- Email: [email protected]
Über die Synthese und Eigenschaften von 4-Thiouridylyl-(3′-5′)-4-thiouridin, 4-Thiouridylyl-(3′-5′)-uridin und Uridylyl-(3′-5′)-4-thiouridin
BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA
28 5
BBA 95971
~3BER DIE SYNTttESE UND EIGENSCFIAFTEN VON 4-THIOURIDYLYL(3'-5')-4-THIOURIDIN, 4-THIOURIDYLYL-(3'-5')-URIDIN UND URIDYLYL- (3'-5') -4-THIOURIDIN K. H. SCHEIT
Max-Planck-Institut [iir experimentelle Medizin, Abteilung Chemie, G6ttingen (Deutschland) (Eingegangen am 22. April, 1968)
SUMMARY
The synthesis of 4-thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridine, 4-thiouridylyl-(3'-5' )uridin and uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin by means of known methods is reported. These compounds have been characterised by analysis of their ultraviolet absorption spectra as well by spectrophotometric titration of 4-thiouracil residues with 4hydroxymercurybenzoate. Mild hydrolysis of the above mentioned substances was achieved by treatment with hydrogenperoxide at pH 8 leading to uridylyl-(3'-5' )uridine. The course of the reaction was followed using ultraviolet spectroscopy.
EINFUHRUNG
Tyrosin tRNA von Escherichia coli enth~ilt neben anderen seltenen Nucleotiden zwei 4-Thiouridinphosphat-Reste je Molektil t. LIPSETT UND DOCTOR1 konnten zeigen, dass die Oxidation von Tyrosin tRNA die intramolekulare Bildung eines 4-Thiouridindisulfides zur Folge hat. Interessanterweise fiihrte diese intramolekulare Disulfid-Brticke jedoch nicht zu einer Anderung der Aminos~iure-Acceptoraktivitiit dieser tRNA. Vielleicht kann die Aufkl~irung der Prim~irstruktur yon Tyrosin tRNA die offene Frage nach der Funktion des 4-Thiouridinphosphats in tRNA 16sen. In diesem Zusammenhang erscheint es uns notwendig Kenntnisse fiber die chemischen Eigenschaften von 4-Thiouridin in Polynucleotiden zu erlangen. Wir haben die Darstellung der obengenannten Verbindungen 4-Thiouridylyl(3'-5')-4-thiouridin, 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin, Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin unternommen, weil diese als Modelle ftir die Untersuchung der chemischen Eigenschaften des 4-Thiouridins in Oligonucleotiden dienen kSnnen. Kfirzlich berichteten wir fiber die Polymerisation yon 4-Thiouridin-5'-diphosphat durch Polynucleotidphosphorylase aus Azotobacter vindandii 2. Darfiber hinaus waren wit an der Polymerisation von 4-Thiouridin-5'-diphosphat durch eine primerabh~ingige Polyuucleotidphosphorylase aus Micrococcus lysodeikticus, unter Verwendung der Primer Thiouridylyl(3'-5')-thiouridin, Thiouridylyl-(3'-5')-uridin, Uridylyl-(3'-5')-thiouridin interessiert. MATERIAL UND METHODEN
Ultraviolett-Spektren wurden mit den Geriiten Zeiss PMQ II und Cary 14 aufgenommen. Biochim. Biophys. Acta, 166 (19{)8) 285-293
286
K . H . SCHEIT
Papierchromatographie. Papier: Schleicher und Schfill 2o43 b (gewaschen). L6sungsmittel: (A) 2-Propanol-conc. NH4OH-Wasser (7:1:2, v/v/v), (B) J~thanol-I M Ammoniumacetat (7:3, v/v), (C) 2-Propanol-o.5 M Tri~thylammoniumbicarbonat (9:2, v/v).
Papierelektrophorese. Elektrophorese erfolgte an Whatman 3 MM-Papier in (E) o.I M Tri~thylammoniumbicarbonat (pH 7.5) bei 17 V/cm. Enzymatische Hydrolysen. o.5-1 nag Substrat wurden in 0.2 ml 0.25 M Trispuffer (pH 8.0) gelfst und mit jeweils 20/~1 Enzyml6sung bei 37 ° 4-6 Stdn. inkubiert. Konzentrationen der verwendeten Enzyml6sungen: Pancreas-Ribonuclease, EC 2.7.7.16 (Fa. Boehringer, Deutschland) I m g Protein/ml; Phosphodiesterase, EC 3.1.4.1 (Crotalus adamanteus, Fa. Boehringer, Deutschland) i mg (20 ooo Enzymeinheiten)/ ml. 3'-O-Acetyl-4-thiouridin. 342 mg (I mMol) 5'-O-Acetyl-2', 3'-O-isopropyliden4-thiouridin3 wurden in 20 ml 50 % Essigs~iure gelfst und die Mischung 2 Stdn. unter Rfickfluss gekocht. Danach wurde eingeengt und das gewiinschte Produkt aus dem Rtickstand durch preparative D~innschichtchromatographie an Kieselgel PF254 (Fa. Merck, Deutschland) in Chloroform-Methanol (8:2, v/v) isoliert. Das entsprechende ultraviolett-absorbierende Band wurde mit Chloroform-Methanol (I:I, v/v) eluiert und das Eluat eingeengt. Der Rfickstand wurde aus )~thanol umkristallisiert. Ausbeute 21o mg gelbe Kristalle (70 %), Fp. 143-145 °. ClIH140eN2S (Mol. Gew. 302.3) her.: C 43.7 %, H 4.7 %, N 9.3 %, S lO.6 %; gef:. C 43.6 %, H 4.7 %, N 9.5 %, S lO.5 %.
5',2'-O-Diacelyl-4-thiouridin-3'-phosphat: 302 mg (i mY[ol) 5'-O-Acetyl- 4thiouridin wurden in 3 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gel6st und zu 4 mMol Triimidazolylphosphinoxid4 in IO ml Tetrahydrofuran gegeben. Nach 15 Stdn. bei Raumtemperatur wurden 15 ml H20 zugeffigt und die Mischung mit NHaOH auf pH 9 gebracht. Man liess 2 Stdn. stehen, dampfte dann zur Trockne ein und trennte den Rfickstand durch prliparative Dfinnschichtchromatographie an Kieselgel in 2-Propanol-o.5 M Tri~thylammoniumbicarbonat (9:2, v/v) auf. Das auf das Ausgangsmaterial folgende gelbe Band wurde mit Methanol eluiert. Ausbeute IO ooo A33omfEinheiten (50 %). Das Eluat wurde eingeengt, der Rfickstand in 50 ml NH40H (pH 8) gelfst und 2.5 mg Pancreas Ribonuclease zugegeben. Man inkubierte 5 Stdn. hei 37 °, filtrierte die Lfsung fiber 50 ml Ionenaustauscher Merck I (Tri~thylammonium-Form) und engte das Filtrat zur Trockne ein. Der sirup6se Riickstand wurde in 5 ml I M Tetra~ithylammoniumacetat gelfst und das Gemisch durch mehrmaliges Abdestillieren von Pyridin bei 0.5 Torr wasserfrei gemacht. D~r z~he Gummi wurde in 1.18 g (IO mMol) Essigs~ureanhydrid unter Schfitteln gelfst und das Reaktionsgemisch 3 $tdn. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde nach Zugabe von 20 ml Pyridin-Wasser (I : I, v/v) 5 Stdn. hydrolysiert, die Lfsung anschliessend tiber IOO ml Ionenaustauscher Merck I (Pyridiniumform) filtriert und alas Filtrat schonend zur Trockne eingeengt. Das zurfickbleibende Glas wurde in 3 ml Pyridin gelfst und das Produkt durch Eintropfen in 200 ml )~ther gef~illt. Der gelbe Niederschlag wurde abzentrifugiert und im Vakuum fiber P205 getrocknet. Die Substanz war chromatographisch rein. ClsH1eO11N2SP • CsHeN (Mol. Gew. 519.5). Gefundenes Mol. Gew. (Spektrophotometrisch): 700; P : 4-Thiouridin -- 0.95 :I. Thiouridylyl- (3'-5' )-4-thiouridin: 7° mg (o. i mMol) 5', 2'-Diacetyl-4-thiouridin3'-phosphat und 60 nag (0.2 mMol) 2', 3'-O-Athoxy~thylen-4-thiouridin5 wurden Biochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 285-293
SYNTHESE VON DINUCLEOTIDEN MIT 4-THIOURIDIN
287
durch Abdestillieren von Pyridin bei 0,5 Tort wasserfrei gemacht. Der Sirup wurde in 3 ml Pyridin gel6st und 2o6 mg (i mMol) dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach 15 Stdn. bei Raumtemperatur wurden zur Reaktions-L6sung 3 ml Wasser zugeffigt und 2 Stdn. stehen gelassen. Dann wurde zur Trockne eingeengt und anschliessend mit 20 ml 50 % Essigs/iure 4 Stdn. bei Raumtemperatur hydrolysiert. Danach destillierte man die Essigs/iure ab und hydrolysierte mit 20 ml NH4OH ..... 3 Stdn. bei Raumtemperatur. Die Mischung wurde eingeengt, mit IO ml Wasser aufgenommen und vom unl6slichen Dicyclohexylharnstoff abgesaugt. Der Reaktionsansatz wurde durch preparative Papierchromatographie in L6sungsmittel (C) aufgetrennt. Das ultraviolett-absorbierende Band mit Rp 0.25 wurde mit Wasser (pH 7) eluiert. Ausbeute 80o A~3om~-Einheiten (4o %). Die Substanz wurde durch Pancreas Ribonuclease in 4-Thiouridin-3'-phosphat and 4-Thiouridin im Verh/~ltnis I : 0.95 und durch Phosphodiesterase in 4-Thiouridin und 4-Thiouridin-5'-phosphat im Verh/iltnis I : I gespalten. 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin wurde in analoger Weise ausgehend von 7° mg (o.I mMol) Diacetyl-4-thiouridin-3'-phosphat und 2',3'-0-(2, 4)-Dimethoxybenzylidenuridine in 30 % Ausbeute (600 A83o m~-Einheiten) isoliert. Hydrolyse durch Pancreas-Ribonuclease: 4-Thiouridin-3'-phosphat: Uridin -I.O 5 : I .
Hydrolyse durch
Phosphodiesterase:
4-Thiouridin:Uridin-5'-phosphat =
I.IO : I.
Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin wurde in analoger Weise ausgehend von 9o mg (o.I mMol) 5'-O-Acetyl-2'-O-/ithoxy/ithyluridin°3'-phosphat7 und 60 mg (0.2 mMol) 2',3'-0-Athoxymethylen-4-thiouridin in 4° % Ausbeute (8oo A3a0m~-Einheiten ) isoliert. Hydrolyse durch Pancreas-Ribonuclease: Uridin-3'-phosphat: 4-Thiouridin = 1.15:1. Hydrolyse durch Phosphodiesterase: Uridin:4-Thiouridin-5'-phosphat = I.IO:I. ERGEBNISSE
Bei der Darstellung von 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin, 4-Thiouridylyl(3'-5')-uridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin benutzten wir Methoden, welche wir bereits mit Erfolg zur Synthese anderer Ribooligonueleotide benutzt hatten 8,9. Ausgangsmaterial ffir 5',2'-0-Diacetyl-4-thiouridin-3'-phosphat war 5-O-Acetyl- 4thiouridin welches durch Phosphorylierung mit Triimidazolylphosphinoxid direkt in 5'-O-Acetyl-4-thiouridin-2',3'-cyclophosphat tiberffihrt werden konnte 1°. Wir glaaben, dass diese Phosphorylierung fiber die Zwischenstufen 3 und 4 verl/iuft. Das Cyclophosphat 4 wurde durch pr/iparative Diinnschichtchromatographie an Kieselgel in 5o % Ausbeute isoliert und Pancreas Ribonuclease zu 5 hydrolysiert. Acetylierung yon 5 nach der Methode von RAMMLER,LAPIDOT UND KHORANA11 ftihrte zu chromatographisch sauberen 5',2'-O-Diacetyl-4-thiouridin-3'phosphat e. Fig. 2 gibt das Schema wieder, nachdem die Synthese der Dinucleosidphosphate durchgeffihrt wurde. Die dargestellten Dinucleosidmonophosphate wurden durch pr/iparative Papierchromatographie in L6sungsmittel (C) isoliert. Der Vorteil Biochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 285-293
288
K.H. SCHEIT s
s
o+o!,., j / ,
c,,_o o
o cH,-c~ =
2
1
s
o --o CH,-~-O~_~
0 O:H 0=~./
~
~
0\ /0
S
o
S
o cH3-o
.
'
'
o
o
H20
Ribonuc(
pH8
0°
0
onhydr'~d. I-
~
~°~,~
~p~
o, oH
ZH20
~_#.o, 0 O-C-CH
O=P.oH
O=~.OH
o0
o0"
4
5
60
S c h e m a i. S y n t h e s e v o n 5', 2 ' - O - D i a c e t y l - 4 - t h i o u r i d i n - 3 ' - p h o s p h a t .
p o-~-CH~ O=P,
od ~
6
H O ' - ~ BI
1.Dicyclohexylcarbo-O diimid O=P-Oe b ' ~ B2
2,Essigs~ur~ 3. NH,0H
HO OH HO-~.~
2
8
0X /0
;c\
H R 7 S c h e m a 2. D i r i b o n u c l e o s i d p h o s p h a t - S y n t h e s e 6a, B 1 = 4-Thiouracil; 6b, ]31 = Uracil; 7 a, B= = 4 - T h i o u r a c i l , R = O-CH2-CH3; 7 b, ]32 = Uracil, R = -C~H3(OCH=)=; 8a, 4 - T h i o u r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n ; ]3z = ]3= = 4-Thiouracil; 8b, 4-Thiou r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - u r i d i n ; ]31 = 4-Thiouracil; B= = Uracil; 8c, u r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n " 131 = U r a cil; 13= = 4-Thiouracil.
dieses L6sungsmittels liegt darin, dass die chromatographische Trennung bei pH 7.5 durchgeffihrt werden kann und Hydrolyse yon 4-Thiouracil zu Uracil, wie wir sie bei Verwendung von L6sungsmittel (A) beobachteten, nicht stattfand. Die Dinucleosidphosphate 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin wurden yon Pancreas Ribonuclease und Phosphodiesterase hydrolysiert. Die quantitative Auswertung ergab, dass wenigstens 95 % jedes Dinucleosidphosphates die 3'-5'-Internucleotidbindung enthielt. Das VerNiltnis 4-Thiouridin:Uridin in den Substanzen 4-Thiouridylyl-(3'-5' )uridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridi n l~isst sich auf einfache Weise und genau aus den Ultraviolett-Absorptionsspektren berechnen, da 4-Thiouridin ein Absorptionsmaximum im langwelligen Bereich besitzt. Die Spektren yon 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin sowie Uridylyl-(3'-5')-4_thi o_ uridin sind identisch und weisen Absorptionsmaxima bei 330 und 257 m/, auf. InteBiochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 285-293
289
SYNTHESE VON DINUCLEOTIDEN MIT 4-THIOURIDIN
0.7 1.5
0.6
7
o ×
0.5
~ 1
0.4
0.3
0,2
0.5
0.1
o
i
240
280
320
360
40()
220
260
>,(mp)
300
340
380
A(m~)
Fig. I. U l t r a v i o l e t t - A b s o r p t i o n s s p e k t r e n v o n 4 - T h i o u r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - u f i d i n ( - - ) U r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' )4 - t h i o u r i d i n ( - - ) u n d 4 - T h i o u r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n ( O - - O ) bei p H 7. Fig. 2. U l t r a v i o l e t t - A b s o r p t i o n s s p e k t r u m y o n 4 - T h i o u r i d i n bei p H 7.
ressanterweise ist das langwellige Absorptionsmaximum bei 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4thiouridin zu 328 m,a nach niederen Wellenl/ingen verschoben. Aus den Spektren 1/isst sich sehr genau die Zusammensetzung der Dinucleosidphosphate ermitteln. Das Ultraviolett-Spektrum des analytisch reinen 4-Thiouridin 3 weist bei pH 7 ein Verh/iltnis A3a0m#:A~60m/~ = 7.36 auf. Teilweise Hydrolyse des 4-Thiouridin zu Uridin hat eine Abnahme dieses Wertes zur Folge. Damit ist es m6glich, eine Verunreinigung eines 4-Thiouridin-Derivates aus dem Ultraviolett-Spektrum sicher zu erkennen. TABELLE
I
ULTRAVIOLETT-ABSORPTIONSSPEKTRUM
Verbindung
~m,,
e38o
4-Thiouridin
33 ° 243
2.1 • lO 4 4" IOa
7.36
pH 7
328
2.1 • lO4
3.3
pH 7 Pyridiniumsalz
4-Thiouridylyl- (3'-5 ' )-uridin
33 ° 258
2.1. lO4
1.5o
pH 7 Hyperchromie wAhrend enzym. Hydrolyse ~3 %
Uridylyl- (3 '-5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n
33o 258
2.1- lO 4
1.5o
pH 7 H y p e r c h r o m i e wAhrend enzym. Hydrolyse ~3 %
328
3.78. lO 4
5.2
H y p e r c h r o m i e wiihrend enzym. Hydrolyse ~ I0
5', 2'-O-Diacetyl-4thiouridin-3'-phosphat
4 - T h i o u r i d y l y 1- (3 '-5 ') -4thiouridin
A 830 m~/A 260 ,,t* Bemerkung
%
Biochim. Biophys. Acta, I66 (1968) 285-293
290
K. H. SCHEIT
Das Ultraviolett-Spektrum des 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin nach enzymatischen Hydrolyse besitzt das gleiche Verh~iltnis A~o ma/A ~80ms wie 4-Thiouridin. Dies besagt zumindest, dass diese Substanz die gleiche Reinheit wie das als Ausgangsmaterial benutzte 4-Thiouridin hat. Die Zusammensetzung von 4-Thiouridylyl-(3'5')-uridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin 1/isst sich auf folgende Weise ermitteln: Es gilt A260 m/~
= 8260 m/* . ~260 m# •C M, Uridin CUridin -~- M, 4-Thiouridin 4-Thiouridin
C = Mol/1
8330 m~ A330 m/~ - - M, 4-Thiouridin " C4-Thiouridin _
Umformung und Substitution ergibt: A260 m~ CUridin ~-
_ 8260 m/~ . "//;330 m/~ M, 4-Thiouridin 8330 m~ M, 4-Thiouridin 8260 m/~ M, Uridin
Setzt man for e~O4mr~hiour~di~---- 2.85" 103, ~M,°3a04-Thiour~d~m~ = 2 . 1 0 " I04 (dem Ultraviolettspektrum des 4-Thiouridin entnommen), eZM~U~'di~= I0. I" I0 z und A3~ o m~,/A ,eo m~, = 1.5 (Ultraviolettspektren yon 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin) so erh/ilt man: 1.5 2.IO " IO4 = 0.788 Mol/1 I O . I • IO 3
I - - 2 . 8 5 • IO 3 • CUridin
=
I"5 C4"Thi°uridin - - 2.IO • IOt
o.714 Mol/1
Daraus ergibt sich fiir 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin ein Verh/iltnis yon Uridin '4-Thiouridin = I.IO
0.6
0,5
/3
(14
0.5
0.3 ~to.3 0.2 0.2 0.1
o.1 300
35o
L,oo
o
.02
?~CmH)
~
.06
~
ol
pMol
Fig. 3. R e a k t i o n y o n U r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n m i t 4 - H y d r o x y m e r c u r i b e n z o e s & u r e bei p H 7. Z u e i n e r L 6 s u n g y o n U r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n i n 3 m l o.o65 M P h o s p h a t p u f f e r p H 7 (Asso m~, = 0.53) w u r d e n j e w e i l s 5 m l e i n e r o.oo2 M 4 - H y d r o x y m e r c u r i b e n z o e s ~ t u r e - L 6 s u n g z u g e g e b e n u n d das Ultraviolettspektrum a u f g e n o m m e n . A, S p e k t r o s k o p i s c h e r N a c h w e i s d e r T i t r a t i o n y o n U r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n m i t 4 - H y d r o x y m e r c u r i b e n z o e s A u r e . 13, S t 6 c h i o m e t r i e d e r R e a k t i o n zwischen Uridylyl-(3'-5')-4-thiour;din und 4-Hydroxymercuribenzoes&ure.
Biochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 2 8 5 - 2 9 3
SYNTHESE VON DINUCLEOTIDEN MIT 4-THIOURIDIN
A
29I
0,4 ! A320mp
0 Min 0.4 A
0
03
Q'-'-'~ /e--"
0.42
0.2
0.38
0.I
0.34 /
0
240
280
320 A(mp)
360
400
0.30 0
/
A260mH
/
10
20 30 (Min)
Zeit
0.8' I 0.7
0.6 A
0.5 0.4 0.8
0.3
0.7 0.6 A0.5 0.4 0.3 0,2 0.1 ~ A 3 2 0
0.2' I
0"11 0
2BO
320 A(mp)
-
3o
% - '
to
A260m~
mIJ
20 30 Zeit (Min)
Fig. 4.A, Reaktion yon Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin mit Wasserstoffperoxid 3 ml einer LOsung yon Uridylyl-(3"-5')-4-thiourid[n in o.i M Tris puffer pH 8 (A3, o my = o.42) wurde mit IO/~1 3 ° % H,O, versetzt. Der zeitliche Verlauf wurde spektroskopisch verfolgt. Die Aufna/lme eines U1traviolettspektrums erforderte 0.5 Min, die Zeitang&ben gelten exact fiJr 32o m/z. Fig. 4.B. Reaktion von 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin mit Wasserstoffperoxid be[ pH 8.
Eine weitere elegante Methode zur spektrophotometrischen Bestimmung von 4-Thiouridin beruht auf dessen Reaktion mit 4-Hydroxymercuribenzoes~iure, die zu einem Reaktionsprodukt mit neuem Absorptionsmaximum fiihrt z, Wie aus Fig. 5 ersichtlich ist, l~isst sich die Reaktion yon Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin mit 4-Hydroxymercuribenzoes~ure leicht spektroskopisch verfolgen und quantitativ auswerten, indem man die Absorption gegen die zugesetzte Menge an Reagens auftr~igt. Die spektrophotometrisch bestimmte Konzentration an 4-Thiouridin war 0.252" lO-4 Mol/1, die durch Reaktion mit 4-Hydroxymercuribenzoes~iure bestimlnte KonzentraBiochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 285-293
292
K. H. SCHEIT
TABELLE
II
PAPIERCHROMATOGRAPHIE
UND ELEKTROPHORESE
RF-Werte in Ldsungsmittel
Substanz
A 5',2'-O- D i a c e t y l - 4 - t h i o u r i d i n - 3 ' - p h o s p h a t 4-Thiouridin-3'-phosphat 5"-O-Acetyl-4-thiouridin-3'-phosphat 5'-O-Acetyl-4-thiouridin-2',3'-cyclophosphat 4 - T h i o u r i d y l - (3'- 5' ) -4-thiouri d i n 4 - T h i o u r i d y l y 1- ( 3 ' - 5 ' ) - u r i d i n 4-Thiouridin
B
C
E*
0.53
o. 17
I .o
o.19 0.24
o.14
0.27 0.24
o.26 0.26
0.52
I.O I.O o.70 o.64 0.66 O.18
* Relative Wanderungsgeschwindigkeit bezogen auf 4-Thiouridin-3'-phosphat.
tion 0.25 • IO-4 Mol/1. Die gute l~bereinstimmung ist ein unabh/ingiger Beweis ffir die Richtigkeit des e~°m"-Wertes fiir Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin. Nach der Behandlung von 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin, 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin oder Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin mit Wasserstoffperoxid in w/issriger L6sung von pH 8 zeigte das Ultraviolettspektrum der Reaktionsl6sung nach 3o Min eine Zunahme der Absorption bei 26o m/~, w/ihrend oberhalb 3oo m# keine Absorption mehr vorhanden war (vgl. Fig. 6 und 7). Verfolgte man den zeitlichen Verlauf der Reaktion spektroskopisch, so ergab sich zuerst eine Abnahme der Absorption bei 33 ° m# aber eine Zunahme der Absorption bei 38o und 26o m/~. Offenbar entstand bei der Oxidation des 4-ThiouracilRestes zuerst eine neue Verbindung mit einem ~maxbei 36o m/~ (vgl. auch Zit. 12), welche dann zu Uracil hydrolysiert, wie die sp~itere Abnahme der Absorption bei 38o m# bei weiterem Fortschreiten der Reaktion zeigt. Aus den Ultraviolett-Spektren sieht man, dab tats/ichlich alles Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin oder 4-Thiouridilyl(3'-5')-uridin in Uridylyl-(3'-5')-uridin umgewandelt wird. Es gilt 6Uracil
A260 mr* 20.2 • IO s
CUridylyl-(3'-5')'4"thi°uridin = C4-Thi°uridylyl-(3"5")-uridin
A324 mt~ -- 1.98 " 104
Ffir die Reaktion von Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin mit H,O2 erh~ilt man 0"420
CUridylyl-(3'-5")-4-thi°uridin -- 1.98"
CUridylyl-(3"'5")-uridin
~
0"420
20.2 - I03
104
--
-- o.212"
0.207
•
10 -4
IO-4
Mol/1
Mol/1
In Analogie ffir die Reaktion von 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin mit C4 - T h i o u r i d y l y l - ( 3 ' - 5 " ) - u r i d i n - -
o.735 -- 0.371 Mol/1 1.98" I o 4
o. 76o CUridyly l'(3"-5')-uridin
20.2 • 103
0.376 Mol]l
Biochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 285-293
H202:
SYNTHESE VON DINUCLEOTIDEN MIT
4-THIOURIDIN
293
DISKUSSION
Wie wir an den Beispielen 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin, 4-Thiouridylyl(3'-5')-uridin sowie Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin zeigen konnten, l~sst sich Reinheit und Zusammensetzung dieser Verbindungen aus den Ultraviolett-Spektren recht genau ermitteln. Als Grundlage ffir diese Auswertung benutzten wir die spektroskopischen Daten des 4-Thiouridin. Ebenso zuverliissig l~sst sich ffir diesen Zweck die Reaktion des 4-Thiouridin in diesen Substanzen mit 4-Hydroxymercuribenzoes~ture benutzen. Besonders geeignet erscheint uns dieses Verfahren ffir die Bestimmung von e-Werten bei 4-Thiouridin-Derivaten zu sein. Die Anwendung dieser oder ~thnlicher Analysen-Methoden erscheint uns unerl~sslich, da immer mit einer Hydrolyse von 4-Thiouridin zu Uridin gerechnet werden kann (vgl. Zitat 12, 13, 14). Die Umwandlung von Uridylyl-(3'-5')-thiouridin, 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin oder Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin zu Uridylyl-(3'-5')-uridin dutch Reaktion mit H202 bei pH 8 ftihrt unserer Beobachtung nach nicht zu einer Spaltung der InternucleotidBindung. Da diese Reaktion schnell und unter milden Bedingungen verliiuft, l~sst sie sich sicherlich auch auf Polynucleotide, die 4-Thiouridin enthalten, anwenden. ZUSAMMENFASSUNG
Die Synthese von 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin, 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin sowie Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin mit Hilfe bekannter Methoden wird berichtet. Die Charakterisierung dieser Verbindungen erfolgte durch Analyse der UltraviolettSpektren sowie spektrophotometrische Titration der 4-Thiouracil-Reste (lurch 4Hydroxymercuribenzoes~ture. Es gelang, die milde Hydrolyse der obengenannten Substanzen zu Uridylyl-(3'-5')-uridin durch Behandlung mit Wasserstoffperoxid bei pH 8. Der Verlauf der Reaktion wurde ultraviolett-spektroskopisch verfolgt. DANK
Herrn Prof. DR. F. CRAMER danke ich ftir die wohlwollende Unterstiitzung, Frl. C. TOMARS fiir fleissige und geschickte Mitarbeit. Die Deutsche Forschungsgemeinschaft f6rderte diese Arbeit durch eine Sachbeihilfe. LITERATUR I 2 3 4 5 6 7 8 9 io II 12 13 14
M. N. LIPSETT UND B. P. DOCTOR, ] . Biol. Chem., 242 (1967) 4072 K. H. SCHEIT, Biochim. Biophys. Acta, 145 (1967) 535. K. H. SCHEIT, Tetrahedron Letters, (1967) 113. F. CRAMER UND H. SCHALLER, Chem. Ber., 14 (1961) 1612. K. H. SCHEIT, Chem. Ber., i o i (1968) 1441. F. CRAMER, W. SAENGER, K. H. SCHEIT UND J. TENNIGKEIT, Liebigs Ann. Chem., 679 (I964} 156. J. ZEMLICKA, S. CHLADEK, A. HOLY UND J. SMRT, Collection Czechoslovak. Chem. Commun., 31 (1966) 3198 . F. CRAMER, H. J. RHAESE, S. RITTNER UND K. H. SCHEIT, Liebigs Ann. Chem., 683 (1965) 199. A. HOLY UND K. H. SCHEIT, Chem. Ber., 99 (1967) 3778. F. ECKSTEIN UND H. GINDL, Chem. Ber., i m Druck. D. H. RAMMLER, Y. LAPIDOT UND S . G-. KHORANA, J . Am. Chem. Soc., 85 (1963) 1989. M. N. LIPSETT, ]. Biol. Chem., 242 (1967) 4067 . M. UZlEL, Biochem. Biophys. Res. Commun., 25 (1966) lO 5. J. J. F o x , I. WEMPEN, A. HAMPTON UND J. L. DOERR, J. Am. Chem. Soc., 8o (1958) 1669.
Biochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 2 8 5 - 2 9 3
28 5
BBA 95971
~3BER DIE SYNTttESE UND EIGENSCFIAFTEN VON 4-THIOURIDYLYL(3'-5')-4-THIOURIDIN, 4-THIOURIDYLYL-(3'-5')-URIDIN UND URIDYLYL- (3'-5') -4-THIOURIDIN K. H. SCHEIT
Max-Planck-Institut [iir experimentelle Medizin, Abteilung Chemie, G6ttingen (Deutschland) (Eingegangen am 22. April, 1968)
SUMMARY
The synthesis of 4-thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridine, 4-thiouridylyl-(3'-5' )uridin and uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin by means of known methods is reported. These compounds have been characterised by analysis of their ultraviolet absorption spectra as well by spectrophotometric titration of 4-thiouracil residues with 4hydroxymercurybenzoate. Mild hydrolysis of the above mentioned substances was achieved by treatment with hydrogenperoxide at pH 8 leading to uridylyl-(3'-5' )uridine. The course of the reaction was followed using ultraviolet spectroscopy.
EINFUHRUNG
Tyrosin tRNA von Escherichia coli enth~ilt neben anderen seltenen Nucleotiden zwei 4-Thiouridinphosphat-Reste je Molektil t. LIPSETT UND DOCTOR1 konnten zeigen, dass die Oxidation von Tyrosin tRNA die intramolekulare Bildung eines 4-Thiouridindisulfides zur Folge hat. Interessanterweise fiihrte diese intramolekulare Disulfid-Brticke jedoch nicht zu einer Anderung der Aminos~iure-Acceptoraktivitiit dieser tRNA. Vielleicht kann die Aufkl~irung der Prim~irstruktur yon Tyrosin tRNA die offene Frage nach der Funktion des 4-Thiouridinphosphats in tRNA 16sen. In diesem Zusammenhang erscheint es uns notwendig Kenntnisse fiber die chemischen Eigenschaften von 4-Thiouridin in Polynucleotiden zu erlangen. Wir haben die Darstellung der obengenannten Verbindungen 4-Thiouridylyl(3'-5')-4-thiouridin, 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin, Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin unternommen, weil diese als Modelle ftir die Untersuchung der chemischen Eigenschaften des 4-Thiouridins in Oligonucleotiden dienen kSnnen. Kfirzlich berichteten wir fiber die Polymerisation yon 4-Thiouridin-5'-diphosphat durch Polynucleotidphosphorylase aus Azotobacter vindandii 2. Darfiber hinaus waren wit an der Polymerisation von 4-Thiouridin-5'-diphosphat durch eine primerabh~ingige Polyuucleotidphosphorylase aus Micrococcus lysodeikticus, unter Verwendung der Primer Thiouridylyl(3'-5')-thiouridin, Thiouridylyl-(3'-5')-uridin, Uridylyl-(3'-5')-thiouridin interessiert. MATERIAL UND METHODEN
Ultraviolett-Spektren wurden mit den Geriiten Zeiss PMQ II und Cary 14 aufgenommen. Biochim. Biophys. Acta, 166 (19{)8) 285-293
286
K . H . SCHEIT
Papierchromatographie. Papier: Schleicher und Schfill 2o43 b (gewaschen). L6sungsmittel: (A) 2-Propanol-conc. NH4OH-Wasser (7:1:2, v/v/v), (B) J~thanol-I M Ammoniumacetat (7:3, v/v), (C) 2-Propanol-o.5 M Tri~thylammoniumbicarbonat (9:2, v/v).
Papierelektrophorese. Elektrophorese erfolgte an Whatman 3 MM-Papier in (E) o.I M Tri~thylammoniumbicarbonat (pH 7.5) bei 17 V/cm. Enzymatische Hydrolysen. o.5-1 nag Substrat wurden in 0.2 ml 0.25 M Trispuffer (pH 8.0) gelfst und mit jeweils 20/~1 Enzyml6sung bei 37 ° 4-6 Stdn. inkubiert. Konzentrationen der verwendeten Enzyml6sungen: Pancreas-Ribonuclease, EC 2.7.7.16 (Fa. Boehringer, Deutschland) I m g Protein/ml; Phosphodiesterase, EC 3.1.4.1 (Crotalus adamanteus, Fa. Boehringer, Deutschland) i mg (20 ooo Enzymeinheiten)/ ml. 3'-O-Acetyl-4-thiouridin. 342 mg (I mMol) 5'-O-Acetyl-2', 3'-O-isopropyliden4-thiouridin3 wurden in 20 ml 50 % Essigs~iure gelfst und die Mischung 2 Stdn. unter Rfickfluss gekocht. Danach wurde eingeengt und das gewiinschte Produkt aus dem Rtickstand durch preparative D~innschichtchromatographie an Kieselgel PF254 (Fa. Merck, Deutschland) in Chloroform-Methanol (8:2, v/v) isoliert. Das entsprechende ultraviolett-absorbierende Band wurde mit Chloroform-Methanol (I:I, v/v) eluiert und das Eluat eingeengt. Der Rfickstand wurde aus )~thanol umkristallisiert. Ausbeute 21o mg gelbe Kristalle (70 %), Fp. 143-145 °. ClIH140eN2S (Mol. Gew. 302.3) her.: C 43.7 %, H 4.7 %, N 9.3 %, S lO.6 %; gef:. C 43.6 %, H 4.7 %, N 9.5 %, S lO.5 %.
5',2'-O-Diacelyl-4-thiouridin-3'-phosphat: 302 mg (i mY[ol) 5'-O-Acetyl- 4thiouridin wurden in 3 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gel6st und zu 4 mMol Triimidazolylphosphinoxid4 in IO ml Tetrahydrofuran gegeben. Nach 15 Stdn. bei Raumtemperatur wurden 15 ml H20 zugeffigt und die Mischung mit NHaOH auf pH 9 gebracht. Man liess 2 Stdn. stehen, dampfte dann zur Trockne ein und trennte den Rfickstand durch prliparative Dfinnschichtchromatographie an Kieselgel in 2-Propanol-o.5 M Tri~thylammoniumbicarbonat (9:2, v/v) auf. Das auf das Ausgangsmaterial folgende gelbe Band wurde mit Methanol eluiert. Ausbeute IO ooo A33omfEinheiten (50 %). Das Eluat wurde eingeengt, der Rfickstand in 50 ml NH40H (pH 8) gelfst und 2.5 mg Pancreas Ribonuclease zugegeben. Man inkubierte 5 Stdn. hei 37 °, filtrierte die Lfsung fiber 50 ml Ionenaustauscher Merck I (Tri~thylammonium-Form) und engte das Filtrat zur Trockne ein. Der sirup6se Riickstand wurde in 5 ml I M Tetra~ithylammoniumacetat gelfst und das Gemisch durch mehrmaliges Abdestillieren von Pyridin bei 0.5 Torr wasserfrei gemacht. D~r z~he Gummi wurde in 1.18 g (IO mMol) Essigs~ureanhydrid unter Schfitteln gelfst und das Reaktionsgemisch 3 $tdn. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde nach Zugabe von 20 ml Pyridin-Wasser (I : I, v/v) 5 Stdn. hydrolysiert, die Lfsung anschliessend tiber IOO ml Ionenaustauscher Merck I (Pyridiniumform) filtriert und alas Filtrat schonend zur Trockne eingeengt. Das zurfickbleibende Glas wurde in 3 ml Pyridin gelfst und das Produkt durch Eintropfen in 200 ml )~ther gef~illt. Der gelbe Niederschlag wurde abzentrifugiert und im Vakuum fiber P205 getrocknet. Die Substanz war chromatographisch rein. ClsH1eO11N2SP • CsHeN (Mol. Gew. 519.5). Gefundenes Mol. Gew. (Spektrophotometrisch): 700; P : 4-Thiouridin -- 0.95 :I. Thiouridylyl- (3'-5' )-4-thiouridin: 7° mg (o. i mMol) 5', 2'-Diacetyl-4-thiouridin3'-phosphat und 60 nag (0.2 mMol) 2', 3'-O-Athoxy~thylen-4-thiouridin5 wurden Biochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 285-293
SYNTHESE VON DINUCLEOTIDEN MIT 4-THIOURIDIN
287
durch Abdestillieren von Pyridin bei 0,5 Tort wasserfrei gemacht. Der Sirup wurde in 3 ml Pyridin gel6st und 2o6 mg (i mMol) dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach 15 Stdn. bei Raumtemperatur wurden zur Reaktions-L6sung 3 ml Wasser zugeffigt und 2 Stdn. stehen gelassen. Dann wurde zur Trockne eingeengt und anschliessend mit 20 ml 50 % Essigs/iure 4 Stdn. bei Raumtemperatur hydrolysiert. Danach destillierte man die Essigs/iure ab und hydrolysierte mit 20 ml NH4OH ..... 3 Stdn. bei Raumtemperatur. Die Mischung wurde eingeengt, mit IO ml Wasser aufgenommen und vom unl6slichen Dicyclohexylharnstoff abgesaugt. Der Reaktionsansatz wurde durch preparative Papierchromatographie in L6sungsmittel (C) aufgetrennt. Das ultraviolett-absorbierende Band mit Rp 0.25 wurde mit Wasser (pH 7) eluiert. Ausbeute 80o A~3om~-Einheiten (4o %). Die Substanz wurde durch Pancreas Ribonuclease in 4-Thiouridin-3'-phosphat and 4-Thiouridin im Verh/~ltnis I : 0.95 und durch Phosphodiesterase in 4-Thiouridin und 4-Thiouridin-5'-phosphat im Verh/iltnis I : I gespalten. 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin wurde in analoger Weise ausgehend von 7° mg (o.I mMol) Diacetyl-4-thiouridin-3'-phosphat und 2',3'-0-(2, 4)-Dimethoxybenzylidenuridine in 30 % Ausbeute (600 A83o m~-Einheiten) isoliert. Hydrolyse durch Pancreas-Ribonuclease: 4-Thiouridin-3'-phosphat: Uridin -I.O 5 : I .
Hydrolyse durch
Phosphodiesterase:
4-Thiouridin:Uridin-5'-phosphat =
I.IO : I.
Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin wurde in analoger Weise ausgehend von 9o mg (o.I mMol) 5'-O-Acetyl-2'-O-/ithoxy/ithyluridin°3'-phosphat7 und 60 mg (0.2 mMol) 2',3'-0-Athoxymethylen-4-thiouridin in 4° % Ausbeute (8oo A3a0m~-Einheiten ) isoliert. Hydrolyse durch Pancreas-Ribonuclease: Uridin-3'-phosphat: 4-Thiouridin = 1.15:1. Hydrolyse durch Phosphodiesterase: Uridin:4-Thiouridin-5'-phosphat = I.IO:I. ERGEBNISSE
Bei der Darstellung von 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin, 4-Thiouridylyl(3'-5')-uridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin benutzten wir Methoden, welche wir bereits mit Erfolg zur Synthese anderer Ribooligonueleotide benutzt hatten 8,9. Ausgangsmaterial ffir 5',2'-0-Diacetyl-4-thiouridin-3'-phosphat war 5-O-Acetyl- 4thiouridin welches durch Phosphorylierung mit Triimidazolylphosphinoxid direkt in 5'-O-Acetyl-4-thiouridin-2',3'-cyclophosphat tiberffihrt werden konnte 1°. Wir glaaben, dass diese Phosphorylierung fiber die Zwischenstufen 3 und 4 verl/iuft. Das Cyclophosphat 4 wurde durch pr/iparative Diinnschichtchromatographie an Kieselgel in 5o % Ausbeute isoliert und Pancreas Ribonuclease zu 5 hydrolysiert. Acetylierung yon 5 nach der Methode von RAMMLER,LAPIDOT UND KHORANA11 ftihrte zu chromatographisch sauberen 5',2'-O-Diacetyl-4-thiouridin-3'phosphat e. Fig. 2 gibt das Schema wieder, nachdem die Synthese der Dinucleosidphosphate durchgeffihrt wurde. Die dargestellten Dinucleosidmonophosphate wurden durch pr/iparative Papierchromatographie in L6sungsmittel (C) isoliert. Der Vorteil Biochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 285-293
288
K.H. SCHEIT s
s
o+o!,., j / ,
c,,_o o
o cH,-c~ =
2
1
s
o --o CH,-~-O~_~
0 O:H 0=~./
~
~
0\ /0
S
o
S
o cH3-o
.
'
'
o
o
H20
Ribonuc(
pH8
0°
0
onhydr'~d. I-
~
~°~,~
~p~
o, oH
ZH20
~_#.o, 0 O-C-CH
O=P.oH
O=~.OH
o0
o0"
4
5
60
S c h e m a i. S y n t h e s e v o n 5', 2 ' - O - D i a c e t y l - 4 - t h i o u r i d i n - 3 ' - p h o s p h a t .
p o-~-CH~ O=P,
od ~
6
H O ' - ~ BI
1.Dicyclohexylcarbo-O diimid O=P-Oe b ' ~ B2
2,Essigs~ur~ 3. NH,0H
HO OH HO-~.~
2
8
0X /0
;c\
H R 7 S c h e m a 2. D i r i b o n u c l e o s i d p h o s p h a t - S y n t h e s e 6a, B 1 = 4-Thiouracil; 6b, ]31 = Uracil; 7 a, B= = 4 - T h i o u r a c i l , R = O-CH2-CH3; 7 b, ]32 = Uracil, R = -C~H3(OCH=)=; 8a, 4 - T h i o u r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n ; ]3z = ]3= = 4-Thiouracil; 8b, 4-Thiou r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - u r i d i n ; ]31 = 4-Thiouracil; B= = Uracil; 8c, u r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n " 131 = U r a cil; 13= = 4-Thiouracil.
dieses L6sungsmittels liegt darin, dass die chromatographische Trennung bei pH 7.5 durchgeffihrt werden kann und Hydrolyse yon 4-Thiouracil zu Uracil, wie wir sie bei Verwendung von L6sungsmittel (A) beobachteten, nicht stattfand. Die Dinucleosidphosphate 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin wurden yon Pancreas Ribonuclease und Phosphodiesterase hydrolysiert. Die quantitative Auswertung ergab, dass wenigstens 95 % jedes Dinucleosidphosphates die 3'-5'-Internucleotidbindung enthielt. Das VerNiltnis 4-Thiouridin:Uridin in den Substanzen 4-Thiouridylyl-(3'-5' )uridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridi n l~isst sich auf einfache Weise und genau aus den Ultraviolett-Absorptionsspektren berechnen, da 4-Thiouridin ein Absorptionsmaximum im langwelligen Bereich besitzt. Die Spektren yon 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin sowie Uridylyl-(3'-5')-4_thi o_ uridin sind identisch und weisen Absorptionsmaxima bei 330 und 257 m/, auf. InteBiochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 285-293
289
SYNTHESE VON DINUCLEOTIDEN MIT 4-THIOURIDIN
0.7 1.5
0.6
7
o ×
0.5
~ 1
0.4
0.3
0,2
0.5
0.1
o
i
240
280
320
360
40()
220
260
>,(mp)
300
340
380
A(m~)
Fig. I. U l t r a v i o l e t t - A b s o r p t i o n s s p e k t r e n v o n 4 - T h i o u r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - u f i d i n ( - - ) U r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' )4 - t h i o u r i d i n ( - - ) u n d 4 - T h i o u r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n ( O - - O ) bei p H 7. Fig. 2. U l t r a v i o l e t t - A b s o r p t i o n s s p e k t r u m y o n 4 - T h i o u r i d i n bei p H 7.
ressanterweise ist das langwellige Absorptionsmaximum bei 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4thiouridin zu 328 m,a nach niederen Wellenl/ingen verschoben. Aus den Spektren 1/isst sich sehr genau die Zusammensetzung der Dinucleosidphosphate ermitteln. Das Ultraviolett-Spektrum des analytisch reinen 4-Thiouridin 3 weist bei pH 7 ein Verh/iltnis A3a0m#:A~60m/~ = 7.36 auf. Teilweise Hydrolyse des 4-Thiouridin zu Uridin hat eine Abnahme dieses Wertes zur Folge. Damit ist es m6glich, eine Verunreinigung eines 4-Thiouridin-Derivates aus dem Ultraviolett-Spektrum sicher zu erkennen. TABELLE
I
ULTRAVIOLETT-ABSORPTIONSSPEKTRUM
Verbindung
~m,,
e38o
4-Thiouridin
33 ° 243
2.1 • lO 4 4" IOa
7.36
pH 7
328
2.1 • lO4
3.3
pH 7 Pyridiniumsalz
4-Thiouridylyl- (3'-5 ' )-uridin
33 ° 258
2.1. lO4
1.5o
pH 7 Hyperchromie wAhrend enzym. Hydrolyse ~3 %
Uridylyl- (3 '-5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n
33o 258
2.1- lO 4
1.5o
pH 7 H y p e r c h r o m i e wAhrend enzym. Hydrolyse ~3 %
328
3.78. lO 4
5.2
H y p e r c h r o m i e wiihrend enzym. Hydrolyse ~ I0
5', 2'-O-Diacetyl-4thiouridin-3'-phosphat
4 - T h i o u r i d y l y 1- (3 '-5 ') -4thiouridin
A 830 m~/A 260 ,,t* Bemerkung
%
Biochim. Biophys. Acta, I66 (1968) 285-293
290
K. H. SCHEIT
Das Ultraviolett-Spektrum des 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin nach enzymatischen Hydrolyse besitzt das gleiche Verh~iltnis A~o ma/A ~80ms wie 4-Thiouridin. Dies besagt zumindest, dass diese Substanz die gleiche Reinheit wie das als Ausgangsmaterial benutzte 4-Thiouridin hat. Die Zusammensetzung von 4-Thiouridylyl-(3'5')-uridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin 1/isst sich auf folgende Weise ermitteln: Es gilt A260 m/~
= 8260 m/* . ~260 m# •C M, Uridin CUridin -~- M, 4-Thiouridin 4-Thiouridin
C = Mol/1
8330 m~ A330 m/~ - - M, 4-Thiouridin " C4-Thiouridin _
Umformung und Substitution ergibt: A260 m~ CUridin ~-
_ 8260 m/~ . "//;330 m/~ M, 4-Thiouridin 8330 m~ M, 4-Thiouridin 8260 m/~ M, Uridin
Setzt man for e~O4mr~hiour~di~---- 2.85" 103, ~M,°3a04-Thiour~d~m~ = 2 . 1 0 " I04 (dem Ultraviolettspektrum des 4-Thiouridin entnommen), eZM~U~'di~= I0. I" I0 z und A3~ o m~,/A ,eo m~, = 1.5 (Ultraviolettspektren yon 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin) so erh/ilt man: 1.5 2.IO " IO4 = 0.788 Mol/1 I O . I • IO 3
I - - 2 . 8 5 • IO 3 • CUridin
=
I"5 C4"Thi°uridin - - 2.IO • IOt
o.714 Mol/1
Daraus ergibt sich fiir 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin und Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin ein Verh/iltnis yon Uridin '4-Thiouridin = I.IO
0.6
0,5
/3
(14
0.5
0.3 ~to.3 0.2 0.2 0.1
o.1 300
35o
L,oo
o
.02
?~CmH)
~
.06
~
ol
pMol
Fig. 3. R e a k t i o n y o n U r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n m i t 4 - H y d r o x y m e r c u r i b e n z o e s & u r e bei p H 7. Z u e i n e r L 6 s u n g y o n U r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n i n 3 m l o.o65 M P h o s p h a t p u f f e r p H 7 (Asso m~, = 0.53) w u r d e n j e w e i l s 5 m l e i n e r o.oo2 M 4 - H y d r o x y m e r c u r i b e n z o e s ~ t u r e - L 6 s u n g z u g e g e b e n u n d das Ultraviolettspektrum a u f g e n o m m e n . A, S p e k t r o s k o p i s c h e r N a c h w e i s d e r T i t r a t i o n y o n U r i d y l y l - ( 3 ' - 5 ' ) - 4 - t h i o u r i d i n m i t 4 - H y d r o x y m e r c u r i b e n z o e s A u r e . 13, S t 6 c h i o m e t r i e d e r R e a k t i o n zwischen Uridylyl-(3'-5')-4-thiour;din und 4-Hydroxymercuribenzoes&ure.
Biochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 2 8 5 - 2 9 3
SYNTHESE VON DINUCLEOTIDEN MIT 4-THIOURIDIN
A
29I
0,4 ! A320mp
0 Min 0.4 A
0
03
Q'-'-'~ /e--"
0.42
0.2
0.38
0.I
0.34 /
0
240
280
320 A(mp)
360
400
0.30 0
/
A260mH
/
10
20 30 (Min)
Zeit
0.8' I 0.7
0.6 A
0.5 0.4 0.8
0.3
0.7 0.6 A0.5 0.4 0.3 0,2 0.1 ~ A 3 2 0
0.2' I
0"11 0
2BO
320 A(mp)
-
3o
% - '
to
A260m~
mIJ
20 30 Zeit (Min)
Fig. 4.A, Reaktion yon Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin mit Wasserstoffperoxid 3 ml einer LOsung yon Uridylyl-(3"-5')-4-thiourid[n in o.i M Tris puffer pH 8 (A3, o my = o.42) wurde mit IO/~1 3 ° % H,O, versetzt. Der zeitliche Verlauf wurde spektroskopisch verfolgt. Die Aufna/lme eines U1traviolettspektrums erforderte 0.5 Min, die Zeitang&ben gelten exact fiJr 32o m/z. Fig. 4.B. Reaktion von 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin mit Wasserstoffperoxid be[ pH 8.
Eine weitere elegante Methode zur spektrophotometrischen Bestimmung von 4-Thiouridin beruht auf dessen Reaktion mit 4-Hydroxymercuribenzoes~iure, die zu einem Reaktionsprodukt mit neuem Absorptionsmaximum fiihrt z, Wie aus Fig. 5 ersichtlich ist, l~isst sich die Reaktion yon Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin mit 4-Hydroxymercuribenzoes~ure leicht spektroskopisch verfolgen und quantitativ auswerten, indem man die Absorption gegen die zugesetzte Menge an Reagens auftr~igt. Die spektrophotometrisch bestimmte Konzentration an 4-Thiouridin war 0.252" lO-4 Mol/1, die durch Reaktion mit 4-Hydroxymercuribenzoes~iure bestimlnte KonzentraBiochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 285-293
292
K. H. SCHEIT
TABELLE
II
PAPIERCHROMATOGRAPHIE
UND ELEKTROPHORESE
RF-Werte in Ldsungsmittel
Substanz
A 5',2'-O- D i a c e t y l - 4 - t h i o u r i d i n - 3 ' - p h o s p h a t 4-Thiouridin-3'-phosphat 5"-O-Acetyl-4-thiouridin-3'-phosphat 5'-O-Acetyl-4-thiouridin-2',3'-cyclophosphat 4 - T h i o u r i d y l - (3'- 5' ) -4-thiouri d i n 4 - T h i o u r i d y l y 1- ( 3 ' - 5 ' ) - u r i d i n 4-Thiouridin
B
C
E*
0.53
o. 17
I .o
o.19 0.24
o.14
0.27 0.24
o.26 0.26
0.52
I.O I.O o.70 o.64 0.66 O.18
* Relative Wanderungsgeschwindigkeit bezogen auf 4-Thiouridin-3'-phosphat.
tion 0.25 • IO-4 Mol/1. Die gute l~bereinstimmung ist ein unabh/ingiger Beweis ffir die Richtigkeit des e~°m"-Wertes fiir Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin. Nach der Behandlung von 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin, 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin oder Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin mit Wasserstoffperoxid in w/issriger L6sung von pH 8 zeigte das Ultraviolettspektrum der Reaktionsl6sung nach 3o Min eine Zunahme der Absorption bei 26o m/~, w/ihrend oberhalb 3oo m# keine Absorption mehr vorhanden war (vgl. Fig. 6 und 7). Verfolgte man den zeitlichen Verlauf der Reaktion spektroskopisch, so ergab sich zuerst eine Abnahme der Absorption bei 33 ° m# aber eine Zunahme der Absorption bei 38o und 26o m/~. Offenbar entstand bei der Oxidation des 4-ThiouracilRestes zuerst eine neue Verbindung mit einem ~maxbei 36o m/~ (vgl. auch Zit. 12), welche dann zu Uracil hydrolysiert, wie die sp~itere Abnahme der Absorption bei 38o m# bei weiterem Fortschreiten der Reaktion zeigt. Aus den Ultraviolett-Spektren sieht man, dab tats/ichlich alles Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin oder 4-Thiouridilyl(3'-5')-uridin in Uridylyl-(3'-5')-uridin umgewandelt wird. Es gilt 6Uracil
A260 mr* 20.2 • IO s
CUridylyl-(3'-5')'4"thi°uridin = C4-Thi°uridylyl-(3"5")-uridin
A324 mt~ -- 1.98 " 104
Ffir die Reaktion von Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin mit H,O2 erh~ilt man 0"420
CUridylyl-(3'-5")-4-thi°uridin -- 1.98"
CUridylyl-(3"'5")-uridin
~
0"420
20.2 - I03
104
--
-- o.212"
0.207
•
10 -4
IO-4
Mol/1
Mol/1
In Analogie ffir die Reaktion von 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin mit C4 - T h i o u r i d y l y l - ( 3 ' - 5 " ) - u r i d i n - -
o.735 -- 0.371 Mol/1 1.98" I o 4
o. 76o CUridyly l'(3"-5')-uridin
20.2 • 103
0.376 Mol]l
Biochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 285-293
H202:
SYNTHESE VON DINUCLEOTIDEN MIT
4-THIOURIDIN
293
DISKUSSION
Wie wir an den Beispielen 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin, 4-Thiouridylyl(3'-5')-uridin sowie Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin zeigen konnten, l~sst sich Reinheit und Zusammensetzung dieser Verbindungen aus den Ultraviolett-Spektren recht genau ermitteln. Als Grundlage ffir diese Auswertung benutzten wir die spektroskopischen Daten des 4-Thiouridin. Ebenso zuverliissig l~sst sich ffir diesen Zweck die Reaktion des 4-Thiouridin in diesen Substanzen mit 4-Hydroxymercuribenzoes~ture benutzen. Besonders geeignet erscheint uns dieses Verfahren ffir die Bestimmung von e-Werten bei 4-Thiouridin-Derivaten zu sein. Die Anwendung dieser oder ~thnlicher Analysen-Methoden erscheint uns unerl~sslich, da immer mit einer Hydrolyse von 4-Thiouridin zu Uridin gerechnet werden kann (vgl. Zitat 12, 13, 14). Die Umwandlung von Uridylyl-(3'-5')-thiouridin, 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin oder Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin zu Uridylyl-(3'-5')-uridin dutch Reaktion mit H202 bei pH 8 ftihrt unserer Beobachtung nach nicht zu einer Spaltung der InternucleotidBindung. Da diese Reaktion schnell und unter milden Bedingungen verliiuft, l~sst sie sich sicherlich auch auf Polynucleotide, die 4-Thiouridin enthalten, anwenden. ZUSAMMENFASSUNG
Die Synthese von 4-Thiouridylyl-(3'-5')-4-thiouridin, 4-Thiouridylyl-(3'-5')-uridin sowie Uridylyl-(3'-5')-4-thiouridin mit Hilfe bekannter Methoden wird berichtet. Die Charakterisierung dieser Verbindungen erfolgte durch Analyse der UltraviolettSpektren sowie spektrophotometrische Titration der 4-Thiouracil-Reste (lurch 4Hydroxymercuribenzoes~ture. Es gelang, die milde Hydrolyse der obengenannten Substanzen zu Uridylyl-(3'-5')-uridin durch Behandlung mit Wasserstoffperoxid bei pH 8. Der Verlauf der Reaktion wurde ultraviolett-spektroskopisch verfolgt. DANK
Herrn Prof. DR. F. CRAMER danke ich ftir die wohlwollende Unterstiitzung, Frl. C. TOMARS fiir fleissige und geschickte Mitarbeit. Die Deutsche Forschungsgemeinschaft f6rderte diese Arbeit durch eine Sachbeihilfe. LITERATUR I 2 3 4 5 6 7 8 9 io II 12 13 14
M. N. LIPSETT UND B. P. DOCTOR, ] . Biol. Chem., 242 (1967) 4072 K. H. SCHEIT, Biochim. Biophys. Acta, 145 (1967) 535. K. H. SCHEIT, Tetrahedron Letters, (1967) 113. F. CRAMER UND H. SCHALLER, Chem. Ber., 14 (1961) 1612. K. H. SCHEIT, Chem. Ber., i o i (1968) 1441. F. CRAMER, W. SAENGER, K. H. SCHEIT UND J. TENNIGKEIT, Liebigs Ann. Chem., 679 (I964} 156. J. ZEMLICKA, S. CHLADEK, A. HOLY UND J. SMRT, Collection Czechoslovak. Chem. Commun., 31 (1966) 3198 . F. CRAMER, H. J. RHAESE, S. RITTNER UND K. H. SCHEIT, Liebigs Ann. Chem., 683 (1965) 199. A. HOLY UND K. H. SCHEIT, Chem. Ber., 99 (1967) 3778. F. ECKSTEIN UND H. GINDL, Chem. Ber., i m Druck. D. H. RAMMLER, Y. LAPIDOT UND S . G-. KHORANA, J . Am. Chem. Soc., 85 (1963) 1989. M. N. LIPSETT, ]. Biol. Chem., 242 (1967) 4067 . M. UZlEL, Biochem. Biophys. Res. Commun., 25 (1966) lO 5. J. J. F o x , I. WEMPEN, A. HAMPTON UND J. L. DOERR, J. Am. Chem. Soc., 8o (1958) 1669.
Biochim. Biophys. Acta, 166 (1968) 2 8 5 - 2 9 3