gekijrnelt und wie von einem groben Maschenwerk durchzogen. In isotonischer Losung platzen die Kerne sogar bei Zutropfen der Farbe. Schuld daran ist entweder die Erniedrigung des osmotischen Druckes durch die wassrige Farbliisung oder die stark saure Reaktion der Farblosung: Toluidinblau pH 2,7; Methylgriin-Pyronin pH 3,7. Zum Ausziihlen der Kerne. Das Endsediment wird in wenig Rohrzuckerl&sung suspendiert und nach der Leukocytenmethode ausgezlhlt. Wir beschicken dazu die Kammer mit der unverdiinnten Kernsuspension. Die umgewandelten Gliakerne sieht man als glanzende Kiirperchen aufleuchten. Mischt man in der Mischpipette die Kernsuspension vorher mit Farblosung, so geht dieser Unterschied verloren. ZUSAMMENFASSUNG

Die Grosshirnrinde des Rindes wurde in Rohrzuckerlosung homogenisiert und die Kerne abgetrennt. Das Endsediment besteht etwa zu 70 % aus Ganglienzellkernen und der Rest aus Gliazellkernen. Beide Kernarten verandern sich in Rohrzuckerliisung und gehen schliesslich zugrunde. Die Erscheinungen, die dabei zu beobachten sind, konnen kaum osmotisch erklart werden, sondern beruhen eher auf der heterogenen Zusammensetzung des Kerninhaltes. Der Inhalt der Gliakerne besitzt eine hiihere Konsistenz als der der Nervenzellkerne. Erst bei der Auflosung der Kerne tritt ein Gebilde hervor, das als Membran angesehen werden konnte. Kerne aus abgelagertem Gewebe sind widerstandsfahiger.

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Experimenfal

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