Diagnostic moléculaire de la résistance de Mycobacterium tuberculosis aux antituberculeux

DIAGNOSTIC MOLiCULAIRE DE LA RiSISTANCE DE MYCOBACTERIUM TlJBERCULOSlS AUX ANTITUBERCULEUX Wladimir

Sougakoff

Emmanuelle

as*, Chantal

Cambaua,

Truffot-Pernot

Nadine

Lemaitrea,

a, Michel

Vincent

Szpytmaa,

Jarhera

R&urn6

other antimycobacterial

Les nouveaux moyens issus de la biologie moleculaire ont modifie les approches utilisables pour detecter la resistance de A4ycobacterium

tuberculosis

nique de I’antibiogramme

aux antibiotiques.

Bien que la tech-

par la methode des proportions

reste la

for the detection quinolones,

drugs. DNA sequencing

of resistance

is a powerful

to rifampin, pyrazinamide

but not to isoniazid.

However, the technique

high-density

oligonucleotide

examine large amounts of DNA sequences

could allow to simulta-

a large number of mechanisms

determination de sequences nucleotidiques. Apparemment attrayante, la technique SSCP n’a jamais ete utilisee en routine en

This new approach

represents

rapid analysis of genomic

raison de defauts techniques majeurs. La methode LiPA, plus simple et plus fiable, permet la detection rapide de la resistance a la rifam-

Mycobacteria

picine, mais cette technique

- antibiotics

La determination

of

arrays that can be used to rapidly

neously investigate

loppee pour d’autres antibiotiques.

requires

specific facilities which are very costly. Finally, the development

methode de reference, des techniques plus rapides sont aujourd’hui disponibles, telles que I’analyse PCR-SSCP, I’hybridation LiPA ou la

est delicate et n’a pas encore ete deve-

tool

and fluoro-

a very promising

of resistance.

alternative

for the

regions involved in drug resistance.

- Mycobacterium - resistance

tuberculosis

- molecular

- tuberculosis

diagnosis.

de la sequence

nucleotidique d’ADN amplifie est la technique la plus puissante, mais elle necessite un appareillage specifique tres couteux. Elle peut etre utilisee pour la detection pyrazinamide detection

de la resistance a la rifampicine, au

et aux fluoroquinolones,

mais difficilement

pour la

de la resistance a I’isoniazide. Dans I’avenir, le developpe-

ment des ‘
tuberculosis.

1. Introduction

M

ycobacterium

tuberculosis est naturellement resistant e un grand

nombre d’antibiotiques, tels que les p-lactamines, les macrolides,

les cyclines, les sulfamides, les glycopeptides permeabilite de la paroi mycobacterienne

Mycobacteries

- Mycobacterium

- antibiotiques

- resistance

tuberculosis

- diagnostic

et les quinolones

clas-

siques. Cette resistance naturelle est en grande partie lice a la faible - tuberculose

molkulaire.

qui est epaisse et tres riche

en lipides, en particulier en acides mycoliques, ainsi qu’a d’autres mecanismes comme la production de P_lactamases qui contribuent a la resistance naturelle des mycobacteries

aux P_lactamines, ou la mauvaise

affinite de la cible (proteines liant la penicilline, ADN gyrase) [l]. La resistance acquise aux antituberculeux chez M. tuberculosis est l&e Summary The development modified

of new technical tools for molecular

the methods

Mycobacterium

used for the identification

tuberculosis.

Although

generally remains the reference

biology has

of resistance

the proportion

in

method

method, more rapid and sophisti-

a des mutations

qui modifient

chromosomiques

qui cadent soit pour des proteines cibles de certains

antibiotiques

la sequence

nucleotidique

(ADN gyrase et fluoroquinolones,

de genes

ribosome et strepto-

mycine, ARN polymerase et rifampicine), soit pour des enzymes impliq&es

dans I’activation de I’antibiotique en substance active (catalase

cated techniques are now available, such as PCR-SSCP analysis, LiPA hybridization and DNA sequencing. At present, PCR-SSCP

et isoniazide, pyrazinamidase

analysis is no longer used in routine.

la cible pour I’antibiotique, alors que dans le deuxieme, elles empechent

The INNO-LiPA

assay, which

is well adapted to routine, allows the rapid determination of rifampin resistance, but is not developed yet for detecting resistance to

et pyrazinamide)

I’activation de I’antibiotique.

La proportion

sents au sein de la population

que toute caverne tuberculeuse, (> 1 Os), contient batteries

avant tout traitement

est administre en monotherapie.

initiale du traitement de la tuberculose

C’est pourquoi la phase

repose toujours sur I’associa-

tants qui sont toujours presents. Une telle strategic n’atteint son but que dans le cas oti au moins deux des antibiotiques

fevrier, accept6 le

20

avril

1999.

actifs sur la souche de M. tuberculosis migratoires en provenance

des Laboratoires,

[l]. De ce fait, il y a un

tion de plusieurs antibiotiques pour eviter la selection des mutants resisadministres sont

en cause. En raison des flux

de regions ou la resistance aux antituber-

culeux est frequente [81, et de l’emergence de souches multiresistantes

0 Elsevier,Paris. Revue Fran&e

ce qui fait

un certain nombre de myco-

deja resistantes a un antituberculeux

tuberculeux

Correspondance 16

et 1 O-* (rifampicine),

en raison de sa richesse en bacilles

risque tres Blew? de selectionner des mutants resistants lorsqu’un anti-

a Laboratoire de bact&riologie-hygiene Groupe hospitalier Piti&Salp&riBre 47-63, bd de I’Hapital 75651 Paris cedex 13

article recu le

de mutants resistants pre-

initialement sensible est generalement

comprise entre 1 O-5 (streptomycine)

l

[5, 61. Dans le premier

cas, les mutations acquises entrainent une diminution de I’affinite de

yin

1999,

No 314

25

Diagnostic

mol&ulaire

en pathologie

infectieuse

observee au cows de ces dernieres annees, les risques d’echec the-

Une proportion

rapeutique

portent pas de mutation dans les genes katG et inhA. On a pu mettre

par selection

de mutants

resistants

ne sont pas negli-

significative

de souches resistantes

a I’isoniazide ne

geables et justifient la determination, dans un dolai aussi court que pos-

en evidence, chez 10 B 15 O/od’entre elles, des mutations

sible, de la sensibilite

lorsque l’on est en

I’expression du gene ahpC codant pour une alkyl hydroperoxide reduc-

presence dune forme tres riche en bacilles (formes a examen micro-

tase qui joue un role dans I’adaptation des batteries au stress oxydatif.

scopique

On pense aujourd’hui que ces mutations ne sont pas directement res-

positif). La methode des proportions

pour apprecier requiere

initiate aux antituberculeux

la sensibilite

habituellement

aux antibiotiques

utilisee

de IL1. tuberculosis

un delai minimum de 4 semaines, les methodes

ponsables

en milieu

de la resistance

modifiant

a I’isoniazide, mais compenseraient

diminution d’activite catalase-peroxydase

une

chez certaines souches [91.

liquide necessitant 2 semaines [141. Les techniques de biologie mole-

D’autres genes pourraient dgalement jouer un role dans la resistance

culaire, qui permettent

a I’isoniazide, en particulier le gene kasA qui code pour une j3-ketoa-

resistance

de detecter

les mutations responsables

en 2 a 3 jours, suscitent

un vif inter& et I’espoir d’un dia-

gnostic rapide de la resistance. Cependant, aujourd’hui

leur utilisation est encore

limitee par la diversite des mecanismes

la resistance de M. tuberculosis plexite des methodes

de la

responsables

aux agents antituberculeux,

de mise en evidence

ponctuelles

ont ete

a partir de souches resistantes B I’isoniazide 191.

de

et la com-

des mutations

cyl ACP synthase et dans lequel des mutations recemment d&rites

corres-

pondantes.

2.3.

Pyraztnamide

La cible moleculaire et le mecanisme d’action du pyrazinamide sont encore mal connus. Comme I’isoniazide, le pyrazinamide ne devient actif qu’apres transformation. II est transforme en acide pyrazino’ique par une enzyme qui est une amidase appelee pyrazinamidase. Bien que ce meca-

2. Mkanismes de resistance aux antituberculeux

nisme d’activation soit encore mal compris, on sait que la grande majorite des souches resistantes au pyrazinamide portent des mutations dans le gene pncA qui code pour la pyrazinamidase. A I’instar de ce qui a ete vu plus haut pour le gene katG, les mutations d&rites

dans pncA sont

tres variees, incluant un grand nombre de substitutions, mais aussi des

Rrfamprcine

2.1.

insertions et des deletions &parties sur toute la longueur du gene pncA. La rifampicine et les autres rifamycines (rifabutine, rifapentine) sont des

Dix a 30 O/odes souches resistantes au pyrazinamide n’ont pas de muta-

antibiotiques

tions dans le gene pncA, ce qui suggere que d’autres mecanismes pour-

qui agissent en se fixant a la sous-unite p de I’ARN poly-

merase, ce qui perturbe la synthese des ARN messagers tion). Chez M. tuberculosis, picine

portent

97 % des souches

des mutations

(transcrip-

raient etre impliques dans la resistance a cet antibiotique.

resistantes a la rifam-

dans le gene rpoB

codant

pour la

2.4.

Fluoroquinolones

sous-unite p de I’ARN polymorase. Ces mutations concernent plus particulierement une region bien delimitee du gene, comprise entre les resi-

Cemergence

dus 507 et 533 [61. Une modification de la serine en position 531 est

a suscite un interet croissant pour de nouveaux antibiotiques,

recente de souches de M. tuberculosis

observee chez environ 50 Yo des souches resistantes a la rifampicine,

ticulier pour les fluoroquinolones.

Cutilisation

multiresistantes en par-

des fluoroquinolones,

et une modification de I’histidine en position 526 chez environ 30 O/o.II

molecules a activite significativement

faut remarquer que les modifications

proteine RpoB entrainent aussi une resistance croisee vis-s-vis de la

vie de la selection de souches resistantes. Ces souches portent en general des mutations dans le gene gyrA codant pour la sous-unit6

rifabutine [9]. Recemment, un autre mecanisme de resistance a la rifam-

A de I’ADN gyrase, la cible preferentielle

picine a ete decrit chez les mycobacteries

M. tuberculosis

de la production tion

des residus 526 et 531 dans la

a croissance rapide. II s’agit

d’une enzyme inactivant I’antibiotique

[l 11,mais ce mecanisme n’a pas ete observe chez

par ribosyla-

le gene gyr6 codant pour la sous-unite 2.5.

lsoniazrde

Cisoniazide est une molecule qui doit subir une transformation codee par le gene katG,

enzypour

Environ 50 % des

souches resistantes a I’isoniazide portent des mutations dans le gene katG.

Ces mutations

d’acides sequence

correspondent

amines, des deletions polypeptidique

vite catalasique

a des substitutions

ou des insertions

ponctuelles

interrompant

la

de KatG, ce qui entraine la perte de I’acti-

quee dans la biosynthese Carrier Protein), reductase

des acides mycoliques

: I’enoyl-ACP (Acyl

codee par le gene inhA.

Dix a 25 a/o des

souches resistantes a I’isoniazide portent des mutations dans le gene qui sont generalement

a I’isoniazide

associees a un bas niveau de resistance

(CM1 <2 mg/ml) et a une resistance

croisee a I’ethio-

constituants

de la paroi des

est lice a des mutations

qui code pour une arabinosyl transferase impli-

de base de la paroi des mycobacteries.

peuvent entrainer soit une augmentation proteines Emb, soit des modifications

Ces mutations

du niveau de synthese des

structurales

au sein de la pro-

teine EmbB (concernant la methionine en position 306 en particulier). Elles sont observees

chez environ 65 o/, des souches de M. tuber-

resistantes a I’ethambutol

et sont associees a un haut niveau

de resistance.

Les autres souches resistantes, qui ont un bas niveau

de resistance,

ne portent pas de mutation dans le gene embB.

2.6.

Streptomycine

La streptomycine 50%

a pour cible la sous-unite 30s du ribosome. Environ

des souches de M. tuberculosis

resistantes a la streptomycine

le sont en raison de mutations qui touchent le gene rpsL codant pour la proteine

latrices sit&es

stitutions Lys43->Arg

une augmenta-

la biosynthese

quee dans la synthese de I’arabinogalactane et du lipoarabinomannane,

namide. Ces mutations concernent le plus souvent les sequences reguen amont du gene inhA et entrainent

B de I’ADN gyrase.’

La resistance a I’ethambutol

de I’operon embCAB

culosis

[9].

II est generalement admis que la molecule resultant de I’activation de I’isoniazide par la catalase a pour cible principale une enzyme impli-

inhA

inhibe specifiquement

mycobacteries.

acquerir son activite vis-a-vis de M. tuberculosis.

chez

Ethambutol

Cethambutol

matique par la catalase-peroxydase,

des fluoroquinolones

121. Des mutations ont egalement ete identifiees dans

M. tubercu-

losis.

2.2.

bactericide, a ete rapidement sui-

ribosomale

S12. Les mutations et Lys88->Gln.

correspondent

aux sub-

La boucle de I’ARN 16s codee

tion du niveau de production de la proteine InhA dans la bacterie. Dans

par le gene rrs, qui interagit avec la proteine ribosomale S12, consti-

ces conditions, des concentrations

d’isoniazide plus importantes sont

tue un autre site de mutation chez 20 O/odes souches resistantes. Enfin,

pour inhiber la cible. Plus rarement, ces mutations affec-

un bas niveau de resistance est trouve chez 30% des souches, mais

necessaires

tent directement 26

le site actif dans la proteine InhA [9].

le mecanisme correspondant

n’est toujours pas identifie.

Revue Franqaise

des Laboratoms,

ym

1999,

No 314

Diagnostic

molkulaire

en pathologie

infectieuse

3. Techniques molkulaires appliqubes 21la detection de la r&istance aux antituberculeux La mise en Evidence par des techniques

de biologie moleculaire des

mutations impliquees dans la resistance de M. tuberculosis aux antibiotiques suscite un vif int&t dans la mesure olj elle ne prend en thko-

1234567

rie que quelques jours au plus, alors qu’avec les techniques classiques d’exploration

phbnotypique

de la sensibilite aux antibiotiques,

les r&sul-

tats ne sont obtenus que dans un d6lai de 2 g 4 semaines, d&lai n&essaire B la croissance bactbrienne. A I’heure actuelle, la plupat-t des techniques de biologie mol6culaire reposent sur une &action d’amplification de I’ADN qui permet d’obtenir, dans un d6lai rapide, une quantitb suffisante de materiel pour permettre

la mise en Evidence de mutations.

Cette derniere &ape peut 6tre r&ali&e lyse de la mobilit

&ectrophor&ique

I’hybridation

reverse sur bandelette

la sequence

nucl&otidique.

3.1.

Canalyse

(single

par trois techniques

: (i) I’ana-

de I’ADN simple brin (SSCP), (ii) (LiPA), et (iii) la determination

de

S

R

R

S

R

SSCP

strand

conformatlonal

polymorphism)

Canalyse SSCP consiste & appr&ier

BlectrophorBtique

de

laforme simple brin d’un fragment d’ADN obtenu par amplification.

la mobilit

En

pratique, apr&s amplification de la portion du gene susceptible de porter les mutations impliqu6es dans la r&sistance, on pro&de

B la d&a-

turation de I’ADN. Les fragments d’ADN simple brin ainsi obtenus sont &par&

par &ectrophor&e

Blectrophoretique

en gel de polyacrylamide,

et leur mobilite

est compar6e & celle des fragments obtenus B par-

tir d’une souche sauvage (sensible) de reference (figure 7) [12]. Cette technique peut 6tre appliqu@e directement aux produits pathologiques lorsque ceux-ci sont riches en bacilles, c’est-g-dire microscopique

lorsque l’examen

est positif. Dans ce cas, les r&sultats peuvent &re obte-

nus moins de trois jours apr&s le pr&vement. nient majeur de la technique petits fragments

Cependant,

I’inconv&

est qu’elle ne permet d’analyser que de

d’ADN (200 g 300 pb) et ne peut done 6tre utilisbe

que si la resistance est due g des mutations regroup&es sur de courtes regions du gene cible, ce qui n’est le cas que pour la rifampicine et les fluoroquinolones. Par ailleurs, il est aujourd’hui clairement Btabli que I’analyse SSCP est peu sensible et qu’elle ne permet pas de d&ecter toutes les mutations, m&me dans le cas le plus simple de la rifampicine. Elle a done BtB abandon&e

au profit de techniques plus fiables,

par ailleurs plus simples $I mettre en ceuvre. 3.2.

Chybndation

LiPA

(line

probe

assay)

Chybridation LiPA consiste a hybrider un fragment d’ADN amplifie avec des sondes specifiques

de la sequence

mutees correspondantes

impliqu6es dans la r6sistance. Les sondes sont

d&j& en place sur une bandelette p&e

sauvage et des &quences

& I’emploi qui est mise en pr&

sence de I’ADN amplifib dans des conditions tion specifique $I une base pr8s. Une r&elation

permettant

une hybrida-

enzymatique, qui se tra-

duit par une reaction color&e, permet de r6v6ler la prbsence ou I’absence d’hybridation au niveau de chaque sonde et, par conskquent, la pr&ence ou I’absence de mutations (figure 2) [lo]. Actuellement, cette technique est commercialis6e sous la forme d’un kit (INN0 LiPA RiffB, Murex) pour la detection de la resistance & la rifampicine. Elle est relativement bien adaptbe g Kquipement ratoire de bact&riologie,

et B I’organisation du travail de routine au labo-

3.3.

Determination

de I’ADN

de la skquence

nucl6otidique

amplifi6

et les premiers r&sultats publies sont encou-

rageants [lo]. En revanche, son coiX est assez BlevB, et elle ne permet

Cidentification

pas I’analyse de grandes regions d’ADN et, rappelons le, elle requiert

determinant

une amplification pr&alable, encore manuelle et hasardeuse. II parait done

[71. Cette methode, g6n&alement

difficilement envisageable de I’appliquer B la detection de la resistance

et tr&s coljteuse,

r6sultant de mutations tr&s dispersbes et pouvant concerner plusieurs

l’&olution

g&nes, comme c’est le cas pour la resistance g I’isoniazide.

en plus performants et maniables. Les resultats obtenus avec ces Bqui-

Revue Fran~alse des Laboratoires,

juin 1999,

N” 314

de mutations prbsentes sur I’ADN peut Btre r&aliGe en

la sequence nucl&otidique est aujourd’hui

technique

de fragments d’ADN amplifies

consid&e applicable

comme tr&s laborieuse en semi-routine

des automates de sequenqage

grace a

qui sont de plus

27

Diagnostic

mokkulaire

en pathologie

infectieuse

tent des mutations connues, comme c’est le cas pour ceux impliques dans la resistance

a la rifampicine, au pyrazinamide

et aux fluoroqui-

nolones. Capplication de la technique pour la detection de la resistance a I’isoniazide semble en revanche plus difficile car plusieurs genes differents sont impliques dans la resistance et de nombreuses rkistantes

de la resistance

2 G

AAACTGGG

ne portent pas de mutations connues.

C

C

T

G

a I’isoniazide, et plus generalement

mecanismes de resistance complexes,

souches

Pour la detection pour celle des

le developpement

recent des

bio-puces a ADN represente une nouvelle approche tres prometteuse [3,4, 131. En effet, avec les bio-puces, I’ADN amplifie peut etre hybride avec plusieurs dizaines de milliers d’oligonucleotides

sondes differents

greffes sur une surface aussi petite que 1 cm2. II devient alors envisageable de rechercher simultanement un grand nombre de mutations

3 A

A

AC

TG

G

dans plusieurs genes, comme cela a ete recemment decrit par Troesch

GAGCTG

et collaborateurs puce permettant

[13] : ces auteurs ont developpe d’effectuer,

et teste une bio-

a partir d’une seule colonie bacterienne

et en moins de quatre heures, I’identification de 26 espkces differentes de mycobacteries

et la detection

lorsque I’espece est M. tuberculosis.

de la resistance

a la rifampicine

Si les puces a ADN sont aujour-

d’hui une realite proche, il faudra toutefois

qu’elles aient et& rigou-

reusement evaluees et qu’elles puissent etre produites a un coirt suffisamment raisonnable avant qu’elles ne soient reellement utilisables en situation de routine. pements sont de tres bonne qualite et leur interpretation

est facilitee

par des logiciels d’aide a I’analyse de sequence

(figure

3). La tech-

nique de sequencage

indiscutable,

presente

enfin I’avantage

com-

4. Conclusion

parativement avec les techniques SSCP et INNO-LiPA, de pouvoir analyser avec une bonne fiabilite des regions de grandes tailles (jusqu’a

es techniques de biologie molsculaire sont d’un grand interet pour

1 000 pb), plusieurs regions pouvant etre analysees simultanement.

L

II n’en demeure pas moins qu’ elle ne peut etre appliquee en pratique

tuberculeux. A I’heure actuelle, I’utilisation en routine de ces techniques

qu’a la mise en evidence

de mecanismes

de resistance

a des anti-

biotiques pour lesquels la grande majorite des souches resistantes por-

de plus en plus sophistiquees

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aux anti-

limitee par la difficulte

a les mettre en ceuvre a un coQt raisonnable.

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28

le diagnostic

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Revue Franyse

des Laboratores,

,u,n 1999,

N” 314