Die rolle der Carotinoide und des Gallenfarbstoffs bei der Farbmodifikation der Puppen von Pieris brassicae

J. InsectPA:ysiol.,1974, Vol. 20, pp. 89

to 103. Pergamon Press. Printed in Great Britain

DIE ROLLE DER CAROTINOIDE UND DES GALLENFARBSTOFFS BE1 DER FARBMODIFIKATION DER PUPPEN VON PIERIS BRASSICAE* HARTMUT II. Zoologisches

KAYSERt

Institut der UniversitSit Giessen, Germany

(Received 9 January

1973 ; revised 4June 1973)

Abstract-The carotenoids and the bile pigment in larvae and pupae of Pieris brmsicae were analysed. Their r81e in the morphological colour adaptation of the pupae was studied by quantitative measurements. The carotenoids are p-carotene, lutein mono-ester, free lutein, and zeaxanthin. Metabolized carotenoids were not found. There are no differences between pupae showing different grades of melanization in the quality of the carotenoids, or in the total amounts, or in the relative portions of each carotenoid fraction. However, the carotenoid content of the integument alone is twofold in the light pupae as compared to dark ones. The integumental carotenoids are deposited mainly in the epidermis. /?-Carotene, lutein, and zeaxanthin are selectively absorbed by the larvae from the diet. P-Carotene and lutein ester are localized mainly in the fat body, whereas lutein is predominant in the haemolymph and in the integument. The pupal bile pigment is protobiliverdin-IXy (pterobilin), which is also known to be the larval pigment. The bile pigment is synthesized mainly during the last larval instar up to the pharate pupal stage. In the pupae the bile pigment content is related to the melanization: pupae exposed to the same light conditions contain less bile pigment the more melanized they are (nlsgative correlation). On the whole there is a strong enhancement by blue light of the bile pigment content besides the known stimulation of melanization (p’ositive correlation). But within such a sample the negative correlation between the amounts of bile pigment and melanin is maintained.

EINLEITUNG DIE M~RPHOLOGISCHE

Farbanpassung der Insekten ist ein Modellfall zur Untersuchung der Wirkungsweise 5usserer Faktoren auf die Entwicklung. Die Reaktion beruht auf quantitativen Vergnderungen chemisch meist gut fassbarer Farbstoffe. Die systematische Untersuchung dieser Umweltwirkung auf die FPrbung wurde von Biickmann und Mitarbeitern vor allem an der Stabheuschrecke Carausius * D26. Die Arbeit wurde angeregt und betreut von Professor Dr. D. Biickmann. Sie wurde lurch Mittel unterstiitzt, welche die Deutsche Forschungsgemeinschaft ihm zur Verftigung stellte. + Jetzige Anschrift: Abteilung fiir Biologie der UniversitZit Ulm, D-7900 Ulm/Donau, Oberer Eselsberg, Germany. 89

90

HARTMUT KAYSER

~UYOSUS(B~~CKMANN und DUSTMANN, 1962; DUSTMANN, 1964; WILLIG, 1969; BERTHOLD, 1973) und an der Puppenfarbung von Pieris brassicae (WIESEN, 1962; OLTMER, 1968; ANGERSBACH, 1970; ANGERSBACH und KAYER, 1971; B~~CKMANN, 1971) in Angriff genommen. Beim Grossen Kohlweissling, Pieris brassicae, wird die Puppenfarbung wahrend einer sensiblen Phase kurze Zeit vor der Verpuppung durch das Licht determiniert. Bisher stand die Steuerung der Melanisierung als des aufilligsten Farbungselementes im Vordergrund der Untersuchungen. Es zeigte sich, dass die optischen Reize iiber humorale Faktoren wirken, die sich vom Vorderkiirper her ausbreiten. Die Melanisierung wurde dabei auf Grund der Auspragung des Fleckenmusters bestimmt. In der vorliegenden Arbeit sollen die Carotinoide und ein Gallenfarbstoff, die ebenfalls an der Puppenfarbung beteiligt sind, durch chemische Methoden erfasst werden. NAGEL (1970) beschreibt diese Farbstoffe als /3-Carotin, freies und verestertes Lutein und als Pterobilin, das von R~~DIGERet al. (1968) aus den Raupen isoliert und als Biliverdin-IXy aufgeklart wurde. Diese qualitativen Quantitative Untersuchungen sollen Angaben werden zunichst nachgepriift. sodann zeigen, wie sich die verschiedenen Farbmodifikationen, die unter verschiedenen Umweltbedingungen entstehen. in ihrem PigmentstofIwechsel unterscheiden. MATERIAL

UND

METHODEN

Die Haltung de-r Tiere Der Tierstamm ist z.T. englischen (David), und z.T. franzosischen Ursprungs (Hurpin). Die Raupen entwickelten sich in Lichtthermostaten bei 20°C und 60-6.5% relativer Luftfeuchtigkeit. Zur Diapauseverhinderung wurde ein 16 Std.Tag geboten (vgl. B~~NNING und JOERRJZNS, 1960, 1962). Verfiittert wurden Blatter von Blumenkohl und Kohlrabi (Brassica oleracea). Die carotinoidfreie Aufzucht der Raupen wurde nach DAVID und GARDINER (1966) durchgefiihrt. Die Versuchsbedingungen und die Versuchsauswertung Als Untergrund wurde gelbes oder schwarzes Samtpapier bzw. weisses Filtrierpapier verwendet und jeweils mit Weisslicht beleuchtet (Osram, Universal White 40 W). Transparente Farblacke von Sudanorange und Sudan III wurden nach ANGERSBACH (1970) hergestellt. Sie wirken als Kantenfilter, die im Fall von Sudanorange fur Wellenlangen > 550 nm, bei Sudan III fiir solche > 560 nm durchlassig sind. Sudan III Iasst ausserdem noch Licht urn 420 nm zu cu. 20% durch. Bei Versuchen mit Blau/UV-Licht wurde eine UV-Rohre (Philips, TL 40 W) verwendet. Die Raupen wurden den Versuchsbedingungen von der Wanderphase ab bis 3-4 Stunden nach dem Spinnen des Giirtelfadens ausgesetzt. Die sensible Phase liegt zwischen dem Ende der Wanderphase und dem Spinnen (OLTMER, 1968). Die Auswertung der Versuche erfolgte drei Tage nach der Verpuppung. Die Melanisierung der Puppen wurde durch eine Klassenein-

DIE

CAROTINOIDE

UND

DER

GALLENFARBSTOFF

VON

PIERIS BRASSICAE

91

teilung des Fleckenmusters nach ANGER~BACH(1970) bestimmt, wobei die Klasse I die am wenigsten melanisierten (‘hellen’), die Klasse 5 die maximal melanisierten (‘dunklen’) Puppen umfasst (vgl. B~~CKMANN, 1971). Das Material wurde abgewogen und bis zur Extraktion der Farbstoffe tiefgefroren (-ZO’C).

Die Untersuchung de-r Carotinoide Extr#uktion. Die Puppen wurden einschliesslich ihres carotinoidfreien Darminhalts mit einem ‘Ultra-Turrax’ in kaltem Aceton homogenisiert. Die Carotinoide wurden weiter mit Aceton und dann mit Methanol extrahiert und in Petrolather (40-60°C) iibergefiihrt. Chromatographie. Die Carotinoide wurden durch Diinnschichtchromatographie (DC) isoliert. Die Verteilungs-DC erfolgte auf nicht aktiviertem KieselgelG (Merck) mit einer Mischung aus Benzin (lOO-14O”C), Propanol-2 und Wasser (130 : 10 : 0,25; vol.), die Adsorptions-DC wurde nach HAGER und MEYERBERTEN~ATH (1966) ausgefiihrt. Chemisehe Reaktionen. Die Verseifung der in wenig Aceton gel&ten Carotinoide wurde mit 3%igem KOH-Methanol (w/w) cu. 12 Std. durchgefiihrt. Die Veratherung allylstandiger Hydroxyle erfolgte in Athanol mit 0,l m Bortrifluorid (als Ath.erkomplex). Wie Vorversuche mit Lutein zeigten, werden unter diesen Bedingungen nur allylstandige OH-Gruppen angegriffen (vgl. GROB und PFLUGSHAUPT, 1962). Die Acetylierung von Hydroxylgruppen wurde mit Acetanhydrid in Pyridin (1 : 1, vol.) durchgefuhrt. Alle Reaktionen wurden durch Probenentnahmen und DC verfolgt. Quantitative Bestimmung. Die einzelnen Franktionen wurden vom Kieselgel mit den1 jeweiligen Messlosungsmittel eluiert und photometriert. Die Spektren wurden in Quarzkiivetten mit den Zeiss-Spektralphotometern PMQ II oder DMR 21 aufgenommen. Die Berechnung der Pigmentmengen erfolgte mit den spezifischen Extinktionskoeffizienten fur p-Carotin in Chloroform (&, = 463 nm’) E :& = 2200 und fur Lutein und Luteinester in Athanol (h,, = 446 nm’) E ;i$, = 2540 (HAGER und MEYER-BERTENRATH (1966). Die Untersuchung des Gallenfarbstoffs Extraktion. Das in vivo vorliegende Bilinproteid (WIELAND und TARTTER, 1940; E%DIGER et al., 1968) wird im Gegensatz zu den Carotinoidproteiden durch Die Carotinoide kiinnen deshalb zuerst mit Aceton Aceton nicht gespalten. Das Bilin wurde dann mit 5%igem HCl-Methanol (5 ml extrahiert werden. 25%iger HCl+ 95 ml Methanol) extrahiert und i_iber Nacht bei 20°C verestert. Der Dimethylester wurde mit Chloroform ausgeschtittelt. Chromatographie. Der Bilin-Dimethylester wurde auf nicht aktiviertem Kieselgel-G mit einer Mischung von Chloroform, Methanol und Eisessig (88 : 2 : 1; vol.) durch DC gereinigt und mit Chloroform unter Zusatz einiger Tropfen Methanol eluiert.

HARTMUT KAYSER

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Strukturanalyse. Die Isomerie des Bilins der Puppen wurde durch den von beschriebenen Chromslureund Chromatabbau auf der Diinnschichtplatte untersucht. Synthetische Biliverdin-Isomere wurden nach LEVIN (1966) durch gekoppelte Oxidation von Protohgmin mit Ascorbat hergestellt und nach O’CARRA und COLLERAN (1970) durch DC isoliert. Quantitative Messung. Wie Vorversuche zeigten, war eine DC-Reinigung des Bilins zur Mengenbestimmung nicht notwendig. Deshalb wurde die Chloroform16sung des Extraktes im Rotationsverdampfer zur Trockene gebracht und mit Die einer definierten Menge 5%igem HCl-Methanol wieder aufgenommen. LGsung wurde iiber Nacht zur Ausfillung von Verunreinigungen bei +4”C aufbewahrt und dann bei X,,, = 690-695 nm gemessen. Die Farbstoffmenge (C) wird in relativen Einheiten angegeben: C = lOOOfache Extinktion der gesamten Bilinmenge in 5,0 ml HCl-Methanol. R~~DIGER(1969)

ERGEBNISSE

Die Carotinoide (a) Die IdentiJizierung Die hellen und dunklen Puppen von P. brassicae wurden getrennt auf Unterschiede in ihrem Carotinoidmuster hin untersucht. Es wurden jedoch keine Beide Extrakte spalten bei der Verteilungsqualitativen Unterschiede gefunden. DC in drei identische Fraktionen auf, die vier Carotinoiden zugeordnet werden konnten: /3-Carotin, Luteinmonoester, freies Lutein und Zeaxanthin. Die spektroskopischen Daten der Hauptcarotinoide @Carotin und Lutein sind in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE l-ABSORPTIONSMAXIMA (nm) UND y0 III/II-WERTE DER CAROTINOIDE AUS P. bYUStiCU&UPPEN; DARUNTERJEWEILS DIE VERGLEICHSWERTENACH HAGER und BERTENRATH(1967a, b) Absorptionsmaxima Lkungsmittel n-Hexan

und

Fraktion verhglt

(%

/3-Carotin N 425,450,477 N 425,450,477

MEYER-

III/II-Werte) Lutein

(32) (27)

420,443,472 420,445,474

(65) (60)

Benz01

-

,464,491 (16) ,464,493

433,457,487 N 432,457,486

(64)

csz

-

,483,509 (11) ,482,509

- 450,475,506 N 450,475,506

(63)

1 (h R, = 83), /3-Carotin: Dieses orangegelbe sich such bei Adsorptions-DC einheitlich.

Pigment ist unverseifbar In beiden Systemen ist

DIE

CAROTINOIDE

UND

DER

GALLENFARBSTOFF

VON

PIERIS

BRASSlCAE

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es nicht von authentischem p-Carotin (Merck) zu unterscheiden. Das Absorptionsspektrum zeigt in Hexan zwei Maxima und einen relativ niedrigen o/III/IIWert. Alle untersuchten Eigenschaften dieses Pigments decken sich mit denen von @Carotin. zeigt diese Fraktion 2 (h R, = 34), Luteinmonoester: Nach der Verseifung gelbe Fraktion einen niedrigeren R,-Wert; es verhslt sich jetzt vSllig gleich wie Fraktion 3a. Das native Pigment l&St sich acetylieren, wobei keine Zwischenprodukte auftreten. Es liegt also eine freie OH-Gruppe vor. Das Acetat l&St sich zu freiern Lutein verseifen. Fraktion 2 enthglt also einen Luteinmonoester. Fraktion 3 (h R, = 15), 3a, Lutein: Dieser unverseifbare, gelbe Farbstoff ist Es zeigt sowohl bei Verteilung als such das polarste Carotinoid des Extraktes. bei Adsrorption die gleichen chromatographischen Eigenschaften wie aus Kohl isolierteo Lutein. Die Absorptionskurve ist in Hexan dreigipfelig mit einem relativ hohen o/oIII/II-Wert. Das Carotinoid bildet einen Monotither, wodurch eine allylstgndige Hydroxylgruppe angezeigt wird, und ein Diacetat. Damit ist die Iderttitgt mit Lutein gesichert. Fraktion 3b, Zeaxanthin: Dieses Carotinoid kommt nur in Spuren vor. Als Isomeres des Luteins lnuft es im Verteilungschromatogramm mit diesem zusammen in einer Zone. Durch Adsorptions-DC l&St es sich als rijtliche Fraktion mit niedrigerem Rf-Wert vom gelben Lutein abtrennen. Farbe und chromatographisches Verhalten entsprechen den Eigenschaften von Zeaxanthin aus Kohl, ebenso die Tatsache, dass das Pigment nicht verstherbar ist, also keine allylstgndigen OH-Gruppen besitzt. Wegen der sehr geringen Menge konnte kein reines Spektrum aufgenommen werden. (b) Qurmtitative Untersuchungen der Carotinoide Der CurotinoidgehaEt heller und dunkler Puppen. Urn Puppen mijglichst vieler Melanisierungsgrade zu bekommen, wurden die Raupen wChrend ihrer sensiblen Phase auf weissem Untergrund in Weisslicht gehalten (ANGERSBACH, 1970). Die Bestimmung der Carotinoide aus Puppen der Melanisierungsklassen 2, 3, 4 und 5 erbrachte keine signifikanten Unterschiede in der prozentualen Zusammensetzung der Carotinoide oder im Gesamtcarotinoidgehalt. Da die Mittelwerte n.ahezu iibereinstimmen, wurden die Einzelmessungen aller untersuchten Melanisierungsklassen gemittelt (Tabelle 2). Es zeigt sich, dass p-Carotin und Gesamt-Lutein in etwa gleicher Menge vorkommen. Die Obereinstimmungen im Carotinoidgehalt erklgren sich aus der Tatsache, dass die sensible Phase, in der Umweltfaktoren iiber die Resorption der Nahrungscarotinoide den Carotinoidgehalt steuern kannten, erst nach dem Ende der Fressphase beginnt. Ein spsterer, fiir helle und dunkle Puppen unterschiedlicher, Abbau der Carotinoide tritt offenbar such nicht auf. Der Carotinoidgehalt des Integuments von hellen und dunklen Puppen. Helle und dunkle Puppen wurden nach OLTMER (1968) auf gelbem bzw. schwarzem Untergrund bei jeweiliger Beleuchtung mit Weisslicht erhalten. Ausserdem wurden such helle Puppen vom weissen Untergrund untersucht.

HARTMUT KAYSER

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Nach Tabelle 3 enthAt das Integument einer hellen Puppe rund doppelt so vie1 Carotinoid wie das einer dunklen Puppe (t-Test: P< 0,0003), das sind 10% bzw. 5% des Gesamtcarotinoids. Die Differenz betrPgt 1,l pg pro Integument. Die prozentuale Zusammensetzung der Integumentcarotinoide ist jedoch in allen Versuchsgruppen gleich. Ein Vergleich der zwei Gruppen heller Puppen, die in Bezug auf Melanisierung und Carotinoidgehalt iibereinstimmen, 15sst vermuten, dass beide PigmentierungsvorgSnge unabhgngig von der Reizsituation miteinander korreliert sind. TABELLE2-CAROTINOIDGEHALTVON P. brassicae-PUPPEN(MITTELWERTE 106 PUPPEN) Gesamt-Carotinoid pgg/g Frischgewicht 50,s * 1,7

PglPuppe

p-Carotin (%)

GesamtLutein (%)

20,l * 0,s

51,s +0,7

48,s + 0,7

rt; s/&z; n = 15 ;

Verestert vom Gesamt-Lutein (%) 21,6 + 1,2

TABELLE 3-ABSOLUTER (pg/IwEGumm) UND PROZENTUALER CAROTINOIDGEHALT DER INTRGIJMENTE VON HELLEN(GELBER bzw. WEISSER UNTERGRUND) UNDDUNKLEN (SCHWARZER UNTERGRUND) Pie&-PUPPEN (MITTELWERTE + STANDARDABWEICHUNGEN s)

n

GesamtCarotinoid &g/Integument)

&Carotin (%)

Hell (2,4), gelber Untergrund

4

2,30 + 0,08

18,s + 6,2

81,s + 6,2

2,9 _+0,4

Hell (2,5), weisser Untergrund

2

2,25 _+0,02

23,3 + 1,3

76,7 _+1,3

2,s + 0,3

Dunkel (4,6), schwarzer Untergrund

3

1,16 + 0,22

20,8 + 5,6

79,2 + 8,s

2,7+1,5

Puppenfarbe (M.M.) Untergrund

n, Zahl der Aufarbeitungen (jew. 10 Integumente); Zugehiirigkeit zu den Melanisierungsklassen.

GesamtVerestert vom Lutein Gesamt-Lutein (%) (%)

M.M.,

Mittelwert der

Bestimmung Der Carotinoidgehalt won Cuticula und Exuvie. Zur quantitativen der Cuticula-Carotinoide wurden Cuticeln von Puppen der Melanisierungsklasse 3 prgpariert. Vergleichend dazu wurden frische Puppen-Exuvien untersucht. Der absolute Carotinoidgehalt von Cuticula und Exuvie ist gleich gross (Tabelle 4). Dies bedeutet, dass die Carotinoide-ebenso wie die Melaninflecken -auf die Exocuticula beschrgnkt sind, die ja im wesentlichen die spltere Exuvie

DIE CAROTINOIDE UND DER GALLENFARBSTOFFVON PIERIS

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BRASSICAE

darstellt. Luteinester ist nicht nachweisbar. Bezogen auf den Gesamtcarotinoidgehalt einer Puppe befindet sich ca. 1% in der Cuticula. Wegen des sehr geringen Carotinoidgehalts wurden die Cuticeln heller und dunkler Puppen nicht getrennt auf etwai.ge Unterschiede untersucht.

TABELLE 4-ABSOLUTER &g/CuTIcuLA bzw. EXUVIE) UND PROZENTUALERCAROTINOIDGEHALT DER CUTICELN UND EXUVIEN VON P. brassicae-PUPPEN /3-Carotin

Cuticula Exuvie

Anzahl

Gesamt-Carotinoid [I.Lg/Cuticula (Exuvie)]

clg

20 200

0,26 0,23

0,03 0,03

Aus der Differenz der Carotinoidmengen der Cuticula ergibt sich der Carotinoidgehalt Puppen und zu 0,9 pg bei dunklen Puppen.

% 11,5 13,3

Lutein P8

%

0,23 0,20

88,s 86,7

im gesamten Integument und in der Epidermis zu 2,0 pg bei hellen

Die Carotinoide van Fettkiirper, Hiimolymphe, Eiern und Darmwand. Die gelbe bzw. gelbgriine F&bung der Hamolymphe und des dorsalen Fettkorpers von Raupen und Puppen ist an die Aufnahme carotinoidhaltiger Nahrung gebunden (vgl. VAN DER GEEST, 1968). Der ventrale Fettklirper bleibt stets Weiss (vgl. CHIPPENDALE und KILBY, 1969). Bei diesen Carotinoiden handelt es sich urn p-Carotin, Lutein und Luteinester in unterschiedlichen, organspezifischen Mengenverhaltnissen, wie Tabelle 5 zeigt. Das gelbe Chromoproteid der Hamolymphe zeigt im sichtbaren Bereich Absorptionsmaxima bei 428, 451 und 483 run. Es wurde mit Ammoniumsulfat gefallt und das Pigment mit Aceton extrahiert. Die Carotinoide der frisch abgelegten Eier und der Darmwand der Raupen sind ebenfalls in Tabelle 3 aufgefiihrt.

Der Gallenfarbstoff

(a) Die Untersuchung des Puppenbilins Es erschien notwendig, das Bilin der Puppen von P. brassicae mit denselben Methoden zu untersuchen, die R~~DIGER et al. (1968) bei der Aufklairung des Raupenbilins angewandt hatten, da NAGEL’S (1970) Beschreibung als Pterobilin lediglich auf einem chromatographischen Vergleich mit dem Raupenpigment beruht. Wie die Untersuchungen ergaben, ist das Absorptionsspektrum des aus den Puppen isolierten Bilins (Tabelle 6) demjenigen des Raupenbilins sehr ahnlich (vgl. R~~DIGER et al., 1968). Ferner verhalt sich das Puppenbilin beim chromatographischen Vergleich mit den synthetischen vier Isomeren des Protobiliverdins (als Dimethylester) mit beiden Laufmitteln und such bei Mehrfachentwicklung vollkommen gleich wie das y-Isomere. Beide Biline liefern such beim

HARTMUTKAYSER

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TABELLES-RELATIVEMENGENDEREINZELNEN CAROTINOIDE IN VERSCHIEDENEN ‘FRAKTIONEN’VONP. bvassicae (MITTELWERTE AUSJEWEILS ZWEIMESSUNGEN)

8-C arotin (%)

GesamtLutein (%)

Verestert vom Gesamt-Lutein (%)

Fettkijrper Raupe (spPt. fi_infteStadium)

78,4

21,6

605

Hlmolymphe Fuppe Raupe (spat. ftinfte Stadium)

992 13,2

90,8 86,8

0,9 Spur

Eier

46,9

53,l

576

Darmwand Raupe (ftinfte Stadium)

56,5

43,5

Spur

TABELL~6-~BSORPTIONSMA~IMA (nm) UNDRELATIVE H~HEDERMAXIMA(EJE,) VON PTEROBILIN AUSP. brassicae-PUPPEN LGsungsmittel

Maxima

JW,

Chloroform neutral

285,331,375,640-645

3,29

Chloroform-HCI

284,332,372,67.5

0,87

5% HCl-Methanol

281, -

2,14

,360,697

El, Hohe des Maximums im langwelligen UV-fette Maximums im sichtbaren Bereich-italische Zahlen.

Zahlen; E,, Hijhe des

Chromatabbau ausschliesslich 3-Methyl-4-vinyl-Pyrroldialdehyd-ein weiterer Beweis fiir die y-Struktur. Beim Chromsaureabbau entstehen Methyl-vinylMaleinimid und Hamatinsiureimidmethylester. Es wurde kein Methyl-athylMaleinimid gefunden. Ein weiterer Beweis fiir die Existenz der Vinylgruppen liefern das Auftreten von Methyl-( 1-methoxy-athyl)-Maleinimid beim Chromsaureabbau und des entsprechenden Pyrroldialdehyd beim Chromatabbau nach dem Kochen des Bilins mit HCl-Methanol. Damit ist das Puppenbilin eindeutig als Protobiliverdin-IXy charakterisiert und somit mit dem Raupenbilin identisch. (b) Der Bilingehalt

wiihrend der Larvalentwicklung

Die Eier von P. brassicae sind rein gelb und enthalten kein Bilin. Die gesamte Bilinmenge wird also erst im Verlauf der Larvalentwicklung gebildet. Diese

DIE

CAROTINOIDE

UND

DER

GALLENFARBSTOFF

VON

PIERIS

BRASSICAE

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Pigmentgenese wurde von der dritten Raupenhgutung ab bis zum Stadium der ‘pharate pupa’ (vgl. HINTON, 1968) an Tieren untersucht, die mit halbsynthetischem Futter ernHhrt worden waren. Nach der vierten HHutung wurden Gruppen phasengleicher Raupen angelegt, deren Altersabstinde von dieser HPutung maximal 12 Stunden betrugen. Wie Abb. 1 zeigt, nimmt der Bilingehalt der Raupen bis zum Ende der Fressphase am fiinften Tag nach der vierten HPutung mit dem Gewicht zu. Am dritten und am sechsten Tag des letzten Larvenstadiums steigt die Bilinsynthese jeweils sprunghaft, was sich vor allem in einer entsprechenden Zunahme der Bilinkonzentration im Tier zeigt. Mit dem Spinnen des Giirtelfadens (6,5 Tage nach der vierten Hgutung) erreicht sowohl die absolute Menge als such die Konzentration des Bilins in der Larve ein Maximulm. A

A

1 I

3.H

I

4.H

2

3

4

5 tt w

6

7

I

GF

8

t

P

I

Tage d5Stadiums Phasen

d. Entwicklung

ABB. 1. Der Bilingehalt der Raupen von P. brassicae im Verlauf der Entwicklung. Emiihrung mit halbsynthetischer D&t bei 20°C im Langtag (LD 16 : 8). Die vertikalen Striche geben die Standartabweichung s an. H, w&utung; W, Wanderphase; GF, Spinnen des Giirtelfadens; P, Verpuppung.

(c) Der Bilingehalt der Puppen und seine Beziehung xur Melanisierung

Zue:rst wurde der Bilingehalt von unterschiedlich stark melanisierten Puppen untersucht, die den gleichen Versuchsbedingungen ausgesetzt waren. Wie oben erwghnt (vgl. S. 93), streuen die Melanisierungsgrade der Puppen besonders in Weisslicht auf weissem Untergrund und such in Dunkelheit, wenn sich die Raupen auf glatten FlHchen verpuppen (vgl. ANGERSBACH, 1970). In beiden

HARTMUT KAYSER

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Versuchen entstehen vorwiegend mittelstark melanisierte Puppen. Im Blau/UVLicht dagegen erreicht die Melanisierung ihren Maximalwert (WIESEN, 1962). Bei jedem dieser Versuche wurden die Puppen nach Melanisierungsklassen getrennt und ihr Bilingehalt bestimmt.

200 1 c

180 ? .% 180 2 i5 140 I

180

.% f 160 B f 1405

5

120

120-

i

E .; 100-

E loo2

s rn 80z 2 0 $ 5

: CJ 2 2 $I .c = m

604020-

80604020-

4 Melanisierungsklassen

Abb. 2.

1

3 2 4 Melanisierungsklassen

5

Abb. 3.

2. Der Bilingehalt der Puppen von P. brassicue aus verschiedenen Melanisierungsklassen nach Einwirkung von Weisslicht (weisse Slulen) bzw. Blau/UVLicht (schwarze Slulen) wlhrend der sensiblen Phase.

ABB.

AsB. 3. Der Bilingehalt der Puppen von P. brussicae aus verschiedenen Melanisierungsklassen nach Einwirkung von Dunkelheit wlhrend der sensiblen Phase. Die negative Korrelation zwischen Melanisierung und Bilingehalt ist mit P
Wie Abb. 2 und 3 zeigen, besteht innerhalb aller Versuchsgruppen eine negative Korrelation zwischen der Starke der Melanisierung und dem Bilingehalt: je dunkler eine Puppe ist, desto weniger Bilin enthalt sie. Die berechneten Regressionsgeraden weisen signifikante negative Koeffizienten auf, z.B. 6, = - 8,8 f 1,9 (PC 0,005) fur die Puppen aus Dunkelheit. Ein Vergleich der Bilingehalte von Puppen gleicher Melanisierungsklassen aus den verschiedenen Versuchen zeigt, dass zwischen Puppen aus Weisslicht und aus Dunkelheit keine Unterschiede bestehen, dass jedoch die Tiere aus Blau/UV-Licht wesentlich mehr Bilin enthalten als die Vergleichstiere. Kurzwelliges Licht fi.ihrt also zu einer Erhijhung der Bilinmenge, aber nicht zu einer Anderung der negativen Relation zur Melanisierung.

DIE CAROTINOIDEUND DER GALLENFARBSTOFF VON PZERZS BRASSZCAE

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Dieser Steigerungseffekt gilt nicht nur fiir die einzelnen Klassen, sondern such fiir #dieGesamtheit der Puppen aus Blaulicht-das ja such eine starke Melanisierung der Puppen bewirkt-wie besonders folgender Versuch zeigt. Durclh die Verwendung transparenter Farblacke wurde ein Untergrund definierter Farbqualitgt geschaffen, wobei die Raupen von ventral mit Farblicht und von dorsal mit Weisslicht bestrahlt wurden. Beide Lacke, Sudan III und Sudanorange, besitzen etwa die gleiche Rottransmission (A> 550-560 nm), Sudan III ausserdem ca. 20% Blautransmission bei 420 nm (vgl. S. 90). Wie erwartet, sind die rot + blau bestrahlten Tiere etwas stgrker melanisiert als die nur rot beleuchteten (Tabelle 7), sie enthalten jedoch wesentlich mehr Bilin als letztere (PC 0,001). Die negative Korrelation zwischen Bilingehalt und Melanisierung, die innerhalb einer jeden Versuchsgruppe besteht, wird also fiir die Gesamtheit der Puppen durch Blaulicht offenbar in eine positive Beziehung ungewandelt. TABELLE 7-DER PTEROBILINGEHALT VONP. brassicae-PuPPm BEI VERPUPPUNGAUF FARBICEM UNTERGRUND (TRANSPARRNTEFARBLACKE) ; BELEUCHTUNGVON BEIDEN ISEITEN MIT WEISSLICHT (MITTELWERTE+ STANDARTABWEICHUNGEN s)

Farblacke Transmission

Bilingehalt/g Gewicht (rel. Einheiten)

M.M.

n

2,1

5

264,3 + 58

198

3

209,8 + 12,8

Sudan II:[ > 560 nm (cu. 90%) + 420 nm (cu. 20%) Sudanorange > 550 nm (cu. 90%) n, Zahl der Aufarbeitungen; Melanisierungsklassen.

M.M.,

Mittelwert

der Zugeharigkeit

zu den

DISKUSSION Die Rolli? der Carotinoide und ihres Metabolismus

Die Befunde von NAGEL (1970) werden durch diese Untersuchung bestgtigt und durlch den Nachweis von Zeaxanthin und die Charakterisierung des Luteinesters als Monoester erweitert. Die Spurencarotinoide, die FELTWELLund VALADON (1972) neuerdings in P. brassicae gefunden haben, konnten nicht nachgewiesen werden. Ein Vergleich der Carotinoidmuster von Insekten mit dem ihrer griinen Nahrungspflanzen macht die Selektivitgt der Carotinoidresorption deutlich (WILLIG, 1969; NAGEL, 1970). Meistens werden nur /3-Carotin und Lutein aufgenomm.en. Eine tierische de novo-Synthese von Carotinoiden ist nicht bekannt (vgl. WE:EDON,1971). Die resorbierten Carotinoide werden bei P. brassicae nicht zu anderen Carotinoiden metabolisiert. Lediglich ein Teil des Luteins wird partiell mit FettsHuren verestert (Kayser, in Vorbereitung) und-wie such bei

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den Puppen von Pap& xuthus (HARASHIMA et al., 1972)~speziell im Fettkiirper deponiert, wahrend sich das freie Lutein in der Hamolymphe als Proteid befindet. Der im Integument von hellen und dunklen Pieris-Puppen gefundene Unterschied im Carotinoidgehalt kommt wahrscheinlich durch eine unterschiedliche Verteilung dieser Pigmente im Karper zustande. Da die Gelbfarbung des Larvalinteguments nicht durch Carotinoide, sondern durch Sepiapterin (HARMSEN, 1966) zustandekommt, muss man bei hellen Puppen eine verstarkte CarotinoideinDer Unterschied von 1 pg-das Integument lagerung in die Epidermis vermuten. enthalt sowieso nur 5 zu 10% des Gesamtcarotinoids-kann jedoch wegen der Pigmentierung von Cuticula und Fettkorper nach aussen hin als Farbungsunterschied nicht wirksam werden. Bei Pieris rapae crucivora fanden OHTAKI und OHNISHI (1967) ebenfalls eine Differenz der Carotinoidmengen in den Cuticeln griiner und brauner Puppen und such keine metabolisierten Carotinoide. Bei einigen Arthropoden, die in unterschiedlichen Farbvarianten auftreten kijnnen, wurde ein Stoffwechsel der resorbierten Carotinoide gefunden, der zudem mit der Ausbildung des einen Farbtyps gekoppelt ist. So kommt der braune und orange Puppentyp bei P. xuthus durch eine offensichtlich hormonal gesteuerte Oxidation von /3-Carotin und Lutein zu roten Ketocarotinoiden zustande (OHNISHI, 1959; HARASHIMA et al., 1972). Bei den grfinen Exemplaren der Phasmide Carausius morosus (WILLIG, 1969) und den roten Farbtypen der marinen Isopoden Idothea montereyensis und I. granulosa (LEE, 1966a, b) wird nur /3-Carotin in jeweils verschiedene Ketocarotinoide umgewandelt. Diese Beispiele unterstiitzen die Vermutung, dass die Carotinoide nur in solchen Fallen von Farbmodifikationen von Bedeutung sind, bei denen such ein Stoffwechsel dieser Pigmente stattfindet, der zu einer Anderung ihres chromophoren Systems fiihrt. Ein solcher Mechanismus win-de such eine gute Moglichkeit zur Regulation bieten. Die Beteiligung des Gallenfarbstojj? an der Fiirbungsmodijikation Der chemische Abbau des Puppenbilins von P. brassicae hat dessen Identitat mit Protobiliverdin-IXy bewiesen, wie es bereits R~~DIGER et al. (1968) fur das Dieses Biliverdin-Isomere wurde bisher nur Bilin der Larven gezeigt haben. bei Lepidopteren gefunden (R~~DIGER, 1970). Seine Synthese erfolgt bei Pieris hauptsachlich wlhrend des letzten Larvenstadiums mit rapiden Anstiegen der Bilinkonzentration, was den Befunden von BARBIER et al. (1970) widerspricht. Inwieweit die Bilinsynthese von der Art der Ernahrung abhangt, muss noch untersucht werden. Die Untersuchung der Farbvarianten der Pi&s-Puppen haben eine klare Beziehung der Bilinmenge zur Melanisierung und damit die Bedeutung dieses Pigments fur die Modifikation der Far-bung aufgezeigt. Innerhalb einer Gruppe von Puppen, die gleichen Lichtbedingungen ausgesetzt waren, enthalten schwach melanisierte Exemplare stets mehr Bilin als stark melanisierte. Die absoluten Bilinmengen sind jedoch von den verschiedenen Lichtbedingungen abhangig. So bewirkt die Wahrnehmung kurzwelligen Lichtes wahrend der sensiblen

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Phase der Vorpuppen eine auffallende Erhijhung der Bilinmenge in den Puppen, wobei die Relation zur Melanisierung innerhalb der Gruppe qualitativ erhalten bleibt. Ziwischen den einzelnen Gruppen kann diese Beziehung sogar ins Gegenteil gekehrt werden, wie die erhijhte Bilinmenge bei gleichzeitiger Fijrderung der Melanisierung im Versuch mit Sudan III gezeigt hat. Die %u%ckfiihrung dieses Effekts auf die Blau-Transmission des Sudan IIILackes, #die Sudanorange fehlt, wird durch die Wirkungsspektren der Melanisierung -und der Bilinmenge bestgtigt (ANGERSBACH und KAYSER, 1971). Sie zeigen Maxima des Bilingehalts und Minima der Melanisierung bei 577 und 661 nm, also im Transmissionsbereich beider Lacke. Licht unterhalb 500 nm bewirkt jedoch einen noch hijheren Bilingehalt, zugleich aber eine stPrkere Melanisierung der Puppen. Wie man bei der Prsparation der Puppen sieht, kommt der Gallenfarbstoff in der Epidermis, im dorsalen FettkGrper und in der HPmolymphe vor. Die Epidermis weist bei hellen und dunklen Puppen einen auffallenden Unterschied in der Bilinpigmentierung auf. WPhrend sie bei hellen Puppen ein blaues Farbmuster zeigt, fehlt ihr bei dunklen Puppen diese Blaufirbung. Die an ganzen Puppen gemessenen Unterschiede im Bilingehalt diirften also hauptsiichlich in der Epidermis zu suchen sein. Ganz entsprechend enthalten such bei Papilioniden (OHNISHI, 1959) und bei P. r. cruciuora (OHTAKI und OHNISHI, 1967) die dunklen Puppen im Integument weniger Bilin als die hellen Puppen. Das Zusammenwirken der Pigmente Ausser den Carotinoiden und einem Gallenfarbstoff wurde bei Pieris such Ommochrom im Integument gefunden und als Xanthommatin identifiziert (Kayser, in Vorbereitung). Bei den Raupen bildet es ein mit den cuticularen Melaninflecken deckungsgleiches Muster in der Epidermis, das bei dunklen Puppen persistiert, bei hellen jedoch verschwindet. An die Stelle des Ommochroms--in diesselben Epidermisbereiche also-tritt bei hellen Puppen das Bilin, wodurch ein entsprechendes blaues Fgrbungsmuster entsteht. Im Gesamten gesehen sind Melanin und Ommochrom auf der einen Seite und Carotinoid und Bilin auf der anderen Seite in entgegengesetzter Weise am Entstehen der Farbmodifika.tionen der Pie&Puppen beteiligt. Die Igeringe, aber tatsachlich vorhandene Beteiligung der Carotinoide an der F2rbungsmodifikation der Puppen von P. brassicae kijnnte als Rest einer phylogenetisch friiheren Bedeutung dieser Pigmente aufgefasst werden. Die Farbmodifika.tion durch Strukturver&derung von Nahrungscarotinoiden kSnnte die urspriingliche sein, die im Lauf der Phylogenese durch die Beteiligung solcher Pigmente verdrlngt wurde, zu deren Synthese das Tier selbst in der Lage ist, wie Melanine, Ommochrome und Biline. Zusa:mmenfassung-Die Carotinoide und der Gallenfarbstoff der Larven und Puppen van P. brassicue werden analysiert und ihre Bedeutung fiir die morphologische Farbanpstssung der Puppen durch quantitative Bestimmungen untersucht. Die Carotinoide sind fi-Carotin, Luteinmonoester, freies Lutein und Zeaxanthin. Es wurden keine

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metabolisierten Carotinoide gefunden. Unterschielich stark melanisierte Puppen unterscheiden sich weder in der Qualit;it noch im Gesamtgehalt oder in der prozentualen Zusammensetzung der Carotinoide. Dagegen entmlt das isolierte Integument heller Puppen doppelt so vie1 Carotinoid wie bei dunklen Puppen. Die Epidermis enthslt den Hauptteil der Integument-Carotinoide. /?-Carotin, Lutein und Zeaxanthin werden selektiv aus der Nahrung resorbiert. fi-Carotin und Luteinester finden sich haupt&chlich im FettkGrper, Lutein dagegen in der Hlmolymphe. Der Gallenfarbstoff der Puppen ist Protobiliverdin-IXy (Pterobilin) und mit dem der Larven identisch. Die Hauptmenge des Bilins wird im letzten Larvenstadium aufgebaut. Bei den Puppen besteht eine Korrelation zwischen der Melanisierung und der Bilinmenge : Puppen aus gleichen Lichtbedingungen enthalten stets urn so weniger Bilin, je stgrker sie Blaulicht bewirkt ausser der Fiirderung der melanisiert sind (negative Korrelation). Melanisierung insgesamt such eine Erhiihung des Bilingehalts der Puppen (positive Korrelation). Inner halb der Versuchsgruppe bleibt aber such im Blaulicht die negative Korrelation zwischen Melanisierung und Bilingehalt erhalten. LITERATUR ANGERSBACHD. (1970) Die Bedeutung der Einfallsrichtung und der WellenlPnge des Lichtes bei der Melanisierung der Kohlweisslingspuppe Pieris brassicae L. Dissertation, Giessen. ANGERSBACHD. and KAYSER H. (1971) Wavelength dependence of light-controlled pupal pigmentation. Naturwiss. 58, 571-572. BARBIER M., BERGERARDJ., HURPIN B. et VUILLAUME M. (1970) Conditionnement de la diapause et pigments tetrapyrroliques chez Pieris brassicae (Insecte ICpidopdre). C. R. Acad, Ski., Paris 271, 342-345. BERTHOLD G. (1973) uber die hormonale Steuerung von Wachstum und Pigmentierung der Indischen Stabheuschrecke Carat&s morosus Br. Wilhelm Roux’ Archiv. Im Druck. BOCKMANND. (1971) Melanisierungsverlauf und Melanisierungshemmung bei der Kohlweisslingspuppe Pieris brassicae L. Wilhelm Roux’ Archiv. 166, 236-253. BUCKMANND. und DUSTMANN J. H. (1962) Biochemische Untersuchungen iiber den morphologischen Farbwechsel von Carausius morosus. Naturwiss. 49, 379. B~?NNINGE. und JOERRENSG. (1960) Tagesperiodische antagonistische Schwankungen der Blauviolett- und Gelbrot-Empfindlichkeit als Grundlage der photoperiodischen Diapause-Induktion bei Pieris brassicae. 2. Naturf. 15b, 205-213. BONING E. und JOERRENS G. (1962) Versuche fiber den Zeitmessvorgang bei der photoperiodischen Diapause-Induktion von Pieris brassicae. 2. Naturf. 17b, 57-61. CHIPPENDALEG. M. and KILBY B. A. (1969) Relationship between the proteins and the haemolymph and fat body during development of Pieris brassicae. J. Insect Physiol. 15, 905-926. DAVID W. A. L. and GARDINER B. 0. C. (1966) Rearing Pieris brassicae (L.) on semisynthetic diets with and without cabbage. Bull. ent. Res. 56, 581493. DUSTMANNJ. H. (1964) Die Redoxpigmente von Curausius morosus and ihre Bedeutung fiir den morphologischen Farbwechsel. 2. vergl. Physiol. 49, 28-57. FELTWELL J. S. E. and VALADONL. R. G. (1972) Carotenoids of Pieris brassicue and of its food plant. J. Insect Physiol. 18, 2203-2215. GROB E. C. und PFLUGSHAUPTR. P. (1962) 185. BeitrPge zur Chemie der CarotinoideI. Mitt. : Sgurekatalytische Reaktionen an hydroxylhaltigen Carotinoiden. Helv. chim. Acta 45, 1592-1598. HAGERA. und MEYER-BERTENRATHT. (1966) Die Isolierung und quantitative Bestimmung der Carotinoide und Chlorophylle von Bllttern, Algen und isolierten Chloroplasten mit Hilfe diinnschichtchromatographischer Methoden. PZantu, Berl. 69, 198-217.

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HAGERA. und MEYER-BERTENRATH T. (1967a) Die Identitizierung der an Diinnschichten getrennten Carotinoide griiner Blotter und Algen. Planta, BerI. 76, 149-168. HAGERA. und MEYER-BERTENRATH T. (196713) Beziehung zwischen Absorptionsspektrum und Konstitution bei Carotinoiden von Algen und hijheren Pflanzen. Ber. dtsch. Bot. Ges. 8’0, 426-436. HARASHIM.A K., OHNO T., SAWACHIKA T., HIDAKAT., and OHNISHIE. (1972) Carotenoids in orange pupae of the swallowtail, Papilio xuthus. Insect Biochem. 2, 2948. HARMSENR. (1966) Identification of fluorescing and U.V. absorbing substances in Pieris brassic,ne L. J. Insect Physiol. 12, 23-30. HINTON, H. E. (1968) Spiracular gills. Adv. Insect Physiol. 5, 65-162. LEE W. L,. (1966a) Pigmentation of the marine isopod Idotheu montereyensis. Comp. Biothem. .Physiol. 18, 17-36. LEE W. L,. (196613) Pigmentation of the marine isopod Idothea grunulosa (Rathke). Comp. Biochem. Physiol. 19, 13-27. LEVIN E. Y. (1966) Studies on Verdohemochrome. Biochem. 5, 2845-2852. ~NAGEL H. (1970) Die griine Farbung der Larven von Ceruru vinula L. (Notodontinae) und einiger anderer Lepidopteren. Dissertation, Giessen. O’CARRA P. and COLLERANE. (1970) Separation and identification of biliverdin isomers and isomer analysis of phycobilins and bilirubin. J. Chromatog. 50, 458468. OHNISHI E. (1959) Pigment composition in the pupal cuticles of two colour types of the swallowtails, Papilio xuthus L. and Papilio protenor demetrius Cramer. J. Insect Physiol. 3, 132-145. OHTAKIT. and OHNISHIE. (1967) Pigments in the pupal integuments of two colour types of cabbage white butterfly, Pieris rapae crucivora. J. Insect Physiol. 13, 1569-1574. OLTMER .A. (1968) Die Steuerung des Melanineinbaus in das Farbmuster der Kohlweisslingspuppe Pieris brassicue L. Wilhelm Roux’ Archiv. 160, 401427. R~DIGER W. (1969) Chromslure- und Chromatabbau von Gallenfarbstoffen. HoppeSeyler’s 2. physiol. Chem. 350, 1291-1300. R~DIGER W. (1970) Gallenfarbstoffe bei wirbellosen Tieren. Naturwiss. 57, 331-337. R~~XGERW., KLOSE W., VUILLAUMEM., and BARBIERM. (1968) On the structure of pterobilin, the blue pigment of Pieris brassicae. Experientia 24, 1000. VAN DER GEESTL. P. S. (1968) Effects of diets on the haemolymph proteins of larvae of Pieris brassicae. J. Insect Physiol. 14, 537-542. In Carotenoids (Ed. by ISLER 0.). Birktiuser, WEEDONB. L. C. (1971) ‘Occurrence’. Basel. WIELAND H. und TARTTER A. (1940) ijber die Fhigelpigmente der SchmetterlingeVIII. Pterobilin, der blaue Farbstoff der Pieridenfliigel. Liebig’s Ann. Chem. 545, 197208. WIESEN M. (1962) Die optische und hormonale Steuerung des morphologischen Farbwechsels beim Kohlweissling (Pieris brussicae L.). Staatsexsmensarbeit, Gottingen (unveriiffentlicht). WILLIG A. (1969) Die Carotinoide und der Gallenfarbstoff der Stabheuschrecke, Curuusius morosus, und ihre Beteiligung an der Entstehung der Farbmodifikationen. J. Insect Physiol. 15, 1907-1927.