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Chromatographie d'affinité de la glucokinase microsomique du foie de chat
Jortrtral of Chromafography, 104 (1975) 470-473 0 Elscvier Scientific Publishing Company, Amsterdam
-
Printed in The Netherlands
CI-IROM. 7956
N
ate
Chromatographie G. AZZAR,
d’affinit6
G. BERTHILLIER
de la glucokinase
le 16 scptcmbrc
du foie de chat
ct R. GOT
UthwsitP Claude Betward Lyorr I, Luhorntoirc rtovembrc~ 19/S, 69621- Vill~wrharrrte (Frar~ce)
(Rcfu
microsomique
de Biochirnic
cfcs Mcrnbrmw.~.
43,
Borrlcvard
cl14
I I
1974)
Bien qu’ayant et6 I’objet de nombreux travaux en raison de leur inter& sur lc plan physiblogique, les glucokinases hcpatiques sont encore peu ou mal caracterisees au point de vue physicochimique. De telles etudes exigent, en effet, des quantites relativement importantes d’enzymes purifies; or, les m&odes de fractionnement et de purification Btablies pour ces glucokinases sont longues et laborieuses ‘e2 et n’aboutissent qu’i de petites quantites d’un enzyme encore impur. Ces difficult& sont encore accrues s’il s’agit d’un enzyme membranaire car il faut prCalablement le solubiliser a partir de fractions subcellulaires dont I’obtentinn generalement en faible quantite necessite la mise en oeuvre d’un fractionnement cellulaire plus ou moins 6laborC. C’est ainsi que la glucokinase du foie de rat 3*4dont Ies proprietes cinetiques prdsentent une originalite certaine5+ n’a pu Ctre aussi bien caracteri&e qu’il aurait et6 souhaitable. La chromatographie d’aflinite semble apporter une solution a ces difficult& grice i sa rapidit&, sa simplicitC, son rendernent et son facteur de purification Clew%. Le Foie de chat possede Cgalement une glucokinase microsomique mais en quantite nettement plus 6levCe que le Foie de rat ‘. C’est done cet enzyme qui a et6 l-objet de nos investigations. S’agissant d’une glucokinase plusieurs types de ligands peuvent dtre fixes B la matrice: glucose, glucosamine ou N-acCtylglucosamine, ATP en ne considerant que les substrats. Pour des raisons de simplicitC de fixation, nous avond Ctd: amen& a cboisir I’ATP. MATCRIEL
ET Ml?TNODES
Les microsomes des hepatocytes de chat contiennent en moyenne le tiers de I’activite glucokinasique cellulaire ‘. Cettc activitd est solubilisee en totalitd par action du Triton X-100 i une concentration de 0.1 y0 (v/v). La solution ainsi obtenue est amenee i une concentration 1.8 M en sulfate d’ammonium. Apres elimination du precipit6, le surnageant est ajuste & une concentration 2.2 M. Le nouveau precipite contient environ 70 “/, de l’activite glucokinasique des microsomes. Ce precipitd est redissous et dialyse contre le tampon Tris-HCI 20 mM (pH 8), MgS04 4 mM, glucose 4 mM, mercaptoethanol 4 mM et EDTA 4 FM. La concentration finale est de 10 mg de proteines dosees par la methode de
NOTES
471
Lowry et al.8par millilitre. L’ATP est fix& SLIT du Sepharose active par le CNBr (Pharmacia, Uppsala, Suede; lot N” 6744) selon la methode de Jackson et al.g, le bras utilise etant le y-methyl ester de glutamate. L’addition de [‘%]ATP permet d’estimer par une simple mesure de radioactivite la quantite d’ATP fix& sur le SCpharose. L’Clution de I’activite glucokinasique est rCalisCe soit par concentration croissante de KC1 soit par une solution d’ATP. Les fractions proteiques sont analysees par Clectrofocalisationlo. Rl%ULTATS
ET DISCUSSION
En partant d’l g de Sdpharose 4BCNBr lyophilise on obtient 3.5 ml de gel sur lequel sont fixes 5 mg d’ATP soit 8.5 pmoles. La Fig. 1 donne le schema d’elution d’une colonne de ce gel CquilibrC contre le tampon Tris-acetate pH 7.15 (10 mM) contenant de I’EDTA (0.1 mM) et du phosphate de sodium (1 mM). L’essentiel des proteines inactives est entrain6 sans retard par le tampon d’equilibre alors que I’activitC glucokinasique n’est 8luC que par addition de KC1 I M au tampon.
KCI 1 M I
_L
i! Fig. 1. Chromatographi’e d’affinitg sur colonne de Sepharose-ATP de la glucokinase particulee de foie de chat. -t--t, proteines ~3280 nm; O-0, activitd glucokinasique totale (unit8 par fraction).
En effet des cssais prealables ont montr6 que les concentrations inferieures en KC1 n’eluaient aucune activite. La dissociation du complexe ATP insolubilisCglucokinase est Cgalement obtenue par addition d’ATP 0.01 M au tampon d’Clution; ce fait demontre que I’alhnitt est la veritable nature de l’interaction glucokinase-ATP insolubilis& D’ailleurs aucune activite n’est retenue sur un gel sans ATP. Le rendement de la chromatographie est proche de lOOo/, avec un facteur de purification d’environ 400. C’est ainsi qu’il n’est plus possible de mesurer une absorption i 280 nm dans les fractions contenant I’activite enzymatique. Ce rhultat est corrobore par IWectrofocalisation en gel: Alors que 25 i 30 lignes apparaissent dans l’extrait depose sur la colonne (Fig. 2) aucune ligne n’est
472
NOTES
b
PH Fig. 2. Elcctrofocalisation. (a) Extrait brut apres traitemcnt par sulfate d’ammonium. de foie de chat purifXe apr&s passage sur colonnc de Scpharosc-ATP.
(b) Glucokinase
dans les fractions correspondant au maximum d’activite glucokinasique bien aient dtC concentrees quatre fois par rapport a I’extrait initial. L’activite spdcifique de I’enzyme ainsi purifie 0. I5 UI/mg de proteines n’est que de deux si trois fois moins elevee que celle obtenu par une methode tres laborieuse avec un rendement d’environ 12 0/Opour la glucokinase microsomique du foie de rat3. 11 faut preciscr que I’affinitd de la glucokinase de chat n’est pas t&s &levee pour I’ATP puisque le K,, correspondant est de 0.25 mM. De plus, les risque de denaturation nous ont amen6 a rCfrigerer la colonne i + 6”. La fixation d’ATP est plus simple que la fixation de glucosamine utilisee par Chester et al.“. Toutefois cette derniere technique permet de separer la glucokinase des hexokinases qui n’ont pas d’affinitb pour la glucosamine. Notre methode parfaitement reproductible est cependant justifiee puisqu’il n’existe pas d’activite hexokinasique dans I‘extrait membranare CtudiC.
d&tectke
qu’elles
ReFf5RENCES 1 M. J. Parry ct D. G. Walker, Biochcnr. J.. 99 (1966) 266. 2 S. J. Pilkiss. ArcJt. Bioclrern. Biopltys., 149 (1972) 349.
NOTES
473
3 G. Bcrthillier, Bcrthillier. 5 G. Bcrthillier G G. Bcrthillicr
L. Colobert, M. Richard et R. Got, Biochim. Biophys. AC/U, 206 (1970) P. Dubois ct R. Got. Biochinl. Biophys. Acta, 293 (1973) 370. et R. Got, FEBS L&t., 8 (1970) 122. et R. Got, Biochinl. Biophys. Acfrr. 258 (1972) 88.
7 G. Azzar, G. 8 0. 1-l. Lowry, 9 R. J. Jackson,
Bcrthillier
4 G.
ct R.
Got,
Cotup.
Biocltenr.
P/~ys~ol.,
I.
sous prcssc.
N. Y. Roscnbrough. A. L. Farr ct R. J. Randall, J. Bio/. Chern., 193 (1951) 265. R. M. Wolcott et T. Shiota. Biochetn. Biophys. Rcs. Cormtrrrr.. 51 (1973) 428. IO 0. Vcstcrbcrg, Biochim. Biophys. AC/U. 257 (1972) I 1. I I J. M. E. Chcsher. 1. P. Trayer ct D. G. Walker. Bioclrenl. SW. Trurrs.. 4 (1973) 876.
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Printed in The Netherlands
CI-IROM. 7956
N
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Chromatographie G. AZZAR,
d’affinit6
G. BERTHILLIER
de la glucokinase
le 16 scptcmbrc
du foie de chat
ct R. GOT
UthwsitP Claude Betward Lyorr I, Luhorntoirc rtovembrc~ 19/S, 69621- Vill~wrharrrte (Frar~ce)
(Rcfu
microsomique
de Biochirnic
cfcs Mcrnbrmw.~.
43,
Borrlcvard
cl14
I I
1974)
Bien qu’ayant et6 I’objet de nombreux travaux en raison de leur inter& sur lc plan physiblogique, les glucokinases hcpatiques sont encore peu ou mal caracterisees au point de vue physicochimique. De telles etudes exigent, en effet, des quantites relativement importantes d’enzymes purifies; or, les m&odes de fractionnement et de purification Btablies pour ces glucokinases sont longues et laborieuses ‘e2 et n’aboutissent qu’i de petites quantites d’un enzyme encore impur. Ces difficult& sont encore accrues s’il s’agit d’un enzyme membranaire car il faut prCalablement le solubiliser a partir de fractions subcellulaires dont I’obtentinn generalement en faible quantite necessite la mise en oeuvre d’un fractionnement cellulaire plus ou moins 6laborC. C’est ainsi que la glucokinase du foie de rat 3*4dont Ies proprietes cinetiques prdsentent une originalite certaine5+ n’a pu Ctre aussi bien caracteri&e qu’il aurait et6 souhaitable. La chromatographie d’aflinite semble apporter une solution a ces difficult& grice i sa rapidit&, sa simplicitC, son rendernent et son facteur de purification Clew%. Le Foie de chat possede Cgalement une glucokinase microsomique mais en quantite nettement plus 6levCe que le Foie de rat ‘. C’est done cet enzyme qui a et6 l-objet de nos investigations. S’agissant d’une glucokinase plusieurs types de ligands peuvent dtre fixes B la matrice: glucose, glucosamine ou N-acCtylglucosamine, ATP en ne considerant que les substrats. Pour des raisons de simplicitC de fixation, nous avond Ctd: amen& a cboisir I’ATP. MATCRIEL
ET Ml?TNODES
Les microsomes des hepatocytes de chat contiennent en moyenne le tiers de I’activite glucokinasique cellulaire ‘. Cettc activitd est solubilisee en totalitd par action du Triton X-100 i une concentration de 0.1 y0 (v/v). La solution ainsi obtenue est amenee i une concentration 1.8 M en sulfate d’ammonium. Apres elimination du precipit6, le surnageant est ajuste & une concentration 2.2 M. Le nouveau precipite contient environ 70 “/, de l’activite glucokinasique des microsomes. Ce precipitd est redissous et dialyse contre le tampon Tris-HCI 20 mM (pH 8), MgS04 4 mM, glucose 4 mM, mercaptoethanol 4 mM et EDTA 4 FM. La concentration finale est de 10 mg de proteines dosees par la methode de
NOTES
471
Lowry et al.8par millilitre. L’ATP est fix& SLIT du Sepharose active par le CNBr (Pharmacia, Uppsala, Suede; lot N” 6744) selon la methode de Jackson et al.g, le bras utilise etant le y-methyl ester de glutamate. L’addition de [‘%]ATP permet d’estimer par une simple mesure de radioactivite la quantite d’ATP fix& sur le SCpharose. L’Clution de I’activite glucokinasique est rCalisCe soit par concentration croissante de KC1 soit par une solution d’ATP. Les fractions proteiques sont analysees par Clectrofocalisationlo. Rl%ULTATS
ET DISCUSSION
En partant d’l g de Sdpharose 4BCNBr lyophilise on obtient 3.5 ml de gel sur lequel sont fixes 5 mg d’ATP soit 8.5 pmoles. La Fig. 1 donne le schema d’elution d’une colonne de ce gel CquilibrC contre le tampon Tris-acetate pH 7.15 (10 mM) contenant de I’EDTA (0.1 mM) et du phosphate de sodium (1 mM). L’essentiel des proteines inactives est entrain6 sans retard par le tampon d’equilibre alors que I’activitC glucokinasique n’est 8luC que par addition de KC1 I M au tampon.
KCI 1 M I
_L
i! Fig. 1. Chromatographi’e d’affinitg sur colonne de Sepharose-ATP de la glucokinase particulee de foie de chat. -t--t, proteines ~3280 nm; O-0, activitd glucokinasique totale (unit8 par fraction).
En effet des cssais prealables ont montr6 que les concentrations inferieures en KC1 n’eluaient aucune activite. La dissociation du complexe ATP insolubilisCglucokinase est Cgalement obtenue par addition d’ATP 0.01 M au tampon d’Clution; ce fait demontre que I’alhnitt est la veritable nature de l’interaction glucokinase-ATP insolubilis& D’ailleurs aucune activite n’est retenue sur un gel sans ATP. Le rendement de la chromatographie est proche de lOOo/, avec un facteur de purification d’environ 400. C’est ainsi qu’il n’est plus possible de mesurer une absorption i 280 nm dans les fractions contenant I’activite enzymatique. Ce rhultat est corrobore par IWectrofocalisation en gel: Alors que 25 i 30 lignes apparaissent dans l’extrait depose sur la colonne (Fig. 2) aucune ligne n’est
472
NOTES
b
PH Fig. 2. Elcctrofocalisation. (a) Extrait brut apres traitemcnt par sulfate d’ammonium. de foie de chat purifXe apr&s passage sur colonnc de Scpharosc-ATP.
(b) Glucokinase
dans les fractions correspondant au maximum d’activite glucokinasique bien aient dtC concentrees quatre fois par rapport a I’extrait initial. L’activite spdcifique de I’enzyme ainsi purifie 0. I5 UI/mg de proteines n’est que de deux si trois fois moins elevee que celle obtenu par une methode tres laborieuse avec un rendement d’environ 12 0/Opour la glucokinase microsomique du foie de rat3. 11 faut preciscr que I’affinitd de la glucokinase de chat n’est pas t&s &levee pour I’ATP puisque le K,, correspondant est de 0.25 mM. De plus, les risque de denaturation nous ont amen6 a rCfrigerer la colonne i + 6”. La fixation d’ATP est plus simple que la fixation de glucosamine utilisee par Chester et al.“. Toutefois cette derniere technique permet de separer la glucokinase des hexokinases qui n’ont pas d’affinitb pour la glucosamine. Notre methode parfaitement reproductible est cependant justifiee puisqu’il n’existe pas d’activite hexokinasique dans I‘extrait membranare CtudiC.
d&tectke
qu’elles
ReFf5RENCES 1 M. J. Parry ct D. G. Walker, Biochcnr. J.. 99 (1966) 266. 2 S. J. Pilkiss. ArcJt. Bioclrern. Biopltys., 149 (1972) 349.
NOTES
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3 G. Bcrthillier, Bcrthillier. 5 G. Bcrthillier G G. Bcrthillicr
L. Colobert, M. Richard et R. Got, Biochim. Biophys. AC/U, 206 (1970) P. Dubois ct R. Got. Biochinl. Biophys. Acta, 293 (1973) 370. et R. Got, FEBS L&t., 8 (1970) 122. et R. Got, Biochinl. Biophys. Acfrr. 258 (1972) 88.
7 G. Azzar, G. 8 0. 1-l. Lowry, 9 R. J. Jackson,
Bcrthillier
4 G.
ct R.
Got,
Cotup.
Biocltenr.
P/~ys~ol.,
I.
sous prcssc.
N. Y. Roscnbrough. A. L. Farr ct R. J. Randall, J. Bio/. Chern., 193 (1951) 265. R. M. Wolcott et T. Shiota. Biochetn. Biophys. Rcs. Cormtrrrr.. 51 (1973) 428. IO 0. Vcstcrbcrg, Biochim. Biophys. AC/U. 257 (1972) I 1. I I J. M. E. Chcsher. 1. P. Trayer ct D. G. Walker. Bioclrenl. SW. Trurrs.. 4 (1973) 876.