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Beta-lactamases des anaerobies gram-negatifs
M~d Mai lnfect. 1990; 20 hors s~r|e : 141-144
BETA-LACTAMASES DES ANAEROBIES GRAM-NEGATIFS. Difficult6s de la caract6risation par focalisation iso-61ectrique
(Une tude de 48 s0uches). S. TIGAUD*, C. KNOCHE*, A. VIGLIECCA* et P. GOBBER*
U cours d'une p~riode d'un an, nous avons isol~ cent souches d'ana~robies a Gram n& gatif r6sistantes a la p~nicilline. Parmi elles, 48 (46 Bacteroides et 2 Fusobacteriurn) avaient une forte activit~ b~ta-lactamase (ABL) se traduisant par une hydrolyse rapide de la nitroc~phine. Nous avons tent~ de caract~riser rABL par focalisation iso-~lectrique. Les difficult6s m~thodologiques et les r~sultats sont comment,s.
~t~ incluses clans notre ~tude. Au total, nous avons inclus 46 Bacteroides et esp~ces apparent~es et 2 Fusobacterium.
A
MATERIEL ET M E T H O D E S Souches Les souches ont toutes 6t6 isol6es et identifi6es au Laboratoire de Microbiologie Clinique de notre h6pital. Tousles types de pr~16vements ont 6t6 utilis~s, a rexception des selles. Les pr~16vements provenaient uniquement de malades hospitalis6s. Uidentification a 6t~ r~alis6e grace aux techniques de laboratoire classiques : 6tude de la fermentation, contenu en enzymes, 6tude des produits de fermentation par chromatographie en phase gazeuse. La sensibilit6 aux antibiotiques a ~t~ d6termin~e par diffusion sur g&lose de Wilkins-Chalgren, sauf pour les Bacteroides a pigmentation noire (Porphyromonas asaccharolyticus et Prevotella melaninogenica). Pour les souches a pigmentation noire, le milieu de Wilkins-Chalgren a ~t6 enrichi avec 5% de sang de cheval. En cas de r6sistance a la p~nicilline, une activit~ b6ta-lactamase a ~t~ recherch~e par le test de l'hydrolyse de la nitroc6phine sur papier (test "C6finase"). Seules les souches responsables d'un virage du jaune au rouge en moins de cinq minutes ont * Laboratoire de Microbiologie.H6pital de la Croix-Rousse, 93 Grande Rue de la Croix-Rousse, F-69317 Lyon cedex 04.
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Caract~risation de la b~ta-lactamase par focalisation iso-electrique Des extraits bruts ont ete prepares comme suit : sonication selon Olsson, filtration sur nitrocellulose 221, et concentration sur cellophane par le dispositif Centricon. L'activite beta-lactamase (ABL) de l'extrait a ete mesuree en etudiant la cinetique de l'hydrolyse par la nitrocephine determinee par la mesure de l'absorbance a 486 nm. Seules les souches pour lesquelles le test Cefinase a donne un resultat positif en moins de 5 minutes possedaient une activite quantifiable et ont ete utilisees dans la presente (~tude.
Pour 23 souches, qui avaient une forte activite spectrophotometrique, nous n'avons obtenu aucune focalisation, quelles que soient les modifications que nous avons apportees aux conditions de l'examen. Nous
20pl d'extrait enzymatique ont ete places a la surface d'un gel de focalisation (gel de polyacrylamide avec tampon Ampholine de LKB (Pagplate pH 3,5-9,5). La focalisation a ete realisee jusqu'~ 3000 volts/ heure. A la fin de la focalisation, un gel d'agarose en tampon phosphate contenant 0,05 M de nitrocephine a ete pose sur le gel de focalisation. La rev(S.lation a demande moins de 5 minutes. Des souches de reference fournies par A. Philippon, soumises h la meme etude, ont permis de mesurer le pl (figure I).
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avons donc tent~ de purifier les extraits enzymatiques par extraction au toluene et chromatographie sur gel d'exclusion G75, sans plus de succ~so
Les r~sultats sont repr~sent~s sur les tableaux I, II et III.
Nous avons clairement d~montr~, comme plusieurs autres auteurs, que Bacteroides fragilis n'est pas la seule esp~ce ana~robie r~sistante aux b~taqactamines. Nous pensons que la caract~risation des b~talactamases des ana~robies ~ Gram n~gatif peut ~tre utile.
COMMENTAIRE ET CONCLUSION Le nombre de souches de chaque esp~ce est trop faible pour permettre de tirer des conclusions g~n~rales concernant les m~canismes de la r~sistance aux b~ta4actamines des ana~robies ~ Gram n~gatif.
Nous devons souligner que les valeurs des pl obt~nues dans notre ~tude sont quelque peu diff~rentes (plus acides) de celles rapport~es par d'autres auteurs. Une amelioration de nos techniques d'extraction est indispensable avant la r~alisation de nouvelles ~tudes.
RESULTATS
Au cours d'une p~riode d'un an, nous avons isol@ cent souches d'ana~robies ~ Gram n~gatif r~sistantes 8 la p~nicilline. Parmi elles, 48 (46 Bacteroides et 2 Fusobacterium) avaient une forte activit~ b~ta-lactamase. L'~tude de ces souches est d~crite ici. Tous les types de pr~l~vements ont ~t~ utilis~s, ~ rexception des selles. Les pr~l~vements ont tous ~t~ obtenus chez des malades hospitalis~s dans notre h6pital. L'identification a fait appel aux techniques de laboratoire classiques. La sensibilit~ aux antibiotiques a ~t@ d~termin~e par diffusion sur g~Iose de Wilkins-Chalgren. Les extraits bruts ont ~t~ prepares de la fat;on suivante : sonication, filtration 0,22~ et concentration sur cellophane. L'activit~ b~ta-lactamase (ABL) de l'extrait a ~t~ d~termin~e par l'~tude de la cin~tique de rhydrolyse de la nitroc~phine. Nous avons tent~ de caract~riser I'ABL de l'extrait pur par iso-~lectro-focalisation en utilisant un gel Ampholine de LKB et en employant ensuite l'hydrolyse de la nitroc~phine comme r~v~lateur. Des souches de r~f~rence, fournies par A. Philippon, ont ~galement ~t~ ~tudikes. Pour 22 souches, aucune focalisation n'a ~t~ obtenue. Pour les 26 souches restantes, nous d~crivons le pH iso-~lectrique (pl) de I'ABL. RESUME
M o t s cl~s : B~ta-lactamases - Ana~robies Gram n~gatifs - Iso-@lectro-focalisation.
SUMMARY
GRAM NEGATIVE ANAEROBES BETA-LACTAMASES. DIFFICULTY ABOUT THEIR CHARACTERIZATION BY ISO-ELECTRIC-FOCUSING (AN 48 STRAINS EXPERIENCE)
During an one year period, we isolated one hundred Penicillin Resistant Gram Negative Anaerobes. Among them, 48 (46 Bacteroides and 2 Fusobacterium) had a strong Beta-Lactarnase activity. Theses strains are reported in this study. The strains . every kind of samples have been included, except feces. All the samples were from our hospital inpatients. Identification was performed by the routine laboratory techniques. Antibiotic susceptibility was performed by diffusion on
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Wilkins-Chalgren agar. Crude extracts were prepared as following: Sonication, 0,22# Filtration, Cellophane Concentration. The Beta-Lactamase (BLA) activity of the extract was assayed by the kinetic of Nitrocephin Hydrolysis. We attempt to characterize BLA by Iso~electric-focusing of c~'ude extract, using Ampholine Plate from LKB, followed by Nitrocephin hydrolysis as revelation. Reference strains, provided by A. Philippon were included in the assay. For 22 strains, no focalisation has been obtained. For the 26 remaining strains, we report the pl of the BLA, against the Beta-Lactam susceptibility pattern. K e y - w o r d s : Beta-lactamases - Gram negative anaerobes - Iso-electric-focusing.
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BETA-LACTAMASES DES ANAEROBIES GRAM-NEGATIFS. Difficult6s de la caract6risation par focalisation iso-61ectrique
(Une tude de 48 s0uches). S. TIGAUD*, C. KNOCHE*, A. VIGLIECCA* et P. GOBBER*
U cours d'une p~riode d'un an, nous avons isol~ cent souches d'ana~robies a Gram n& gatif r6sistantes a la p~nicilline. Parmi elles, 48 (46 Bacteroides et 2 Fusobacteriurn) avaient une forte activit~ b~ta-lactamase (ABL) se traduisant par une hydrolyse rapide de la nitroc~phine. Nous avons tent~ de caract~riser rABL par focalisation iso-~lectrique. Les difficult6s m~thodologiques et les r~sultats sont comment,s.
~t~ incluses clans notre ~tude. Au total, nous avons inclus 46 Bacteroides et esp~ces apparent~es et 2 Fusobacterium.
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MATERIEL ET M E T H O D E S Souches Les souches ont toutes 6t6 isol6es et identifi6es au Laboratoire de Microbiologie Clinique de notre h6pital. Tousles types de pr~16vements ont 6t6 utilis~s, a rexception des selles. Les pr~16vements provenaient uniquement de malades hospitalis6s. Uidentification a 6t~ r~alis6e grace aux techniques de laboratoire classiques : 6tude de la fermentation, contenu en enzymes, 6tude des produits de fermentation par chromatographie en phase gazeuse. La sensibilit6 aux antibiotiques a ~t~ d6termin~e par diffusion sur g&lose de Wilkins-Chalgren, sauf pour les Bacteroides a pigmentation noire (Porphyromonas asaccharolyticus et Prevotella melaninogenica). Pour les souches a pigmentation noire, le milieu de Wilkins-Chalgren a ~t6 enrichi avec 5% de sang de cheval. En cas de r6sistance a la p~nicilline, une activit~ b6ta-lactamase a ~t~ recherch~e par le test de l'hydrolyse de la nitroc6phine sur papier (test "C6finase"). Seules les souches responsables d'un virage du jaune au rouge en moins de cinq minutes ont * Laboratoire de Microbiologie.H6pital de la Croix-Rousse, 93 Grande Rue de la Croix-Rousse, F-69317 Lyon cedex 04.
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Caract~risation de la b~ta-lactamase par focalisation iso-electrique Des extraits bruts ont ete prepares comme suit : sonication selon Olsson, filtration sur nitrocellulose 221, et concentration sur cellophane par le dispositif Centricon. L'activite beta-lactamase (ABL) de l'extrait a ete mesuree en etudiant la cinetique de l'hydrolyse par la nitrocephine determinee par la mesure de l'absorbance a 486 nm. Seules les souches pour lesquelles le test Cefinase a donne un resultat positif en moins de 5 minutes possedaient une activite quantifiable et ont ete utilisees dans la presente (~tude.
Pour 23 souches, qui avaient une forte activite spectrophotometrique, nous n'avons obtenu aucune focalisation, quelles que soient les modifications que nous avons apportees aux conditions de l'examen. Nous
20pl d'extrait enzymatique ont ete places a la surface d'un gel de focalisation (gel de polyacrylamide avec tampon Ampholine de LKB (Pagplate pH 3,5-9,5). La focalisation a ete realisee jusqu'~ 3000 volts/ heure. A la fin de la focalisation, un gel d'agarose en tampon phosphate contenant 0,05 M de nitrocephine a ete pose sur le gel de focalisation. La rev(S.lation a demande moins de 5 minutes. Des souches de reference fournies par A. Philippon, soumises h la meme etude, ont permis de mesurer le pl (figure I).
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avons donc tent~ de purifier les extraits enzymatiques par extraction au toluene et chromatographie sur gel d'exclusion G75, sans plus de succ~so
Les r~sultats sont repr~sent~s sur les tableaux I, II et III.
Nous avons clairement d~montr~, comme plusieurs autres auteurs, que Bacteroides fragilis n'est pas la seule esp~ce ana~robie r~sistante aux b~taqactamines. Nous pensons que la caract~risation des b~talactamases des ana~robies ~ Gram n~gatif peut ~tre utile.
COMMENTAIRE ET CONCLUSION Le nombre de souches de chaque esp~ce est trop faible pour permettre de tirer des conclusions g~n~rales concernant les m~canismes de la r~sistance aux b~ta4actamines des ana~robies ~ Gram n~gatif.
Nous devons souligner que les valeurs des pl obt~nues dans notre ~tude sont quelque peu diff~rentes (plus acides) de celles rapport~es par d'autres auteurs. Une amelioration de nos techniques d'extraction est indispensable avant la r~alisation de nouvelles ~tudes.
RESULTATS
Au cours d'une p~riode d'un an, nous avons isol@ cent souches d'ana~robies ~ Gram n~gatif r~sistantes 8 la p~nicilline. Parmi elles, 48 (46 Bacteroides et 2 Fusobacterium) avaient une forte activit~ b~ta-lactamase. L'~tude de ces souches est d~crite ici. Tous les types de pr~l~vements ont ~t~ utilis~s, ~ rexception des selles. Les pr~l~vements ont tous ~t~ obtenus chez des malades hospitalis~s dans notre h6pital. L'identification a fait appel aux techniques de laboratoire classiques. La sensibilit~ aux antibiotiques a ~t@ d~termin~e par diffusion sur g~Iose de Wilkins-Chalgren. Les extraits bruts ont ~t~ prepares de la fat;on suivante : sonication, filtration 0,22~ et concentration sur cellophane. L'activit~ b~ta-lactamase (ABL) de l'extrait a ~t~ d~termin~e par l'~tude de la cin~tique de rhydrolyse de la nitroc~phine. Nous avons tent~ de caract~riser I'ABL de l'extrait pur par iso-~lectro-focalisation en utilisant un gel Ampholine de LKB et en employant ensuite l'hydrolyse de la nitroc~phine comme r~v~lateur. Des souches de r~f~rence, fournies par A. Philippon, ont ~galement ~t~ ~tudikes. Pour 22 souches, aucune focalisation n'a ~t~ obtenue. Pour les 26 souches restantes, nous d~crivons le pH iso-~lectrique (pl) de I'ABL. RESUME
M o t s cl~s : B~ta-lactamases - Ana~robies Gram n~gatifs - Iso-@lectro-focalisation.
SUMMARY
GRAM NEGATIVE ANAEROBES BETA-LACTAMASES. DIFFICULTY ABOUT THEIR CHARACTERIZATION BY ISO-ELECTRIC-FOCUSING (AN 48 STRAINS EXPERIENCE)
During an one year period, we isolated one hundred Penicillin Resistant Gram Negative Anaerobes. Among them, 48 (46 Bacteroides and 2 Fusobacterium) had a strong Beta-Lactarnase activity. Theses strains are reported in this study. The strains . every kind of samples have been included, except feces. All the samples were from our hospital inpatients. Identification was performed by the routine laboratory techniques. Antibiotic susceptibility was performed by diffusion on
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Wilkins-Chalgren agar. Crude extracts were prepared as following: Sonication, 0,22# Filtration, Cellophane Concentration. The Beta-Lactamase (BLA) activity of the extract was assayed by the kinetic of Nitrocephin Hydrolysis. We attempt to characterize BLA by Iso~electric-focusing of c~'ude extract, using Ampholine Plate from LKB, followed by Nitrocephin hydrolysis as revelation. Reference strains, provided by A. Philippon were included in the assay. For 22 strains, no focalisation has been obtained. For the 26 remaining strains, we report the pl of the BLA, against the Beta-Lactam susceptibility pattern. K e y - w o r d s : Beta-lactamases - Gram negative anaerobes - Iso-electric-focusing.
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