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Conservation des hématies du panel par l'azote liquide
T r a n s f u s i o n . T. IX. N ° 3. - - 1966
Conservati,on des hbmaties du panel par l'azote
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liquide
A propos d'un proc6d,6 original par F. STREIFF, A. PETERS, B. GENETET et S. GILGENKRANTZ*
Les Centres de T r a n s f u s i o n Sanguine d o i v e n t d i s p o s e r en p e r m a nence, p o u r la d S t e c t i o n et l ' i d e n t i f i c a t i o n des a n t i c o r p s irr~guliers, d ' u n ~chantillonnage d'h~maties-tests (panel des auteurs anglo-saxons). P o u r ce faire, il est n~cessaire de r e c u e i l l i r le sang d ' u n c e r t a i n n o m b r e .de d o n n e u r s dont le p h 6 n o t y p e sanguin a ~t~ p a r f a i t e m e n t 6tabli : ce qui exige le g r o u p a g e le plus c o m p l e t possible d ' u n e v i n g t a i n e d e p e r s o n n e s r e n d u souvent difficile p a r ]a raret6 de c e r t a i n s s~rums-tests. Ceci r~alis~, il est toujours p o s s i b l e de c o n v o q u e r f r ~ q u e m m e n t les donneurs. Il nous a sembl~ p l u s ~l~gant d ' u t i l i s e r les p r o p r i ~ t ~ s de l'azote l i q u i d e p o u r o b t e n i r c h a q u e s e m a i n e une p e t i t e quantit~ d e ces h6maties-tests tout en n ' e x i g e a n t d e nos d o n n e u r s qu'un don b i m e s t r i e l , voire t r i m e s t r i e l . Notre but n'est pa.s de c o n s e r v e r du sang p o u r la transfusion sanguine, m a i s n o t r e u n i q u e souci a ~t6 de t r o u v e r un m o y e n tr~s simple p e r m e t t a n t de f r a c t i o n n e r un don u n i q u e en unit~s d i s p o n i b l e s le plus r a p i d e m e n t possible. Nos r e c h e r c h e s d a n s ce d o m a i n e ne sont c e p e n d a n t pas t e r m i n 6 e s et nous d o n n o n s les p r e m i e r s r~sultats a u x q u e l s nous s o m m e s p a r v e n u s et .qui d o n n e n t satisfaction. De n o m b r e u x proc~d~s sont a c t u e l l e m e n t pr~conis~s d e p u i s la cong~lation h - - 2 0 ° C jusqu'~ l ' u t i l i s a t i o n des g r a n d s f r o i d s (azote l i q u i d e - - 1 9 6 ° C ) en p a s s a n t p a r la c o n s e r v a t i o n h - - 8 0 ° C dans la carbo-glace. P a r ailleurs, de n o m b r e u s e s m~thodes ont 6t~ r e c o m m a n d ~ e s p o u r prot6ger les h~maties c o n t r e la t r a n s f o r m a t i o n vitreuse (REY) [14], notamment le g l y c e r o l (KEvY) [10] fort appr~ci~ d e p u i s les t r a v a u x de ROSTAND [15], les sucres (HuGGINS) [4], l'alcool (KLIMAN) [11] et ~galemerit la d i m 6 t h y l - s u l f o x y d e (HuaGINS) [5]. Nous avons, quant A nous, p o u r d e s r a i s o n s de commodit6, r e t e n u le m o d e de c o n s e r v a t i o n d e s globules trait6s p a r le s a c c h a r o s e ~ 40 g p. cent et entrepos6s dans l'azote liquide apr6s i n t r o d u c t i o n dans des paillettes de mati~re plastique, * Centre de Transfusion Sanguine, 9, rue Lionnois, Nancy (Dirvcteur : Prof. agr6g6
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Le p r i n c i p e de la m~thode de c o n s e r v a t i o n est d o n c l ' u t i l i s a t i o n d e s p r o p r i 6 t ~ s du s a c c h a r o s e h 40 g p. cent p o u r la survie g l o b u l a i r e clans l'azote l i q u i d e ~ - - 1 9 6 ° C . Le s u c r e m a i n t i e n t l ' i s o t o n i c i t ~ du m i l i e u et r~duit la force ionique, l ' h y p e r t o n i c i t ~ c o n d u i s a n t en effet h l'Sclatem e n t g l o b u l a i r e p a r f o r m a t i o n de c r i s t a u x ( t r a n s f o r m a t i o n v i t r e u s e ) . On salt que c'est LUYET (12) qui fut le p r e m i e r h r e c o m m a n d e r l ' e m p l o i de l'azote p o u r la c o n s e r v a t i o n du sang. Depuis, REY a p a r f a i t e m e n t d6crit les propri~t6s de l'azote p o u r la c o n s e r v a t i o n des tissus a n i m a u x . P o u r o b t e n i r l ' i n e r t i e totale de ceux-ci, il faut a t t e i n d r e tr~s r a p i d e m e n t - - 1 3 0 ° C ce q u i est r~alisable avec l'azote liquide. Quant au s a c c h a r o s e , HUNTSMAN [6, 7, 8] en a codifi6 l ' e m p l o i en 1960 p o u r la c o n s e r v a t i o n d ' u n p a n e l d ' h 6 m a t i e s tests. Cet a u t e u r utilise p o u r ce f a i r e des boites en c a r t o n c o n t e n a n t les globules rouges trait6es, plong~es d i r e c t e m e n t dans l'azote. Nous utilisons une v a r i a n t e de cette m~thode en ce sens que nous r ~ p a r t i s s o n s le sang m61ang~ au s a c c h a r o s e d a n s des p a i l l e t t e s de mati~re p l a s t i q u e (AGACHE) [1] c o n t e n a n t e n v i r o n 1,5 ml de m~lange. Ces paillettes sont a c t u e l l e m e n t utilis~es en p r a t i q u e v~t~rinaire p o u r la c o n s e r v a t i o n d e la s e m e n c e de t a u r e a u dans les c e n t r e s d ' i n s ~ m i n a t i o n artificielle (JoNDET) [9]. MERYMAN [13] a m o n t r 6 qne l'homog~n~it~ de l ' a b a i s s e m e n t de la t e m p d r a t u r e h l ' i n t ~ r i e u r du c y l i n d r e a u g m e n t e en r a i s o n i n v e r s e du diam~tre. Cette homog~n~it~ dans le r e f r o i d i s s e m e n t ~vite les g r a d i e n t s t h e r m i q u e s p r 6 j u d i c i a b l e s h une b o n n e c o n s e r v a t i o n . Le faible diam~tre des paillettes p e r m e t d ' o b t e n i r cette homogeneitY. Nous avons d ' a i l l e u r s eu la s a t i s f a c t i o n de c o n s t a t e r que l'Ecole de MOUaEAU h Liege (BouILLENNEC, ANDRe, BROCTEUR, OTTO-SERVAIS [2] p r 6 c o n i s a i t la m~me technique. Les r6sultats de ces t r a v a u x ont donn~ s a t i s f a c t i o n h ces a u t e u r s et ont ~t~ pr6sent6s h S t r a s b o u r g en 1965. Mat6riel 1) L'AZOTE LI~UIDE ." L'azote est c o n t e n u dans un r ~ e i p i e n t LNR 25 LINDE p o u v a n t conten i r 28 litres d'azote. L ' a p p r o v i s i o n n e m e n t se f a i t toutes les semaines (environ 8 litres). Le niveau s u p ~ r i e u r d'azote, qui dolt t o u j o u r s d~passer l'extr6mit~ s u p ~ r i e u r e des paillettes, est f a c i l e m e n t r e p a r a b l e h l ' a i d e .d'un baton p e i n t en noir. Le r ~ c i p i e n t p e u t r e c e v o i r 6 p a n i e r s c y l i n d r i ques m~talliques ( c a n i s t e r ) d o n t les d i m e n s i o n s sont les s u i v a n t e s : 26 cm de haut et 7 de diamStre. Ces c a n i s t e r s c o n t i e n n e n t des p a n i e r s en toile m~tallique divis~s en 8 c o m p a r t i m e n t s et q u i r e c e v r o n t les paillettes ( m i n i m u m 100, maxim u m 120 p a r c a n i s t e r ) . 2) LES PAILLETTES : Ce sont des tubes de c h l o r u r e de p o l y v i n y l e (CAssou) [3], .de couleur, bouch~s ~ une extr~mit~ et d o n t le d i a m ~ t r e est de 4,2 m m et
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l'6paisseur de 0,17 mm, la l o n g u e u r de 132 ram. U n e m a r q u e (peinture de diff6rents coloris) p e r m e t d'identifier facilement le sang.
3) LE SANG : Nous utilisons le sang recueilli (de prdf6renee le jour de la cong6lation) sur E.D.T.A. (1 mg p o u r 1 ml de sang). U n don d ' e n v i r o n 100 ml ~t 150 ml est suffisant p o u r u n e p6riode de 2 mois. 4) LES RI~CTIFS : Solution de saccharose h 40 g p. cent en eau b'idistill6e port~e h 37°C. Solution de C1 N a h 1 g p. cent en eau bidistill6e portde h 45°C.
Technique de, cong61ation et de d6cong~lation I ) INTRODUCTION DU SACCHAROSE :
A 1 ml de sang total c o n t e n u dans u n tube h hdmolyse on ajoute 0,5 ml de saecharose h 40 g p. cent p r d a l a b l e m e n t port~ h 37°C. L ' i n t r o d u e t i o n du saceharose doit 8tre r~alis6e l e n t e m e n t p a r r e t o u r n e m e n t s suceessifs du tube. Le m61ange est ensuite laiss6 p e n d a n t trente m i n u t e s h 37°C. 2) INTRODUCTION DU MELANGE SACCHAROSE-SANG DANS LES PAILLETTES :
Les paillettes sont bouch6es h u n e extr6mit6 ; cette extr6mit6 perm e t t a n t n d a n m o i n s d ' a s p i r e r le m~lange c o n t e n u dans le tube h h6molyse. Ceci est r6alisable grace ~ la trompe h eau, l'extr6mit6 libre de la paillette 6tant plong6e dans le tube c o n t e n a n t le sang. Le sang d ' u n m~me d o n n e u r est ainsi pr~lev6 dans des paillettes p o r t a n t u n rep6re de couleur identique. Les paillettes des diffdrents d o n n e u r s d u << p a n e l >> sont ensuite raises dans les dii~drents c o m p a r t i m e n t s des p a n i e r s m6talliques. 5) CONG~LATION :
Les p a n i e r s m6talliques a y a n t 6t6 r~intdgr6s dans leurs canisters sont plong6s dans le r 6 e i p i e n t LINDB. I1 est h noter que quelquefois des projections d'azote se p r o d u i s e n t ; ceci n ' a r i e n de d a n g e r e u x . La cal6faction emp~chant l'attaque des tissus p a r le l i q u i d e (REY). 4) DI~CONGELATION " Elle est r~alis~e dans une solution de CINa h 1 g p. cent port6e h 45°C. On d6cong61e (en fonction des besoins) h chaque utilisation une dizaine de paillettes de chaque d o n n e n r . Cette op6ration doit ~tre r6ali-
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s6e r a p i d e m e n t . Les paillettes d'un m~me d o n n e u r (extr6mit6 bouchfie en haut) sont plong~es d a n s uu g r a n d tube (type tube ~ BW) c o n t e n a n t la solution saline chaude. La d~cong~lation doit ~tre r a p i d e et r~alis~e p a r 4 h 5 r e t o u r n e m e n t s . Une petite entaille est p r a t i q u 6 e ~ l'extrfimit~ s u p 6 r i e u r e de la p a i l l e t t e afin de p e r m e t t r e au sang d e s'6couler. On centrifuge p e n d a n t 1 m i n u t e h 2.000 RPM et le s u r n a g e a n t est d6cant~. Un ou deux lavages en solution saline i s o t o n i q u e h t e m p e r a t u r e du labor a t o i r e sont r~alis~s et enfin les globules rouges sont m i s en s u s p e n s i o n 5 p. c e n t ou 2 p. c e n t en eau p h y s i o l o g i q u e . I1 faut n o t e r q u ' u n e mise en s u s p e n s i o n d a n s la solution ACD p e r m e t une c o n s e r v a t i o n ~ + 4 ° d'une semaine environ.
Etude d e s propri6t~s i m m u n o l o g i q u e s du s a n g d ~ c o n g e l ~ Nous nous s o m m e s p a r t i c u l i ~ r e m e n t inqui~t~s de s a v o i r si les p r o pri~t~s antig~niques des globules tests se m a i n t e n a i e n t c o n s t a n t e s lors de la cong~lation-d~cong~lation et au cours d u temps, et si l ' i n t r o d u c t i o n de sucre n ' a p p o r t a i t pas de modification ~ la s t r u c t u r e antig~nique. 1) Etude qualitative des antig~nes de groupes sanguins portds par les h~malies congel~es : Nous avons ~tudi~ les antig~nes de g r o u p e s s a n g u i n s dans les syst~mes s u i v a n t s :
ABO (A1 A~ B O) Rhesus (CcC~Def) MNSs --P - - Kell, Cellano, K p ( a ) , Kp(b) Duffy Kidd Lewis Lutheran. Nous avons p o u r cela group~ le sang : - - apr~s pr~l~vement s u r E.D.T.A. apr~s i n t r o d u c t i o n du s a c c h a r o s e I apr~s 6 h e u r e s de cong~lation - - apr~s cong~lation apr~s 24 h e u r e s de cong61ation apr~s 30 jours de cong~lation Nous avons t o u j o u r s retrouv6 les antig~nes. L ' a n a b i o s e ~ - - 196°C i n t r o d u i t d o n c la notion de r e s p e c t ~des antig~nes ~ r y t h r o c y t a i r e s . 2) Etude semi-quantitalive des anlig~nes de groupes sanguins port,s par les h~maties congel~es : Nous avons, p o u r un c e r t a i n n o m b r e de syst~mes de g r o u p e s sanguins pr~cil~s, mesurd l'activit~ d ' u n sdrum-test donnd s u r les m~mes
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h6maties a v a n t et apr6s cong61ation, et p o u r :des d i l u t i o n s d'h~maties constantes. C'est ainsi que nous avons constat6 que le titre de s6rums-tests anti D (titre appr6ci6 p a r la t e c h n i q u e de coombs i n d i r e c t et apr6s t r a i t e m e n t des globules du p a n e l p a r la b r o m e l i n e et la papaine) ne subissait a u c u n e variation. De m~me u n s6rum c o n t e n a n t des a n t i c o r p s anti A i n d i q u e toujours le m~me titre avant et apr6s cong61ation. Ceci se retrouve 6galement p o u r les diff6rents antig6nes du syst6me MNSs.
Etude de l'h6molyse du sang congel6 et d6congel6 Dans cette p r e m i 6 r e partie de notre ~tude nous nous sommes surtout attach6s h o b t e n i r du sang utilisable p o u r la d~tection des a n t i c o r p s irr6guliers. La m~thode d6crite nous p e r m e t d ' a v o i r h n o t r e disposition un p a n e l facilement accessible et surtout dont la p r 6 p a r a t i o n et la conservation sont r e l a t i v e m e n t ais6es. I1 n ' e n reste pas m o i n s n6cessaire d ' o b t e n i r u n e b o n n e c o n s e r v a t i o n parall~lement h u n faible p o u r c e n t a g e d'h6molyse ; nos recherches portent actuellement sur la mesure de celle-ci. P o u r ce faire, nous p a r t o n s d ' u n e quanfit6 donn6e de sang complet et apr6s i n t r o d u c t i o n .du saccharose nous m e s u r o n s le r a p p o r t globules-m~lange plasma saccharose. Nous pouvons ainsi c o n n a l t r e la quantit6 de globules rouges c o n t e n u s dans chaque paillette a v a n t la cong~lation. Apr6s la d~cong61ation et les diff,rents lavages en saline h y p e r t o n i q u e h 1 g p. cent et en salin h 0,85 p. cent, nous 61iminons au m a x i m u m l'eau physiologique el nous m e s u r o n s la quautit6 d'h6maties restante. Nous o b t e n o n s actue]lement une c o n s e r v a t i o n d ' e n v i r o n 80 % ce qui est u n r6saltat dont nous pouvons nous satisfaire 6rant donn6 l'usage auquel nous d e s t i n o n s les globales rouges. I1 est 6vident que cette m6thode de mesure ne tient pas compte des pertes .dues n o n pas h la cong~lation-d~cong61ation mais h la m a n i p u l a tion elle-m~me (sang sur les parois des paillettes et des tubes, lavage, etc.). Variante de la m6thode Parall61ement aux 6tudes r6alis~es sur les paillettes nous avons ~galement r6p6t6 la m6thode d'HuNSTMAN en boites de carton. P o u r ce faire nous congelons le sang auquel a ~t6 p r ~ c 6 d e m m e n t a d j o i n t le saccharose en laissant t o m b e r goutte ~ goutte l'azote l i q u i d e ~ l'aide d ' u n e pipette. Nous o b t e n o n s des perles que nous i n t r o d u i s o n s dans les boites de carton identifi6es au n o m du d o n n e u r , perc6es de trous et p e r m e t t a n t l'entr~e de l'azote q u a n d on les plonge d a n s le r 6 c i p i e n l LINDE. NOS 6tudes d ' o r d r e i m m u n o l o g i q u e ont 6t6 parall61es ~ celles d6crites plus haut, et les c o n c l u s i o n s identiques. P a r c e n t r e n o u s obtenons semble-t-il u n p o u r c e n t a g e de c o n s e r v a t i o n plus 61ev6 (de l ' o r d r e de 90 p. cent). Le reproche qui peut ~ t r e fait ~ l'6gard de cette m~rhode est l ' e n c o m b r e m e n t (il est en effet n6cessaire de f r a c t i o n n e r le
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et les difficult6s de m a n i p u l a -
Conclusion U n e m 6 t h o d e de c o n s e r v a t i o n des h 6 m a t i e s d ' u n p a n e l est d o n c r6alis6e ~ l ' a i d e d e l ' a z o t e l i q u i d e ~ - - 1 9 6 ° C , a p r 6 s t r a i t e m e n t des glob u l e s r o u g e s p a r le s a c c h a r o s e h 40 p. cent. Ce q u i n o u s a c o n d u i t c h o i s i r cette m 6 t h o d e , c ' e s t la s i m p l i c i t 6 de r 6 a l i s a t i o n de la t e c h n i q u e . L ' h 6 m o l y s e est e n c o r e i m p o r t a n t e ( e n v i r o n 20 p. c e n t ) , m a i s p o u r r a ~tre c e r t a i n e m e n t a b a i s s 6 e h l ' a v e n i r . P a r c o n t r e , la c o n s e r v a t i o n des antig~n e s de g r o u p e s s a n g u i n s est p a r f a i t e , l ' a n a b i o s e ne p r o d u i s a n t a u c u n e d 6 g r a d a t i o n de c e u x - c i . Cette m 6 t h o d e p e r m e t doric, h p a r t i r d ' u n don p e u f r 6 q u e n t , d ' a v o i r t o u j o u r s h sa d i s p o s i t i o n les h 6 m a t i e s t 6 m o i n s d o n t p e u t a v o i r b e s o i n le d 6 p a r t e m e n t d ' i m m u n o - h 6 m a t o l o g i e . Nous remercions tout particuli~rement la Compagnie gaise de produits oxyg6n6s, filiale de Nancy, pour sa boration. E t n o s remerciements vont figalement ~ M. QUET du Centre d'Ins6mination artificielle pour l'aide nous a apport6e avec spontan6it6.
francolla. BOUqu'il
R6sum6 Les a u t e u r s d 6 c r i v e n t u n e m 6 t h o d e de c o n s e r v a t i o n d a n s l ' a z o t e liq u i d e des g l o b u l e s r o u g e s d ' u n p a n e l , a p r 6 s t r a i t e m e n t de c e u x - c i p a r le s a c c h a r o s e ~ 40 p. cent. Le s a n g des d o n n e u r s est r 6 p a r t i d a n s des p a i l l e t t e s e n m a t i 6 r e p l a s t i q u e , f a c i l e m e n t i d e n t i f i a b l e s , ce q u i p e r m e t u n e e x p l o i t a t i o n facile. L a s u r v i e g l o b u l a i r e est v o i s i n e de 80 ,%. La t e c h n i q u e d e m a n i p u l a t i o n est r e l a t i v e m e n t s i m p l e et n ' e x i g e pas d ' i n s t a l l a t i o n sp6ciale.
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liquide
A propos d'un proc6d,6 original par F. STREIFF, A. PETERS, B. GENETET et S. GILGENKRANTZ*
Les Centres de T r a n s f u s i o n Sanguine d o i v e n t d i s p o s e r en p e r m a nence, p o u r la d S t e c t i o n et l ' i d e n t i f i c a t i o n des a n t i c o r p s irr~guliers, d ' u n ~chantillonnage d'h~maties-tests (panel des auteurs anglo-saxons). P o u r ce faire, il est n~cessaire de r e c u e i l l i r le sang d ' u n c e r t a i n n o m b r e .de d o n n e u r s dont le p h 6 n o t y p e sanguin a ~t~ p a r f a i t e m e n t 6tabli : ce qui exige le g r o u p a g e le plus c o m p l e t possible d ' u n e v i n g t a i n e d e p e r s o n n e s r e n d u souvent difficile p a r ]a raret6 de c e r t a i n s s~rums-tests. Ceci r~alis~, il est toujours p o s s i b l e de c o n v o q u e r f r ~ q u e m m e n t les donneurs. Il nous a sembl~ p l u s ~l~gant d ' u t i l i s e r les p r o p r i ~ t ~ s de l'azote l i q u i d e p o u r o b t e n i r c h a q u e s e m a i n e une p e t i t e quantit~ d e ces h6maties-tests tout en n ' e x i g e a n t d e nos d o n n e u r s qu'un don b i m e s t r i e l , voire t r i m e s t r i e l . Notre but n'est pa.s de c o n s e r v e r du sang p o u r la transfusion sanguine, m a i s n o t r e u n i q u e souci a ~t6 de t r o u v e r un m o y e n tr~s simple p e r m e t t a n t de f r a c t i o n n e r un don u n i q u e en unit~s d i s p o n i b l e s le plus r a p i d e m e n t possible. Nos r e c h e r c h e s d a n s ce d o m a i n e ne sont c e p e n d a n t pas t e r m i n 6 e s et nous d o n n o n s les p r e m i e r s r~sultats a u x q u e l s nous s o m m e s p a r v e n u s et .qui d o n n e n t satisfaction. De n o m b r e u x proc~d~s sont a c t u e l l e m e n t pr~conis~s d e p u i s la cong~lation h - - 2 0 ° C jusqu'~ l ' u t i l i s a t i o n des g r a n d s f r o i d s (azote l i q u i d e - - 1 9 6 ° C ) en p a s s a n t p a r la c o n s e r v a t i o n h - - 8 0 ° C dans la carbo-glace. P a r ailleurs, de n o m b r e u s e s m~thodes ont 6t~ r e c o m m a n d ~ e s p o u r prot6ger les h~maties c o n t r e la t r a n s f o r m a t i o n vitreuse (REY) [14], notamment le g l y c e r o l (KEvY) [10] fort appr~ci~ d e p u i s les t r a v a u x de ROSTAND [15], les sucres (HuGGINS) [4], l'alcool (KLIMAN) [11] et ~galemerit la d i m 6 t h y l - s u l f o x y d e (HuaGINS) [5]. Nous avons, quant A nous, p o u r d e s r a i s o n s de commodit6, r e t e n u le m o d e de c o n s e r v a t i o n d e s globules trait6s p a r le s a c c h a r o s e ~ 40 g p. cent et entrepos6s dans l'azote liquide apr6s i n t r o d u c t i o n dans des paillettes de mati~re plastique, * Centre de Transfusion Sanguine, 9, rue Lionnois, Nancy (Dirvcteur : Prof. agr6g6
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282 Principo
Le p r i n c i p e de la m~thode de c o n s e r v a t i o n est d o n c l ' u t i l i s a t i o n d e s p r o p r i 6 t ~ s du s a c c h a r o s e h 40 g p. cent p o u r la survie g l o b u l a i r e clans l'azote l i q u i d e ~ - - 1 9 6 ° C . Le s u c r e m a i n t i e n t l ' i s o t o n i c i t ~ du m i l i e u et r~duit la force ionique, l ' h y p e r t o n i c i t ~ c o n d u i s a n t en effet h l'Sclatem e n t g l o b u l a i r e p a r f o r m a t i o n de c r i s t a u x ( t r a n s f o r m a t i o n v i t r e u s e ) . On salt que c'est LUYET (12) qui fut le p r e m i e r h r e c o m m a n d e r l ' e m p l o i de l'azote p o u r la c o n s e r v a t i o n du sang. Depuis, REY a p a r f a i t e m e n t d6crit les propri~t6s de l'azote p o u r la c o n s e r v a t i o n des tissus a n i m a u x . P o u r o b t e n i r l ' i n e r t i e totale de ceux-ci, il faut a t t e i n d r e tr~s r a p i d e m e n t - - 1 3 0 ° C ce q u i est r~alisable avec l'azote liquide. Quant au s a c c h a r o s e , HUNTSMAN [6, 7, 8] en a codifi6 l ' e m p l o i en 1960 p o u r la c o n s e r v a t i o n d ' u n p a n e l d ' h 6 m a t i e s tests. Cet a u t e u r utilise p o u r ce f a i r e des boites en c a r t o n c o n t e n a n t les globules rouges trait6es, plong~es d i r e c t e m e n t dans l'azote. Nous utilisons une v a r i a n t e de cette m~thode en ce sens que nous r ~ p a r t i s s o n s le sang m61ang~ au s a c c h a r o s e d a n s des p a i l l e t t e s de mati~re p l a s t i q u e (AGACHE) [1] c o n t e n a n t e n v i r o n 1,5 ml de m~lange. Ces paillettes sont a c t u e l l e m e n t utilis~es en p r a t i q u e v~t~rinaire p o u r la c o n s e r v a t i o n d e la s e m e n c e de t a u r e a u dans les c e n t r e s d ' i n s ~ m i n a t i o n artificielle (JoNDET) [9]. MERYMAN [13] a m o n t r 6 qne l'homog~n~it~ de l ' a b a i s s e m e n t de la t e m p d r a t u r e h l ' i n t ~ r i e u r du c y l i n d r e a u g m e n t e en r a i s o n i n v e r s e du diam~tre. Cette homog~n~it~ dans le r e f r o i d i s s e m e n t ~vite les g r a d i e n t s t h e r m i q u e s p r 6 j u d i c i a b l e s h une b o n n e c o n s e r v a t i o n . Le faible diam~tre des paillettes p e r m e t d ' o b t e n i r cette homogeneitY. Nous avons d ' a i l l e u r s eu la s a t i s f a c t i o n de c o n s t a t e r que l'Ecole de MOUaEAU h Liege (BouILLENNEC, ANDRe, BROCTEUR, OTTO-SERVAIS [2] p r 6 c o n i s a i t la m~me technique. Les r6sultats de ces t r a v a u x ont donn~ s a t i s f a c t i o n h ces a u t e u r s et ont ~t~ pr6sent6s h S t r a s b o u r g en 1965. Mat6riel 1) L'AZOTE LI~UIDE ." L'azote est c o n t e n u dans un r ~ e i p i e n t LNR 25 LINDE p o u v a n t conten i r 28 litres d'azote. L ' a p p r o v i s i o n n e m e n t se f a i t toutes les semaines (environ 8 litres). Le niveau s u p ~ r i e u r d'azote, qui dolt t o u j o u r s d~passer l'extr6mit~ s u p ~ r i e u r e des paillettes, est f a c i l e m e n t r e p a r a b l e h l ' a i d e .d'un baton p e i n t en noir. Le r ~ c i p i e n t p e u t r e c e v o i r 6 p a n i e r s c y l i n d r i ques m~talliques ( c a n i s t e r ) d o n t les d i m e n s i o n s sont les s u i v a n t e s : 26 cm de haut et 7 de diamStre. Ces c a n i s t e r s c o n t i e n n e n t des p a n i e r s en toile m~tallique divis~s en 8 c o m p a r t i m e n t s et q u i r e c e v r o n t les paillettes ( m i n i m u m 100, maxim u m 120 p a r c a n i s t e r ) . 2) LES PAILLETTES : Ce sont des tubes de c h l o r u r e de p o l y v i n y l e (CAssou) [3], .de couleur, bouch~s ~ une extr~mit~ et d o n t le d i a m ~ t r e est de 4,2 m m et
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l'6paisseur de 0,17 mm, la l o n g u e u r de 132 ram. U n e m a r q u e (peinture de diff6rents coloris) p e r m e t d'identifier facilement le sang.
3) LE SANG : Nous utilisons le sang recueilli (de prdf6renee le jour de la cong6lation) sur E.D.T.A. (1 mg p o u r 1 ml de sang). U n don d ' e n v i r o n 100 ml ~t 150 ml est suffisant p o u r u n e p6riode de 2 mois. 4) LES RI~CTIFS : Solution de saccharose h 40 g p. cent en eau b'idistill6e port~e h 37°C. Solution de C1 N a h 1 g p. cent en eau bidistill6e portde h 45°C.
Technique de, cong61ation et de d6cong~lation I ) INTRODUCTION DU SACCHAROSE :
A 1 ml de sang total c o n t e n u dans u n tube h hdmolyse on ajoute 0,5 ml de saecharose h 40 g p. cent p r d a l a b l e m e n t port~ h 37°C. L ' i n t r o d u e t i o n du saceharose doit 8tre r~alis6e l e n t e m e n t p a r r e t o u r n e m e n t s suceessifs du tube. Le m61ange est ensuite laiss6 p e n d a n t trente m i n u t e s h 37°C. 2) INTRODUCTION DU MELANGE SACCHAROSE-SANG DANS LES PAILLETTES :
Les paillettes sont bouch6es h u n e extr6mit6 ; cette extr6mit6 perm e t t a n t n d a n m o i n s d ' a s p i r e r le m~lange c o n t e n u dans le tube h h6molyse. Ceci est r6alisable grace ~ la trompe h eau, l'extr6mit6 libre de la paillette 6tant plong6e dans le tube c o n t e n a n t le sang. Le sang d ' u n m~me d o n n e u r est ainsi pr~lev6 dans des paillettes p o r t a n t u n rep6re de couleur identique. Les paillettes des diffdrents d o n n e u r s d u << p a n e l >> sont ensuite raises dans les dii~drents c o m p a r t i m e n t s des p a n i e r s m6talliques. 5) CONG~LATION :
Les p a n i e r s m6talliques a y a n t 6t6 r~intdgr6s dans leurs canisters sont plong6s dans le r 6 e i p i e n t LINDB. I1 est h noter que quelquefois des projections d'azote se p r o d u i s e n t ; ceci n ' a r i e n de d a n g e r e u x . La cal6faction emp~chant l'attaque des tissus p a r le l i q u i d e (REY). 4) DI~CONGELATION " Elle est r~alis~e dans une solution de CINa h 1 g p. cent port6e h 45°C. On d6cong61e (en fonction des besoins) h chaque utilisation une dizaine de paillettes de chaque d o n n e n r . Cette op6ration doit ~tre r6ali-
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s6e r a p i d e m e n t . Les paillettes d'un m~me d o n n e u r (extr6mit6 bouchfie en haut) sont plong~es d a n s uu g r a n d tube (type tube ~ BW) c o n t e n a n t la solution saline chaude. La d~cong~lation doit ~tre r a p i d e et r~alis~e p a r 4 h 5 r e t o u r n e m e n t s . Une petite entaille est p r a t i q u 6 e ~ l'extrfimit~ s u p 6 r i e u r e de la p a i l l e t t e afin de p e r m e t t r e au sang d e s'6couler. On centrifuge p e n d a n t 1 m i n u t e h 2.000 RPM et le s u r n a g e a n t est d6cant~. Un ou deux lavages en solution saline i s o t o n i q u e h t e m p e r a t u r e du labor a t o i r e sont r~alis~s et enfin les globules rouges sont m i s en s u s p e n s i o n 5 p. c e n t ou 2 p. c e n t en eau p h y s i o l o g i q u e . I1 faut n o t e r q u ' u n e mise en s u s p e n s i o n d a n s la solution ACD p e r m e t une c o n s e r v a t i o n ~ + 4 ° d'une semaine environ.
Etude d e s propri6t~s i m m u n o l o g i q u e s du s a n g d ~ c o n g e l ~ Nous nous s o m m e s p a r t i c u l i ~ r e m e n t inqui~t~s de s a v o i r si les p r o pri~t~s antig~niques des globules tests se m a i n t e n a i e n t c o n s t a n t e s lors de la cong~lation-d~cong~lation et au cours d u temps, et si l ' i n t r o d u c t i o n de sucre n ' a p p o r t a i t pas de modification ~ la s t r u c t u r e antig~nique. 1) Etude qualitative des antig~nes de groupes sanguins portds par les h~malies congel~es : Nous avons ~tudi~ les antig~nes de g r o u p e s s a n g u i n s dans les syst~mes s u i v a n t s :
ABO (A1 A~ B O) Rhesus (CcC~Def) MNSs --P - - Kell, Cellano, K p ( a ) , Kp(b) Duffy Kidd Lewis Lutheran. Nous avons p o u r cela group~ le sang : - - apr~s pr~l~vement s u r E.D.T.A. apr~s i n t r o d u c t i o n du s a c c h a r o s e I apr~s 6 h e u r e s de cong~lation - - apr~s cong~lation apr~s 24 h e u r e s de cong61ation apr~s 30 jours de cong~lation Nous avons t o u j o u r s retrouv6 les antig~nes. L ' a n a b i o s e ~ - - 196°C i n t r o d u i t d o n c la notion de r e s p e c t ~des antig~nes ~ r y t h r o c y t a i r e s . 2) Etude semi-quantitalive des anlig~nes de groupes sanguins port,s par les h~maties congel~es : Nous avons, p o u r un c e r t a i n n o m b r e de syst~mes de g r o u p e s sanguins pr~cil~s, mesurd l'activit~ d ' u n sdrum-test donnd s u r les m~mes
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h6maties a v a n t et apr6s cong61ation, et p o u r :des d i l u t i o n s d'h~maties constantes. C'est ainsi que nous avons constat6 que le titre de s6rums-tests anti D (titre appr6ci6 p a r la t e c h n i q u e de coombs i n d i r e c t et apr6s t r a i t e m e n t des globules du p a n e l p a r la b r o m e l i n e et la papaine) ne subissait a u c u n e variation. De m~me u n s6rum c o n t e n a n t des a n t i c o r p s anti A i n d i q u e toujours le m~me titre avant et apr6s cong61ation. Ceci se retrouve 6galement p o u r les diff6rents antig6nes du syst6me MNSs.
Etude de l'h6molyse du sang congel6 et d6congel6 Dans cette p r e m i 6 r e partie de notre ~tude nous nous sommes surtout attach6s h o b t e n i r du sang utilisable p o u r la d~tection des a n t i c o r p s irr6guliers. La m~thode d6crite nous p e r m e t d ' a v o i r h n o t r e disposition un p a n e l facilement accessible et surtout dont la p r 6 p a r a t i o n et la conservation sont r e l a t i v e m e n t ais6es. I1 n ' e n reste pas m o i n s n6cessaire d ' o b t e n i r u n e b o n n e c o n s e r v a t i o n parall~lement h u n faible p o u r c e n t a g e d'h6molyse ; nos recherches portent actuellement sur la mesure de celle-ci. P o u r ce faire, nous p a r t o n s d ' u n e quanfit6 donn6e de sang complet et apr6s i n t r o d u c t i o n .du saccharose nous m e s u r o n s le r a p p o r t globules-m~lange plasma saccharose. Nous pouvons ainsi c o n n a l t r e la quantit6 de globules rouges c o n t e n u s dans chaque paillette a v a n t la cong~lation. Apr6s la d~cong61ation et les diff,rents lavages en saline h y p e r t o n i q u e h 1 g p. cent et en salin h 0,85 p. cent, nous 61iminons au m a x i m u m l'eau physiologique el nous m e s u r o n s la quautit6 d'h6maties restante. Nous o b t e n o n s actue]lement une c o n s e r v a t i o n d ' e n v i r o n 80 % ce qui est u n r6saltat dont nous pouvons nous satisfaire 6rant donn6 l'usage auquel nous d e s t i n o n s les globales rouges. I1 est 6vident que cette m6thode de mesure ne tient pas compte des pertes .dues n o n pas h la cong~lation-d~cong61ation mais h la m a n i p u l a tion elle-m~me (sang sur les parois des paillettes et des tubes, lavage, etc.). Variante de la m6thode Parall61ement aux 6tudes r6alis~es sur les paillettes nous avons ~galement r6p6t6 la m6thode d'HuNSTMAN en boites de carton. P o u r ce faire nous congelons le sang auquel a ~t6 p r ~ c 6 d e m m e n t a d j o i n t le saccharose en laissant t o m b e r goutte ~ goutte l'azote l i q u i d e ~ l'aide d ' u n e pipette. Nous o b t e n o n s des perles que nous i n t r o d u i s o n s dans les boites de carton identifi6es au n o m du d o n n e u r , perc6es de trous et p e r m e t t a n t l'entr~e de l'azote q u a n d on les plonge d a n s le r 6 c i p i e n l LINDE. NOS 6tudes d ' o r d r e i m m u n o l o g i q u e ont 6t6 parall61es ~ celles d6crites plus haut, et les c o n c l u s i o n s identiques. P a r c e n t r e n o u s obtenons semble-t-il u n p o u r c e n t a g e de c o n s e r v a t i o n plus 61ev6 (de l ' o r d r e de 90 p. cent). Le reproche qui peut ~ t r e fait ~ l'6gard de cette m~rhode est l ' e n c o m b r e m e n t (il est en effet n6cessaire de f r a c t i o n n e r le
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286 s a n g en de n o m b r e u s e s b o l t e s de c a r t o n ) t i o n (n6cessit6 de p r 6 1 e v e r l ' a z o t e l i q u i d e ) .
et les difficult6s de m a n i p u l a -
Conclusion U n e m 6 t h o d e de c o n s e r v a t i o n des h 6 m a t i e s d ' u n p a n e l est d o n c r6alis6e ~ l ' a i d e d e l ' a z o t e l i q u i d e ~ - - 1 9 6 ° C , a p r 6 s t r a i t e m e n t des glob u l e s r o u g e s p a r le s a c c h a r o s e h 40 p. cent. Ce q u i n o u s a c o n d u i t c h o i s i r cette m 6 t h o d e , c ' e s t la s i m p l i c i t 6 de r 6 a l i s a t i o n de la t e c h n i q u e . L ' h 6 m o l y s e est e n c o r e i m p o r t a n t e ( e n v i r o n 20 p. c e n t ) , m a i s p o u r r a ~tre c e r t a i n e m e n t a b a i s s 6 e h l ' a v e n i r . P a r c o n t r e , la c o n s e r v a t i o n des antig~n e s de g r o u p e s s a n g u i n s est p a r f a i t e , l ' a n a b i o s e ne p r o d u i s a n t a u c u n e d 6 g r a d a t i o n de c e u x - c i . Cette m 6 t h o d e p e r m e t doric, h p a r t i r d ' u n don p e u f r 6 q u e n t , d ' a v o i r t o u j o u r s h sa d i s p o s i t i o n les h 6 m a t i e s t 6 m o i n s d o n t p e u t a v o i r b e s o i n le d 6 p a r t e m e n t d ' i m m u n o - h 6 m a t o l o g i e . Nous remercions tout particuli~rement la Compagnie gaise de produits oxyg6n6s, filiale de Nancy, pour sa boration. E t n o s remerciements vont figalement ~ M. QUET du Centre d'Ins6mination artificielle pour l'aide nous a apport6e avec spontan6it6.
francolla. BOUqu'il
R6sum6 Les a u t e u r s d 6 c r i v e n t u n e m 6 t h o d e de c o n s e r v a t i o n d a n s l ' a z o t e liq u i d e des g l o b u l e s r o u g e s d ' u n p a n e l , a p r 6 s t r a i t e m e n t de c e u x - c i p a r le s a c c h a r o s e ~ 40 p. cent. Le s a n g des d o n n e u r s est r 6 p a r t i d a n s des p a i l l e t t e s e n m a t i 6 r e p l a s t i q u e , f a c i l e m e n t i d e n t i f i a b l e s , ce q u i p e r m e t u n e e x p l o i t a t i o n facile. L a s u r v i e g l o b u l a i r e est v o i s i n e de 80 ,%. La t e c h n i q u e d e m a n i p u l a t i o n est r e l a t i v e m e n t s i m p l e et n ' e x i g e pas d ' i n s t a l l a t i o n sp6ciale.
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