Chromatographische differenzierung von cardenoliden durch anwendung von boraten und anderen diolreagenzien

tiHROMATOGRAPHlSCl% DURm ANWENDUNG ZIEN*

R

MEGGES,

BARBARA

DIFFERENZIERUNG VON- CARDENOLEDEN VON BORATEN UND ANDEREN DIOLREAGEN-

ST RECKENBACH

und K. R. Ef. REPKE

Bereich Bhnembrruren, Zentralhsctit~c fir Mo~ekdarbiologii, Forschungszemrmn fw MolekularbioIogie und Medizirr der rfkcrriemie tier Wi5senwkaffen der D-D-R., Lidenberger Weg, 70 DDR-III.5 BedSBuck (D.D.R.)

(Eingegangen am IO. Mai 1977; ge&derte Fassmg

eingegangen

am 15. Dezember

1977)

SUMMARY Chromatographic

separation of cardenolides rrsing berates and other did reagents

The paper probes

13 diol reagents known to interact with the cis-1,2- and/or

-1,3-diol groups of carbohydrates and other compounds, as to their influence on the relative mobilities of 1Qacetyigitoxin and acctylgitoxin-a: as representatives for cis1,2- and cis-1,3-dials in the cardenolide series. The influence on mobility has been studied using paper partition chromatography with formamide as stationary phase. Metaboric acid, boric acid, arsenic pentoxide, phenyl arsenic acid, ammonium metavanadate, sodium molybdate, and sodium tungstate are without influence on the relative mobilities of both diols. Sodium metaborate, disodium tetraborate, and potassium borooxalate decrease and arsenic trioxide increases specifkally the mobiity of the 1,2-dioI. Phenylboronic acid and diphenylborinic acid increase the relative mobility of both cliols. In the case of phenylboronic acid a differentiation between both diols is possible: at low concentration the relative mobility bf the 1,3-dial only and at high concentration that of the 1,2-dial, too, increases. The effect of the diol reagents is completely lost by acetylation of one OH group of the reacting diol group. Apparent&, the reagent’s effects on chromatographic mobility are due to the formation of cyclic complexes or cyclic esters with the crk-1,2-

or cis-L,3-diol group.

EINLEITUNG

BorsGre und ibre Salze bilden &it Polyolen geeigneter Struktur mehr oder minder stabile cyclische Derivate (Es@r oder Komplexe, ubersichten z.B. Lit..l, 2)Diese Eigenschaft ist wiederholt benutzt worden zur besseren chromatographischen * AIBZ&W~X
der D.D.R

in Berlin: Phmmnzie.

27 (1972) 718.

198

R. MEGGES, B. STRECKJ%BACH, K. it. EL REPKli

Trennung van Polyolen 5hnlicher chromatographischer Mobs&t, aber unterschiedlither Neigung zur Derivatbildung (z-5 Lit. 3-S). Analoge De&ate werden such mit Phenylborssiure6s7, Diphenylbor&uress9, Boroxalats, Ar~niti*‘O*‘~, Arsens&n$, Phenylarsons5ure’3, Molybdat10*14, Wolfi-amat10*14, Vanadat’* u.a. Qiolreagenzien gebildet und teilweise in der Chromatographie angewandt. Entsprechend dem Polyolcharakter der Cardenolide sollte ihr chromatographisches Verhalten durch Diolreagenzien beeinflussbar sein. &her liegen dariiber aber nur wenige Untersuchungen vor lsl’_ In der vorliegenden Arbeit wird die MBglichkeit der Beeinfiussung der chromatographischen Mobil&t von 16-Acetylgitoxin bzw. _4cetylgitoxin-a: (vgl. Fig. 1) als Vertreter von c&-1,2- bzw. cis-1,3-Diolen der Cardenolidreihe durch 13 Diolreagenzien vergleichend gepriift. Ziel der Arbeit ist, durch Anwendung geeigneter Diolreagenzien die chromatographische Trennung van Cardenoliden zu verbessem sowie eine einfache Methode zum Nachweis der Anoder Abwesenheit entsprechender Diolgruppiemngen im Molekiil zu erhalten.

Fig. 1. Acetylgitoxin-a:RI = CH,CO; R2 = H. 16-AcetyIgitoxin:RI = H; R2 = CH3C0. EXPERItiENTELLES Die papierchromatographische Analyse von je 0.1 ~Mol Cardenolidglykosid erfolgte vergleichend in Abwesenheit und in Gegenwart des jeweils gepriiften Diolreigenses absteigend mit fonnamidge&tigtem P,ropyli%ther-Tetrahydrofuran 2:l (modifKert nach Lit. 18) auf Formamid-imprggniertem Papier (30% Formamid in Aceton; SchIeicher und Schfill, 2043 b Mgl). Diphenylbors%re wurde der mobilen, alle iibrigen Reagenzien wurden der station&en Phase zugesetzt_ Das erfolgte je nach Lijslichkeit entweder durch Liisung in der Formamid-ImprPgnierungsmischung (Phenylborsgure, Phenylarsons5ure) oder vor der FormamidimprQniemn g durch Eintauchen der Papiere in die w&r&en Liisungen (alle iibrigen Reagenzien) und anschliessende Trockmmg. Die entwickelten Chromatogramme wurden zur Entfemung des Formamids bei 160 Torr 30 tin auf 90” erhitzt. Zur Lokalisienmg der Cardenolide wurden die Chromatogramme mit Trichloressigs~urKhloramin I9 oder (bei Einsatz der Salze sowie der Phenylarsons&re und der Arylbors5uren) mit m-Dinitrobenzol-Natronlaugti’ behandelt. Das Formamid wurde zur Reinigung je 30 min mit stark basischem und stark saurem Ionenaus+uscher geschiittelt und in VQCUOfraktioniert.

DIFFERENZIERUNG

VON CARDENOLIDEN

199

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Die Ergebnisse der Untersuchung des Einflusses von 13 Diolreagenzien auf die papierchromatographische Mobil&at van 16-Acetylgitoxin (c&l,ZDiol: CL&OH an der endst&digen Digitoxose) bzw. Acetylgitoxin-a: (c&-1,3-Diol : 14#l,l6&OH am Steroidgeriist; vgl. Fig. 1) sind in der Tabelle I zusammengefasst, auf die sich die folgende Besprechung stiitzt. Dabei sind nur die durch Derivatbildung verursachten spezi&chen Mobilititsinderungen beriicksichtigt. Eine mZighche Erhiihung der MobiLit% durch den unspezitichen Salzeffekts~~5ist durch Bezug auf die Mobilitit des jeweils nicht reagierenden Diols rechnerisch diminiert (relative Mobilit%: s. Lcgende zur Tabelle I). TABELLE I EMFLUSS VON 13 DIOLREAGENZIEN AUF DAS PAPIERCHROMATOGRAPHISCHE VERHALTEN VON A CETYLGITOX1N-e UND 16ACETYLGITOXIN Die hderung der rehtiven Mobil&% dR w der Verbindungen wurde berechnet nach: ARw = 100 x (LB, x LDJ(LE, x LD,) - 100, wobei LB, bzw. LB, = Laufstrecke (cm) der Bezugssubstam (nicht reaktivesDiol) ohne (0) bzw. s&t (m) Dioh-eagens,und LD, bzw_LD, = Laufstrecke (cm) des Dials ohne (0) bzw. mit (m) Dioheagens. Die Chromatogmmme wurden 20 Stunden im Durchlaufverfahren (ReageazienNr. l-5 und S-12) bzw. 3.5 Stunden @Jr_ 6, 7 und 13) entwickeh. Weitere method&he Angaben im experimentellenTeil. 0-E. = ohne Einflussauf die Mobilitit. Nr.

1

DioCreagens

ImprcignienmgsKwng

A&

0/OReagerrs’

I,SDioZ

IJ-Diol

0-E. 0-E.

0-E.

Pff

2

Metabors&rre

2

5

BOlTSSUE

5

3 4

Natriunnethorat

2 2

5 6 7 8 9 10 11 12 13

Dinatriumtetraborat Kalillmbor0xalat

Phenylborsiiure

*-

Diphenylbotiure Ammonium-me-vanadat Natriummolybdat Natriumwolfmmat Arsentrioxid

Arsenpentoxid

Phenylarsotiure

2 2 0.1 1 5 0.5 2 2

:

1; 5

11 9 5 5

-

0-E.

: 5

o.E. o.E j460 +430--i-590”’ 0-E. 0-E. 0-E. 0-E.

2; 7.4’

o.E. 0-E.

0-E. -83

-76 -20 0-E. +344--i-505” 0.E

oE. 0-E. -l-40 o.E. o.E.

* In der Regel konnten hohere Konzentrationeninfolge der geringenLiislichkeitder Reagenzien nicht geprilft werden. ** Aquimolekulares Gemischvan Bor&ue uad Kaliumoxalat. *** Hier ist 100 x LDJLD,, - 108 stattA& angegeben. f pH-Einstellung mit NaOH.

An bier Derivatbikimgbeteiligte Gruppen Die beiden Cardenolide besitzen je fiinffreie OH-Gruppen, die als Angriffsorte der Diolreagenzien in Frage kommen. Die chromatographischen Effekte der Diolreagenzien werden bereits durch die Ausschaltung nur einer OH-Gruppe der jeweiligen Diolgruppierung durch Acetylierung viillig aufgehoben. Damit ist bewiesen, dass nur die OM-Gruppen der jeweihgen Diolgruppierung mit dem Dioheagens offenbar unter

Bildung eines cyclischen Derivates reagieren. Die Bildung @&her De&ate isi +Zir Bors&u$l, Phenylborslure-2J und Diphenylbors5uress26durch RGntgenkristallstrukturanalysebewifzsen. Borstiuren, Borate, Boroxdat Meta- und Orthobortiure (Tabelle r) beeinflussen die relativen Mobil&ten beider Diole nicht. Offenbar sind unter den gepriiften Bedingungen die Bor&ureester nicht stab& Im Gegensatz zur Papierchromatographie tritt jedoch bei der Diinnschichtchromatographie an Kieselgel G mit Borslure (0.16% bezogen auf Kieselgel) beim i,3-Diol Derivatbildung ein (mobile Phase: Chloroform + 10% ilthanol; 100x & in Gegenwart/Abwesenheit von Borsgure: 70/48),beim 1,2-Diol (bis 10% Bors&ue) jedoch nicht (40/39). Die Borate (Nr. 3 und 4 in Tabelle I) sind ohne EinIIuss auf das 1,3-Diol, vermindem aber die relative Mobilitit des 1,ZDiols erheblich. Diese Spezifitit der Boratkomplexbildung und die griissere Stabilitgt des 1,2Diol-Komplexes gegenGber dem Ester stehen im Einklang mit Literatnrangaben (2-B. Lit. 1 und 2). Die Priifung des Einflussesder Reagenskonzentration im Falle von Dinatriumtetraborat zeigt, dass mit wachsender Reagenskonzentration (0.2 bis 2%) die relative Mobilitit weiter abnimmt (d R w = - 10 bis -76). Dieses Verhalten llsst den Schluss zu, dass die wandemde Substauz das 1,2-Diol ist, dessenWauderuugsgerjchwindigkeit durch zunehmende Bildung des polaren Boratkomplexes in der station&en Phase reduziert wird. Der s*&k basische Charakter der Borate verursacht ausserdem eine teilweise Desacetylierung beider Cardenolide sowie eine Acetylwanderung bei Acetyl@toxin-a Zur /&Position.Diese Effekte treten in dem gesamten pH-Bereich (pH > 8.5) auf, iu dem die Boratliisungen die relative Mob&& beeinflussen. Verseifung und Acetylwanderung lassen sich durch Anwendung von Kaliumboroxalat, das bei pH 5 Derivate bildet, vermeiden. Dieses Reagens wirkt ebeufalls nur auf das 1,2-Diol.

Phenylborsziure

Schon in niedriger Kouzentration (0.1%) erh6ht Phenylborsiiure die relative Mobilit% des 1,3-Diols betri-khtlich. Erst 5ei hiiherer Konzentration (1%) wird such die Mobil&sit des 1,2-Diols in gleichem Masse erhiiht: Die Gr&se der Mobilit%&erhiihung durch Phenylbors&ure ist unabhlngig von der Diolreageuskonzentration. Danach ist die Erhiihung der Mobilitit auf die Bildung eines Phenylborsgureesters zuriickzuf%.ren. Dass Phenylborsgure im Gegensatz zn Ortho- und Metaborsgure untzr den gepriiften Bedingungen ausreichend stabile Derivate bildet, entspricht der gr&seren HydrolysestabilitZt der Phenylbors&re- im Vergleich zu den BorsUreestemz7. Diphenylborsiiure

Diphenylbotiure ist bei 1% ohne Einfluss und erhiiht erst bei 5 % die MobilitZt beider Diole. Diphenylbors&rekomplexe sind danach offenbar infolge griisseren Raumbedarfs des Reagenses weuiger stabil als Phenylbor&ureester oder -Boratkomplexe. Bemerkenswert ist, dass im Gegensatz zum Borat, das nur mit 1,ZDiolen Derivate bildet, DiphenylborsZure mit beiden Diolen reagiert. __

_ .

-

,-

D-NZIERUNG

VON CARDENOLIDEN

201

Die genannten Reagenzien sind ohne Einfiuss auf die relative Mobil%& der beiden Diole und danach unter den geprX%en Bedingungen offenbar nicht in der Lage, eine Real&on unter BiIdung stabiler Derivate einzugehen. Arsentrioxic?,Arsenpentoxid, PhenylarsonsZure Arsentrioxid erhiiht die relative Mobilit% des 1,ZDiols offenbar unter Bildung eines Arsenigs%rmesters, der demnach stabtier ist aIs der analoge Bors8ureester. Arsentrioxid reagiert dagegen nicht tit dem 1,IDiol und verh5lt sich in dieser Beziehung wie die Borate. Arsenpentoxid und PhenylarsonsG.rre sind ohne Einfhrss auf die Mobilitst beider Diole. Prakifiche Verwertbarkeit Sieben der 13 Diolreagenzien sind unter den gepriifren Bedingungen in der Lage, die reIative Mobil&t des 1,2- und/oder 1,3-Diols zu beein&ssen. Die Reagenzien unterscheiden sich z.T. betrgchtlich in bezug auf Spezifitit, Richtung und Ausmass der Beeinfhtssung sowie in bezug auf die pH-Wert-Anforderungen an die Derivatbifdung. Fur die Anwendung zur Trennung von Cardenolidgemischen bzw. den- Nachweis der An- oder Abwesenheit von cis-1,2- und/oder cis-1,3-Diolgruppen im Molekiil stehen damit verschiedene M8glichkeiten zur Verftigung. Die Anwendung der Diolreagenzien ist dabei nicht auf die Papierchromatographie beschr%&t, sondern ist ebensogut such bei der Diimrschichtchromatographie16~17 (such an Kieselgel) mSgIich. Die beschriebene Spezifitgt van Phenyl- und DiphenylborsHure wurde such bei anderen c&1,2- bzw. &-1,3-Diolen der Cardenolid- und Bufadienolidreihe gepriZt=. Dabei zeigte sich, dass sich die in dieser Arbeit gezogenen Schlussfolgerungen weitgehend veralIgemeinern lassen. -_\ DANK Fiir geschickte experimentelle I.

Mitarbeit

danken wir Frau H. Timm und Frau

Siirnnich. Den Herren Dir. Dr. J. Renz (Basel) und Dr. G. Baumgarten (Wernige-

rode) sind wir fiir die freundIiche gitoxin sehr verbunden.

Uberlassung

von Acetylgitoxin-a:

und l&Acetyl-

ZUSAMMENFASSUNG

Von 13 untersuchten Verbindungen baben sich 7 ds geeignet erwiesen, die chromatographische Mobilit5t eines Cardenolid-1,2- bzw. -1,Bdiols spezifisch zu beeinflussen. Die Arbeit beschreibt Verfahren zum Nachweis und zur verbesserten chromatographischen Trennung oder zur analytischen KlassiGzierung von cis-1,2und cZs-1,IDioIen der Cardenolidreihe. LITERATUR 1 J. Dale, 3. Chwz. Sue.. (196:) 910, 922. 2 R Eciister. in E. MiiUer (Herausgekr), Ho&en- weyl, ~dmfen Bad W2, Georg Thieve, Stuttgut, 4. Aufl., 1963,S. 171K

der orgclnisdietzChemie,

202

R

MEGGEs,

B.

STRECKENBACH;

K. R EL REPKE

und D. B. M. Scott, Science, ill (i950) 543. L. 3. Morris, J. Chronzzmgr., 12 (1963) 321. M. T. Krauss, H. J&x, 0. Schindler und T. Reichstein,J. Chromutogr., 3 (1960) 63. .~ E. 3. Boume, E. M. Lees und H. Weigeel,J. Chromatogr, 11 (1963) 253. R J. Ferrier, W. G. Overend, G. A. Rafferty, H. M. Wail und N. R. Williams, Fro& Gem. Sue_ (London), (1963) 133. 8 H. J. Roth, Deut. Apufh.-Ztg., 103 (1963) 520. 9 P. J. Garegg und K. LindstrGm, Acfa Chem. Scan& 25 (1971) 1559. 10 H. W-1, A&vm. Carfwhyd. Chem.. 18 (1963) 61. 11 M. L. Wolfram und M. J. Helm, 1. Org. Ckem., 26 (1961) 273. 12 B. Englund, Nova Acra Re@e Sue. Sci. Upsal., Ser. IV, 8 (3) (i932) 1. 13 E. J. Salmi, K. Merivuori und E. Laaksonen, &omen Ketitiiehti B, 19 (1946) 102. 14 J. Hahnekoski, Swme~ Kemistilehti B, 35 (1962) 39. 15 H. P. Deys, Disserfafiun, Reichsuniversitit Utrecht, Utrecht, 1961. 16 J. Reicbelt und I. Pitt-a, &sk. Farm., 12 (1963) 416. 17 C. Lindig, P. Frznke und K. R. H. Repke, 1. Prakt_ Chem., 317 (i975) 17. 18 F. Kaiser, E. H%ack und H. Spin&r, Justrcs _&&I& Ann. C/&n., 603 (1957) 75. 19 F. Kaiser, C&m. Ber., 88 (1955) 556. 20 O_ Schindier und T. Reichstein, Web. Chim_ Acta. 34 (1951) log. 21 J. D. Dun&z, D. M. Hawley, D. MiHo5, D. N. J. White, Yu. Berlin, R. Mar&i& und V. Prelog, Web Chim. Acta, 54 (1971) 1709. 22 H. Shimmouchi, N. Saito und Y. Sasada, Bull. Chem. Sue. Jap., 42 (1969) 1239. 23 H. Andrew, J. Wang, I. C. Paul, K. L. Rinehart, Jr. und F. J. Antosz, J. Amer. Chem. Sue., 93 (1971) 6275. 24 P. J. Cox, P. D. Cradwich und G. A. Sim, J. Chem. Sot., Perkin Trans. II, (1976) 110. 25 S. J. Retxig, J. Trotter und W. KLiegel, Can. J. Chem., 52 (1974) 2531. 26 S. J. Rettig und J. Trotter, Can. 1. Chem., 54 (1976) 1168. 27 R. Megges, B. Streckenbach und K. Repke, DDR- Wirtsckaftspatent, 77489 (1968). 2g R Meggq B. Strcckenbachund K. R H. Repke, J. Chromatogr., im Druck. 3 S. S. Cohen

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