Der Beitrag der hydrophoben Wechselwirkungen und der intermolekularen Disulfidbrücken bei der Heterogenität des Zeins1).

Biochem. Physiol. Pflanzen 174, 451-461 (1979)

Der Beitrag der hydrophoben Wechselwirkungen und der intermolekularen Disulfidbri.icken bei der Heterogenitat des Zeins 1 ) W. A. REwA und CHR. BRUCKNER Laboratorium fiir EiweiBchemie, Kischinjower Staatliche Leninuniversitiit, Kischinjow, UdSSR

Contribution of Hydrophobic Interaction and Intermolecular Disulfide Bonds to the Heterogeneity of Zein Key Term Index: zein, hydrophobic interaction, disulfide polymerisation, molecular heterogeneity; Zea mays.

Summary The prolamins of maize endosperm were fractionated after extraction by 80% eth
Einleitung

In einer vorangegangenen Arbeit (REWA et al. 1978) wurde gezeigt, daB sich Zein (die Prolamine der Maissamen) mit Hilfe der Elektrophorese im Porengradienten cines Polyacrylamid-Gels in 12 elektrophoretische Hauptkomponenten zerlegen liWt, die ein mittleres Molekulargewicht (MG) von 40100 bis 275400 D aufweisen. AuBerdem wurde ein hochmolckulares, nicht auftrennbares Protein festgestellt. Anderen Angaben zufolge befinden sich die mittleren Werte fUr die MG in einem weitaus engeren Intervall: von 20000 bis 4000·J D (Siehe z. B. DANZER und REES 1976), von 9600 bis 23000 D (GIANAZZA et al. 1976). Andcrerseits wurde cine ausgepragtc Tendenz der Zein-Moleklile zum Aggregieren durch Bildung intcrmolekularer Disuflidbrlicken (TURNER et al. 1965) und hydrophober Wechselwirkungen (RIGHETTI et al. 1977) festgestellt. Es ist mi:iglich, daB bei unseren Untersuchungen Zein-Komponentcn vorlagen, die individuelle Proteinc darstellen. 1) Gewidmet dem Andenken an Professor W. G. KLIMENKO

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W. A. REWA und CHR. BnucKNER

Die vorliegcndc Arbeit soll die Rolle der hydrophoben Wechselwirkungen und dcr intermolekularen Disulfidbrticken bei der Heterogenitat der Zein-Komponenten beleuchten. Material und Methoden Untersuchungsmaterial

Fiir die Untersurhung wurden vollreife Samen der Maissorte Tiraspolskaja skorospelaja 3B verwendet, die 1976 auf der biologischen Station der Kischinjower Staatlichen Leninuniversitiit aufgezogen wurden. Die Aufbereitung des Materials erfolgte wie bereits beschrieben (REwA et al. 1978). Gewinnung nichtmodifizierter Zein-Priiparate

Der nach dem Herauslosen des Albumin-Globulin-Gemisehes (REWA et al. 1978) erhaltene feste Mehlriickstand wurde zweimal mit 80% Athanol bel 25 oc extrahiert (erste Extraktion mit zehnfaehem Volumen im Verlaufe einer Nacht, zweite mit fiinffachen Volumen 1 h lang). Danach wurde der feste Mehlriickstand zweimal wie oben beschrieben bei GO oc je 1 h lang extrahiert. In allen Fallen wurden die Extrakte vom festen Mehlriickstand bei 6000 U/min (15 min) abgetrennt. Die erhaltenen Extrakte, bei 25 oc als Z-1 und bei 60 oc als Z-2 bezeichnet, wurden bei 30 oc im Vakuum eingedampft und in einer Saule mit Sephadex LH-20 gereinigt, gegen Aqua dest. dialysiert, lyophilisiert und einzeln untersucht. Bei speziellen Untersuchungen wurde die Dialyse gegen Aqua dest. nicht durchgefiihrt (nichtlyophilisierte, nichtmodifizierte Praparate). In diesen Fallen wurden die nach der Reinigung von nichteiweiBhaltigen Beimengungen erhaltenen Zein-Losungen in Dialysesackchen gefiillt und im kalten Luftstrahl eingedampft. Diese Zein-Losung wurde periodisch gegen 80% Athanol dialysiert, urn Proteinprazipitation beim Eindampfen des Athanols zu verhindern. Die EiweiBkonzentrationen der Losungen wurde nach LownY eta!. (1951) bestimmt. Gewinnung modifizierter Zein-Priiparate

Die im Protein erreichbaren Sulfhydryl-Gruppen konnen vollstandig mit Acrylnitril unter Bildung von S-Cyanoathylderivaten (SEIBLES und WEILL 1967) alkylieren. Dadurch wird die Bildung von Disulfidbriicken blockiert. Urn den Zeitpunkt der Bildung der Disulfidbriicken herauszufinden, wurde die Alkylierung des nativen Zeins bei und sofort nach der Extraktion vorgenommen. (I) S-Cyanoiithylierung bei der Extraktion: Die Extraktion und die Reinigung der Zein-Praparate Z-1 und Z-2 erfolgte wie bereits im Abschnitt ,Gewinnung nichtmodifizierter Zein-Praparate" beschrieben mit dem Unterschied, daB zum 80% Athanol fiir die Extraktion zweimal destilliertes Acrylonitril (Reachim, UdSSR) bis zu einer Konzentration von 1% (v/v) hinzugegeben wurde. pH 8,0 wurde durch Zugabe von 1% wiiBriger Triathylamin-Losung (Reachim, UdSSR) erreicht. Vor der Reinigung in einer Saule mit Sephadex LH-20 wurde der pH auf 7,0 mittels verdiinnter Essigsiiure gesenkt. (II) S-Cyanoiithylierung nach der Extraktion: Die Extraktion erfolgte wie bereits oben beschrieben. In aliquoten Tei!en der Extrakte Z-1 und Z-2 wurde sofort pH 8 0 mit Hilfe von 1% waBriger Triathylamin-Losung eingestellt. Danach wurde unter standigem Riihren destilliertes Acrylonitril hinzugegeben bis zur Endkonzentration 1 %- Die Reaktion verlief bei pH 8,0 4 h lang. Danach wurde das Gemisch mit verdiinnter Essigsaure auf pH 7,0 eingeste!lt, im Vakuum eingedampft und gereinigt wie bereits beschrieben. Die verbleibenden aliquoten Kontrollteile der Extrakte Z-1 und Z-2 wurden ohne irgendeine Vorbehandlung gereinigt. (III)S-Cyanoiithylierung von Zein nach Reduktion der Sulfhydrylgruppen: 25 ml 8 M Harnstofflosung, die 0,2% EDTA enthielt, oder 25 ml 80% Athanol mit 0,05% EDTA, wurden in eine potentiostatische Kammer mit 1% wiiBriger Triathylamin-Losung (pH 8,5) gefiillt. Durch die Losungen

Hydrophobe Wechselwirkungen und Disulfidbriicken im Zein

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wurde 30 min gasfiirmiger C0 2-freier Stickstoff geblasen und danach 250 mg Zein-Praparat hinzugegeben. Nach dem Liisen des Proteins wurde das N2 -Durchblasen 10 min lang wiederholt. Unter standigem Riihren und N2-Durchblasen wurden 0,3 ml 2-Mercaptoathanol (Merck, BRD) hinzugesetzt. Die Reaktion verlief 4 h bei 25 oc und pH 8,0. Danach wurde zum Gemisch 0,6 ml destilliertes Acrylonitril hinzugegeben, die Cyanoathylierung verlief in einer N2-Atmosphare. Die Liisung wurde mit verdiinnter Essigsaure auf pH 7,0 eingestellt, gegen Aqua dest. bei 4 oc his zur vollstandigen Beseitigung des Harnstoffs oder des Athanols dialysiert. Das Protein wurde lyophilisiert und bei niedrigen Temperaturen iiber CaCI 2 im Exiccator gelagert. Chromatographische Untersuchungen

Die Gel-Filtration der Praparate wurde in ~aulen (2,4 x 52,0 em) mit Sephacryl S-200, superfine (Pharmacia Fine Chern., Schweden) durchgefiihrt. Fiir Siiulen-Ausgleich und Eluierung der Proteine wurde 70% Athanol verwendet, der mit 0,001 M Acetat-Puffer auf genau pH 5,3 eingestellt war. Die zu untersuchende Zein-Probe (50 mg) wurde in einem Vol. von weniger als 2 ml aufgetragen. Die Eluierung erfolgte von oben nach unten mit einer Geschwindigkeit von 14 ml/h. Die Fraktionen zu 2,5 ml je Probe wurden mittels Spektrofotometer S FD-2 (Lomo, Leningrad) im UV-Bereich analysiert. Fiir jede Fraktion wurde der Elutionskoeffizient k = Elutionsvolumen und V t

-

v

_e berechnet, wobei Ve Vt

das

das Gesamtvolumen der Saule darstellen.

Untersuchungen der Loslichkeit von Zein-Priiparaten im Athanolkonzentrationsgradienten

Die Liislichkeit von Zein-Praparaten wurde im Athanol-Konzentrationsgradienten untersucht (REWA 1978). Dafiir wurden 30-50 mg Zein in 10 ml 80% Athanol geliist und die Liisung mit 3 g Celite 545 (Lawson, England) gemischt. Zu diesem Gemisch wurde tropfenweise unter standigem Riihren eine waBrige NaCI-Liisung (8 mg auf 100 ml) his zu einer Endkonzentration des Athanols von 2% hinzugegeben. Die Suspension wurde in eine Chromatographie-Saule gefiillt und das Protein mit einem nahezu Iinearen 80-30%igen Athanol-Gradienten mit 14 ml/h eluiert. Polyacrylamidgel-Elektrophorese in Gegenwart von H arnstoff (Urea- Elpho)

Die Elektrophorese der erhaltenen Z-1 und Z-2 Praparate und die Bestimmung ihrer MG wurde im Porengradienten (7-30 %) eines Polyacrylamidgels in Gegenwart von 35% Essigsaure und 5 M Harnstoff durchgefiihrt (REWA eta!. 1978). Der Mittelwert der MG wurde aus drei Versuchen ermittelt. Die maximale Abweichung von den Mittelwerten war kleiner als 6%Polyacrylamidgel-Eletkrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-Elpho)

Die Gel-Gradienten wurden nach LORENTZ (1976) hergestellt. Der Gelpuffer enthielt 0,5% SDS (Serva, BRD), die Gele und der Elektrodenpuffer 0,1% SDS. Da alkylierte Zein-Praparate untersucht wurden, brauchte zum Elektrodenpuffer kein 2-Mercaptoathanol hinzugegeben werden. 1 mg Zein wurde im Verlaufe von 3 h bei 40 oc oder in 5 min bei 100 oc in dreimal verdiinntem Gelpuffer (1 ml), der 1% SDS enthielt, geliist. Danach wurde das gleiche Vol. Saccharose-Liisung (40 %) hinzugegeben. In jedes Riihrchen wurden 0,1 ml der so vorbereiteten Liisung des Zein-Praparates oder des StandardeiweiBes aufgetragen. Die Elektrophorese dauerte 7 h; zuerst 2 h bei 5 Vjcm, danach bei 13 Vjcm. Nach dem Ablauf der Elektrophorese wurden die Gele mit Coomassie Brilliant Blau G 250 (Serva, BRD) gefarbt (BLAKESLEY and BoEzr 1977) und mit einem verbesserten Densitometer Eri-10 (Carl-Zeiss-Jena, DDR) analysiert. Fiir die MG-Bestimmung der Zein-Komponenten wurden folgende StandarteiweiBe verwendet: Rinderserumalbumin (66 700; Koch-Light-Lab., England), Ovalbumin (45000; Olainskii sawod, UdSSR), Chymotrypsinogen A (25000; Reanal, UVR), Myoglobin (17 200; BDH, England), Lysozym (14300; Lawson, England). Der .Mittelwert der .MG wurde aus 6 Versuchen ermittelt. Die maximale Abweichung vom .Mittel wert iiberstieg nicht 10%-

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W. A. REWA und CHR. BRuCKNER

Ergebnisse und Diskussion

Nichtmodifizierte, nichtlyophilisierte Praparate Z-1 und Z-2 unterscheiden sich durch einen, bei der Gel-Filtration auf Sephacryl S-200 in Athanollosungen in der Fraktion mit dem Elutionskoeffizienten 0,98 des Z-2 festgestellten, schwach ausgepragten Peak im niedermolekularen Bereich (Abb. 1a und 2a). Bei der Lyophilisierung von Z-1 verschwindet die Fraktion 0,98, es entsteht aber eine relativ hochmolekulare Fraktion 0,51, die nicht in nichtlyophilisierten, nichtmodifizierten Praparaten nachgewiesen Werden kann (Abb. 1b). Die Praparate Z-2 neigen im Vergleich zu Z-1 Weniger zu ahnlichen Aggregationsprozessen. Die Fraktion 0,51 -w1ude nicht in Zein-Praparaten gefunden, deren Sulfhydrylgruppen bei der Extraktion oder sofort nach ihr blockiert wurden. Ebenso verschwand sie vollstandig nach Reduktion der Sulfhydrylgruppen des Proteins und anschlie13ender Alkylierung der reduzierten Produkte (Abb. 1 c und 2 c). Die erhaltenen Resultate beweisen, daB die Veranderung des Proteins im ProzeB von Extraktion und Reinigung wahrscheinlich nicht allein durch Aggregatbildung mittels Disulfidbrucken bedingt ist, da bei Lyophilisierung die Fraktion 0,98 sowohl im nichtmodifizierten Praparat, als auch in Praparaten mit reduzierten und alkylierten Sulfhydrylgruppen verschwindet (Abb. 1c). Hochstwahrscheinlich erfolgt die Trennung des Zeins auf Sephacryl nicht nur nach den MG, sondern auch nach den Adsorptionseigenschaften des Proteins, da die Fraktionen mit betrachtlichem Verzug eluieren.

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Abb. 1. Elutionskurven der Zein-Priiparate Z-1 bei der Gel-Filtration auf Sephacryl S-200. a - nichtmodifiziertes, nichtlyophilisiertes Priiparat b - dasselbe, aber lyophi!isierte Priiparat c - nach Reduktion der Sulfhydrylgruppen S-cyano-iithyliertes Priiparat Uber den Fraktionen der Kurven sind die Elutionskoeffizienten angefiihrt. Auf der Abszisse sind die Fraktionsnummern eingetragen. Abb. 2. Elutionskurven der Zein-Priiparate Z-2 bei der Gel-Filtration auf Sephacryl S-200. Die Bezeichnungen entsprechen denen von Abb. 1.

Hydrophobe Wechselwirkungen und Disulfidbriicken im Zein

45g

Zein-Praparate, die nach der Reduktion der Sulfhydrylgruppen alkyliert wurden, enthalten weniger an niedermolekularer Fraktion 0,98. Diese Beobachtung weist offenbar auf eine Anderung nicht nur des Aggregationsgrades, sondern auch der Adsorptionseigenschaften des Proteins hin. Die Lyophilisierung und die Vorarbeiten dazu fiihrten nicht nur zu Veranderungen des MG der bei der Gel-Filtration auf Sephacryl gefundenen Zein-Komponenten, sondern auch zu Veranderungen im Verhalten des Proteins bei der Elution im Athanolgradienten. Lyophilisierte, nichtmodifizierte Praparate Z-1 eluieren in 5 Fraktionen mit Elutionsmaxima bei 32, 36, 42, 48, 54% Athanol (Abb. 3 a). Genauso eluieren die Fraktionen der lyophilisierten, nichtmodifizierten Praparate Z-2 (Abb. 4a). Wie aus dem Vergleich der Elutionskurven sichtbar, tiberwiegen bei heiden Praparaten die Fraktionen 48 und 54 (Die Fraktionen wurden mit den sie eluierenden Athanolkonzentrationen bezeichnet.). In den Praparaten Z-2 ist der Anteil der leichtloslichen Fraktionen 32 und 31 vergroBert. Bei der Untersuchung nichtmodifizierter Praparate wurde ftir Z-1 und Z-2 (Abb. 3b und 4 b) eine Verschiebung im relativen Gehalt der ftir die lyophilisierten Praparate charakteristischen Fraktionen festgestellt. lm Unterschied zum lyophilisierten Pra-

Abb. 3. Loslichkeitskurven im Athanol-Konzentrationsgradienten der Zein Praparate Z-1 a - nichtmodifiziertes, lyophilisiertes Priiparat b - dasselbe, aber nichtlyophilisierte Praparat c - bei der Extraktion S-cyanoathyliertes Priiparat d - nach Reduktion der Sulfhydrylgruppen S-cyanoiithyliertes Priiparat Die Or dinaten links: Extinktion; rechts: Athanolkonzentration. Uber den Peaks sind mit Ziffern die Athanolkonzentrationen angegeben, bei denen die Fraktionen eluierten. 30

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W. A.

REWA

und

CHR. BRuCKNER

parat Z-1 uberwog im nichtlyophilisierten die Fraktion 42 (Abb. 3b). In relativ groBer Menge sind die Fraktionen 32 und 36, in geringerer die Fraktionen 48 und 54 vertreten. Analog sieht die Loslichkeitscharakteristik fUr nichtlyophilisiertes, nichtmodifiziertes Z-2 aus, die Fraktion 36 erschien hier jedoch nicht (Abb. 4b). Die durch Alkylierung im Moment der Extraktion und sofort nach ihr erhaltenen Praparate Z-1 und Z-2 zeigen eine gleiche Loslichkeitscharakteristik (Abb. 3c und 4c). Bei den Praparaten Z-1 wurden die Fraktionen 42, 48 und 54 in etwa den gleichen Mengen festgestellt. Die in den Praparaten Z-2 gefundene neue Fraktion 46 stellt hOchstwahrscheinlich ein Gemisch der Fraktionen 42 und 48 dar (Abb. 4c). In den nach Reduktion der Sulfhydrylgruppen alkylierten Praparaten Z-1 und Z-2 ist die Fraktion 54 wesentlich verringert, wogegen die Fraktionen 42 und 48 bei Z-1 und 46 bei Z-2 vergroBert sind (Abb. 3d und 4d). Im ubrigen entsprechen ihre Loslich· keitscharakteristika denen dcr bei oder unmittelbar nach der Extraktion alkylierten Praparate. Der Aggregationsgrad von Zein in Losungen kann wesentlich von der Art des Losungsmittels abhangen. Wir bestimmten das MG der Zcin-Komponenten in Harnstoffund SDS-Losungen mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese im Porengradienten. Bei der Urca-Elpho teilten sich die lyophilisierten, nichtmodifizierten Praparate Z-1 und Z-2, wie auch die Praparate Z-1 (RE\VA et al. 1978) in 12 elektrophoretische Komponentcn (Abb. 5a und 6a) mit den entsprechendcn MG von 40100 (1), 48600 (2), 78800 (3),

Abb. 4. Los!ichkeilskurven im Aihano!-Konzentrationsgradienten der Zein-Priiparale Z-2. Die Bezeichnungen entsprechen denen von Abb. 3.

Hydrophobe Wechselwirkungen und Disulfidbriicken im Zein

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89500 (4), 115700 (5), 130800 (6), 143500 (7), 161000 (8), 192000 (9), 207400 (10), 238300 (11), 275400 (12) D. AuBerdem wurde ein nicht getrenntes ,StarteiweiB" festgestellt. Zwischen dem ,StarteiweiB" und dem 12. elektrophoretischen Band sind diffuse Zonen oder ,Lii.ngsschwii.nze" eingelagert. Diese Zonen und ,Schwii.nze" verschwanden bei Verwendung von Acrylamid an Stelle von Saccharose zur DichteerhOhung der angefertigten ProteinIOsungen. Hierbei findet moglicherweise eine S-Alkylierung der Sulfhydrylgruppen des Zeins durch Reaktion derselben mit Acrylamid statt. Aller Wahrscheinlichkeit nach legten sich, infolge von unkontrollierter Bildung von Disulfidbriicken entstandene, Ubergangsaggregate zwischen das hochmolekulare ,StarteiweiB" und das 12. elektrophoretische Band. Die Urea-Elpho zeigt, daB nichtmodifizicrtc, lyophilisierte Prii.parate Z-1 im Vergleich zu Z-2 verhii.ltnismii.Big viele hochmolekulare Komponenten der MG 192000 (9), 207 400 (10), 238300 (11), 275400 (12) D sowie das ,StartciwciB", aber weniger relativ niedermolekulare Komponenten mit einem MG von 40100 (1) D enthii.lt. Die bei der Extraktion S-cyanoii.thylicrten Zein-Prii.parate enthielten Spuren von Proteinkomponenten mit MG tiber 275400 D (Abb. 5b und 6b). Eine Reduktion der Sulfhydrylgruppen mit 2-Mercaptoii.thanol und anschlieBende Alkylierung fiihrt zu keiner Verii.nderung des Anteils der relativ niedermolekularen Komponenten(Abb. 5c und 6c). Jedoch verschwanden die Komponenten der MG 192000 238000 und 275400 D, die im nichtmodifizierten Zein gefunden wurden, vollstii.ndig. Folglich stellten sie, aus niedermolekularen elektrophoretischen Komponenten durch Disulfid-Polymerisierung entstandene Aggregate dar. So mit besteht Zein in Harnstoff-Losungcn (sowohl Z-1 als auch Z-2) a us Komponenten mit MG von 40100 bis 275400 D. Dicse Komponenten stellen wahrscheinlich Aggregate dar und stehen ihrem Aggregationsgrad nach dem nativen Zein nahe. Im wesentlichen ist diese Aggregation keine Folge einer Disulfid-Polymerisation. Nur einige relativ hochmolekulare in vivo gebildete Komponenten mit MG von 192000, 238300 und 275400 D zerfallen bci der Reduktion der Suflhydrylgruppen und anschlieBender Alkylierung in niedermolekularere Komponenten. Dabei fiihrte die Reduktion der Sulfhydrylgruppen bei sehr verschiedenen Bedingungen (8 M Harnstoff und 80% Athanol) zu keinen Verii.nderungen im Aggregationsgrad des Proteins. Wii.hrend der Extraktion und der Reinigung der nichtmodifizierten Zein-Prii.parate konnte eine Disulfid-Polymerisierung beobachtet werden. Offensichtlich hat die Disulfid-Polymerisierung in vivo eine begrenzte Bedeutung, verlii.uft aber Ieicht in Losungen. Urn den Zusammenhang zwischen der Heterogenitii.t des Zeins der Loslichkeit im Athanolgradienten nach und der nach dem MG zu klii.ren, wurden die einzelnen, im Athanolgradienten erhaltenen, Fraktionen mittels Urea-Elpho untersucht. Es wurde herausgefunden, daB die Loslichkeit der Fraktionen im Athanolgradienten wenigstens einer der, durch das MG der Komponenten bestimmten, Faktoren ist. LeichtIOsliche Fraktionen enthalten hauptsii.chlich relativ niedermolekulare Komponenten. 30*

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W. A. REWA und CHR. BRUCKNER

VerhaltnismaBig hochmolekulare haben dagegen Elutionsmaxima im Bereich relativ hoher Athanolkonzentrationen. Offenbar kann man mit dieser Tatsache folgende Umstande erklaren: Erstens - in lyophilisierten, nichtmodifizierten Praparaten Z-2 ist im Vergleich mit Z-1 der Anteil der leichtloslichen Fraktionen 32 und 36 vergroBert. Diese Fraktionen enthalten Komponenten mit den geringsten MG. So enthalten die Praparate Z-2 mehr relativ niedermolekulare Komponenten als die Praparate Z-1. Diese Tatsache geht direkt auch a us den Urea-Elpho-Untersuchungen hervor. Zweitens - wird klar, daB die relative VergroBerung des Gehalts an schwer!Oslichen Fraktionen bei Extraktion und Reinigung der Praparate durch eine Anhaufung von Aggregaten hervorgerufen wird, die durch Disulfid-Polymerisierung gebildet werden.

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5 6 8 7 Abb. 5. Densitogramme von Elektrophoregrammen der Zein-Priiparate Z-1 nach Urea-Elektrophorese. a - nichtmodifiziertes, lyopbilisiertes Priiparat b - bei der Extraktion S-cyanoathyliertes Praparat -c - nach Reduktion der Sulfhydrylgruppen S-cyanoathyliertes Praparat. Uber den Peaks sind die Nummern der elektrophoretiscben Komponenten von Kathode zu Anode in der Reihenfolge der VergriiBerung des MG eingetragen. Abb. 6. Densitogramme von Elektrophoregrammen der Zein-Priiparate Z-2 nach der Urea-Elektroyhorese. Die Bezeichnungen entsprechen denen von Abb. 5. Abb. 7. Densitogramme von Elektrophoregrammen der Zein-Priiparate Z-1 nach SDS-Elektrophorese. a - nichtmodifiziertes, lyophilisiertes Priiparat .b - nach Reduktion der Sulfhydrylgruppen S-cyanoiithyliertes Praparat Uber den Peaks sind mit Buchstaben die elektrophoretischen Hauptkomponenten von Anode zu Kathode in Reihenfolge der VergriiBerung des MG angefiihrt. Abb. 8. Densitogramme von Elektrophoregrammen der Zein-Priiparate Z-2 nach der SDS-Elektroyhorese. Die Bezeichnungen entsprechen denen von Abb. 7.

Hydrophobe Wechselwirkungen und Disulfidbriitken im Zein

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Es ist bekannt, daB das Verhalten des Proteins in Losungen durch die Natur und Sequenz der eingebauten Aminosauren, ihre W echselwirkungen untereinander und mit dem sie umgebenden Losungsmittel bestimmt wird. Es wurde errechnet (RIGHETTI et al. 1977), daB etwa 45% der Aminosaurenreste im Zein hydrophob sind, und saure Reste (30 %) in Form von Asparagin und Glutamin vorliegen. Nur etwa 3% aller Aminosaurenreste sind basisch. Diese Aminosaurenzusammensetzung bestimmt die auBerst hydrophoben Eigenschaften der Zein-Moleklile. Wahrscheinlich unterstiitzt diese Sepzifik im ProzeB der Einlagerung des Zeins, die Formierung von stabilen EiweiBkorpern (CHRISTIANSON et al. 1969). Dabei sind die hydrophoben Wechselwirkungen im Gegensatz zu den Wasserstoffbriickcnbindungen nicht so exakt gerichtet und haben nichts mit einer echten stochiomctrischen Bindung gemeinsam. In Natriumdodecylsulfat-Losungen kommt es offensichtlich zu Wechselwirkungen zwischen den Kohlenstoffgruppen von SDS und den hydrophoben Zein-Molekiilen. Mit der Bildung von negativ geladenen Mizellen molekularer AusmaBe, die eine negative Gesamtladung besitzen, kommt es :mm Zerfall der EiweiBaggregate, die durch hydrophobe Wechselwirkungen assoziiert warcn. Das fiihrt, wi e die nachfolgende SDS-Elpho zeigte, zu eincr wesentlichen Verringerung des MG der ermittelten Komponenten im Vcrgleich zu den MG der mit Urea-Elpho gefundencn. Nichtmodifizierte, lyophilisierte Praparate Z-1 und Z-2 teilten sich in 9 Hauptkomponenten (Abb. 7 a und Sa) folgender MG: A= 12400, B = 15200, C = 16700, D = 20200, E = 24400, F = 46100, G = 52500, H = 59900 und I = 91200 D. Weiterhin wurde eine Reihe von Nebcnkomponenten mit groBeren MG zwischen Band I und Start festgestellt. Nichtmodifizierte Praparate Z-1 und Z-2 unterscheiden sich im Gehalt einzelner Komponenten. In beidcn hcrrschen die Komponenten D und E vor, Z-2 enthalt jedoch mchr die relativ niedermolekularen Komponenten A, B und C. Die Reduktion der Sulfhydrylgruppen mit anschlieBender Alkylierung fiihrt zum vollstandigen Verschwinden der Komponenten mit MG iiber 59900 D (Abb. 7b und Sb). Eine Reduktion bei sich stark untcrscheidenden Bedingungen (8 M Harnstoff und 80% Athanol) ergibt bei SDS-Elpho ein gleiches Bild. Es wurden keine Veranderungen im relativen Gehalt der Hauptkomponenten A-H festgestellt. Man muB annehmen, daB die Komponenten A-E einzelne Polypeptidketten darstellen. Was die hochmolekularen Komponenten F -H mit den MG 46100, 52500 und 59900 D betrifft, so ist ihr einkettiger Aufbau nicht genau bestimmt. Diese Komponenten bleiben unverandert beim Los en in SDS sowohl bei 40 oc im Verlaufe von 3 h, als auch 5 min bei 100 °C. Die Frage iiber ihrcn Aufbau bleibt offen. Einerseits sind in einigen Untersuchungen (MrsRA et al. 1976) Komponenten mit MG nahe den hier festgestellten W erten, gefunden worden. Den Ergebnissen GIANAZZA et al. (1976) zufolge, konnten allerdings keine solch hochmolekularen Komponenten im Zein festgestellt werden. SchlieBiich gibt cs Angaben, wonach Natriumdodecylsulfat nicht immer vollstandig die Eiwei13aggregate trennt (KATZMANN 1972; NAGLER und WARTANJAN 1973). Jedoch ist offensichtlich, daB die Komponenten mit einem MG iiber 59900 D aus den durch Disulfid-Polymerisierung in Aggregate vereinten Komponenten A -H

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W. A. REW.\ und CnR. BRUCKNER

bestehen. Diese Disulfid-Polymerisierung ist hauptsachlich cine Folge der angewendeten Extraktions- und Reinigungsmethoden. Die bei der Extraktion modifizierten Prii.parate enthalten geringe Mengen hochmolekularer Komponenten, die bei der Reduktion verschwinden. In nach der Extraktion modifizierten Zein-Prii.paraten ist der Gehalt dieser Komponenten etwa urn die Halfte geringer, als in nichtmodifizierten Iyophilisierten Praparaten. Die erhaltenen Ergebnisse erlauben folgende Schltisse:

1. Das gesamte Zein (Z-1 und Z-2) bestcht aus 2 wesentlichen Untereinheiten (nach ihrem Gehalt) mit MG von 20200 und 24400 D und 6 Untereinheiten mit MG von 12400, 15200, 16700, 46100, 52500, 59900 D. Jede Untereinheit bestcht wahrscheinlich aus einer Polypeptidkettc. Die relativ hohen MG dcr 3 letzteren Untcreinheiten lassen an deren einkcttigem Aufbau allerdings zweifeln. Offcnsichtlich ist fur die genaue Klii.rung des Aufbaus derselben ihre Isolation und die Untersuchung ihrer Eigenschaften notwendig. In den Z-2 sind im Vergleich mit Z-1 mehr relativ niedermolekulare Untereinheiten mit MG von 12 400, 15 200 und 16 700 D enthalten. Andererseits wurde gczeigt, daB, die bei normalcr und heiBcr Zeinextraktion erhaltenen Fraktionen, durch ii.hnliche Aminosaurenzusammensetzung charaktcrisiert sind. Offensichtlich besteht kein prinzipieller Unterschied zwischen den Prii.paraten Z-1 und Z-2 (BAUDET et al. 1966). 2. Die Zein-Untcreinheiten sind im nativen Zustand auf Grund von starken hydrophoben Wechselwirkungen und Wasserstoffbrtickenbindungen zu Komplexen aggregiert. Diese Wechselwirkungen und Bindungen liegen in der Primii.rstruktur des Proteins und teilweise in einer Disulfid-Polymerisierung begrtindet. Die bei der Urea-Elpho gefundenen Zein-Komponentcn mit MG von 40100 bis 275400 D, sind, im wesentlichen auf Grund von hydrophoben W echselwirkungen entstandenc, Aggregate. 3. Die Disulfid-Polymerisierung der Untereinheiten hat in vivo eine begrenzte Bedeutung. Unter den Komponenten, die bei der Urea-Elpho gefunden wurden, sind nur die mit MG von 192000, 238300 und 275400 D Aggregate, welche aus niedermolekularen Komponenten durch intermolekulare Disulfidbrticken entstanden. Die Disulfid-Polymerisation verlii.uft Ieicht unter den Bedingungen der Extraktion und Reinigung der Prii.parate. SchlieBiich hat letztere auch EinfluB auf das Verhalten des Zeins in Athanolliisungen bei der Gel-Filtration auf Sephacryl S-200 und bei der Extraktion im Athanolgradienten.

Literatur BA UDET, J., )IossE, J., LAXDRY, J., et ~IorREu·x, T.: Etude sur les proteins du mais. 1. Composition en arides amines des fractions azotees du grain. Ann. Physiol. Veg. 8, 321 (1966). BLAKESLEY, R. W., and BoEZI, J. A.: A new staining technique for proteins in polyacrylamide gels using Coomassie Brilliant Blue G 250. Anal. Biochem. 82, 580-582 (1977).

Hydrophobe Wechselwirkungen und Disulfidbriicken im Zein

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Eingegangen am 12. Dezember 1978, reridierte Fassung am 24. Marz 1979. Adresse der Antoren: Wn.TSCHESLAW ALEXANDROWITSCH REWA und CHRISTIAN BRUCKNER, Laboratorinm fiir EiweiBehemie, Kischinjower Staatliche Leninuniversitat, ul. Sadowaja 60, 277 003 Kisehinjow, UdSSR.