Die cytospektrometrische Proteinbestimmung mit der Tetrazonium-Kupplungsreaktion I. Optimierung der Färbemethode

Acta histochem,

na. 61,

S. 317-329 (1978)

Institut fur Biochemie an der Universitat Graz, Osterreich (Vorstand: Prof. Dr. E. SCHAUENSTEIN)

Die cytospektrometrische Proteinbestimmung mit der Tetrazonium-Kupplungsreaktion 1. Optimierung der Farbemethode The cytospectrophotometrical determination of proteins by the tetrazonium coupling reaction I. Optimization of the staining method Von

GERHARD NOHAMMER

Mit 6 Abbildungen (Eingegangen am 4. Oktober 1977)

Zusammenfassung Die Tetrazonium-Kupplungsreaktion mit Echtblau B und 6-Hydroxynaphthalinsulfonsaure· (2).Natriumsalz dient zum histochemischen Proteinnachweis. Echtblau B reagiert mit Histidin, Tyrosin und in geringerem Mall auch mit Tryptophan. Die histochemische Tetrazonium-Kupplungsreaktion ergab nach Optimierung der Reaktionsbedingungen eine spezifische, reproduzierbare Proteinfiirbung. Das Absorptionsmaximum bei A = 530 nm der bei der Kupplungsrcaktion entstehenden Farbstoffe gehorcht dem LAMBERT-BEERschen Gesetz. Nucleinsauron und ProteinSH·Gruppen reagieren unter histochemischen Bedingungen nicht mit Echtblau B. Wogen der exakten Reproduzierbarkeit und Spezifitiit der Tetrazonium-Kupplungsrcaktion scheint clieso zumindest fur vergleichende, mikrospektrometrische Proteinbestimmungen innerhalb einer ZcIIart geeignet zu sein,

Summary The tetrazonium coupling reaction using Fast blue salt B and the sodium salt of 6-hydroxy. naphthalinsulfonic acid.(2) serves as a method for histochemical demonstration of proteins. Fast blue salt B reacts with histidin, tyrosin and in a slighter extent also with tryptophan. It is shown in this paper, that the histochemical tetrazonium reaction carried out under the optimal conditions is a specific staining for proteins and highly reproducible. The maximum of absorption at A = 530 nm of the azo dyes generated by the coupling reaction followes the LAMBERT-BEER'S law. Nucleic acids as weIl as protein-S'H-groups do not react with Fast blue salt B under the conditions described. Due to the exact reproducibility and specifity the tetrazonium coupling reaetion seems to be a suitable method for at least comparative, microspectrometric protein det ermination within one species of cells.

Einleitung Den makroskopischen, quantitativen Proteinbestimmungsmethoden kann bis data lediglich die mikrospektrometrische Methode nach CASPERSSON gegeniibergestellt werden; sie beruht auf dem UV-Absorptionsmaximum der Proteine bei A = 280 nm

318

G.

NOHAMMER

(CASPERSSON 1950, BRODSKIJ und LIMARENKO 1954, SANDRITTER 1957, UNGERULLMANN 1976, NOHAMMER et al. 1977). Del' GroBteiI del' gebrauchlichen histochemischen Proteinnachweis- und -Bestimmungsmethoden beruht auf del' Adsorption von Farbstoffen an die Proteine. Es ist daher nicht verwunderlich, daB die von CLARA (1932) erstmals verwendete, histochemische Methode del' Tetrazoniumfarbung in del' Folge in einer Reihe von eingehenden Arbeiten untersucht und verbessert wurde (DANIELLI 1947, 1950, BARNARD 1956, 1960, 1961, PEARSE 1968, BURSTONE 1955, RAPPAY 1959, BENES und SANDRITTER 1960). Echtblau B [(EB); (Tetraazotiertes-odianisidindihydrochlorid)] enthalt 2 reaktive Diazoniumgruppen. Die TetrazoniumKupplungsreaktion (TK) beruht auf del' Azokupplung einiger Aminosauren del' Zellproteine mit 1 del' 2 Diazoniumgruppen, wobei die zweite fur die anschlieBende Kupplung mit einem beliebig wahlbaren Kuppler (meist eine Naphtholverbindung) erhalten bleibt. Wiihrend die Verbindungen I meist gelb bis orange sind, stellen die VerbindungenII je nach eingesetzter Naphtholverbindung rote bis violette Farbstoffe dar. Diazoniumverbindungen reagieren sicher mit Histidin, Tyrosin (PAULY 1904, 1915) und in geringerem AusmaB auch mit Tryptophan (DANIELLI 1953, PEARSE 1968). Ferner konnen sie mit Thiolen reagieren (DUFFIN und KENDALL 1954, HOWARD und WILD 1957, ZAHN et al. 1953) und mit cx- und e-Aminogruppen del' Aminosauren relativ stabile Triazene bilden (BUSCH et al. 1934, HOWARD und WILD 1957). Eine mehrfach diskutierte, chemische Reaktion von Diazoniumverbindungen mit Nucleinsauren kann unter den Bedingungen del' histochemischen Farbung ausgeschlossen werden (GOMoRI 1952, BARNARD 1961, PEARSE 1968, BENES 1960). Die TK als histochemische Proteinbestimmungsmethode ist mit mehreren Unsicherheitsfaktoren behaftet. EB reagiert einerseits mit mehreren Aminosauren in sehr unterschiedlichem AusmaB (DANIELLI 1953, PEARSE 1968) und ist andererseits in alkalischer Losung als Diazoniumhydroxyd hochst instabil und liefert so schwer kontrollierbare Zersetzungsprodukte. Weiter wird EB die Eigenschaft zugesohrieben, sich an Nucleinsauren adsorptiv anzulagern (BURSTONE 1955, RAPPAY 1959), was den Wert del' TK noch mehr in Frage stellt. Ferner wird EB sehr stark an Schleim gebunden und ist dann schwer auswaschbar.

2 Kupplungsreaktion: H OCH OCH o-ro' 3 3

/H OCH 3 OCH 3 0

P~R-N=N-OO-N=Nl 0 - pro~R-N=N OON=N-b Q./ QS03.-.$ Na S03~~ +

R=His, Tyr, Trp

Abb. 1. Reaktionsschema der Tetrazonium-Kupplungsreaktion.

II1rotl

Die cytospektrometrische Proteinbestimmung, 1.

319

'to

'"

100

200

300

400 mgEB/100mt

Abb. 2. Abhungigkeit der 1. Kupplungsreaktion vom pH und der EB-Konzentration des 0,1 M Veronalpuffers (EATZ): Kurve I: pH Kurve 4: pH

= =

8,0; 9,6;

Kurve 2: pH Kurve 5: pH

= =

8,6; 10,0.

Kurve 3: pH = 9,2;

Trotz aller Einschrankungen und Nachteile der TK bleibt die Tatsache bestehen, dal3 EB unter den Bedingungen der histochemischen Farbung ausschlieBlich mit einzelnen Aminosauren der Zellproteine in chemische Reaktion tritt, wenn auch in verschiedenern AusmaB. So gesehen eignet sioh die TK zum spezifischen, histochemischen Proteinnachweis, Ihre Verwendbarkeit zur quantitativen, cytospektrometrischen Proteinbestimmung hangt. im wesentlichen von folgenden Bedingungen ab: 1. Das Gesamtmaximum bei A = 530 nm, entstanden durch Uberlagerung der Einzelabsorptionsmaxima der bei der TK der verschiedenen Aminosauren (His, Tyr, Trp) gebildeten Farbstoffe, mull dem LAMBERT-BEERschen Gesetz gehorchen. 2. Der Gehalt der Zellproteine an den Aminosauren His, Tyr und Trp mulite konstant sein. 3. Die TK muf streng reproduzierbar sein. Aus den Arbeiten von BARNARD und BENES geht eindeutig hervor, daB die erste Bedingung erfiillt ist. Bedingung 2 ist an sich sehr unwahrscheinlich, Da aber EB mit mehreren Aminosauren reagiert, besteht die Moglichkeit einer ahnlichen Bruttoreaktionsrate, so daB eine gewisse Hoffnung besteht, die TK konnte eine quantitative, cytospektrometri-

320

G. NOHAMMER

sche Proteinbestimmungsmethode ergeben. Die Anwendungsmogliohkeit del' TK fur vergleichende Proteinbestimmungen innerhalb einer Zellart ist unbestritten, wenn die Methode streng reproduzierbar ist. ad 3: Die Reproduzierbarkeit einer histochemischen Farbemethode verlangt unter anderem auch deren Optimierung. Speziell die extrem empfindliche Azokupplungsreaktion wird stark von del' Reaktionstemperatur, Reaktionszeit, pH, Molaritat und Art des Puffers, Konzentration del' Reagentien usw. beeinflulit werden. Ziel diesel' Arbeit war es, Bedingungen zu finden, unter denen EB einerseits stabil ist und es andererseits zu einer optimalen, spezifischen und reproduzierbaren Anfarbung del' Proteine kommt. Ferner sollte eine etwaige Beeinflussung del' Farbung durch Nucleinsauren und Protein-SH-Gruppen untersucht werden.

Material und Methoden Die Ehrlich-Ascites-Tumorzellen (EATZ) entstammten NMRI-Mausen und wurden am 7. Tag

poet transplant, entnommen. Rattenleberzellen (RLZ) von Wistar-Ratten wurden nach der Methode von BERRY und FRIEND (1969) in der Modifikation von SEGLEN (1973) gewonnen. B- und T-Lymphozyten (BZ und TZ) entstammten der Bursa bzw. dem Thymus 8 Tage alter Huhner und wurden mittels Durchreiben dieser Organe durch ein Metallsieb in gepufferter Kochsalzlosung gewonnen. Die Superficialzellen (SZ) und Irrterrnediarzellen (IZ) der menschlichen Portio uteri wurden nach der gangigen Methode des gynakologischen Zellabstriches gewonnen. Samtliche zur Untersuchung gelangten Zellen wurden in einem Gemisch von Diathylather und Athanol (I : I) mindestens 30 min fixiert. Die cytospektrometrischen Bestimmungen wurden mit einem UMSP-I (C. Zeiss , Oberkochen, BRD) durchgefuhrt , Einstelldaten : Objektiv: UF 100, Projektiv: 100, Leuchtfeldblende: 3 pm, l\IeJ3blende: I pm, Schrittweite: 111m. Die cytospektrometrischen Messungen irn Absorptionsmaximum bei A. = 530 nm der bei der TK mit EB und 6-Hydroxynaphthalinsulfonsaure-(2)-Natriumsalz (HNS) entstehenden Farbstoffe erfolgten durch maandorfdrrniges "scanning", wobei die innerhalb einer Zelle gemessenen Einzelextinktionen (E/pm 2 ) automatisch summiert (Gesamtextinktion: E g es ) und digital angezeigt wurden, Reagentien: Echtblausalz B fur die Mikroskopie: Merck, Darmstadt, BRD. 6-Hydroxynaphthalinsulfonsaure-(2)-Natriumsalz Dihydrat: Merck-Schuchardt, Hohenbrunn, BRD.

Ergebnisse Aus del' Fragestellung diesel' Arbeit ergibt sich zwangslaufig eine Durchfuhrung del' Versuche unter zunaehst nicht optimalen Bedingungen fur die TK. Zunaohst wurde del' Einflull del' Puffersubstanzen untersucht, die fur die Kupplungsreaktion von EB mit den Zellproteinen verwendet wurden. Aufser Veronalpuffer wurden noch 0,4 M Glycin-NaOH-Puffer 8,6 < pH < 10,6, sowie 0,2 M und 0,4 M Trispuffer 8,0 < pH < 8,8 untersucht. Wahrend mit den Trispuffern hdchst unterschiedliche Resultate erzielt wurden, fuhrten die Glycin-NaOH-Puffer stets zur raschen Zersetzung von EB. Veronalpuffer zeigte die fiir die TK gewiinschte Eigenschaft del' Stabilisierung von EB im alkalischen Milieu.

321

Die cytospektrometrische Proteinbestimmung, 1.

1. pH-Einflu13 und Einflu13 del' Konzentration von EB Fixierte EATZ kamen bei 1 °C in aqua dest. und wurden anschliellend 3 h bei 1 °C in einem 0,1 M Veronalpuffer gekuppelt, dessen pH und EB-Konzentration variiert wurden. Nach del' Kupplung mit EB wurden die Zellen bei 1 °C 3 min in 0,2 M Glycin-HCl-Puffer pH = 2,5 und 2mal 3 min in H 20 gewaschen, worauf sie bei Zimmertemperatur (ZT) 15 min in eine Losung von 1 g HNS in 100 ml 0,1 M Veronalpuffer pH = 9,6 zur zweiten Kupplung gestellt wurden. Nach einer 15miniitigen Waschung in flie13endem Leitungswasser wurde luftgetrocknet und in Immersionsglycerin eingedeckeIt. Abb. 2 zeigt die sehr ausgepriigte pH- und Konzentrationsabhiingigkeit del' Kupplungsreaktion von EB und den Zellproteinen. Das maximale Ausmaf del' 1. Kupplungsreaktion liegt bei pH = 9,6 bei einer EB-Konzentration von 400 mg/100 ml Puffer (Tabelle 1). 2. Einflu13 del' Molaritiit des Veronalpuffers und del' Konzentration von EB Fixierte EATZ kamen 5 min bei 1 °C in H 2 0 und wurden ansohliellend 3 h bei 1 °C in eincm Veronalpuffer pH = 10,0 gekuppelt, dessen Molaritiit und EB-Konzentration variiert wurden. Die weiteren Schritte (Waschen und zweite Kupplung) erfolgten wie unter 1 angegeben. Tabelle 2 und Abb. 3 zeigen die Zunahme del' Extinktionen bei gleichzeitigem Ansteigcn del' Molaritiit des Veronalpuffers und del' EB-Konzentration. Das maximale Ausmaf del' 1. Kupplungsreaktion wurde mit 400 mg EB/100 ml 0,4 M Veronalpuffer pH = 10,0 erreicht. 3. pH-Abhiingigkeit del' zweiten Kupplungsreaktion EATZ wurden 5 min bei 1 °C in H 2 0 gestellt und anschliellend 15 min bei 1 °C in 0,2 M Veronalpuffer pH = 9,3 bei einer EB-Konzentration von 100 mg EB/100 ml Puffer gekuppelt. Tabelle 1. Abhangigkeit der 1. Kupplungsreaktion vom pH und der EB-Konzentration des 0,1 M Veronalpuffers (EATZ): n Anzahl der gemessenen Zellen, Eges mitt.lere Gesamtextinktion, KB 99 Konfidenzbereich des Mittelwertes (±) mit 99 %iger Sicherheit

pH des 0,1 M Veronalpuffers

100 mg EB/I00 ml n

Eges

KB 99

200 mg EB/IOO ml n

Eges

KB 99

400 mg EB/IOO ml n

E ges

KB 99

8,0

50

22,1

2,9

50

22,2

2,7

50

41,2

3,8

8,6

50

41,3

5,8

50

59,6

8,9

50

65,4

9,6 16,4

9,2

50

102,0

13,2

50

145,1

15,0

50

160,3

9,6

50

150,7

12,8

50

147,0

15,8

50

161,3

18,3

10,0

50

150,8

13,8

50

155,1

II,2

50

159,7

II,5

322

G.

NOHAMMER

Tabelle 2. Abhangigkeit der 1. Kupplungsreaktion von der Molaritat und der EB-Konzentration des Veronalpuffers pH = 10 (EATZ) Molarit.at. des Veronalpuffers

100 mg EB/lOO rnl

E ges

n

200 mg EB/IOO ml

KB 99

n

E ges

400 mg EB/IOO ml

KB 99

n

E ges

KB 99

0,1

50

150,8

13,8

50

155,1

II,2

50

159,7

II,5

0,4

50

148,3

12,6

50

159,8

II,7

50

168,0

14,6

Tabelle 3. pH-Abhangigkeit der 2. Kupplungsreaktion

pH des 0,1 M Veronalpuffers

KB 99

n

8,0

50

51,6

5,3

8,6

50

63,7

5,6

9,0

50

68,2

8,1

9,6

50

69,5

II,3

170

2

160

150

100

200

300

400

mg EB/100ml

Abb. 3. Abhangigkeit der 1. Kupplungsreaktion von der Molaritat. und EB-Konzentration des Veronalpuffers pH = 10 (EATZ): Kurvs I: 0,1 M; Kurve 2: 0,4 M.

Die cytospektrometrische Proteinbestimmung, 1.

323

Eges

70

60

50 8

9

10

pH

Abb.4. pH-Abhiingigkeit der 2. Kupplungsreaktion (EATZ).

Gewaschen wurde wie unter 1 angegeben. Die 15miniitige, zweite Azokupplung mit HNS wurde beziiglich des pH des 0,1 M Veronalpuffers variiert. Es ergab sich eine merkliche pH-Abhangigkeit del' zweiten Kupplungsreaktion, deren pH-Optimum ebenfalls bei 9,6 liegt (Tabelle 3, Abb. 4). 4. Zeitlicher Verlauf del' Reaktion von EB mit den Proteinen von EATZ, RLZ, IZ und SZ unter optimalen Bedingungen Fixierte EATZ, RLZ, IZ und SZ wurden jeweils 5 min bei I °C in H 2 0 gestellt, anschliel3end bei 1 °C in einer Losung von 400 mg EB in 100 ml 0,4 M Veronalpuffer pH = 9,6 gekuppelt, wobei die Kupplungsdauer variiert wurde. Nach diesel' ersten Kupplung wurde 3 min bei 1 °C mit 0,2 M Glycin-HCI-Puffer pH = 2,5 und 2mal 3 min bei 1 °C mit H 2 0 gewaschen. Die 15miniitige, zweite Kupplung bei ZT erfolgte in einer Losung von 1 g HNS in 100 ml 0,1 M Veronalpuffer pH = 9,6. AnschlieBend wurde noch 15 min in f1iel3endem Leitungswasser gewaschen, luftgetrocknet und in Immersionsglycerin eingedeckelt. Fur aIle untersuchten Zellarten ergab sich ein ahnlicher hyperbolischer Reaktionsverlauf. Das Ende del' ersten Kupplungsreaktion wurde stets nach 3 h Reaktionszeit erreicht (Tabelle 4; Abb. 5, 6). 5. EinfluB del' Reaktionstemperatur auf die zweite Kupplungsreaktion EATZ wurden wie unter 4 angegeben gefarbt, nul' die Reaktionstemperatur und -Zeit del' zweiten Kupplungsreaktion wurden wie folgt geandert: 10 min zweite Kupplungsreaktion bei 1 °C in einer Losung von 1 g HNSj100 ml 0,1 M Veronalpuffer

324

G.NOHAMMER

'I'abelle 4. Zeitlicher Verlauf der Tetrazonium-Kupplungsreaktion (EATZ, RLZ, IZ und SZ): E/fJ-m2 : Extinktion pro fJ-m 2 gemessen im Plasma von IZ und SZ Reaktionszeit

[h] 0,5 1,0

EATZ

RLZ

n

E ges

50

108,8

4,9 10,8

KB 99

n

IZ

KB 99

200

0,239

0,014

222

0,355

0,026

173

0,508

0,025

140

0,569

0,028

KB 99

n

50

365,2

43,0 37,0

50

2,0

50

152,1

8,7

50

413,5

3,0

50

169,6

19,7

100

455,2

42,3

456,9

59,8

4,0

EfJ-m2

E g es

139,0

50

3

o 400

300

200

1

100

2 3

2 t[h]

Abb. 5. Zeitlicher Verlauf der TetrazoniumK-upplungsreaktion: Kurve 1: EATZ; Kurve 2: EATZ, benzoyliert; Kurve 3: RLZ.

4

+ SZ

Die cytospektrometrische Proteinbestimmung, 1.

2

325

3

HhJ Abb.6. Zeitlicher Verlauf der Tetrazonium-Kupplungsreaktion (IZ und SZ): Ordinate: EJpm 2 = Extinktion pro pm2 gernessen im Plasma von IZ und SZ.

pH = 9,6 mit anschlieBendem, 20miniitigem Angleichen diesel' Losung an die ZT (siehe BARNARD [1961]). Es ergab sich kein Unterschied in den Farbeergebnissen zwischen Praparaten, die nach 4 bzw. 5 gefarbt wurden: Eges . 4 = 167 [n = 50]; Eges . 5 = 171 [n = 50].

6. Reproduzierbarkeit del' TK Urn die Reproduzierbarkeit del' TK un tel' optimalen Bedingungen (siehe 4) zu untersuchen, wurden bei 4 Zellarten verschiedene Praparationen untersucht, wobei moglichst streng darauf geachtet wurde, daB aile Faktoren, die den Proteingehalt beeinflussen hatten konnen, nicht variiert wurden. Bei allen 4 Zellarten ergab sich eine gute Ubereinstimmung del' Ergebnisse (Tabelle 5), die die Reproduzierharkeit del' TK demonstriert. Tabelle 5. Reproduzierbarkeit der Tetrazonium-Kupplungsreaktion (EATZ, RLZ, TZ und BZ)

E g e•

KB 99

50 50 50 50 50

168,0 178,0 169,6 174,5 166,8

14,6 14,2 19,7 14,5 16,3

18. II. 1976 4. 3. 1977

100 50

455,2 450,3

41,3 46,9

BZ

17. 5. 1976 20. 12. 1976

100 100

29,0 30,8

3,0 2,7

TZ

17. 5. 1976 20. 12. 1976

100 100

18,5 17,7

1,2 1,6

Zellart

Versuchsdatum

EATZ

24. 3. 7. 13. 15.

1975 1976 1976 1977 1977

RLZ

22

6. 4. 4. I. 3.

Acta histochem. Bd, 61

n

326

G.

NOHAMMER

Tabelle 6. Zeitlicher Verlauf der Tetrazonium-Kupplungsreaktion an benzoylierten EATZ Reaktionszeit [hI

n

Egos

0,5 1 2 3

50 50 50 50

4,1 7,7 14,9 16,4

KB 99

0,7 1,0 1,9 2,6

7. EinfluB des Protein-SH-Gehalts auf die TK Del' Gehalt der RLZ an proteingebundenen SH-Gruppen (PSH) weist erhebliche Schwankungen auf. Die Bestimmung des PSH-Gehalts erfolgte mit der DDD-Echtblau B-Farbung (NOHAMMER 1977). Es wurden 2 verschiedene Praparationen von RLZ mit PSH-Gehalten von 4,6 . 10-14 bzw. 11,5' 10-14 Molen SH/Zelle untersucht. Die nach der TK mikrospektrometrisch an den beiden RLZ-Praparationen ermittelten, mittleren Gesamtextinktionen waren dagegen gleich: E ges . 1 = 450 [n = 50]; E ges . 2 = 455 [n = 50]. 8. EinfluB einer etwaigen Triazenbildung auf die TK Ein Praparat von EATZ wurde wie unter 4 angegeben gefarbt. Ein zweites Praparat wurde nach 3sttindigem Kuppeln bei 1 °C mit EB nicht 3 min bei 1 °C mit 0,2 M Glycin-HCl-Puffer pH = 2,5, sondern zur Zerstorung etwaiger Triazene mit 0,05 n HCl 3 min bei 1 °C (siehe BARNARD [1961]) gewaschen und sodann wie unter 4 angegeben weiterbehandelt. Die mikrospektrometrische Messung beider Praparate ergab praktisch die gleiche, mittlere Gesamtextinktion: Eges• 2.5 = 170 [n = 50]; Eges. 0.05 n HeL = 178 [n = 50]. 9. EinfluB del' unspezifischen Farbung auf das Ergebnis der TK Die fixierten EATZ kamen 5 min bei ZT in H 2 0 und wurden anschlieBend bei ZT 48 h bei 15 Torr tiber P 2 0 5 getrocknet. Diese Zellen wurden nach BARNARD (1961) mit Benzoylchlorid und Pyridin in Acetonitril 24 h benzoyliert. An den so benzoylierten Zellen wurde der zeitIiche VerIauf der TK untersucht (Abb. 5, Kurve 2). Die nach 3sttindiger TK an den benzoylierten Zellen erhaltene Extinktion betrug nur knappe 10 % der Extinktion, die an nicht benzoylierten EATZ nach 3stiindiger TK erhalten wurde (Tabelle 6). 10. EinfluB der Nu k l e i n s a ur e auf das Erge bnis der TK

Fixierte EATZ sowie RLZ wurden zur Extraktion der Nucleinsauren nach SCHNEIDER (1945) 15 min bei 90°C in 5%ige Trichloressigsaure (TCA) gestellt. AnschIieBend wurde zweimal 5 min mit Athanol und weitere 5 min mit H 20 gewaschen, worauf die so vorbehandelten Zellen der TK nach der unter 4 angegebenen, optimierten Methode unterzogen wurden. Die mittlere Gesamtextinktion der nach TCA-Behandlung ge-

Die cytospektromet.rische Proteinbestimmung, 1.

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fa rbten EATZ betrug: E ges , TeA = 168,621 [n = 50] gegeniiber einer mittleren Gesamtextinktion von Eges . 4 = 166,823 [n = 50] von normal nach 4 gefiirbten EATZ. Bei RLZ betrug Eges . TCA = 451.697 [n = 50] gegeniiber Eges . 4 = 450,335 [n = 50].

Diskussion Wegen del' Instabilitiit del' Diazoniumhydroxyde bei pH = 9,6 wurde bei den vorliegendon Versuehen + I °C als Reaktionstemperatur gewahlt , Veronalpuffer erwios sich als stabilisierend auf EB. Damit nul' eine del' beiden Diazoniumgruppen von EB mit den Zellproteinen reagiert, wurde eine hohe Konzentration an EB gewiihlt. Hohere Konzentrationen an EB verlangten abel' zur Stabilisierung eine hohere Molarit.at des Veronalpuffers. 400 mg EBjlOO ml 0,4 M Veronalpuffer pH = 9,6 erwiesen sieh als optimal fur die Reaktion VOn EB mit den Zellproteinen. Diese Reaktion war bei allen zur Untersuehung gelangten Zellarten nach :l h de facto zu Ende. Ein etwaiger, leiehter Extinktionsanslieg naeh :lstiindiger TK ist auf die steigende unspezif'ischc Anfiirbung durch schwer auswasehbare Zersetzungsprodukte von EB zuruckzufuhren. Das geringe Ausmafs (10 %) del' unspezifisehen Fiirbung an benzoylierten Zellen gegeniiber del' Fiirbung an nieht benzoylierten Ze llen maeht einerseit.s die hohe Spezif'it at del' TK deutlich und bestiitigt anderorseit.s die Effizienz des gewiihlten Auswaschverfahrcns fur uberschussigcs EB. Die von BARNARD (1961) besohriebene, an die Kupplung del' Proteine mit EB anschlief.lende Behandlung mit 0,05 n HCl zur ZerstOrung etwaiger Triazene wurde mit gleir-hcm Effekt durch ein Waschen del' Zellen mit 0,2 M Glycin-Hf.l-Puffer pH = 2,5 ersetzt. Del' Sinn dicsos Waschvorganges wird in erst.er Linie in del' Umwandlung del' labilen Diazoniumhydroxide in die sta.bilere n Hydrochloride gesehen, Die zweite Kupplungsreaktion del' nach EB-Protein-Kupplung noch freien Diazoniumgruppe mit HNS ist ebenfalls pH.abhiingig; das pH·Optimum liegt bei pH = 9,6. Die hohe Konzcntralion von HNS (I g/IOO ml) wurde pravent.iv wegen del' Instabilitiit del' Diazoniumgruppe gewiihlL HNS wurde lediglieh wegcn des relativ niedrigen Ansehaffungspreises verwendet und kann durch jede andere, wasserlosliche, kupplungsfiihige Verbindung (wie z: B. Naphthol AS) ersetzt werden. Die hier gewiihlte Art del' zweiten K upplungsreakt ion (15 min bei ZT) bringt das gleiche Fitrbeerge bnis wie die von BARNARD (1961) vorgoschlagene Art (l0 min bpi 2° bis 4 °C und anschlief.lende 20miniit,ige Angleichung an die ZT). Zur Uberprufung del' Frage, ob EB mit Protcin-Skl-Gruppen roagiert , wurdon RLZ gewahlt., deren PSH·Gehalt starke Schwankungen aufweist, wiihrend del' makroskopisch ermittelte Proteingehalt (bezogen auf g Feuehtgewicht) kej ne grof.len Sehwankungen zeigt. Obwohl del' PSH· Go halt zwischen den beiden untersucht.en RLZ-PriiparationE'n urn den Faktor 2,5 differierte, waren die mittleren, mikrospektrometr isch gemE'ssenen Gcsamtextinktionen nach TK so gut wie gleich. Auf Grund dieses Befundos durft.e eino Rr-akt ion von EB mit Prot.ein-S'Hvfb-uppon untr-r den Bcdingungen del' TK auszuschlieflen sein , "'urden die Nucleinsauren nach SCHNEIDER (1945) mit TeA extrahiert, konnte kein Unt orschied in den Ergebnissen der TK gegE'niiber Pruparat.en beobaehtet werden, d eren Nuclcinsauron nicht extrahiert wurden. Unter den Bedingungen del' TK kommt es dernnach zu keiner Reakt.ion oder Adsorption von EB mit bzw. an die Nucleinsauren. Allerdings wurde beobacht e t, daLl die nach TCA·Extraktion teilweise am Praparat noch orkennbarsn Schlieren nach TK angefarbt waren. Es wird daher vermut e t , daLl freie Nur-lcinsauren wahl in del' Lage sind, EB adsorpt iv binden zu kormcn , Die Reproduz.ie.rbarkeit. del' TK wurde an mehreren Zellarten mit dcm Ergebnis unt ersucht, daf.l be i einer gegebenen Zellart, die unter den gleichen Bedingungen, abel' zu verschiedenen Zeit en gewonnen wurde, st.ot.s die gloiche, mit.t.lere Gesamtextinktion gemessen wurde. Zusammenfassend kann gesagt werdE'n, daD die TK UIIter den oben unter 4 angE'fiihrten Be· dingungen eine streng reproduzierbare, spezifisehe Proteinnachweismethode ist. Das bei del' histo· chemisehE'n TK mit EB und HNS cntstehende Farbstoffgflmisch weist ein Absorptionsmaximum

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G. NOHAMMER

bei A = 530 nm auf, das nach BENEi\ (1960) und BARNARD (1961) dem LAMBERT-BEERschen Gesetz gehorcht , Die TK eignet sich fur vergleichende Proteinbest immungr-n innerhalb einer Zellart. Ob sie auch zur generellen, quantitativen, mikrospektrometrischen Proteinbestimmung geeignet ist, bildet den Gegenstand weit.erer Untersuchungen, Die Arbeit wurde mit Unterstiitzung des Fonds zur Forderung del' wiesenschaft liche n Forschung, Wien, durchgefiihrt. Mein besonderer Dank gilt meinem Lehrer, Herrn Prof. Dr. E. SCHAUENSTEIN, Vorstand des Institutes fur Biochemie, Universitiit Graz, Osterreich, fur dessen wertvolle Unterstiitzung. An diesel' Stelle mocht,e ich auch Herrn Prof. Dr. F. BAJARDI, Leiter des Cytologischen Laboratoriums des LKH-Graz, Osterreich, fur die Bereitstellung gyniikologischer Zellabstriche danken. Weiter danke ich Herrn Dozent Dr. H. ZOLLNER, Institut fur Biochemie, Universitat Graz, Osterreieh, fur die Priiparation del' RLZ, sowie Herrn Dr. K. SCHAUENSTEIN, Institut fur allgemeine und experimentelle Pathologie del' Universit.at Innsbruck, Osterreich, fiir dip Praparat.ion del' BZ und TZ.

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Die cytospektrometrische Proteinbestimmung, r.

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Acta histochem, Bd, 61