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Biotechnologie, coquillages et crustacés
Biotechnologie,
R
’ Biofutur,
Outils
de
diagnostic
et ge’nie
ge’ne’tique
141, rue de Javel, 75747
permettront
bient6t
de juguler
rauagent
r&gulit?renzent
d’huitres
et de crevettes.
a conchyliculture est en France une veritable niche Pconomique pour les regions cotieres. En 1995, 148 247 tonnes d’huitres, 69 956 tonnes de moules et 4 4 10 tonnes de coquillages divers y ont PtP produits, soit un chiffre d’affaires de 2,565 milbards de francs. Son impact Pconomique est done loin d’etre negligeable et engage des regions enrieres, Bretagne, Languedoc, Roussillon... Malheureusement, le5 elevages d’huitres, moules et crustacis... sont regulierement victimes d’infections dues i divers agents pathogenes : virus, bacCries, champignons, protozoaires. I.es Cleveurs ont des capacitts d’intervention limit&es et I’equilibre financier de leur entreprise en est affecti. Pour les elevages de crevettes en zone tropicale, les probltmes d’infections sent encore plus cruciaux et certains sites ont ete abandon&s. II est done indispensable
les maladies
qui
les e’leuages de moules,
de trouver des solutions qui mettent a I’ahri les mollusques et Cpargnent aux eleveurs des difficult& rCpCtCes qui peuvent entrainer des faillites. En complement de la selection genetique, les biotechnologies, Cgalement developpies par I’Ifremer, constituent I’un des recours possibles pour tenrer de limiter I’impact des infections qui menacent la conchyliculturc. La vaccination aurait pu @tre envisagee mais le degre d’evolution du systeme immunitaire de ces animaux la rend impossible. En effet, les invertebres, mollusques et crustaces compris, n’ont pas d’immunoglobuline. ni les elements pouvant constituer une memoire immunitaire. Reste alorr une alternative : le diagnostic, qui permet d’agir de facon preventive, ou la genetique qui procurerait par selection ou par genie genetique - des animaux ayant une meilleure resistance aux maladie5.
> Diagnostic et prkvention On est encore impuissant dommages commis par
devant les les agents
Paris
cedex 15.
Forts de l’experience acquise en clinique humaine, dans le domaine du diagnostic des agents pathogenes (batteries, virus, chlnmydia...), ies chercheurs tentent d’en faire bentficier les mollusques et les crustacis, cela aux differents stades de leur production. On essaie d’adapter h la conchyliculture les tests destines i la sante humaine et qui ont fait leurs preuves. Deux techniques d’analyse sent en tours de dtveloppement depuis Ic debut des annees quatre-vingt-dix. D’une part, I’immunodiagnostic par anticorps monoclonaux. La technique est deja bien au point. UII kit base sur la mithode Elisa pour ditecter le protozoaire Bonamia ostreil. parasite dc I’huitre plate, a vu le jour, commercialise. mais n’est plus L’autre methode fait appel aux outils de la biologie moleculaire et utilise de5 sondea nucleiques specifiques des batteries des mollusques ou des virus de crevettes (1).
> Une hub
(1) E Mialhe eta/ (1995). Molecular Marine Biology and Biotechnology 4,
275-283.
rksistante aux maladies
Diagnostiquer les maladies c’est bien, mais faire en sorte que le mollusque ou la crevette soit resistant a celles-ci, ou tout du moins capable de lutter contre elles, serait preferable. Dans genetique cette optique, 1e genie represente une technologie de choix. Son emploi pourrait rendre ces animaux capables de mieux se defendre contre les agents pathogenes qui les menacent, et done de mieux resister aux variations du milieu. Philippe Roth, directeur de I’unite Defense et resistance chez les interBIOFUTURIGO
l
0ctobrc1996
a 47
coquillages
4
(2) F Hubert eial (1996). Aquaf hng Resour9, 115-124. (3) F Hubert ef a/ (1996). furJB/othem 240. 302-306. (4) V Boulot elai (1996) Molecular Marine Btology and B/ochemNry 5,
167-l 74
c
*a
vertPbrts marins (Drim), associant 1’Ifremer et le CNRS sur le campus de I’universitk Montpellier II, explique que les potentiali& immunitaires des huitres et crusta& sont encore inconnues. Dans un premier temps, il vaut mieux comprendre le fonctionnement de leur systsme immunitaire. Or on constate que les moules rksistent mieux aux infections que les huitres (2). Elles semblent posskder une puissante immunit& innke, relayke par different5 effecteurs : cellules macrophages, rkactions de toxicitk, mise en place de protkines de stress, r&actions i base de radicaux oxy#nis libres et sCcrPtion de peptides antihiotiques permettant aux animaux de se dPfendre contre I’invasion microbienne. C’est cette dernike voie qui est explorke par 1’Cquipe de la Drim. Elle a identifik plusieurs de ces peptide,, h la fois chez les crevettes et chez les moules. Gun d’eux a ktt! isole de la moule miditerrankenne ; c’est une dkfensine analogue i celles des insectes, mais originale car poskdant huit cystiines (au lieu de six) et dotCe d’une activitC antibactkienne dirigke i la fois contre les bactkies gram - et gram -. Ces travaux ont iti men& en
collaboration avec le laboratoire de macromol~culairr de biochimir Montpellier (3). Reste maintenant k isoler chez la moule, h l’aide des techniques de biologie mokulaire, la rCgion rkgulatrice qui contrble le gkne de la defensine. U&ape suivante consistera i suivre le fonctionnement de cette rkgion rtgulatrice lors d’une infection et done 2 comprendre comment les moules rkistent si bien. Une possibilitP sera alors de reconstruire un g&e comportant une partie codant une superprotkine antimicrobienne, associ6e i des rigions rkgulatrices approprikes. Le produit de ce supergkne devra etre efficace contre les principaux pathogtnes, stable en milieu salin, actif j faibles doses, non spkcifique pour &re actif sur un spectre le plus large possible et, bien stir, inoffensif pour les cellules des animaux h&es - I’huitre en l’occurrence, qui semble bien dkpourvur de dkfensine i l’itat naturel. Tout ceci aprks avoir franchi les indispensables &apes intermediaires de mise au point. 11 restera i injecter la construction gCnCtique dans des cellules en culture afin d’en vkrifier le fonctionnement. Puis il faudra l’introduire dam des embryons et en verifier l‘int6gration dans le
e poisson ne se consomme pas seulement frais mais aussi en conserve. Un grand nombre d’entre eux sont ainsi trait& et cornrnetcialis& sous des formes variees : du Poisson entier g la prbparation culinaire Qlabo&e, en passant par les miettes B I’huile ou en sauce. Les industriels de la fili&e de transformation, mais aussi les consommateurs, p&endent avoir quelques garantii quant B ces produits que les uns vendent et que les autres wnsomment. Les fabricants franFais souhaitaient depuis longtemps disposer d’une m&ode d’identification rapide et s&e. Afn de wnnaRre exactement le contenu des boites de conserve de poissons, de d&ecter les Bventuelles fraudes, de garantir I’origine et la qualit& des produits, saris oublier le respect de la tiglementation en vigueur, mais aussi, et surtout, pour lutter contre la concurrence d&oyale que leur font les produits import& au d&iment de leur industfie et du consommateur. Pour ce type de conserves, I’expertise morphologique est diiicile, voire impossible, lorsqu’on a affaire B des momeaux de poissons. De plus, si la fabrication du prod& a fait intervenir des traitements thermiques qui ont d&aturb les prot6ine.s. on est dans le brouillard total.
Les m&hodes existantes, comme l’&ctrophor&e, sont inopkantes dans les conserves appertiskes ou des produits fortement sal6s telles les semiconserves d’anchois. Des techniques de biologie mol6culaire, comme la PCR, petmettraient en principe de travailler sur des produits beaucoup plus d6grad&s. Une so&% canadienne, BIO-ID, a mis au point une m&hode bapti&e FINS (forensically intbrmative nucleotid sequencing). Son principe : la wmparaison d’une Gquence de nucl6otides du g&e du cytochrome b de I’ADN mitochondrial, extrait de I’&hantillon aux shp3nces de r&f&ewe contenues dans une banque de donnks constit&e par le laboratoire canadien. Deux chercheun de I’lfmmer (Nantes), Henri Lo&al et Monique ktienne du D6partement de valorisetion des produits, en collaboration avec le laboratoire de g&&ique molkulaire de l’association Atlang&ne (Nantes), ont test6 avec succ&s la fiabilit6 de cette nouvelle technique sur des Bchantiltons wmmerciaux. Ils ont d&ermin6 s-a faisabilitb sur plusieurs espkes de thons et bonites en conserves appertisr%s. Les fragments d’ADN tinatur& par le traitement thermique sont trop courts, tels
L
48 BIOFUTUR160
l
Octobre1996
quels, pour &tre identifik.. L’amplification doit done se faire en dew temps pour que la mkthode soit valable. Premiere &ape, I’amplification des plus courts morceaux suivie d’une seconde amplification. Ainsi, il a ktk possible d’amplifier deux petits fragments d’ADN de 125 et 101 nucleotides dans les Bchantillons pr&lev& dans les boites de conserve m6talliques. ccOn a ainsi
pu,
apt&
s@quencage,
distinguer
/es thonidk du genre Thunnus et proceder 1 des mises au point pour rendre la mbthode plus performante Q, souligne ces chercheurs. Tous les Bchantillons expkrimentaux ont 4th correctement identifiks, cela quelle que soit I’intensitk du traitement appliquk, y compris les produits ayant subi une prkuisson et un bar&me de st&?lisation Blew+. Cette technique de PCR s’est av&Se fiable pour I’identification d’espke de thonidk en conserve appertiske et applicable B des melanges d’espkes, B la condition qu’elles soient dissemblables. Elle pourrait constituer un bon outil pour I’application de la r6glementation europbenne, ainsi que pour celle des normes du Codex Alimentarius. n
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d’huitres
et de crevettes.
a conchyliculture est en France une veritable niche Pconomique pour les regions cotieres. En 1995, 148 247 tonnes d’huitres, 69 956 tonnes de moules et 4 4 10 tonnes de coquillages divers y ont PtP produits, soit un chiffre d’affaires de 2,565 milbards de francs. Son impact Pconomique est done loin d’etre negligeable et engage des regions enrieres, Bretagne, Languedoc, Roussillon... Malheureusement, le5 elevages d’huitres, moules et crustacis... sont regulierement victimes d’infections dues i divers agents pathogenes : virus, bacCries, champignons, protozoaires. I.es Cleveurs ont des capacitts d’intervention limit&es et I’equilibre financier de leur entreprise en est affecti. Pour les elevages de crevettes en zone tropicale, les probltmes d’infections sent encore plus cruciaux et certains sites ont ete abandon&s. II est done indispensable
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> Diagnostic et prkvention On est encore impuissant dommages commis par
devant les les agents
Paris
cedex 15.
Forts de l’experience acquise en clinique humaine, dans le domaine du diagnostic des agents pathogenes (batteries, virus, chlnmydia...), ies chercheurs tentent d’en faire bentficier les mollusques et les crustacis, cela aux differents stades de leur production. On essaie d’adapter h la conchyliculture les tests destines i la sante humaine et qui ont fait leurs preuves. Deux techniques d’analyse sent en tours de dtveloppement depuis Ic debut des annees quatre-vingt-dix. D’une part, I’immunodiagnostic par anticorps monoclonaux. La technique est deja bien au point. UII kit base sur la mithode Elisa pour ditecter le protozoaire Bonamia ostreil. parasite dc I’huitre plate, a vu le jour, commercialise. mais n’est plus L’autre methode fait appel aux outils de la biologie moleculaire et utilise de5 sondea nucleiques specifiques des batteries des mollusques ou des virus de crevettes (1).
> Une hub
(1) E Mialhe eta/ (1995). Molecular Marine Biology and Biotechnology 4,
275-283.
rksistante aux maladies
Diagnostiquer les maladies c’est bien, mais faire en sorte que le mollusque ou la crevette soit resistant a celles-ci, ou tout du moins capable de lutter contre elles, serait preferable. Dans genetique cette optique, 1e genie represente une technologie de choix. Son emploi pourrait rendre ces animaux capables de mieux se defendre contre les agents pathogenes qui les menacent, et done de mieux resister aux variations du milieu. Philippe Roth, directeur de I’unite Defense et resistance chez les interBIOFUTURIGO
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4
(2) F Hubert eial (1996). Aquaf hng Resour9, 115-124. (3) F Hubert ef a/ (1996). furJB/othem 240. 302-306. (4) V Boulot elai (1996) Molecular Marine Btology and B/ochemNry 5,
167-l 74
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e poisson ne se consomme pas seulement frais mais aussi en conserve. Un grand nombre d’entre eux sont ainsi trait& et cornrnetcialis& sous des formes variees : du Poisson entier g la prbparation culinaire Qlabo&e, en passant par les miettes B I’huile ou en sauce. Les industriels de la fili&e de transformation, mais aussi les consommateurs, p&endent avoir quelques garantii quant B ces produits que les uns vendent et que les autres wnsomment. Les fabricants franFais souhaitaient depuis longtemps disposer d’une m&ode d’identification rapide et s&e. Afn de wnnaRre exactement le contenu des boites de conserve de poissons, de d&ecter les Bventuelles fraudes, de garantir I’origine et la qualit& des produits, saris oublier le respect de la tiglementation en vigueur, mais aussi, et surtout, pour lutter contre la concurrence d&oyale que leur font les produits import& au d&iment de leur industfie et du consommateur. Pour ce type de conserves, I’expertise morphologique est diiicile, voire impossible, lorsqu’on a affaire B des momeaux de poissons. De plus, si la fabrication du prod& a fait intervenir des traitements thermiques qui ont d&aturb les prot6ine.s. on est dans le brouillard total.
Les m&hodes existantes, comme l’&ctrophor&e, sont inopkantes dans les conserves appertiskes ou des produits fortement sal6s telles les semiconserves d’anchois. Des techniques de biologie mol6culaire, comme la PCR, petmettraient en principe de travailler sur des produits beaucoup plus d6grad&s. Une so&% canadienne, BIO-ID, a mis au point une m&hode bapti&e FINS (forensically intbrmative nucleotid sequencing). Son principe : la wmparaison d’une Gquence de nucl6otides du g&e du cytochrome b de I’ADN mitochondrial, extrait de I’&hantillon aux shp3nces de r&f&ewe contenues dans une banque de donnks constit&e par le laboratoire canadien. Deux chercheun de I’lfmmer (Nantes), Henri Lo&al et Monique ktienne du D6partement de valorisetion des produits, en collaboration avec le laboratoire de g&&ique molkulaire de l’association Atlang&ne (Nantes), ont test6 avec succ&s la fiabilit6 de cette nouvelle technique sur des Bchantiltons wmmerciaux. Ils ont d&ermin6 s-a faisabilitb sur plusieurs espkes de thons et bonites en conserves appertisr%s. Les fragments d’ADN tinatur& par le traitement thermique sont trop courts, tels
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/es thonidk du genre Thunnus et proceder 1 des mises au point pour rendre la mbthode plus performante Q, souligne ces chercheurs. Tous les Bchantillons expkrimentaux ont 4th correctement identifiks, cela quelle que soit I’intensitk du traitement appliquk, y compris les produits ayant subi une prkuisson et un bar&me de st&?lisation Blew+. Cette technique de PCR s’est av&Se fiable pour I’identification d’espke de thonidk en conserve appertiske et applicable B des melanges d’espkes, B la condition qu’elles soient dissemblables. Elle pourrait constituer un bon outil pour I’application de la r6glementation europbenne, ainsi que pour celle des normes du Codex Alimentarius. n