Caractérisation des variants génétiques de l'albumine humaine par focalisation isoélectrique

Rev. Fr. T r a n s f u s . H 6 m o b i o l . , 1991, 34, 35-47

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Caract6risation des variants g6nbtiques de l'albumine humaine par focalisation iso61ectrique par D. Rochu,

H. Crespeau

et J.M. Fine

Laboratoire d'Immunochimie Analytique, Institut National de Transfusion Sanguine, 6, rue Alexandre Cabanel, 75015 Paris.

RESUME L'albumine normale et les fractions bisalbuminiques issues de variants gdndtiques hdt~rozygotes d'origine europdenne ont dt~ dtudides par focalisation iso~lectrique en couche mince rdalisde sur le sdrum brut ou sur les fractions atbuminiques purifides par chromatographie d'affinitd sur Blue-Trisacryl. Des gammes restreintes d'ampholytes procurant des gradients de pH entre 5 et 8, utilisdes en prdsence d'urde 8 M, ont permis d'obtenir des profils de focalisation autorisant une discrimination des diffdrents variants analysds. Dans de telles conditions, l'albumine normale et les variants prdsentent une microhdtdrogdnditd avec un certain hombre de bandes majeures. L'albumine normale se rdpartit en quatre bandes principales tandis que les variants pr~sentent des bandes additionnelles diffdrant par le hombre et Ie pI. La position des bandes suppl~mentaires, par comparaison avec celles de I'albumine normale est en bonne corrdlation avec le comportement dIectrophordtique des variants, les allotypes rapides exhibant des bandes additionnelles de pI plus anodiques, et les allotypes lents des bandes de pI plus cathodiques. Le nombre et la position de ces bandes

Manuscrit requ le 15 octobre 1990. Accept6 le 30 novembre 1990.

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a permis de caractdriser un certain hombre de variants alors que d'autres prdsentaient des profils similaires, cette similitude dtant en relation avec des substitutions d'aminoacides identiques intervenues g~ des endroits diffdrents de la moldcule d'albumine. Ces observations indiquent que la focalisation isodlectrique peut, d'une part permettre une distinction claire des variants gdndtiques de l'albumine humaine, a la condition que tes mutations de ceux-ci soient de nature diffdrente, d'autre part confirmer l'occurence de mutations de nature identique lorsque les profils de bandes sont indistinguables. Parall~lement g~l'dtude des mobilitds dlectrophordtiques relatives d trois pH, la focalisation isoldctrique analytique devient une technique tr~s utile, g~employer comme deuxi~me drape dans l'identification des allotypes et ce, prdalablement ou gt la place de la ddtermination par sdquenfage, de la modification structurale caractdrisant le variant.

SUMMARY Normal human serum albumin and bisalbuminic fractions from genetic variants of european origin have been studied by ultrathin-layer isoelectric focusing performed on whole sera or after purification of albumin fractions by affinity chromatography on Blue-Trisacryl. Narrow range ampholytes giving pH gradient between 5 and 8, together with the use of 8 M urea, provided suitable patterns allowing to discriminate the various allotypes. In these conditions, both normal albumin and heterozygous variants were microheterogeneous with several main bands ; in the case of normal albumin, four major bands were found, while variants exhibited additional bands differing in number and pI. The position of additional bands comparatively to that of normal albumin was consistent with the electrophoretic behavior of variants. Fast moving allotypes exhibited additional bands with more anodal pls, whereas slow moving variants were characterized by cathodal additional bands. The number and position of these bands allowed to characterize some variants, when they failed to distinguish between some others, identical patterns being correlated to identical mutations arising at different locations on the albumin molecule. These observations indicate that isoelectric focusing could allow a clear distinction of albumin variants, provided that their mutation were different, or could confirm the occurence of identical mutation when IEF patterns are indistinguishable. In addition to electrophoretic mobilities at various pH, analytical isoeIectric focusing could be a useful technique employed as a second step in the identification of allotypes prior to the determination of the structural change charactdrizing the variant.

CARACTERISATION DES VARIANTS GENETIQUES DE L'ALBUMINE

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INTRODUCTION Alors que les m6thodologies actuelles p e r m e t t e n t d'analyser le polymorphisme des protdines par des 6tudes conduites au niveau gdnomique, les donn6es c o n c e r n a n t la variabilit6 g6n6tique de l'albumine du s6rum humain ont 6t6 essentiellement acquises par des 6tudes effectudes au niveau prot6ique. Ainsi, les variants g6n6tiques de l'albumine humaine ont d ' a b o r d 6t6 d6crits sur la base de leur mobilit6 61ectrophordtique anormale, soit plus rapide soit plus lente que celle de l'albumine normale. I1 s'agit dans la majorit6 des cas observ6s d ' u n e expression h6t6rozygote se traduisant par deux fractions distinctes d'albumine (bisalbumin6mie) lors de l'61ectrophor~se du s6rum. Une premibre classification des variants a 6t6 effectu6e par Weitkamp et al. [25, 26] en 1973, distinguant 30 allotypes diff6rents. En 1982, nous avons ddvelopp6 une technique [7] qui a permis d'6tablir une classification des variants d'origine europ6enne, selon leurs mobilit6s 61ectrophor6tiques relatives /~ 3 valeurs de p H diff6rentes. La pr6cision ainsi que la reproductibilit6 de la m6thode ont pu 8tre d6montr6es [9]. Au cours de ces dernibres ann6es, des 6tudes structurales sur certains allotypes ont permis de d6terminer la nature et la localisation des modifications structurales responsables du c o m p o r t e m e n t 61ectrophor6tique anormal de ces variants. Ainsi, la caract6risation structurale des allotypes utilis6s c o m m e t6moins de r6f6rence dans notre classification 61ectrophordtique a 6t6 r6alis6e [21]. Par contre, jusqu'h ce jour, la focalisation iso61ectrique (IEF) des variants gdn6tiques de l'albumine n ' a pu aboutir h l'obtention de donn6es p e r m e t t a n t de distinguer ces allotypes [14]. Dans ce travail, nous rapportons les r6sultats de l'6tude par focalisation iso61ectrique, de variants d'albumine d'origine europ6enne.

MATERIEL ET METHODES Variants g6n6tiques de l'albumine Les fractions d'albumine, c o n t e n a n t / t la lois la prot6ine normale et le variant ont 6t6 purifi6es par chromatographie d'affinit6. Dix 6chantillons de r6f6rence, structuralement caract6ris6s ont 6t6 utilis6s : cinq variants rapides, l'albumine Gent [27], 573 Lys -~ Glu [17], l'albumine Castel di Sangro, 536 Lys -~ Glu [20], l'albumine Venezia, 572Gly~Pro [193, l'albumine Reading [24], 6chantillon 8003, 313 Lys ~ Asn [21], l'albumine Vanves [6], 574 Lys ~ Asn [18], et cinq variants lents, la proalbumine Christchurch [2], 6chantillon 3433, - 1 Arg ~ Gin [8], la proalbumine Lille [1], 6chantillon 6035, - 2 Arg ~ His [10], l'albumine Roma, 321 Glu ~ Lys [18], l'albumine B [5], 6chantillon 3006, 5 7 0 G l u ~ Lys [21] et l'albumine Catania, 580 Glu ~ Lys ~ 582 [11].

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L'albumine Sondrio, dont la substitution (333 Glu-~ Lys) vient d'6tre dftermin6e (Galliano, communication personnelle), de nature identique /t celle des variants R o m a et B, fait l'objet d'une 6tude particuli6re ne figurant pas d a m le prbsent travail. Enfin, l'albumine Milano n'est pas encore caractdris6e structuralement. R6actifs Acrylamide, N,N'-m6thyldn6bisacrylamide, Repel-Silane, ur6e et Coosmassie briliant Blue R 250, proviennent de LKB (Bromma, Suede). Les ampholytes Pharmalytes(40 %) couvrant diff6rentes gammes de pH proviennent de Pharmacia (Uppsala, Subde). Tousles autres r6actifs, de qualit6 analytique, sont de chez Prolabo (Paris, France). Purification des albumines par ehromatographie d'affinit6 Les fractions d'albumines, contenant l'albumine normale et le variant ont 6t6 purifi6es par chromatographie d'affinit6 sur Blue-Trisacryl (IBF, Villeneuve-la-Garelme, France). 1 ml de s6rum inject6 sur une cololme de 7 ml de Blue-Trisacryl en tampon d'adsorption, Constitu6 de 0,025 M Tris-HC1 pH 8,8 0,6 M NaC1. Apr~s lavage des prot6ines nonadsorb6es, les fractions d'albumines ont 6t6 61u6es par 0,025 M Tris-HC1 pH 8,8, 3 M NaC1. La colonne a ~t6 r~g6n6r6e par passage d'eau distill6e puis de tampon d'adsorption. La puret6 des fractions d'albumine a 6t6 v6rifi6e par 61ectrophor6se sur ac6tate de cellulose Cellogel (Chemetron, Milano, Italie). Focalisation iso61ectrique en couche mince L'IEF en couche mince [15], a 6t6 pratiqu6e horizontalement dans des gels de polyacrylamide de 0,5 mm d'6paisseur en utilisant le systbme Multiphor LKB. Les gels de polyacrylamide (4 % T, 3 % C) coul6s sur des feuilles de GelBond (FMC Rockland ME, USA) contenaient 8 M d'ur6e et un m61ange d'ampholytes de pH 5-6 et 5-8 (1/1, v/v) ~ une concentration finale de 2 %. La temp6rature a 6t6 maintenue /~ 200 C. Les solutions d'61ectrolytes utilis6es 6taient 0,04 M d'acide glutamique pour 1'anode et 0,2 M d'histidine pour la cathode. Les 6chantillons d'albumine, 20 ~1 4 g/l, pr6alablement dialys6s contre 0,1 M NaC1 et 8 M d'ur6e ont 6t6 d6pos6s sur des papiers Whatman 3 MM, 5 x 10 mm appliqu6s ~ la surface du gel/~ 2 cm de la cathode. Un voltage de 500 V a fit6 appliqu6 all gel, puis aprbs retrait des papiers applicateurs, les conditions 61ectriques imposfes ont 6t6: 2 000 V, 20 W, avec limitation du courant/~ 20 mA. La dur6e totale des migrations a 6t6 de 2 h 30 min. Le gel a d'abord 6t6 fix6 pendant 1 h dans l'acide trichloroac6tique/~ 20 %, puis lav6 30 minutes dans la solution de d6coloration (m6thanol 35 %, acide ac6tique 10 %, eau distill6e 55 %).

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Les prot6ines ont ensure 6t6 color6es par le Coomassie R 250/: 0,1% en m6thanol 45 %, acide ac6tique 8 %, eau distill6e 47 %, pendant 30 min.

Western-Blot Le transfert des prot6ines s6riques s6par6es par IEF a 6t6 r6alis6 sur membranes d'Immobilon P (Millipore, Bedford, MA, USA) par simple pression durant 10 rain. Les membranes sont lav6es en tampon Tris salin (TBS) puis incub6es dans le m6me tampon contenant 6 % de g61atine de poisson comme agent de blocage. Les membranes sont ensuite trait6es par un s6rum de lapin anti-albumine humaine. La r6v61ation immunoenzymatique est fake/~ l'aide d'un second anticorps anti-Ig de lapin coupl6 /: la phosphatase alcaline.

RESULTATS La focalisation iso61ectrique en gel de polyacrylamide en couche mince est utilis6e pour pratiquer des 6tudes comparatives de prot6ines, l'6tat natif ou d6natur6es en pr6sence de fortes concentrations d'ur6e. Nous avons appliqu6 ce principe g6n6ral & l'analyse des variants g6n6tiques de l'albumine humaine. De nombreuses IEF ont 6t6 pratiqu6es en absence ou en pr6sence d'ur6e, soit sur les s6rums totaux, sok sur les fractions d'albumine pr6alablement purifi6es. Les r6sultats obtenus en l'absence d'ur6e ont 6t6 moins satisfaisants que ceux obtenus en pr6sence de cet agent d6naturant. L'IEF en pr6sence d'ur6e a abouti/~ des profils nettement diff6renci6s permettant de disfinguer de fines bandes, alors qu'en l'absence d'ur6e, celles-ci sont diffuses et masqu6es darts une tache d'albumine. D'autre part, FIEF r6alis6e sur les s6rums, en pr6sence d'ur6e 8 M, ne permet pas d'obtenir des profils de bandes suffisamment lisibles pour permettre une discrimination des diff6rents allotypes d'albumine, du fait que les multiples bandes de l'albumine normale et du variant sont partiellement masqu6es par d'autres prot6ines. Pour cette raison, les fractions d'albumine ont 6t6 pr6alablement purifi6es. Enfin, du fait que l'albumine normale pr6sente un point iso61ectrique de 4,7 et que la pr6sence d'ur6e 8 M occasionne un ApI de 1,2 unit6s pH, nous avons 6t6 conduits & choisir des gammes d'ampholytes encadrant pH 6. Plusieurs gradients 6troits de pH ont 6t6 essay6s afin d'obtenir la meilleure r6solution des bandes d'albumine, couvrant des gammes entres 4 et 8, les r6sultats les meilleurs ayant 6t6 obtenus avec un m61ange 5-6, 5-8, g parts 6gales. L'albumine normale isolde d'un s6rurn individuel est homoghne lors de l'analyse 61ectrophor6tique. Elle montre par contre en IEF une h6t6rog6n6it6 se pr6sentant sous la forme de 4 bandes majeures correspondant g diff4rents pI et pr6sentes/~ des concentrations variables. Par

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comparaison, les fractions d'albumine de sujets h6t~rozygotes, comenant l'albumine normale et le variant, m o m r e m des bandes additionnelles dues au variant. Les profils d'IEF de l'albumine normale et des bisalbumin~mies comenant les allotypes europ~ens sont pr6sem~s sur la fi-

gure 1 A. 11 n'est pas surprenant d'observer que deux groupes de variants peuvem ~tre mis en 6vidence selon la position des bandes additiolmelles, par rapport/~ celle des bandes de l'albumine normale. Le premier groupe pr~seme des bandes plus anodiques incluant tousles variants rapides en ~lectrophor~se (albumines Gent, Castel di Sangro, Venezia, Vanves et Reading). Le second groupe se caract~rise par des bandes additiolmelles plus cathodiques et comprend les variants lems: les proalbumines Christchurch et Lille, les albumines Roma, B, Milano et Catania. La figure 1 B montre la repr6semation diagrarnmatique des r~sttltats de la figure 1 A. Les bandes de l'albumine normale et des variants ont ~t6 numfrot6es de 1 ~t 12 par ordre d'61oignement par rapport/~ la cathode. L'albumine normale procure 4 bandes principales, num6rot6es 6, 7, 8 et 9, qui se retrouvem chez tomes les alloalbumin~mies h6t6rozygotes.

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FIG. 1. - Profils de focalisation iso61ectrique de l'albumine humaine normale et d'anotypes d'origine europ6elme. De Gent ~ Reading : variants de mobilit6 rapide, de Christchurch ~ Catania, variants de mobilit~ lente. A : focalisafion iso~lectrique en gel de polyacrylamide en couche mince, en gradiem de pH de 5 8, en pr6sence d'urbe 8 M. La cathode est en haut. B : repr~semation diagrammafique des profils d'IEF de la figure 1 A. Settles les bandes majeures sont num6rot6es en ordre de distance croissante par rapport ~ la cathode. 1 /t 5 : bandes additiolmelles des variants lents, 6 ~t 9 : bandes de l'alburnine normale, 10 h 12 : bandes additionnelles des variants rapides.

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Chaque variant est caract6ris6 par le nombre et la position de ses bandes suppl6mentaires, certains variants pr6sentant des profils sp6cifiques, alors que d'autres pr6sentent des distributions de bandes similaires. Par exemple, l'albumine Venezia, caract6ris6e par les bandes 10 et 11, se distingue de t o u s l e s autres variants rapides, alors que les albumines Vanves et Reading pr6sentent les m6mes profils d'IEF caract6ris6s par la pr6sence de la bande 10. De plus, les concentrations respectives des bandes 8 et 9 sont augment6es chez tous les variants rapides par rapport /~l'albumine normale ou aux variants lents. De la m6me mani6re, parmi les variants lents, certains pr6sentent des profils individuels et d'autres des profils similaires. Les donn6es compl6tes des distributions de bandes en IEF des allotypes europ6ens 6tudi6s sont r6sum6es dans le tableau L avec mention de la modification structurale de chaque variant, et de la charge 61ectrique diff6rentielle par rapport/t l'albumine normale, due cette modification. I1 ressort de ces r6sultats que 8 types de profils diff~rents sont observ6s parmi 11 allotypes europ6ens soumis g l'analyse permettant la distinction de profils individuels pour 5 variants : Venezia, Christchurch, Lille, Milano et Catania. De plus, les profils similaires constat6s pour certains aUotypes peuvent ~tre corr616s/~ des modifications structurales de nature identique survenues en diff6rentes localisations sur la mol6cule d'albumine : Gent et Castel di Sangro = Lys ~ Glu, Vanves et Reading = Lys ~ Asn, B e t R o m a - Glu ~ Lys. Les autres similitudes concernent les allotypes dont la modification structurale n'a pas encore ~t6 caract6ris6e. La purification de la fraction albumine des s6rums, r6alis6e dans cette 6tude, ne peut 6tre envisag6e lors de l'6tude syst6matique d'un large 6chantillon de population. Aussi, g la suite de la caract6risation des variants par IEF pratiqu6e sur les fractions albuminiques purifi6es, un protocole d'utilisation de cette technique appliqu6e directement sur les s6rums alloalbumin6miques a 6t6 d6velopp6. Aprbs focalisation des prot6ines s6riques, ceUes-ci sont transf6r6es suv membranes d'Immobilon et les bandes correspondant/~ l'albumine normale et au variant sont d6tect6es par un anticorps anti-albumine humaine, lui-mbme r6v616 immunoenzymatiquement par un anticorps antiglobuline correspondant coupl6/~ la phosphatase alcaline.

DISCUSSION L'albumine est compos6e d'une seule chaine polypeptidique de 585 r6sidus. Cette prot6ine est responsable de 75/t 85 % de la pression osmotique collo'idale du plasma et agit comme prot6ine de transport pour les acides gras, la bilirubine, et de nombreux autres catabolites et drogues. En 61ectrophor6se de routine, l'albumine normale est homog6ne (une seule bande). Bien que le gbne de l'albumine soit tr6s polymorphique selon les r6sultats de nombreux travaux sur les s6quences d'ADN

(a) Co) (c) (d)

3

3 3 4

4 5 5

5

6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6

7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7

Bandes (a)

8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

10 10 10' 10 10

11

12 12

Lys -o Glu Lys -~ Glu Gly --+ Pro (b) Lys --+ ASh gys -+ Asn n.d. 580 Gin -0 Lys (c) 321 Glu -~ Lys 570 Glu -~ Lys - 1 Arg --+ Gin - 2 Arg --* His

573 536 572 574 313

Mutation

-2 -2 -1 -1 1 0 n.d. +1 +2 +2 +2 +3

Charge (d) nette

Les bandes les plus concentr6es sont en gras, les moins concentr6es en italique. Substitution de sept r~sidus 572 ~ 578 (Pro.Thr.Met.Arg.Ile.Arg.Glu) par d61~tiou d'une base et perte des sept r6sidus C terminaux par codon de terminaison. Substitution de trois r~sidus 580.581.582 (Lys.Leu.Pro) et perte des trois r6sidus C terminaux. Charge 61ectrique nette par rapport ~t l'albumine normale.

Gent Castel di Sangro Venezia Vanves Reading Normal Milano Catania Roma B Christchurch Lille

Allotype

Tableau I Distribution des bandes observdes par focalisation iso~lectrique des allotypes europdens d'albumine humaine, avec leur mutation et leur diffdrence de charge dlectrique nette par rapport d l' albumine normale.

¢b

O

.ga t.~

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compl6mentaire ou g6nomique, ou sur le polymorphisme de longueur des fragments de restriction, les variants g6n6tiques d'albumine sont un ph6nom6ne tr6s rare [9]. Les modifications structurales identifi6es h ce jour sur les alloalbumines sont des mutations ponctuelles au niveau de la s6quence de la prot6ine mature on sur celle du propeptide,/~ l'exception de deux variants caract6ris6s par des d616tions C terminales introduisant un d6calage du cadre de lecture. L'albumine hurnaine exarnin6e en IEF apparait comme h6t6rog6ne, sous forme de plusieurs bandes de points isodectriques diff6rents. La microh6t6rog6n6it6 ainsi observ6e peut &re due h des interactions hydrophobes de la prot6ine avec des ligands charg6s. Les acides gras, ont &6 d6crits cornme entralnant une microh6t6rog6n6it6 de l'albumine en absence d ' u r &, alors que leur influence semble abolie en pr6sence de faibles concentrations d'ur6e [ 13]. Cependant, de fortes concentrations d'ur6e, telles que celles utilis6es dans ce travail, dissocient les aggr6gats ou les polym6res, et d6roulent les cha~nes polypeptidiques, lib6rant ainsi les cofacteurs non covalents. D'autre part, certaines prot6ines ont une forte affinit6 pour les ampholytes, l'albumine humaine par exemple, pouvant fixer quatre mol6cules d'ampholyte par mol6cule de prot6ine [22]. Les ligands non covalents &ant th6oriquement 6vinc6s par l'action de l'ur6e, seuls ceux li6s de fa~on covalente sont susceptibles d'introduire en IEF une h6t6rog6n6it6 de l'albumine. Par exemple, une glycosylation de l'albumine provoque une grande h6t6rog6n6it6, rnontrant jusqu'h 20 bandes rnajeures entre pI 4 et pI 7 [3]. Comme la glycosylation abaisse le pH en bloquant les groupements amines primaires des prot6ines, il faut cependant admettre l'intervention d'autres r6actions pour aboutir h la suppression de charges n6gatives de la mol6cule d'albumine. En d6pit du profil complexe de l'albumine humaine analys6e en IEF, les exp6riences pratiqu6es en pr6sence d'ur6e 8 M perrnettent d'obtenir des r6sultats tr6s informatifs. Les distributions des bandes observ6es pour les variants diff6rent de celles de l'albumine norrnale. Ces variants 6tant /~ l'6tat h6t6rozygote, pr6sentent en plus des 4 bandes rnajeures de l'albumine normale des bandes additionnelles dues h l'albumine rnut6e. Selon les variants, ces bandes additionnelles different par leur nornbre et leur position. En particulier, leur position est en relation avec le comportement 61ectrophor&ique des aUotypes, les variants rapides pr6sentant des bandes anodiques, les variants lents des bandes cathodiques. Ces r6sukats sont en accord avec les modifications structurales des variants. Les variants 6tant des 61ectromorphes, d6tect6s en vertu de leurs rnobiht6s dectrophor&iques anormales, les mutations responsables de ces allotypes sont des substitutions entra~nant une modification de la charge 61ectrique nette. Ainsi, les albumines Gent et Castel di Sangro, avec une charge relative de - 2 par rapport /~ l'alburnine norrnale, pr6sentent la bande la plus anodique, et la proalbumine Lille, avec une charge diff6rentielle de + 3, pr6sente la bande la plus cathodique. Cependant, s'il refl6te la nature de la mutation, le profil en IEF ne refl6te pas la localisation de celle-ci. Les variants qui diff6rent par leurs mobilit6s ~lectrophor6tiques h 3 pH, mais qui portent une m~rne substitution (par

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D. ROCHU et coil

exemple Glu ~ Lyg localis4e a diff6rentes positions sur la mol6cule d'albumine, sont indistinguables par leur profil d'IEF. Au contraire, les variants caract6ris6s par des substitutions de nature diff6rente pr6sentent des profils diff4rents. A la lumi6re de ces r6sultats, pour un variant dont la mutation n'est pas encore connue et pour lequel le profil d'IEF est trouv4 similaire ~ celui d'un variant structuralement caract6ris6, l'incidence de la mutation sur la charge diff6rentielle peut 6tre pr6dite. L'61ectrophor6se/~ 3 pH permet d'investiguer un large spectre d'ionisation de la prot6ine. Ainsi, est analys6e l'ionisation relative des diff6rents r6sidus potentiellement charg6s, localis6s en diff6rentes positions sur la mol6cule, dans diff6rents environnement polypeptidiques. Au contraire, FIEF en conditions d6naturantes s61ectionne les mol6cules d'albumine d6bobin6es, en fonction de leur point iso61ectrique. Bien que FIEF soit couramment utilis6e darts l'analyse du polymorphisme de prot6ines comme l'hbmoglobine ou 1'~ 1-antitrypsine, cette technique n'a jusqu'alors pas 6t6 appliqu6e/t l'4tude des variants g6n6tiques de l'albumine. Dans un article sur l'h6t6rog6n6it6 de l'alburnine bovine en IEF, Spencer et King [23] avaient montr6 qu'une bisalbumin6mie humaine diffbrait de l'albumine normale. Plus r6cemment, plusieurs variants g6nhtiques d'albumine humaine ont 6t6 analys6s en IEF. Leurs profils compar6s/~ celui de l'albumine normale permettent seulement de distinguer les variants anodiques des variants cathodiques, sans pouvoir diff6rencier les variants /t l'int6rieur de chacun de ces deux groupes [14]. Dans le pr6sent travail, nous montrons que, dans certaines conditions, la focalisation iso61ectrique peut 6tre utilis6e et permettre une diff6renciation des variants selon leur charge nette diff6rentielle par rapport/~ celle de l'albumine normale. Bien que la d4termination de la s6quence du peptide mut6 soit le crithre final de la caract6ristique d'un variant, celle-ci est compliqu6e et longue, et de ce fait, rarement r4alis4e. En compl6ment de la d6termination des mobilit6s 61ectrophor6tiques relatives, la focalisation iso4lectrique des variants procure des indications pr6cieuses concernant la nature de la modification structurale responsable. Darts ce contexte, l'utilisation de FIEF directement sur les 6chantilIons de s4rums avec r6v41ation par immunoblotting ne requiert ni volume important nu purification pr6alable, et permet d'envisager son application au d6pistage des variants de l'albumine dans une population donn6e. L'utilisation de FIEF pour d6tecter 6ventuellement des substitutions affectant des amino acides inaccessibles /~ l'ionisation et doric non affect6s par les modifications de pH des tampons d'61ectrophorbse est maintenant soulev6e. La repr6sentation tridimensionnelle de la configuration mol6culaire de l'albumine 4tablie r4cemment par cristallographie [4] montre l'existence des trois domaines homologues avec les sousdomaines IA, IB et IIA formant une large tbte compacte, tandis que les sous-domaines IIB, IIIA et IIIB constituent une queue 6tendue (fig. 2A). La position des substitutions actuellement connues montre que celles-ci sont localis6es sur la pattie aminoterminale, y compris le propeptide, sur les h6lices des inter sous-domaines expos6es au solvant, ainsi que sur les

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A

B

domaine I

domaine II domaineIII ]

C it N

--1020

50

80

t10

170 230 290 350 410 470 530 5gO 140 200 260 320 380 4 4 0 500 560

s6quence FIG 2. - Variabilit6 g6n6tique de l'albumine humaine d6tect6e par 61ectrophorbse des prot+ines. A : configuration mol6culaire de l'alburnine humaine d'apr~s Carter et al. [4]. B : localisation des domaines et sons-domaines de Ia mol6cule d'aIbumine humaine. C : localisafion sur la s6quence polypeptidique de l'albumine des mutations correspondant aux variants d6tect+s par 61ectrophor~se des prot6ines. (N = n o m b r e de mutations par classes de s+quences de 5 aminoacides).

domaines de connexion n o n h61ico'idaux, enfin sur les sous-domaines 6tir~s IIB et IIIB. De telles localisations sugg6rent que ces mutations ont 6t6 essentiellement d6tect6es darts des r6gions accessibles h une 6ventuelle ionisation (fig. 2 B). La figure 2 C m o n t r e la variabilit6 de l'albumine h u m a i n e selon les mutations d6tect6es par l'61ectrophor6se des prot6ines, confirmant l'existence de ~, clusters ,, de mutations d6tect6es,

D. ROCHU et coil.

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d a n s des p o s i t i o n s pr6cises, c o r r e s p o n d a n t p r o b a b l e m e n t a u x r 6 g i o n s de la m o l 6 c u l e d ' a l b u m i n e accessible a u x t a m p o n s d ' 6 1 e c t r o p h o r b r e . U n e r e c h e r c h e de v a r i a n t d ' a l b u m i n e p a r I E F e n c o n d i t i o n s d 6 n a t u r a n t e s d e v r a i t p e r m e t t r e de t e s t e r l ' h y p o t h b s e q u e la variabilit6 de la p r o t f i n e est d i s t r i b u 6 e t o u t a u l o n g de la c h a i n e p o l y p e p t i d i q u e c o m p r e n a n t des m u t a t i o n s i n d 6 t e c t a b l e s e n 61ectrophorbse, o u si les ~, clusters ,, de s u b s t i t u t i o n s refl6tent la vuha6rabilit6 de c e r t a i n e s r 6 g i o n s d u g b n e de l ' a l b u m i n e / ~ la m u t a t i o n . REMERCIEMENTS. -- Nous remercions M me C. NOLET pour l'excellente assistance de secrbtariat, le Pr F. PORTApour la fourniture des allotypes d'origine italienne, et le Pr F.W. PUTNAMpour ses fructueux commentaires.

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CARACTERISATION DES VARIANTS GENETIQUES DE L'ALBUMINE

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