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Diagnostic des microsporidioses intestinales
COPROLOGIE PARASITAIRE
Diagnostic des microsporidioses intestinales Isabelle Accoceberrya,*, Mahussi d’Almeida-Fourqueta
RÉSUMÉ
SUMMARY
Les microsporidies sont des parasites intracellulaires obligatoires, récemment reclassées parmi les champignons. C’est avec la pandémie de sida qu’ont émergé les cas de microsporidioses humaines causés par des espèces jusqu’alors inconnues. Enterocytozoon bieneusi et Encephalitozoon intestinalis, responsables des microsporidioses intestinales, sont de loin les plus prévalentes. Actuellement, elles sont identifiées de plus en plus fréquemment chez des patients présentant d’autres formes d’immunosuppression, essentiellement les transplantés d’organes solides mais également les enfants, les voyageurs et les personnes âgées. Le principal symptôme clinique est la diarrhée, chronique chez l’immunodéprimé ou le plus souvent spontanément résolutive chez l’immunocompétent. Pour le diagnostic de routine, la détection directe des spores (1-3 μm) des parasites dans les selles, après coloration trichromique de Weber modifiée et/ou par les fluorochromes (Uvitex 2B, Calcofluor White 2MR), est sensible et surtout non invasive. L’identification de l’espèce en cause est indispensable pour orienter le traitement. Elle peut être réalisée par PCR ciblant notamment le gène codant pour la petite sous-unité ribosomale de l’ARN (ARNr 16S) ou immunomarquage à l’aide d’anticorps monoclonaux dirigés contre la paroi des spores. Les dernières techniques de PCR développées, quantitatives pour évaluer la charge parasitaire et la réponse au traitement, multiplex pour la détection simultanée des 2 espèces, sont des outils très performants. L’albendazole est le traitement de choix pour E. intestinalis, alors que seule la fumagilline permet d’éradiquer E. bieneusi. Microsporidies intestinales – immunodépression – diagnostic – selles – spores (1-3 μm) – microscopie optique – PCR – anticorps monoclonaux.
1. Rappels (définition et généralités) Les microsporidies sont des eucaryotes unicellulaires, très répandus dans le monde animal (protozoaires, invertébrés et vertébrés). Ce sont des parasites intracellulaires obligatoires. Le Phylum des Microspora (Sprague, 1969) comprend environ 150 genres et près de 1 300 espèces
a Laboratoire de parasitologie-mycologie Centre hospitalier universitaire de Bordeaux – Hôpital Saint-André 1, rue Jean-Burguet 33075 Bordeaux cedex
* Correspondance [email protected] article reçu le 30 octobre, accepté le 28 novembre 2011 © 2012 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.
Diagnosis of intestinal microsporidia Microsporidia are spore forming obligate intracellular parasites, recently reclassified from protozoa to fungi. Human microsporidiosis have emerged with the HIV/AIDS pandemic. Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon intestinalis, which causes gastrointestinal diseases, are the most prevalent agents. Currently, they are increasingly diagnosed in otherwise immunocompromised patients, including organ transplant recipients, but also in children, travelers and the ederly. Chronic or self-limiting diarrhoea is the most common symptoms in immunodeficient or immunocompetent individuals. Direct examination of the stools stained by chemofluorescent agents stains (UVITEX 2B, calcofluor white M2R) and/or Weber’s modified trichrome stain is a sensitive, noninvasive test which can be successfully implemented in a clinical laboratory. Species identification, which is absolutely necessary to start the relevant treatment, can be achieved by PCR targeting the small subunit rRNA or indirect immunofluorescence using monoclonal antibodies directed against spore wall. The newly described PCR methods, quantitative for assessing spore shedding intensity and treatment efficiency, multiplex for the simultaneous detection of the 2 species, are very powerful tools. Infections caused by E. intestinalis were treated with albendazole, while only fumagillin has been shown effective for eradicating E. bieneusi. Intestinal microsporidiosis – immunodepression – diagnosis – stools – spores (1-3 μm) – light microscopy – PCR – monoclonal antibodies.
dont 14 infectent l’homme. Le nom de microsporidies (Microsporidium) a été proposé par Balbiani (professeur au Collège de France) en 1882, en raison des très petites dimensions de leurs spores (quelques μm) qui assurent la dissémination. Il est actuellement admis que les microsporidies s’apparentent aux champignons avec lesquels elles partagent diverses particularités (modalités de la division nucléaire, stades diplocaryotiques, paroi des spores riche en chitine, homologie des séquences de gènes codant pour certaines protéines) [1]. Jusqu’en 1985, seuls quelques cas isolés de microsporidioses ont été rapportés chez l’homme. C’est avec la pandémie de sida qu’ont émergé les cas de microsporidioses humaines causés par des espèces jusqu’alors inconnues dont Enterocytozoon bieneusi REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - MARS 2012 - N°440 //
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décrite par Desportes et al. en 1985 [2] et Encephalitozoon (Septata) intestinalis par Cali et al. en 1993 |3], agents des microsporidioses intestinales de loin les plus prévalentes. Très rapidement, l’association microsporidiose intestinale, diarrhée chronique, malabsorption et perte de poids sévère a été clairement établie chez les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) avec un taux de lymphocytes CD4 inférieur à 100 cellules par mm3. Ainsi, selon les études réalisées entre 1989 et 1998, la prévalence d’E. bieneusi pouvait atteindre 30 à 50 % chez ces patients. Encephalitozoon intestinalis venait au second rang dans l’étiologie, impliquée dans environ 10 % des cas [4]. Dans les pays où les polythérapies anti-rétrovirales sont disponibles, la prévalence des microsporidioses a considérablement diminué, de même que celles des autres parasitoses intestinales opportunistes (cryptosporidiose, cyclosporose, isosporose). Actuellement, les microsporidies sont surtout détectées dans la population infectée par le VIH en Inde, en Thaïlande, en Turquie, en Afrique, au Brésil et au Pérou |5, 6]. Les microsporidioses intestinales sont diagnostiquées de plus en plus fréquemment chez les patients présentant d’autres formes d’immunosuppression, essentiellement les transplantés d’organes solides (foie, cœur-poumons, reins), notamment après le renforcement du traitement immunosuppresseur pour éviter un rejet. La malnutrition et le vieillissement constitueraient également des facteurs de risque selon des enquêtes réalisées dans une maison de retraite et des orphelinats en Espagne.
Figure 1 – Organisation typique d’une spore de microsporidie.
Des cas d’infections à E. bieneusi et E. intestinalis sont également rapportés chez des patients immunocompétents, voyageant ou séjournant en zone tropicale ou subtropicale (Caraïbes, Afrique, Asie, Moyen-Orient) et plus exceptionnellement chez des patients sédentaires |5, 6]. Chez l’immunocompétent, la symptomatologie se limite le plus souvent à une diarrhée spontanément résolutive. La pathogénie d’E. bieneusi et d’E. intestinalis est probablement sous-estimée chez les patients non infectés par le VIH, immunodéprimés ou non, du fait que ce diagnostic est rarement évoqué par les cliniciens chez ces patients. Une seule étude publiée en 2003 a révélé la présence dans les selles de patients portugais souffrant de diarrhées, 22 infectés par le VIH et 3 non infectés par le VIH, de spores d’une troisième espèce [7]. L’analyse génomique a montré qu’elle était très proche de Vittaforma corneae (96 % d’homologie) responsable de kératites et d’infection
disséminée. Plusieurs modes de contamination sont possibles : contamination féco-orale, contamination par ingestion ou inhalation de spores, contamination par les aérosols [8]. La transmission directe de personne à personne a été évoquée dans plusieurs études. Par ailleurs, le portage asymptomatique est possible quel que soit le statut immunitaire de l’hôte. Une étude sérologique indique des taux relativement importants de prévalence d’anticorps anti-E. intestinalis chez des donneurs de sang néerlandais (8 %) et des femmes enceintes françaises (5 %) [9]. La détection d’ADN d’E. bieneusi et d’E. intestinalis dans des eaux de surface, des eaux d’égouts ou des eaux utilisées pour la consommation humaine suggère également la possibilité de contamination à partir de sources environnementales [8]. Les deux espèces ont été identifiées dans les échantillons de selles d’animaux d’élevage et de compagnie. Enterocytozoon bieneusi est également présente chez des mammifères sauvages ainsi que chez des oiseaux (poulets d’élevage industriel et pigeons en zone urbaine). La mise en évidence par analyse phylogénétique de génotypes identiques chez l’homme et certaines espèces animales atteste également d’une transmission zoonotique [10].
2. Agents pathogènes Le cycle évolutif des microsporidies se déroule en deux phases, une phase proliférative (mérogonie) suivie d’une phase de sporulation (sporogonie) qui se succèdent à l’intérieur de la cellule hôte. Les stades de développement générés au cours de la mérogonie sont appelés des mérontes alors que les sporontes, les sporoblastes et les spores sont successivement produits au cours de la sporogonie. Les spores sont excrétées dans le milieu extérieur avec les selles, les urines et les sécrétions respiratoires des patients infectés. La spore (figure 1) est la forme de développement la plus caractéristique du cycle évolutif. Sa paroi est constituée par une double enveloppe composée d’une exospore protéique et d’une endospore plus épaisse, essentiellement faite de chitine. L’endospore recouvre la membrane
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plasmique délimitant le sporoplasme, élément infectieux formé par le cytoplasme et un ou deux noyaux. La spore possède une structure caractéristique, le filament (ou tube) polaire qui, rigide à la partie antérieure, s’enroule en un nombre variable de spires occupant les 2/3 postérieurs de la spore. Un système de membranes formant un empilement de saccules aplatis et désigné par le terme de polaroplaste, entoure la portion rectiligne (manubrium) du filament polaire qui s’insère au disque d’ancrage plaqué sous la paroi à l’extrémité antérieure de la spore. Une vacuole est visible à la partie postérieure de la spore. Le processus d’infestation est spécifique des microsporidies. L’extrusion du filament polaire, induit par l’augmentation brutale de la pression intrasporale, entraîne l’expulsion du sporoplasme infectieux qui est directement inoculé dans le cytoplasme de la cellule hôte (figure 2) [11]. Les spores matures d’E. bieneusi sont oviformes, mesurant 1,0 à 1,6 μm sur 0,6 à 0,9 mm, avec à l’intérieur le filament polaire, formant 4 à 5 ou 6 à 7 tours de spires disposés sur deux rangs, autour d’un noyau unique. Les entérocytes de l’intestin grêle (duodénum, jéjunum) sont le site privilégié de l’infection (figure 3). L’extension aux cellules épithéliales nasales, bronchiques et de l’arbre biliaire est parfois observée. Le développement s’effectue directement dans le cytoplasme de la cellule hôte et les stades parasitaires se localisent au pôle apical de la cellule, entre la bordure en brosse et le noyau. Les spores d’E. intestinalis plus grandes mesurent 1,5 à 2,0 μm sur 1,0 à 1,2 μm et ne possèdent qu’un seul noyau. Le filament polaire forme 4 à 7 tours de spires disposés en une seule rangée. Les étapes du cycle se déroulent à l’intérieur d’une vacuole parasitophore, provenant vraisemblablement de la membrane de la cellule hôte. Encephalitozoon intestinalis se développe dans les entérocytes, comme dans les macrophages, les fibroblastes et les cellules endothéliales du chorion ce qui explique la dissémination de l’infection à d’autres organes, le rein notamment. Les spores de Vittaforma spp. mesurent entre 1,8 à 3,6 μm sur 1,0 à 1,4 mm. Tous les stades de développement sont diplocaryotiques et entourés par le réticulum endoplasmique de la cellule hôte.
Figure 2 – Le tube polaire (flèche) décharge son contenu dans une invagination de la membrane plasmique (*) de la cellule hôte apparemment formée à son contact (x 30 000).
D’après A. Magaud.
Figure 3 – Spores (flèches) d’E. bieneusi dans un entérocyte altéré de la muqueuse jéjunale d’un patient infecté par le VIH et souffrant de diarrhée chronique.
3. Diagnostic La localisation intracellulaire des stades de développement, la taille très réduite (1 à 4 μm) des spores émises dans les selles et leurs propriétés tinctoriales particulières rendent difficile la détection des microsporidies intestinales. Ainsi, les premiers diagnostics reposaient uniquement sur l’analyse ultrastructurale et histologique de biopsies de l’intestin grêle. Depuis, un panel de techniques réalisables en routine ont été développées permettant la recherche des microsoporidies par microscopie optique, immunodétection et PCR dans différents échantillons biologiques.
3.1. Microscopie électronique L’examen en microscopie électronique des tissus permet le diagnostic et l’identification de l’espèce en cause d’après la configuration nucléaire, la morphologie des spores et du tube polaire, les caractéristiques des phases de déve-
Photo I. Desportes-Livage. NCH = noyau cellule hôte.
loppement du parasite, le mode de division et l’interface hôte-parasite. Comme pour d’autres infections opportunistes décrites au cours du sida, telles que la pneumocystose et la cryptosporidiose, l’analyse ultrastructurale de toutes les biopsies réalisées a révélé l’existence de sites jusqu’alors inconnus de l’infection. L’examen en microscopie électronique d’échantillons de selles ou de liquides biologiques est possible mais il ne REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - MARS 2012 - N°440 //
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permet d’observer que l’ultrastructure des spores. Sa sensibilité est faible car seul un faible volume de l’échantillon peut être observé. Même si la microscopie électronique reste une méthode de référence, la lourdeur de sa réalisation exclut son utilisation en routine.
3.2. Histologie L’examen histologique des biopsies intestinales (duodénum, jéjunum) conserve une place dans le diagnostic, notamment lorsque l’examen parasitologique des selles est négatif. Il permet surtout l’étude des aspects physiopathologiques et des modifications architecturales de la muqueuse intestinale liée à l’infection. Les microsporidies ne sont pas facilement identifiables avec les colorations classiques comme la coloration au Gram ou à l’hématoxyline-éosine [12]. Les colorations par le Giemsa, le bleu de toluidine O, le Gram modifié, le Warthin-Starry ou le trichrome sont plus performantes. Les parasites sont détectés grâce à leur localisation caractéristique intraentérocytaire en position supranucléaire. Les techniques de fluorescence directe par marquage par un fluorochrome sont sensibles, rapides et faciles à réaliser tant sur les appositions que sur les coupes de tissus inclus en paraffine.
3.3. Microscopie optique Les seuls stades de développement extracellulaires sont les spores que l’on peut rechercher dans divers liquides biologiques.
3.3.1. Examen direct des selles Le moyen de diagnostic le plus aisé est la détection directe des spores de microsporidies dans les selles car il n’est pas invasif. Cependant, leurs dimensions très réduites ne permettent pas de les distinguer des bactéries fécales si la méthode de détection n’est pas appropriée. De nouvelles méthodes de coloration ou de marquage par un fluorochrome ont donc été proposées et validées. 3.3.1.1. Techniques de concentration Certains auteurs constatent que l’examen direct des selles est d’un rendement supérieur à celui des techniques de concentration qui entraînent une perte importante de spores, et parfois des résultats faussement négatifs [13]. D’autres techniques de concentration comme la sédimentation à l’éther ou la centrifugation des échantillons à différentes vitesses semblent améliorer la récupération des spores |14, 15]. 3.3.1.2. Méthodes de coloration • Colorations au Giemsa et au Gram Le Giemsa est la première utilisée (1990), le cytoplasme des spores apparaît coloré en bleu-gris, et parfois on peut voir le noyau violet caractéristique. La présence de trop nombreuses bactéries et levures dans les selles rend la lecture particulièrement difficile et n’est pas adaptée au dépistage en routine. Le Gram pose les mêmes difficultés de lecture puisqu’il n’y a pas de contraste entre les spores de microsporidies et le fond de la préparation [16].
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• Coloration trichromique de Weber et techniques dérivées Cette technique utilise un colorant dérivé du trichrome classique de Wheatley, le chromotrope 2R, à une concentration 10 fois supérieure à celle utilisée habituellement pour la coloration des amibes et des flagellés, en raison de la pénétration plus difficile du colorant à l’intérieur des spores de microsporidies [17]. Les spores apparaissent en rose-brillant sur un fond verdâtre très pâle. La coloration au niveau de la spore est inhomogène et apparaît plus intense à l’intérieur de la spore donnant un aspect de spore barrée ou d’un T à l’intérieur de la spore. La vacuole postérieure transparente est nettement discernable. Quelques bactéries fécales, notamment les cocci de taille voisine, et les levures peuvent aussi se colorer en rouge, mais leur forme et leur profil de coloration évitent la confusion. Plusieurs équipes ont alors apporté des modifications à cette technique de coloration proposée par Weber. La technique publiée par Kokoskin est significativement meilleure que l’originale [18]. Les spores de microsporidies apparaissent plus intensément colorées, sur un fond plus clair, mais surtout le temps de coloration est réduit de 80 minutes. En 1995, dans le laboratoire de parasitologie du CHU de la Pitié-Salpêtrière, nous avons optimisé la technique proposée par Koskokin [14]. Les résultats obtenus à partir d’échantillons de selles contenant de nombreuses spores de petite taille de type E. bieneusi ou de grande taille de type E. intestinalis sont présentés figures 4 et 5.
Optimisation de la coloration trichromique de Weber modifiée par Kokoskin Solution préconisée : - chromotrope 2R 6g - fast green 0,6 g - acide phosphotungstique 1,4 g Ajouter à la solution 3 ml d’acide acétique glacial, laisser reposer 30 minutes à l’abri de la lumière et ajouter enfin progressivement 100 ml d’eau distillée. L’eau peut être ajoutée en premier, mais il faut alors déposer la préparation sur agitateur magnétique pendant 15 minutes. La solution colorante est chauffée à 50 °C à l’étuve et doit être maintenue à cette température pendant toute la coloration. - Plonger les lames 10 minutes dans le colorant. - Rincer rapidement à l’eau. - Différencier 10 s dans l’alcool acétique en agitant légèrement. - Rincer rapidement à l’éthanol à 95°, le jeter et plonger les lames 5 minutes dans l’éthanol à 95°. - Laisser sécher les lames et observer à l’objectif x 100 à l’immersion. Enfin, une technique combinant la coloration par une solution de carbofuschine, la décoloration alcoolo-acide et la coloration trichromique modifiée permettrait de détecter sur une même lame les oocystes de Cryptosporidium spp. et les spores de microsporidies [19]. Cependant, quelle que soit la technique, la lecture est fastidieuse et requiert un « œil expérimenté » surtout si les spores sont rares dans l’échantillon.
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Figure 4 – Spores d’E. bieneusi dans les selles d’un patient infecté par le VIH. Coloration trichromique modifiée (x 1 000).
• Coloration par les fluorochromes Les fluorochromes (Uvitex 2B, Calcofluor White 2MR et Fungifluor) se fixent électivement sur la chitine présente dans la paroi des spores de microsporidies et lui confère un aspect bleu brillant sous lumière ultra-violette. Van Gool et al. ont proposé une technique de fluorescence directe utilisant l’Uvitex 2B, pour la recherche des microsporidies dans les selles [20]. La lecture est effectuée sur un microscope à fluorescence, équipé d’un couple de filtres particuliers, permettant une excitation entre 355 et 425 nm et une émission à 460 nm. Les spores présentent une fluorescence bleue très prononcée au niveau de la périphérie, sur fond noir (figure 6). Cette coloration de réalisation rapide, de lecture facile, apporte encore un plus pour le diagnostic. Cependant, elle s’avère moins spécifique si les selles contiennent d’autres éléments riches en chitine. En effet, les fongiques apparaissent aussi bleu-fluorescent. Si la taille permet d’écarter les levures, il n’en est pas toujours de même de certaines spores de champignons filamenteux. Des débris d’origine végétale peuvent également être marqués.
Figure 5 – Spores d’E. intestinalis dans les selles d’un patient infecté par le VIH. Coloration trichromique modifiée (x 1 000).
3.3.2. Examen direct d’autres liquides biologiques Les spores d’E. bieneusi et d’E. intestinalis peuvent être également recherchées dans les liquides d’aspiration duodénale, la bile, les urines, les lavages bronchioloalvéolaires, le jetage nasal, les ponctions sinusales. Le nombre de spores excrétées dans ces prélèvements pouvant être très faible, une centrifugation préalable à grande vitesse (minimum 1 500 x g) est indispensable pour les concentrer dans le culot de centrifugation.
3.4. Immunodiagnostic La mise au point des premières techniques d’immunofluorescence indirecte (IFI) utilisant des anticorps polyclonaux a montré l’existence de communautés antigéniques entre plusieurs espèces de microsporidies.
Figure 6 – Spores d’E. bieneusi dans les selles d’un patient infecté par le VIH. Coloration à l’Uvitex 2B (x 1 000).
Technique de coloration de Van Gool Réactifs - Uvitex 2B : préparer une solution à 1 % dans du tampon PBS (pH = 7.4) à conserver à l’abri de la lumière. - Solution de Bleu Evans à 1 % dans du tampon PBS. L’étalement des selles est fait sur lame à spot de 1,3 cm de diamètre. Toute la coloration doit être effectuée à l’abri de la lumière. - Recouvrir l’étalement de la solution d’Uvitex 2B à 1 % et laisser agir 15 minutes. - Rincer à l’eau distillée. - Recouvrir l’étalement de la solution de Bleu Evans à 1 % pendant 5 minutes. - Rincer à l’eau distillée et laisser sécher. La lecture se fait à l’objectif x 100 à l’immersion au microscope à fluorescence. REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - MARS 2012 - N°440 //
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Figure 7 – Marquage en IFI par l’IG2a de la paroi des spores d’E. bieneusi dans les selles d’un enfant de 7 ans transplanté rénal (x 1 000).
aux techniques classiques de coloration (trichrome modifié et Uvitex 2B) et à la PCR, de façon prospective aux CHU de Bordeaux et de la Pitié-Salpêtrière (> 600 prélèvements de selles) et dans 2 enquêtes réalisées en Afrique chez des patients infectés ou non par le VIH [23, 24]. Elle s’est avérée plus sensible que les techniques de coloration et aussi performante que la PCR utilisant des amorces spécifiques des 2 espèces, encore réservée aux laboratoires spécialisés. L’IgG2a anti-exospore d’E. bieneusi et l’IgG1 anti-endospore d’E. intestinalis sont commercialisés par Bordier Affinity Products SA (www. bordier.ch).
3.5. Diagnostic moléculaire
Figure 8 – Marquage en IFI par l’IG1 de la paroi des spores d’E. intestinalis dans les selles d’un patient infecté par le VIH (X 1000).
Photo M. Thellier.
Des anticorps polyclonaux produits contre les différentes espèces du genre Encephalitozoon ont ainsi permis de détecter des spores d’E. bieneusi et d’E. intestinalis dans des échantillons cliniques [21]. Du fait de leur réactivité croisée, la détection spécifique d’une espèce donnée est difficile. Deux anticorps monoclonaux spécifiques de la classe des IgG dirigés respectivement contre la paroi des spores d’E. bieneusi [15] et d’E. intestinalis [22] ont été produits et appliqués à la détection des parasites par IFI dans les selles de patients infectés. Le marquage franc de la paroi des spores matures permet de les visualiser à un faible grossissement, ce qui facilite le diagnostic même pour un observateur non expérimenté (figures 7 et 8). La technique a été évaluée et validée par comparaison
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Le séquençage de différents gènes chez plusieurs espèces de microsporidies infestant l’homme a permis l’application de la PCR au diagnostic et au génotypage de ces parasites. Des techniques ciblant essentiellement les séquences du gène codant pour la petite sous-unité ribosomale de l’ARN (ARNr 16S) et plus rarement des séquences de la région intergénique non transcrite (ITS) ou du gène codant pour la grande sousunité ribosomale de l’ARN (ARNr 23S) ont été mises au point. Les amorces décrites sont soit spécifiques d’une seule espèce, notamment d’E. bieneusi ou d’E. intestinalis, soit spécifiques du genre Encephalitozoon, soit universelles et amplifient l’ADN de la plupart des microsporidies humaines. Dans ce dernier cas, plusieurs méthodes peuvent être mises en œuvre pour identifier spécifiquement l’espèce de microsporidie détectée. Elles incluent le séquençage du fragment d’ADN amplifié et la comparaison à des séquences connues, l’analyse des amplicons par hybridation à l’aide de sondes nucléiques spécifiques de différentes espèces (Southern-blot) ou bien la digestion par des enzymes de restriction (RFLP, restriction fragments lenght polymorphism). Les méthodes de préparation des échantillons pour le diagnostic moléculaire des microsporidies sont détaillées dans la revue de Weiss et Vossbrinck [25]. La technique utilisée peut significativement affecter la sensibilité de la technique de PCR mise en œuvre. Les acides nucléiques peuvent être extraits des différents échantillons cliniques aussi bien par des méthodes standards comme la digestion par la protéinase K suivie d’une extraction par le chloroforme et d’une précipitation par l’éthanol ou à l’aide de kits commerciaux (e.g. QIAmp DNA stool mini kit, Qiagen) ou encore par des méthodes automatisées (e. g. MagNA Pure LC, Roche). L’extraction peut parfois être réalisée à partir des coupes en paraffine utilisées en histopathologie (kits commerciaux spécifiques DexPat) et des lames de selles fixées et colorées par le trichrome modifié ou le Giemsa. Un autre procédé utilisant des flitres FTA® imprégnés (solution chimique brevetée, Whatman) permet la lyse des membranes cellulaires et la dénaturation des protéines lors du dépôt de l’échantillon. Les acides nucléiques alors immobilisés et stabilisés peuvent être stockés à température ambiante. Cependant l’extraction et l’amplification de l’ADN à partir des prélèvements de selles reste difficile néces-
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sitant souvent le recours à une rupture mécanique de la paroi des spores et/ou un prétraitement des échantillons avant l’extraction. La pulvérisation des spores à l’aide de billes de verre associée à la digestion par la protéinase K, la lyticase ou la chitinase semblent efficaces. Les selles peuvent contenir des inhibiteurs de PCR dont la présence peut être bloquée par l’emploi d’hypochlorite de sodium 0,5 %, de thiocyanate de guanidine, d’hydroxyde de potassium, de dithiothretol, d’hexadecyltrimethylammonium bromide ou inactivée par chauffage des échantillons. Une dilution des échantillons est parfois nécessaire. La PCR est une technique sensible, spécifique et reproductible qui permet un diagnostic d’espèce. La limite de détection de 102 spores/g de selles est beaucoup plus faible que pour l’examen en microscopie optique des selles qui est de l’ordre de 104 à 106/g [26]. Plusieurs techniques de PCR en temps réel ont été publiées. Cette technologie détecte les amplicons au fur et à mesure qu’ils s’accumulent via l’interaction avec des agents intercalants ou des sondes fluorescentes dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés. De plus, elle utilise des systèmes en tubes fermés et dispense des manipulations post-amplification ce qui permet d’augmenter le débit et de réduire les risques de contamination inhérents à la PCR. Un contrôle interne peut permettre de détecter l’inhibition de l’amplification par les contaminants fécaux. La technique publiée par Menotti et al. en 2003 qui utilise des amorces spécifiques de l’ARNr 16S d’E. intestinalis pour rechercher le pathogène dans différents échantillons cliniques s’avère être extrêmement sensible avec une limite de détection estimée à 20 spores/mL [27]. Elle a ainsi permis de montrer la dissémination de l’infection par voie hématogène, en détectant l’ADN dans le sang de certains patients. Le tropisme tissulaire d’E. intestinalis pour certains organes s’est traduit par la présence de fortes charges parasitaires dans des selles, des urines ou des prélèvements broncho-pulmonaires. Enfin, les PCR multiplex en temps réel permettant la détection simultanée d’E. bieneusi et d’E. intestinalis [28] voire celle d’autres pathogènes intestinaux (Cyclospora cayetanensis, Isospora belli) [29] dans les selles des patients infectés, se développent. Les séquences de la plupart des amorces utilisées pour l’amplification des microsporidies humaines, ainsi que les températures d’hybridation recommandées et la taille attendue des amplicons (pour les techniques de PCR conventionnelles) sont compilées dans la revue de Ghosh et al. [30]. La PCR est applicable au diagnostic et à l’identification d’E. bieneusi et d’E. intestinalis avec une sensibilité et une spécificité de 100 % dans certaines conditions. Par ailleurs, beaucoup d’infections chez des patients modérément immunodéprimés ou immunocompétents qui excrètent de faible quantité de spores dans les selles ne sont pas diagnostiquées par les techniques classiques.
variable des anticorps chez les patients immunodéprimés, de l’impossibilité de différencier une infection aigue d’une infection ancienne, de la prévalence élevée des anticorps dans la population immunocompétente et de l’existence de réactions croisées entre les différentes espèces. Toutefois, les analyses sérologiques pourraient s’avérer utiles pour dépister les infections subcliniques chez des patients qui sont susceptibles de les transmettre à des patients à risque (e.g. transplantés d’organes solides) ou chez ceux qui pourraient réactiver l’infection dans des conditions d’immunodépression.
3.7. Approches diagnostique et thérapeutique
3.6. Tests sérologiques
À l’heure actuelle, pour établir le diagnostic de microsporidiose intestinale chez un patient, il semble justifié de pratiquer, dans un premier temps, la recherche de spores dans les selles avant tout examen invasif. Cet examen parasitologique des selles permet un bon rendement diagnostique dans la majorité des cas et est au moins aussi sensible (sinon plus) que l’examen histologique des biopsies intestinales, en raison de la distribution en foyers des microsporidies, de la petite taille de tissu prélevé et de la difficulté pour les endoscopistes à sélectionner les zones à biopsier. En pratique, pour le diagnostic de routine, les deux techniques de colorations classiques, chromotrope 2R et Uvitex 2B, sont réalisées simultanément pour accroître la fiabilité du diagnostic. L’emploi d’une coloration chimiofluorescente, comme l’Uvitex 2B de Van Gool, garantit une excellente sensibilité et son association avec une coloration au trichrome de Weber, qui se caractérise par une bonne spécificité, permet un dépistage parasitologique satisfaisant. Même si cette approche diagnostique apparaît simple et d’un coût peu élevé, elle requiert une grande expertise et surtout ne permet pas le diagnostic d’espèce. Si les sujets immunocompétents peuvent guérir spontanément, un traitement efficace est indispensable pour les patients immunodéprimés présentant une diarrhée chronique pouvant grever leur pronostic vital [5, 32]. L’identification de l’espèce en cause, par PCR ou immunomarquage à l’aide d’anticorps monoclonaux, reste indispensable pour orienter le traitement. Pour E. intestinalis, l’administration d’albendazole à la dose de 400 mg deux fois par jour pendant 3 semaines, conduit à une amélioration clinique franche, à la négativation de l’ensemble des prélèvements aussi bien digestifs qu’urinaires. Pour E. bieneusi, à l’heure actuelle, seule la fumagilline permet d’éradiquer le parasite, à la fois dans les selles et dans les biopsies. La dose curative efficace est de 60 mg/jour pendant 14 jours. L’analyse par PCR en temps réel d’échantillons de selles de 6 patients traités par fumagilline au cours de l’essai thérapeutique ANRS 090 a permis de montrer une réduction moyenne de 4,7 log de l’ADN d’E. bieneusi dans les selles après 2 semaines de traitement [33].
Les tests sérologiques, ELISA, IFI, western blot, agglutination directe [31], ne sont pas recommandés à l’heure actuelle pour le diagnostic en raison de l’expression
Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article. REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - MARS 2012 - N°440 //
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Diagnostic des microsporidioses intestinales Isabelle Accoceberrya,*, Mahussi d’Almeida-Fourqueta
RÉSUMÉ
SUMMARY
Les microsporidies sont des parasites intracellulaires obligatoires, récemment reclassées parmi les champignons. C’est avec la pandémie de sida qu’ont émergé les cas de microsporidioses humaines causés par des espèces jusqu’alors inconnues. Enterocytozoon bieneusi et Encephalitozoon intestinalis, responsables des microsporidioses intestinales, sont de loin les plus prévalentes. Actuellement, elles sont identifiées de plus en plus fréquemment chez des patients présentant d’autres formes d’immunosuppression, essentiellement les transplantés d’organes solides mais également les enfants, les voyageurs et les personnes âgées. Le principal symptôme clinique est la diarrhée, chronique chez l’immunodéprimé ou le plus souvent spontanément résolutive chez l’immunocompétent. Pour le diagnostic de routine, la détection directe des spores (1-3 μm) des parasites dans les selles, après coloration trichromique de Weber modifiée et/ou par les fluorochromes (Uvitex 2B, Calcofluor White 2MR), est sensible et surtout non invasive. L’identification de l’espèce en cause est indispensable pour orienter le traitement. Elle peut être réalisée par PCR ciblant notamment le gène codant pour la petite sous-unité ribosomale de l’ARN (ARNr 16S) ou immunomarquage à l’aide d’anticorps monoclonaux dirigés contre la paroi des spores. Les dernières techniques de PCR développées, quantitatives pour évaluer la charge parasitaire et la réponse au traitement, multiplex pour la détection simultanée des 2 espèces, sont des outils très performants. L’albendazole est le traitement de choix pour E. intestinalis, alors que seule la fumagilline permet d’éradiquer E. bieneusi. Microsporidies intestinales – immunodépression – diagnostic – selles – spores (1-3 μm) – microscopie optique – PCR – anticorps monoclonaux.
1. Rappels (définition et généralités) Les microsporidies sont des eucaryotes unicellulaires, très répandus dans le monde animal (protozoaires, invertébrés et vertébrés). Ce sont des parasites intracellulaires obligatoires. Le Phylum des Microspora (Sprague, 1969) comprend environ 150 genres et près de 1 300 espèces
a Laboratoire de parasitologie-mycologie Centre hospitalier universitaire de Bordeaux – Hôpital Saint-André 1, rue Jean-Burguet 33075 Bordeaux cedex
* Correspondance [email protected] article reçu le 30 octobre, accepté le 28 novembre 2011 © 2012 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.
Diagnosis of intestinal microsporidia Microsporidia are spore forming obligate intracellular parasites, recently reclassified from protozoa to fungi. Human microsporidiosis have emerged with the HIV/AIDS pandemic. Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon intestinalis, which causes gastrointestinal diseases, are the most prevalent agents. Currently, they are increasingly diagnosed in otherwise immunocompromised patients, including organ transplant recipients, but also in children, travelers and the ederly. Chronic or self-limiting diarrhoea is the most common symptoms in immunodeficient or immunocompetent individuals. Direct examination of the stools stained by chemofluorescent agents stains (UVITEX 2B, calcofluor white M2R) and/or Weber’s modified trichrome stain is a sensitive, noninvasive test which can be successfully implemented in a clinical laboratory. Species identification, which is absolutely necessary to start the relevant treatment, can be achieved by PCR targeting the small subunit rRNA or indirect immunofluorescence using monoclonal antibodies directed against spore wall. The newly described PCR methods, quantitative for assessing spore shedding intensity and treatment efficiency, multiplex for the simultaneous detection of the 2 species, are very powerful tools. Infections caused by E. intestinalis were treated with albendazole, while only fumagillin has been shown effective for eradicating E. bieneusi. Intestinal microsporidiosis – immunodepression – diagnosis – stools – spores (1-3 μm) – light microscopy – PCR – monoclonal antibodies.
dont 14 infectent l’homme. Le nom de microsporidies (Microsporidium) a été proposé par Balbiani (professeur au Collège de France) en 1882, en raison des très petites dimensions de leurs spores (quelques μm) qui assurent la dissémination. Il est actuellement admis que les microsporidies s’apparentent aux champignons avec lesquels elles partagent diverses particularités (modalités de la division nucléaire, stades diplocaryotiques, paroi des spores riche en chitine, homologie des séquences de gènes codant pour certaines protéines) [1]. Jusqu’en 1985, seuls quelques cas isolés de microsporidioses ont été rapportés chez l’homme. C’est avec la pandémie de sida qu’ont émergé les cas de microsporidioses humaines causés par des espèces jusqu’alors inconnues dont Enterocytozoon bieneusi REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - MARS 2012 - N°440 //
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décrite par Desportes et al. en 1985 [2] et Encephalitozoon (Septata) intestinalis par Cali et al. en 1993 |3], agents des microsporidioses intestinales de loin les plus prévalentes. Très rapidement, l’association microsporidiose intestinale, diarrhée chronique, malabsorption et perte de poids sévère a été clairement établie chez les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) avec un taux de lymphocytes CD4 inférieur à 100 cellules par mm3. Ainsi, selon les études réalisées entre 1989 et 1998, la prévalence d’E. bieneusi pouvait atteindre 30 à 50 % chez ces patients. Encephalitozoon intestinalis venait au second rang dans l’étiologie, impliquée dans environ 10 % des cas [4]. Dans les pays où les polythérapies anti-rétrovirales sont disponibles, la prévalence des microsporidioses a considérablement diminué, de même que celles des autres parasitoses intestinales opportunistes (cryptosporidiose, cyclosporose, isosporose). Actuellement, les microsporidies sont surtout détectées dans la population infectée par le VIH en Inde, en Thaïlande, en Turquie, en Afrique, au Brésil et au Pérou |5, 6]. Les microsporidioses intestinales sont diagnostiquées de plus en plus fréquemment chez les patients présentant d’autres formes d’immunosuppression, essentiellement les transplantés d’organes solides (foie, cœur-poumons, reins), notamment après le renforcement du traitement immunosuppresseur pour éviter un rejet. La malnutrition et le vieillissement constitueraient également des facteurs de risque selon des enquêtes réalisées dans une maison de retraite et des orphelinats en Espagne.
Figure 1 – Organisation typique d’une spore de microsporidie.
Des cas d’infections à E. bieneusi et E. intestinalis sont également rapportés chez des patients immunocompétents, voyageant ou séjournant en zone tropicale ou subtropicale (Caraïbes, Afrique, Asie, Moyen-Orient) et plus exceptionnellement chez des patients sédentaires |5, 6]. Chez l’immunocompétent, la symptomatologie se limite le plus souvent à une diarrhée spontanément résolutive. La pathogénie d’E. bieneusi et d’E. intestinalis est probablement sous-estimée chez les patients non infectés par le VIH, immunodéprimés ou non, du fait que ce diagnostic est rarement évoqué par les cliniciens chez ces patients. Une seule étude publiée en 2003 a révélé la présence dans les selles de patients portugais souffrant de diarrhées, 22 infectés par le VIH et 3 non infectés par le VIH, de spores d’une troisième espèce [7]. L’analyse génomique a montré qu’elle était très proche de Vittaforma corneae (96 % d’homologie) responsable de kératites et d’infection
disséminée. Plusieurs modes de contamination sont possibles : contamination féco-orale, contamination par ingestion ou inhalation de spores, contamination par les aérosols [8]. La transmission directe de personne à personne a été évoquée dans plusieurs études. Par ailleurs, le portage asymptomatique est possible quel que soit le statut immunitaire de l’hôte. Une étude sérologique indique des taux relativement importants de prévalence d’anticorps anti-E. intestinalis chez des donneurs de sang néerlandais (8 %) et des femmes enceintes françaises (5 %) [9]. La détection d’ADN d’E. bieneusi et d’E. intestinalis dans des eaux de surface, des eaux d’égouts ou des eaux utilisées pour la consommation humaine suggère également la possibilité de contamination à partir de sources environnementales [8]. Les deux espèces ont été identifiées dans les échantillons de selles d’animaux d’élevage et de compagnie. Enterocytozoon bieneusi est également présente chez des mammifères sauvages ainsi que chez des oiseaux (poulets d’élevage industriel et pigeons en zone urbaine). La mise en évidence par analyse phylogénétique de génotypes identiques chez l’homme et certaines espèces animales atteste également d’une transmission zoonotique [10].
2. Agents pathogènes Le cycle évolutif des microsporidies se déroule en deux phases, une phase proliférative (mérogonie) suivie d’une phase de sporulation (sporogonie) qui se succèdent à l’intérieur de la cellule hôte. Les stades de développement générés au cours de la mérogonie sont appelés des mérontes alors que les sporontes, les sporoblastes et les spores sont successivement produits au cours de la sporogonie. Les spores sont excrétées dans le milieu extérieur avec les selles, les urines et les sécrétions respiratoires des patients infectés. La spore (figure 1) est la forme de développement la plus caractéristique du cycle évolutif. Sa paroi est constituée par une double enveloppe composée d’une exospore protéique et d’une endospore plus épaisse, essentiellement faite de chitine. L’endospore recouvre la membrane
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COPROLOGIE PARASITAIRE
plasmique délimitant le sporoplasme, élément infectieux formé par le cytoplasme et un ou deux noyaux. La spore possède une structure caractéristique, le filament (ou tube) polaire qui, rigide à la partie antérieure, s’enroule en un nombre variable de spires occupant les 2/3 postérieurs de la spore. Un système de membranes formant un empilement de saccules aplatis et désigné par le terme de polaroplaste, entoure la portion rectiligne (manubrium) du filament polaire qui s’insère au disque d’ancrage plaqué sous la paroi à l’extrémité antérieure de la spore. Une vacuole est visible à la partie postérieure de la spore. Le processus d’infestation est spécifique des microsporidies. L’extrusion du filament polaire, induit par l’augmentation brutale de la pression intrasporale, entraîne l’expulsion du sporoplasme infectieux qui est directement inoculé dans le cytoplasme de la cellule hôte (figure 2) [11]. Les spores matures d’E. bieneusi sont oviformes, mesurant 1,0 à 1,6 μm sur 0,6 à 0,9 mm, avec à l’intérieur le filament polaire, formant 4 à 5 ou 6 à 7 tours de spires disposés sur deux rangs, autour d’un noyau unique. Les entérocytes de l’intestin grêle (duodénum, jéjunum) sont le site privilégié de l’infection (figure 3). L’extension aux cellules épithéliales nasales, bronchiques et de l’arbre biliaire est parfois observée. Le développement s’effectue directement dans le cytoplasme de la cellule hôte et les stades parasitaires se localisent au pôle apical de la cellule, entre la bordure en brosse et le noyau. Les spores d’E. intestinalis plus grandes mesurent 1,5 à 2,0 μm sur 1,0 à 1,2 μm et ne possèdent qu’un seul noyau. Le filament polaire forme 4 à 7 tours de spires disposés en une seule rangée. Les étapes du cycle se déroulent à l’intérieur d’une vacuole parasitophore, provenant vraisemblablement de la membrane de la cellule hôte. Encephalitozoon intestinalis se développe dans les entérocytes, comme dans les macrophages, les fibroblastes et les cellules endothéliales du chorion ce qui explique la dissémination de l’infection à d’autres organes, le rein notamment. Les spores de Vittaforma spp. mesurent entre 1,8 à 3,6 μm sur 1,0 à 1,4 mm. Tous les stades de développement sont diplocaryotiques et entourés par le réticulum endoplasmique de la cellule hôte.
Figure 2 – Le tube polaire (flèche) décharge son contenu dans une invagination de la membrane plasmique (*) de la cellule hôte apparemment formée à son contact (x 30 000).
D’après A. Magaud.
Figure 3 – Spores (flèches) d’E. bieneusi dans un entérocyte altéré de la muqueuse jéjunale d’un patient infecté par le VIH et souffrant de diarrhée chronique.
3. Diagnostic La localisation intracellulaire des stades de développement, la taille très réduite (1 à 4 μm) des spores émises dans les selles et leurs propriétés tinctoriales particulières rendent difficile la détection des microsporidies intestinales. Ainsi, les premiers diagnostics reposaient uniquement sur l’analyse ultrastructurale et histologique de biopsies de l’intestin grêle. Depuis, un panel de techniques réalisables en routine ont été développées permettant la recherche des microsoporidies par microscopie optique, immunodétection et PCR dans différents échantillons biologiques.
3.1. Microscopie électronique L’examen en microscopie électronique des tissus permet le diagnostic et l’identification de l’espèce en cause d’après la configuration nucléaire, la morphologie des spores et du tube polaire, les caractéristiques des phases de déve-
Photo I. Desportes-Livage. NCH = noyau cellule hôte.
loppement du parasite, le mode de division et l’interface hôte-parasite. Comme pour d’autres infections opportunistes décrites au cours du sida, telles que la pneumocystose et la cryptosporidiose, l’analyse ultrastructurale de toutes les biopsies réalisées a révélé l’existence de sites jusqu’alors inconnus de l’infection. L’examen en microscopie électronique d’échantillons de selles ou de liquides biologiques est possible mais il ne REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - MARS 2012 - N°440 //
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permet d’observer que l’ultrastructure des spores. Sa sensibilité est faible car seul un faible volume de l’échantillon peut être observé. Même si la microscopie électronique reste une méthode de référence, la lourdeur de sa réalisation exclut son utilisation en routine.
3.2. Histologie L’examen histologique des biopsies intestinales (duodénum, jéjunum) conserve une place dans le diagnostic, notamment lorsque l’examen parasitologique des selles est négatif. Il permet surtout l’étude des aspects physiopathologiques et des modifications architecturales de la muqueuse intestinale liée à l’infection. Les microsporidies ne sont pas facilement identifiables avec les colorations classiques comme la coloration au Gram ou à l’hématoxyline-éosine [12]. Les colorations par le Giemsa, le bleu de toluidine O, le Gram modifié, le Warthin-Starry ou le trichrome sont plus performantes. Les parasites sont détectés grâce à leur localisation caractéristique intraentérocytaire en position supranucléaire. Les techniques de fluorescence directe par marquage par un fluorochrome sont sensibles, rapides et faciles à réaliser tant sur les appositions que sur les coupes de tissus inclus en paraffine.
3.3. Microscopie optique Les seuls stades de développement extracellulaires sont les spores que l’on peut rechercher dans divers liquides biologiques.
3.3.1. Examen direct des selles Le moyen de diagnostic le plus aisé est la détection directe des spores de microsporidies dans les selles car il n’est pas invasif. Cependant, leurs dimensions très réduites ne permettent pas de les distinguer des bactéries fécales si la méthode de détection n’est pas appropriée. De nouvelles méthodes de coloration ou de marquage par un fluorochrome ont donc été proposées et validées. 3.3.1.1. Techniques de concentration Certains auteurs constatent que l’examen direct des selles est d’un rendement supérieur à celui des techniques de concentration qui entraînent une perte importante de spores, et parfois des résultats faussement négatifs [13]. D’autres techniques de concentration comme la sédimentation à l’éther ou la centrifugation des échantillons à différentes vitesses semblent améliorer la récupération des spores |14, 15]. 3.3.1.2. Méthodes de coloration • Colorations au Giemsa et au Gram Le Giemsa est la première utilisée (1990), le cytoplasme des spores apparaît coloré en bleu-gris, et parfois on peut voir le noyau violet caractéristique. La présence de trop nombreuses bactéries et levures dans les selles rend la lecture particulièrement difficile et n’est pas adaptée au dépistage en routine. Le Gram pose les mêmes difficultés de lecture puisqu’il n’y a pas de contraste entre les spores de microsporidies et le fond de la préparation [16].
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• Coloration trichromique de Weber et techniques dérivées Cette technique utilise un colorant dérivé du trichrome classique de Wheatley, le chromotrope 2R, à une concentration 10 fois supérieure à celle utilisée habituellement pour la coloration des amibes et des flagellés, en raison de la pénétration plus difficile du colorant à l’intérieur des spores de microsporidies [17]. Les spores apparaissent en rose-brillant sur un fond verdâtre très pâle. La coloration au niveau de la spore est inhomogène et apparaît plus intense à l’intérieur de la spore donnant un aspect de spore barrée ou d’un T à l’intérieur de la spore. La vacuole postérieure transparente est nettement discernable. Quelques bactéries fécales, notamment les cocci de taille voisine, et les levures peuvent aussi se colorer en rouge, mais leur forme et leur profil de coloration évitent la confusion. Plusieurs équipes ont alors apporté des modifications à cette technique de coloration proposée par Weber. La technique publiée par Kokoskin est significativement meilleure que l’originale [18]. Les spores de microsporidies apparaissent plus intensément colorées, sur un fond plus clair, mais surtout le temps de coloration est réduit de 80 minutes. En 1995, dans le laboratoire de parasitologie du CHU de la Pitié-Salpêtrière, nous avons optimisé la technique proposée par Koskokin [14]. Les résultats obtenus à partir d’échantillons de selles contenant de nombreuses spores de petite taille de type E. bieneusi ou de grande taille de type E. intestinalis sont présentés figures 4 et 5.
Optimisation de la coloration trichromique de Weber modifiée par Kokoskin Solution préconisée : - chromotrope 2R 6g - fast green 0,6 g - acide phosphotungstique 1,4 g Ajouter à la solution 3 ml d’acide acétique glacial, laisser reposer 30 minutes à l’abri de la lumière et ajouter enfin progressivement 100 ml d’eau distillée. L’eau peut être ajoutée en premier, mais il faut alors déposer la préparation sur agitateur magnétique pendant 15 minutes. La solution colorante est chauffée à 50 °C à l’étuve et doit être maintenue à cette température pendant toute la coloration. - Plonger les lames 10 minutes dans le colorant. - Rincer rapidement à l’eau. - Différencier 10 s dans l’alcool acétique en agitant légèrement. - Rincer rapidement à l’éthanol à 95°, le jeter et plonger les lames 5 minutes dans l’éthanol à 95°. - Laisser sécher les lames et observer à l’objectif x 100 à l’immersion. Enfin, une technique combinant la coloration par une solution de carbofuschine, la décoloration alcoolo-acide et la coloration trichromique modifiée permettrait de détecter sur une même lame les oocystes de Cryptosporidium spp. et les spores de microsporidies [19]. Cependant, quelle que soit la technique, la lecture est fastidieuse et requiert un « œil expérimenté » surtout si les spores sont rares dans l’échantillon.
COPROLOGIE PARASITAIRE
Figure 4 – Spores d’E. bieneusi dans les selles d’un patient infecté par le VIH. Coloration trichromique modifiée (x 1 000).
• Coloration par les fluorochromes Les fluorochromes (Uvitex 2B, Calcofluor White 2MR et Fungifluor) se fixent électivement sur la chitine présente dans la paroi des spores de microsporidies et lui confère un aspect bleu brillant sous lumière ultra-violette. Van Gool et al. ont proposé une technique de fluorescence directe utilisant l’Uvitex 2B, pour la recherche des microsporidies dans les selles [20]. La lecture est effectuée sur un microscope à fluorescence, équipé d’un couple de filtres particuliers, permettant une excitation entre 355 et 425 nm et une émission à 460 nm. Les spores présentent une fluorescence bleue très prononcée au niveau de la périphérie, sur fond noir (figure 6). Cette coloration de réalisation rapide, de lecture facile, apporte encore un plus pour le diagnostic. Cependant, elle s’avère moins spécifique si les selles contiennent d’autres éléments riches en chitine. En effet, les fongiques apparaissent aussi bleu-fluorescent. Si la taille permet d’écarter les levures, il n’en est pas toujours de même de certaines spores de champignons filamenteux. Des débris d’origine végétale peuvent également être marqués.
Figure 5 – Spores d’E. intestinalis dans les selles d’un patient infecté par le VIH. Coloration trichromique modifiée (x 1 000).
3.3.2. Examen direct d’autres liquides biologiques Les spores d’E. bieneusi et d’E. intestinalis peuvent être également recherchées dans les liquides d’aspiration duodénale, la bile, les urines, les lavages bronchioloalvéolaires, le jetage nasal, les ponctions sinusales. Le nombre de spores excrétées dans ces prélèvements pouvant être très faible, une centrifugation préalable à grande vitesse (minimum 1 500 x g) est indispensable pour les concentrer dans le culot de centrifugation.
3.4. Immunodiagnostic La mise au point des premières techniques d’immunofluorescence indirecte (IFI) utilisant des anticorps polyclonaux a montré l’existence de communautés antigéniques entre plusieurs espèces de microsporidies.
Figure 6 – Spores d’E. bieneusi dans les selles d’un patient infecté par le VIH. Coloration à l’Uvitex 2B (x 1 000).
Technique de coloration de Van Gool Réactifs - Uvitex 2B : préparer une solution à 1 % dans du tampon PBS (pH = 7.4) à conserver à l’abri de la lumière. - Solution de Bleu Evans à 1 % dans du tampon PBS. L’étalement des selles est fait sur lame à spot de 1,3 cm de diamètre. Toute la coloration doit être effectuée à l’abri de la lumière. - Recouvrir l’étalement de la solution d’Uvitex 2B à 1 % et laisser agir 15 minutes. - Rincer à l’eau distillée. - Recouvrir l’étalement de la solution de Bleu Evans à 1 % pendant 5 minutes. - Rincer à l’eau distillée et laisser sécher. La lecture se fait à l’objectif x 100 à l’immersion au microscope à fluorescence. REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - MARS 2012 - N°440 //
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Figure 7 – Marquage en IFI par l’IG2a de la paroi des spores d’E. bieneusi dans les selles d’un enfant de 7 ans transplanté rénal (x 1 000).
aux techniques classiques de coloration (trichrome modifié et Uvitex 2B) et à la PCR, de façon prospective aux CHU de Bordeaux et de la Pitié-Salpêtrière (> 600 prélèvements de selles) et dans 2 enquêtes réalisées en Afrique chez des patients infectés ou non par le VIH [23, 24]. Elle s’est avérée plus sensible que les techniques de coloration et aussi performante que la PCR utilisant des amorces spécifiques des 2 espèces, encore réservée aux laboratoires spécialisés. L’IgG2a anti-exospore d’E. bieneusi et l’IgG1 anti-endospore d’E. intestinalis sont commercialisés par Bordier Affinity Products SA (www. bordier.ch).
3.5. Diagnostic moléculaire
Figure 8 – Marquage en IFI par l’IG1 de la paroi des spores d’E. intestinalis dans les selles d’un patient infecté par le VIH (X 1000).
Photo M. Thellier.
Des anticorps polyclonaux produits contre les différentes espèces du genre Encephalitozoon ont ainsi permis de détecter des spores d’E. bieneusi et d’E. intestinalis dans des échantillons cliniques [21]. Du fait de leur réactivité croisée, la détection spécifique d’une espèce donnée est difficile. Deux anticorps monoclonaux spécifiques de la classe des IgG dirigés respectivement contre la paroi des spores d’E. bieneusi [15] et d’E. intestinalis [22] ont été produits et appliqués à la détection des parasites par IFI dans les selles de patients infectés. Le marquage franc de la paroi des spores matures permet de les visualiser à un faible grossissement, ce qui facilite le diagnostic même pour un observateur non expérimenté (figures 7 et 8). La technique a été évaluée et validée par comparaison
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Le séquençage de différents gènes chez plusieurs espèces de microsporidies infestant l’homme a permis l’application de la PCR au diagnostic et au génotypage de ces parasites. Des techniques ciblant essentiellement les séquences du gène codant pour la petite sous-unité ribosomale de l’ARN (ARNr 16S) et plus rarement des séquences de la région intergénique non transcrite (ITS) ou du gène codant pour la grande sousunité ribosomale de l’ARN (ARNr 23S) ont été mises au point. Les amorces décrites sont soit spécifiques d’une seule espèce, notamment d’E. bieneusi ou d’E. intestinalis, soit spécifiques du genre Encephalitozoon, soit universelles et amplifient l’ADN de la plupart des microsporidies humaines. Dans ce dernier cas, plusieurs méthodes peuvent être mises en œuvre pour identifier spécifiquement l’espèce de microsporidie détectée. Elles incluent le séquençage du fragment d’ADN amplifié et la comparaison à des séquences connues, l’analyse des amplicons par hybridation à l’aide de sondes nucléiques spécifiques de différentes espèces (Southern-blot) ou bien la digestion par des enzymes de restriction (RFLP, restriction fragments lenght polymorphism). Les méthodes de préparation des échantillons pour le diagnostic moléculaire des microsporidies sont détaillées dans la revue de Weiss et Vossbrinck [25]. La technique utilisée peut significativement affecter la sensibilité de la technique de PCR mise en œuvre. Les acides nucléiques peuvent être extraits des différents échantillons cliniques aussi bien par des méthodes standards comme la digestion par la protéinase K suivie d’une extraction par le chloroforme et d’une précipitation par l’éthanol ou à l’aide de kits commerciaux (e.g. QIAmp DNA stool mini kit, Qiagen) ou encore par des méthodes automatisées (e. g. MagNA Pure LC, Roche). L’extraction peut parfois être réalisée à partir des coupes en paraffine utilisées en histopathologie (kits commerciaux spécifiques DexPat) et des lames de selles fixées et colorées par le trichrome modifié ou le Giemsa. Un autre procédé utilisant des flitres FTA® imprégnés (solution chimique brevetée, Whatman) permet la lyse des membranes cellulaires et la dénaturation des protéines lors du dépôt de l’échantillon. Les acides nucléiques alors immobilisés et stabilisés peuvent être stockés à température ambiante. Cependant l’extraction et l’amplification de l’ADN à partir des prélèvements de selles reste difficile néces-
COPROLOGIE PARASITAIRE
sitant souvent le recours à une rupture mécanique de la paroi des spores et/ou un prétraitement des échantillons avant l’extraction. La pulvérisation des spores à l’aide de billes de verre associée à la digestion par la protéinase K, la lyticase ou la chitinase semblent efficaces. Les selles peuvent contenir des inhibiteurs de PCR dont la présence peut être bloquée par l’emploi d’hypochlorite de sodium 0,5 %, de thiocyanate de guanidine, d’hydroxyde de potassium, de dithiothretol, d’hexadecyltrimethylammonium bromide ou inactivée par chauffage des échantillons. Une dilution des échantillons est parfois nécessaire. La PCR est une technique sensible, spécifique et reproductible qui permet un diagnostic d’espèce. La limite de détection de 102 spores/g de selles est beaucoup plus faible que pour l’examen en microscopie optique des selles qui est de l’ordre de 104 à 106/g [26]. Plusieurs techniques de PCR en temps réel ont été publiées. Cette technologie détecte les amplicons au fur et à mesure qu’ils s’accumulent via l’interaction avec des agents intercalants ou des sondes fluorescentes dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés. De plus, elle utilise des systèmes en tubes fermés et dispense des manipulations post-amplification ce qui permet d’augmenter le débit et de réduire les risques de contamination inhérents à la PCR. Un contrôle interne peut permettre de détecter l’inhibition de l’amplification par les contaminants fécaux. La technique publiée par Menotti et al. en 2003 qui utilise des amorces spécifiques de l’ARNr 16S d’E. intestinalis pour rechercher le pathogène dans différents échantillons cliniques s’avère être extrêmement sensible avec une limite de détection estimée à 20 spores/mL [27]. Elle a ainsi permis de montrer la dissémination de l’infection par voie hématogène, en détectant l’ADN dans le sang de certains patients. Le tropisme tissulaire d’E. intestinalis pour certains organes s’est traduit par la présence de fortes charges parasitaires dans des selles, des urines ou des prélèvements broncho-pulmonaires. Enfin, les PCR multiplex en temps réel permettant la détection simultanée d’E. bieneusi et d’E. intestinalis [28] voire celle d’autres pathogènes intestinaux (Cyclospora cayetanensis, Isospora belli) [29] dans les selles des patients infectés, se développent. Les séquences de la plupart des amorces utilisées pour l’amplification des microsporidies humaines, ainsi que les températures d’hybridation recommandées et la taille attendue des amplicons (pour les techniques de PCR conventionnelles) sont compilées dans la revue de Ghosh et al. [30]. La PCR est applicable au diagnostic et à l’identification d’E. bieneusi et d’E. intestinalis avec une sensibilité et une spécificité de 100 % dans certaines conditions. Par ailleurs, beaucoup d’infections chez des patients modérément immunodéprimés ou immunocompétents qui excrètent de faible quantité de spores dans les selles ne sont pas diagnostiquées par les techniques classiques.
variable des anticorps chez les patients immunodéprimés, de l’impossibilité de différencier une infection aigue d’une infection ancienne, de la prévalence élevée des anticorps dans la population immunocompétente et de l’existence de réactions croisées entre les différentes espèces. Toutefois, les analyses sérologiques pourraient s’avérer utiles pour dépister les infections subcliniques chez des patients qui sont susceptibles de les transmettre à des patients à risque (e.g. transplantés d’organes solides) ou chez ceux qui pourraient réactiver l’infection dans des conditions d’immunodépression.
3.7. Approches diagnostique et thérapeutique
3.6. Tests sérologiques
À l’heure actuelle, pour établir le diagnostic de microsporidiose intestinale chez un patient, il semble justifié de pratiquer, dans un premier temps, la recherche de spores dans les selles avant tout examen invasif. Cet examen parasitologique des selles permet un bon rendement diagnostique dans la majorité des cas et est au moins aussi sensible (sinon plus) que l’examen histologique des biopsies intestinales, en raison de la distribution en foyers des microsporidies, de la petite taille de tissu prélevé et de la difficulté pour les endoscopistes à sélectionner les zones à biopsier. En pratique, pour le diagnostic de routine, les deux techniques de colorations classiques, chromotrope 2R et Uvitex 2B, sont réalisées simultanément pour accroître la fiabilité du diagnostic. L’emploi d’une coloration chimiofluorescente, comme l’Uvitex 2B de Van Gool, garantit une excellente sensibilité et son association avec une coloration au trichrome de Weber, qui se caractérise par une bonne spécificité, permet un dépistage parasitologique satisfaisant. Même si cette approche diagnostique apparaît simple et d’un coût peu élevé, elle requiert une grande expertise et surtout ne permet pas le diagnostic d’espèce. Si les sujets immunocompétents peuvent guérir spontanément, un traitement efficace est indispensable pour les patients immunodéprimés présentant une diarrhée chronique pouvant grever leur pronostic vital [5, 32]. L’identification de l’espèce en cause, par PCR ou immunomarquage à l’aide d’anticorps monoclonaux, reste indispensable pour orienter le traitement. Pour E. intestinalis, l’administration d’albendazole à la dose de 400 mg deux fois par jour pendant 3 semaines, conduit à une amélioration clinique franche, à la négativation de l’ensemble des prélèvements aussi bien digestifs qu’urinaires. Pour E. bieneusi, à l’heure actuelle, seule la fumagilline permet d’éradiquer le parasite, à la fois dans les selles et dans les biopsies. La dose curative efficace est de 60 mg/jour pendant 14 jours. L’analyse par PCR en temps réel d’échantillons de selles de 6 patients traités par fumagilline au cours de l’essai thérapeutique ANRS 090 a permis de montrer une réduction moyenne de 4,7 log de l’ADN d’E. bieneusi dans les selles après 2 semaines de traitement [33].
Les tests sérologiques, ELISA, IFI, western blot, agglutination directe [31], ne sont pas recommandés à l’heure actuelle pour le diagnostic en raison de l’expression
Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article. REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - MARS 2012 - N°440 //
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