Die Glucose-6-phosphat Dehydrogenase im Stoffwechsel photoautotropher Organismen

Biochem. Physiol. Pflanzen 183,449-475 (1988) VEB Gustav Fischer Verlag lena

BPP-Review

Die Glucose-6-phosphat Dehydrogenase im Stoffwechsel photoautotropher Organismen 1) M. EICHHORN und B. CORBUS Friedrich-Schiller-Universitat Jena, Sektion Biologie, Wissenschaftsbereich Pflanzenphysiologie, lena, DDR

Metabolic Role of Glucose-6-phosphate Dehydrogenase in Photoautotrophic Organisms Key Term Index: glucose-6-phosphate dehydrogenase, kinetics, metabolite- and enzyme regulation , oxidative pentose phosphate pathway, photomodulation

Summary Glucose-6-phosphate dehydrogenase is an especially important agent in regulating the flux of carbon through the oxidative pentose phosphate pathway. Separate species of the enzyme occur in chloroplasts and cytoplasm. There is a strong competition for glucose-6-phosphate between oxidative pentose phosphate pathway and glycolysis. Glucose-6phosphate is also a key intermediate for generation of additional NADPH + H+ , for providing the carbon skeleton for cell wall components, and also for a variety of aromatic and phenolic compounds. The kinetics, the influence of effectors, as well as multiple forms and isoenzymes of glucose-6-phosphate dehydrogenase are probably of importance for the extent of metabolism of glucose-6-phosphate following one of these pathways. Photomodulation regulates the activity between the reductive and oxidative pentose phosphate pathway in chloroplasts (in connection with the NADPH + H+/NADP+ ratio). There is tremendous variation in the distribution of the enzyme in plant tissues , depending on plant-species , growth conditions and developmental stages. Especially the presence of isoenzymes and multiple form s of glucose-6-phosphate dehydrogenase in plant cells raises problems which are still open until now.

[nhalt I. 2. 2.1. 2.2. 2.3.

Einleitung . . . .. Nachweis und Bestimmung der Aktivitiit . Pflanzenextrakt .. Schnittpraparat. Polyacrylamidgel.

449 451 451 452 452

2.4. Amplifikation infolge "enzymatic cycling" . 3. Vorkommen.

452 454

Abkiirzungen: Fd, Ferredoxin; G6P, Glucose-6-phosphat; G6PD , Glucose-6-phosphat Dehydrogenase; Glu, Glutamat; GluD , Glutamat -Dehydrogenase; LEM , light -effect- mediator; PPW, oxidati ver Pentosephosphatweg ; Pa, anorganisches Phosphat ; PS, Photosystem ; R5P , Ribose-5-phosphat ; Ru5P, Ribulose-5-phosphat; Thio(S) , oxidiertes Thioredoxin ; Thio(SH) , reduziertes Thioredoxin; 2OGA, 2-0xoglutarat; 6PG , 6-Phosphogluconat; 6PGD, 6 Phosphogluconat Dehydrogenase ; U. E., Enzymuntereinheit 1) Herm Prof. Dr. HELMUT AUGSTEN aus AniaB seines 60. Geburtstages gewidmet

30

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449

4.

5.

5.1. 5.2.

5.3. 6. 6.1. 6.2.

6.3. 7. 8.

....... .... . . .

Struktur, multiple Formen und Isoenzyme Kinetik .. . . . . . . . . . . . . . . Substratspezifitat. Aktivatoren Inhibitoren . . . . Regulation.... Metabolit- und Enzymregulation . . Photosynthese-vermittelte Modulation . Gen-Regulation Ausblick . Literatur . . . .

455 460 460 460

461 462

463 465 467 468 468

1. Einleitung Die Glucose-6-phosphat Dehydrogenase (EC 1.1.1.49; G6PD) oxidiert Glucose-6phosphat und iibertriigt den Wasserstoff auf NADP+. Das Reaktionsprodukt (6-Phosphogluconat) wird sofort unter NADPH + H+ -Bildung zu Ribulose-5-phosphat weiter oxidiert (6-Phosphogluconat Dehydrogenase: EC 1.1.1.44; 6PGD). Beide Enzyme stehen am Anfang des oxidativen Pentosephosphatweges . 1m Gegensatz zur 6PGD ist die G6PD in ihrer Aktivitiit stark modulierbar; das favorisiert sie zu einem Schliisselenzym im Kohlenhydratstoffwechsel (z. B. LEVY 1979; ap REES 1980). Das Interesse fiir die G6PD in pflanzlichen Objekten konzentriert sich insbesondere auf regulatorische Aspekte, wei I urn das Glucose-6-phosphat mehrere Stoffwechselreaktionen konkurrieren (vgl. Abb. 1). Der im Cytoplasma und Chloroplast ablaufende PPW liefert in beiden Kompartimenten neben gleichartigen Bausteinen (z. B. fUr DNA und RNA) auch spezifische Komponenten (im Cytoplasma z. B. Zellwandbausteine; vgl. GANDER 1982). An diesen Prozessen sind auch multiple Enzym-Formen beteiligt, die wiihrend der Ontogenese gebildet oder aktiviert werden. Ein im Vergleich mit heterotrophen Systemen zusiitzlicher Aspekt resultiert aus der Photomodulation des im Chloroplast lokalisierten Enzyms (LENDZIAN und ZIEGLER 1970; Dbersieht: BUCHANAN 1980). Dieser photosyntheseabhiingige Vorgang siehert im tiiglichen TagINacht-Wechsel die COr Reduktion zum Glucose-6-phosphat (Calvin-Zyklus) bzw . den Kohlenhydratstoffwechsel yom Glucose-6-phosphat zu den C-5-Verbindungen (PPW) . Er ermoglicht aber auch die Adaptation an Dauerlichtverhiiltnisse und favorisiert die Stiirkesynthese. Obwohl in den letzten Jahren mit verbesserten Nachweis- bzw. Priiparationsmethoden unsere Kenntnisse iiber Kompartimentierung, Enzymmuster bzw. kinetisches Verhalten vertieft und erweitert werden konnten (z. B. OUTLAW 1980), bleiben Fragen offen. 1m folgenden werden Aspekte des Nachweises der G6PD-Aktivitiit, der Verbreitung, der Eigenschaften sowie die regulatorische Rolle des Enzyms im pflanzlichen Stoffwechsel dargestellt und diskutiert.

450

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Chi oroplast

cytoplasma

• Hemizellulose

41

-'--::c-,---'\

~

--~r--

,___

-A_

o o

?:-

• NADPH. H·

(!)

• Ribosen IDN A.RN AI

• Ribosen IDNA, RN AI

• aram. Aminas . • aram. A minos.

• nie de rm, Pheno t'ler b.

• Lignin • niederm. Phenol'lerb. • heterozykl . Verb·

Starke

Saccharose

Glucose

Glucose

Abb . I. Um Glucose-6-phosphat konkurrierende Stoffwechselsequenzen bei Pflan zen. Glucose - 6- phospho t

NADP+

6-Phosphogluconolocton

o II

0° 0

CHzO®

I

CD

I

H

R

+

~ z

1 C-NH +H+

N

I

OH

,-+HzO

CHzO®

H) 1/ H

H

'.j

r()r~J
NADPH+H+

H

I

CID

R

OH

-tV

COO-

HO"'{_H_ _ H

OH

6-Phosphogluconot

Abb. 2. Reaktion von G6PD mit Glucose-6-phosphat zu 6-Phosphogluconolacton (Reaktion J) und Hydrolyse des Lactons (Reaktion II). Das H-Atom wird direkt iibertragen (stlirker gezeichnetes H) ; R = Adenosin-diphosphatRibose bzw. 2' -Phosphoadenosin-diphosphat-Ribose (NAD+ bzw. NADP+).

2. Nachweis und Bestimmung der Aktivitiit 2.1 . Pjlanzenextrakt Die Reaktion von G6PD mit Glucose-6-phosphat zu 6-Phosphogluconolacton ist zwar thermodynamisch reversibel, jedoch unter physiologischen Bedingungen irreversibel (LEVY 1979). 6-Phosphogluconolacton wird rasch durch Gluconolactonase in 6-Phosphogluconat iiberfiihrt (vgl. Abb. 2). Ein MaS fUr die Enzymaktivitat ist die gebildete NADPH + H+30*

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451

Menge. Sie wird photometrisch (bei 334, 340 oder 366nm; WARBURG und CHRISTIAN 1936; Ubersicht : LOHR und WALLER 1970) oder fluorimetrisch (z. B. Excitation bei 365 nm und Emission bei 460nm; LOWRY und PASSONNEAU 1972; OUTLAW 1980) bestimmt. Auch das bei dieser Reaktion akkumulierte 6-Phosphogluconolacton ist fUr die Messung geeignet (OUTLAW 1980). Allerdings muB infolge zusatzlicher NADPH + H+ -Bildung durch 6PGD mit hoheren Aktivitatswerten gerechnet werden; empfohlen wird eine 6PGD-Hemmung mit Maleinimid (BERGMEYER et al. 1970). Zu beriicksichtigen ist die Empfindlichkeit der chloroplastidiiren G6PD-Formen gegeniiber Licht. Die Messung der Enzymaktivitat erfolgt im allgemeinen im Rohextrakt (nach ZellaufschluB bei "griinem Sicherheitslicht"). Eine Reinigung fiihrt meist zu mehr oder weniger groBen Aktivitatsverlusten (z. B . KERSTEN 1973) .

2.2. Schnittpriiparat Das MeBprinzip besteht in einer Zweischritt-Reaktion: Das durch G6PD gebildete NADPH + H+ reduziert Tetrazoliumsalze (z. B . 2,3-Nitrophenyl-5-phenyltetrazoliumchlorid) zum Formazan (Katalysator: Phenazinmethosulfat) (Abb . 3; SEIDLER und WENK 1982). Fiir quantitative Bestimmungen wird das Formazan aus fixierten Gewebeschnitten extrahiert und die Extinktion gemessen (KRUG 1980; GAHAN 1984) . Auch der direkte Nachweis der gebildeten Formazanmenge ist mittels Mikrodensitometrie im Praparat moglich (GAHAN 1984). Versuche zur Lokalisierung der G6PD im pflanzlichen Gewebepraparaten (GAHAN et al. 1979, 1986; AUDERSET et a1.1985) miissen jedoch mit Vorbehalt interpretiert werden, da an tierischen Objekten gezeigt wurde, daB im Gewebepraparat abgelagerte Formazanniederschlage nicht immer mit dem Ort der G6PD-Aktivitat identisch sind (WINCKLER 1975).

2.3. Polyacrylamidgel Die im Pflanzenextrakt gemessene Enzymaktivitat ist die Resultante verschiedener G6PDFormen . Ihre Auftrennung erfolgt mittels Polyacrylamidgelelektrophorese (z. B. GABRIEL 1971 ; NEUHOFF 1973). Die Enzymaktivitat des aufgetrennten Bandenmusters ist dann nach der "Zweischritt-Methode" (vgl. 2.2.) erfaBbar und durch Registrierung der Formazanmenge (Photometer) auch quantifizierbar (vgl. z. B. EICHHORN 1984).

2.4. Amplifikation infolge .. enzymatic cycling" Die Messung sehr geringer Enzymaktivitaten (z. B. in Gewebestiicken) erfolgt mittels "enzymatic cycling" (enzymatische Cyclisierung, Ubersicht: HAMPP 1987) iiber eine Akkumulation von 6-Phosphogluconat (LOWRY und PASSONNEAU 1972). Dieser "Amplifikations-Effekt "wird nach Behandlung des Praparates in mehreren Stufen (mindestens 3) erzielt : I. Die Glucose-6-phosphat-Oxidation und NADP+ -Reduktion erfolgen im Gewebe nach 2.1 . Durch milde Alkalisierung und Erhitzung wird das iiberschiissige NADP+ zerstort, wobei NADPH + H+ erhalten bleibt. II. 1m "enzymatic cycling"-System erfolgt mit definierten Mengen der Reaktionspartner (EC 1.4.1.4, EC 1.1.1.49 mit den entsprechenden Substraten) unter Zusatz der nativ gebildeten NADPH + H+ -Menge die Akkumulation von Glutamat sowie 6-Phosphogluconat (vgl. Abb. 4) . Wenn die NADPH + H+ -Konzentration unterhalb der Michaelis-Konstante liegt, sind die pro Zeiteinheit im Zyklus gebildeten Glutamat- und 6Phosphogluconat-Mengen der Menge an reduziertem NADP+ proportional. Nach einer 452

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G6P

~NADP'

Formazan

G6PD

6PG

J~NADPH+H+

Tetrazoliumsalz

Abb. 3. "Zweischritt-Reaktioll" der durch G6PD-vermittelten allschliejJende Phenazinmethosul[at-katalysierte Formazan-Bildung.

I

G5P

Oxidatioll

von

Glucose-6-phosphat

ulld

NADP+

V

G5PD

6PG)\ NADPH+H+

IT

NH.+ 20GA\(

NADPH+H+\

GluD ) \ NADP+

Glu

lIT

(6PG

G6PD )

\G6P

5PG VNADP+ 6PGD Ru 5PI\NADPH+H+ COz

Abb.4. Amplifikation des G6PD-Nachweises infolge "enzymatic cycling".

bestimmten Zeit wird der Zyklus unterbrochen und III. das akkumulierte 6-Phosphogluconat enzymatisch bestimmt. Die Berechnung der G6PD-Aktivitat im Praparat resultiert schlieBlich aus parallel mitgefiihrter Standard-Probe bzw . Kontrolle, deren Aktivitaten im Bereich der Probenaktivitat liegen (NADPH + H+ -Standard, Reagenzkontrolle mit und ohne G6P, Gewebekontrolle) (CROXDALE und OUTLAW 1983). Das Verfahren existiert als Mikro- bzw. Ultramikromethode und erfaBt bei der fluorimetrischenNADPH + H+ -Bestimmung (ReaktionIII; Abb. 4) Mengen bis zuO,1 Ilmoll-' ;eine weitere Senkung der Nachweisgrenze (bis 0 ,01 Ilmoll-') wird dUTCh alkaliinduzierte Bildung von Fluoreszenzderivaten des NADPH + H+ ermoglicht (OUTLAW 1980).

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453

3. Vorkommen Das 1931 in Erythrozyten (Pferd) entdeckte (WARBURG und CHRISTIAN 1931) und als ,,zwischenfennent" bezeichnete Enzym (WARBURG et al. 1935) wurde sehr rasch in einer Vielzahl tierischer, mikrobieller und pflanzlicher Objekte nachgewiesen (Obersicht: MULLER 1960). Seine Isolierung und Reinigung erfolgten 30 Jahre spater (Backerhefe; NOLTMAN et al. 1961). Tierische und mikrobielle Zellen enthalten das losliche Enzym im Cytoplasma sowie in Mikrosomen und Mitochondrien (Obersicht: LEVY 1979). In photosynthetisch aktiven Zellen der hoheren Pflanze gelang der Nachweis zunachst im Cytoplasma (vgl. MULLER 1960) und spater auch im Chloroplast (GARNIER-DARDAT 1965; HEBER et al. 1967), wo es sowohlloslich im Stroma als auch an Thylakoide gebunden vorliegt (WILDNER 1975; BEN-BASSAT und ANDERSON 1981). Auch in isolierten Vakuolen (Daucus carota-Zellkultur: Hopp et al. 1985) konnte G6PD-Aktivitat nachgewiesen werden. Chlorophyllfreies Gewebe kann neben cytoplasmatischen auch plastidlire Fonnen der G6PD enthalten, z. B. in etiolierten Keimpflanzen (Pisum: ANDERSON et al. 1974; STITT und ap REES 1978, Raphanus: SCHNARRENBERGER et al. 1975), Wurzelgewebe (Pisum: EMES und FOWLER 1979) und keimenden Samen (Ricinus: SATOH et al. 1983). Hingegen wurde in den Proplastiden des Endospenns keimender Samen (Ricinus bzw. Corylus: SIMCOX et al. 1977 sowie NISHIMURA und BEEVERS 1979 bzw. GOSLING und Ross 1980) keine G6PD-Aktivitat gefunden. Das Vorkommen bzw. die Aktivitat der G6PD - haufig als "Marker" fur die PPWAktivitat verwendet (AUDERSET et al. 1985; GAHAN et al. 1979, 1986) - sind eng mit dem physiologischen Zustand der Pflanze bzw. der Ontogenese verbunden (z. B. Kernholzbildung, ZIEGLER 1968). Zusatzlich sind - artabhangig - weitere Modifizierungen moglich. Es wird einerseits ein verstlirkter Abbau von Glucose-6-phosphat tiber das Pentosephosphat und damit eine venninderte Glycolyse in alten Zellen bzw. eine unveranderte KapaziHit des PPW in alten und jungen Blattern beobachtet und andererseits eine Stimulierung des PPW im stoffwechselaktiven, meristematischen Gewebe, z. B. in SproBspitzen (vgl. hierzu: EICHHORN und AUGSTEN 1977 a; TURNER und TURNER 1980). Detaillierte Untersuchungen an Blattgewebe fuhrten zu der SchluBfolgerung, daB der PPW offenbar dort besonders aktiv ist, wo die Bereitstellung von NADPH + H+ mittels Photosynthese fehlt (Xylemdifferenzierung: SAGISAKA und ASADA 1981 ; Epidermis, etioliertes MesophyIl: WURTELE und NIKOLAU 1986; vgl. 6.1.). AuBerdem sind mit erhohter G6PD-Aktivitat korreliert: Tracheidenbildung (Coleus: PRYKE und ap REES 1976), Adventivwurzelbildung (Phaseolus: HAISSIG 1982), Blattprimordien-Entwicklung (Dianthus: CROXDALE und OUTLAW 1983), SproBbildung aus Blattzellen (Nicotiana: SEENI und GNANAM 1984) und die Ausbildung von Wurzelspeichergewebe (Cichorium: TESNIERE et al. 1984). Ferner konnte ein Zusammenhang zwischen erhohter PPW-Aktivitat und Bliihinduktion bei Spinat nachgewiesen werden (GAHAN et al. 1979; AUDERSET et al. 1980; AUDERSET et al. 1985; BONZON et al. 1985); bei Brassica campestris steigen beim Obergang zur Infloreszenzbildung G6PD- und 6PGD-Aktivitaten stark an (ORR 1985). Eine verstlirkte Kohlenhydrat-Oxidation tiber den PPW wurde mit der Beendigung der Donnanz und dem Beginn der Keimung von Samen beobachtet (z. B. LA CROIX und JASWAL 1967; GOSLING und Ross 1980; SATOH et al. 1983; PYTEL und CHELIAK 1986); diese Stoffwechselanderung ist auf das Embryogewebe beschrankt, so daB Untersuchungen an Extrakten ganzer Samen zu Fehlinterpretationen fiihren konnen (GAHAN et al. 454

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Tabelle I.

Untereinheiten und Molekulargewichte pj/.anzlicher G6PD

Objekt

Untereinheiten

Acrochaetium daviesii Anabaena spec.

Ipomea batatas

2

Nicotiana tabacum Oryza sativa Pisum sativum

4

Pisum sativum

4

Spinacia oleracea

Woljjia arrhiza

Bemerkungen

Autoren

99 185 214 120 240 345 110

3 multiple Formen

vAN DER VELDE et al. (1975)

3 mUltiple Formen

SCHAEFFER und STANIER (1978)

Dimer

91 liS 120 776 je 56 224 je 60 240 105 105

2 multiple Formen 2 multiple Formen Tetramer

MUTO und URITANI (1970) HOOVER et al. (1977a)

Molekulargewicht (kDa)

1I2

IGAUE et al. (1981) SRIVASTA vAund ANDERSON (1983) FICKEN SCHER und SCHEIBE (1986) SCHNARRENBERGER et al. (1973)

Tetramer 2 multiple Formen (je l! Kompartiment)

EICHHORN (1984)

1986). Auf saisonbedingte Aktivitatsanderungen im Rindenparenchym bzw. in der Xylemfliissigkeit (Populus) weist SAGISAKA (1972, 1974) hin. Deutlich erhOhte Enzymaktivitaten wurden schlieBlich in Pflanzen nach einer Infektion (Viren, Bakterien, Pilze) gefunden (SCOTT und SMILLIE 1966; TSCHEN et al. 1979; MAKOVCOCA et al. 1980; BORNER und GRISEBACH 1982; SINDELAR 1986).

4. Struktur, multiple Formen und Isoenzyme Die bei photoautotrophen Organismen bisher nachgewiesenen Enzym-Untereinheiten differieren in ihrer Zahl und im MG (Tab. 1). Offensichtlich ist das physiologisch aktive Enzym aus 2 bis 4 Monomeren zusammengesetzt. SCHAEFFER und ST ANIER (1978) fanden bei Anabaena 3 U. E. mit ansteigendem MG, wobei die kleinste U. E. (120 kDa) als ein Monomer mit sehr geringer Aktivitat charakterisiert wurde. MUTO und URITANI (1970) beschrieben allerdings mit 110kDa ein Dimer, das der Gr6Benordnung der G6PD tierischer Zellen entspricht. Das bisher gr6Bte Molekulargewicht wurde bei Reis bestimmt (776kDa, IGAUE et al. 1981). Neuere Untersuchungen am Chloroplastenenzym von Pisum ergaben ein Tetramer (224kDa, Stokes-Radius 5,2nm) mit 56kDa pro U. E. (SRIVASTAVA und ANDERSON 1983) und am Cytoplasmaenzym ein Tetramer (240kDa) mit 60kDa pro U. E. (FICKENSCHER und SCHEIBE 1986). Eine Stimulierung der Tetramerenbildung durch Mg2+ diskutieren BONSIGNORE et al. (1971). Der Aggregationszustand ist offenbar durch die Milieubedingungen leicht veranderbar. BPP 183 (1988) 6

455

Tabelle 2. Multiple Formen bzw. Isoenzyme pjlanzlicher G6PD Objekt

multiple Formen

Acrochaetium daviesii

3

Allium cepa Allium cepa ,V setatska'

5 4

Anabaena spec.

3

Atriplex spongiosa

2

Bryophyllum calycinum

2

Chlamydomonas reinhardii (137 C) Chlorella pyrenoidosa (211-8b)

2

Chlorella vulgaris Chlorogonium elongatum

2 2-9

Coix lacryma-jobi Crassula Iycopodioides

2

Hordeum vulgare

7

Nicotiana tabacum ,Wisconsin 38'

1-2

Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum

2 1-2

Nicotiana tabacum ,Wisconsin 38'

4

Oryza sativa Pisum sativum

2 2

Portulaca oleracea

2

4-5

I

Ricinus communis Ricinus communis

456

BPP 183 (1988) 6

4

Isoenzyme

Bemerkungen

Keimwurzel Samen

Mesophyll: I Biindelscheide: I Chloroplast: I Cytoplasma: I

Autoren

VAN DER VELDE et al. (1975) MALLERY (1972) HADA(;ov A et al. (1981) SCHAEFFER und STANIER (1978) HERBERT et al. (1979) HERBERT et al. (1979) HERBERT et al. (1979)

Synchronkultur

autotroph Sommer: 2 autotroph Winter: 5 mixotroph: 9 Mesophyll Chloroplast: I Cytoplasma: I Blatt Kallus, cytokininautonomer Stamm Suspensionskultur Chloroplast: I Cytoplasma: I Kallus, cytokininu. auxinabhangiger Stamm Suspensionskultur Chloroplast: I Cytoplasma: I Mesophyll: I Biindelscheide: I Endosperm Samen Plastiden: 3 Cytoplasma: 1

CHEN (1979) CHEN und Lorenzen (1986) HERBERT et al. (1979) KERSTEN (1973)

HERBERT et al. (1979) HERBERT et al. (1979) SAKO und STAHMANN (1972) HADA(;ovA et al. (1975)

HOOVER et al. (1977a,b) HERBERT et al. (1979) KAMfNEK et al. (1981)

IGAUE et al. (1981) ANDERSON et al. (1974) HERBERT et al. (1979) SIMCOX und DENNIS (1978) SATOH et al. (1983)

Fortsetzung Tabelle 2 Objekt

multiple Formen

Isoenzyme

Bemerkungen

HERBERT et al. (1979)

Saccharum officinarum Secale cereale ,Imperial'

Autoren

5

etiolierte Keimpflanzen

SALINAS und BENITO (1983)

Sedum rubrotinctum

2

Chloroplast: 1 Cytoplasma: 1

HERBERT et al. (1979)

Solanum tuberosum

5

Knollen

KAHL (1974, 1979)

Spinacia oleracea

2

Chloroplast: I Cytoplasma: 1

SCHNARRENBERGER et al. (1973)

Spinacia oleracea

2

Triticum aestivum

2

Chloroplast: 1 Cytoplasma: I

HERBERT et al. (1979)

Triticum aestivum

5-6

keimende Friichte (Embryo): 6 SproG: 5

TONG et al. (1980)

Triticum aestivum

7

etiolierte Keimpflanzen

SALINAS und BENITO (1983)

Wolffia arrhiza

4-6

Chloroplast: 2 Cytoplasma (autotroph): 2 (mixotroph): 4

EICHHORN (1984)

Xanthium pennsylvanicum

6-9

Blatt, entwicklungsabhiingig

CHEN et al. (1970)

Mesophyll

HERBERT et al. (1979)

,King II', ,Dakold'

.

,Chinese spring'

Zea mays

HERBERT et al. (1979)

Eine reversible Dissoziation hochmolekularer Formen kann beispielsweise durch KCl (0,5 mol 1- 1) (lGAUE et al. 1981) oder durch Verdiinnen des enzymhaltigen Praparates in Abwesenheit von Effektoren bzw. durch pH-Erh6hung (SCHAEFFER und STANIER 1978) rasch eingeleitet werden. NADP+ (OAmoll- I ) fUhrt zu einer v6lligen Dissoziation des Enzyms in die Monomere, wahrend G6P allein appliziert keinen Effekt zeigt (SCHAEFFER und STANIER 1978; IGAUE et al. 1981). Demgegeniiber beobachteten MUTO und URITANI (1971, 1972) einen f6rdernden EinfluB von NADP+ auf die Assoziation der U. E. und VAN DER VELDE et al. (1975) schlieBlich ein indifferentes Verhalten der Enzymstruktur. Isoenzyme bzw. multiple Formen der G6PD sind bei photoautotrophen Organismen in unterschiedlicher Zahl festgestellt worden (vgl. Tabelle 2). In einigen Fallen bedarf das Bandenmuster der weiteren Prazisierung. Beispielsweise weisen HADACOV A et al. (1981) darauf hin, daB beim gleichen Objekt in Abhangigkeit von der Extraktionsmethode die Bandenzahl variieren kann. Folgt man der Empfehlung der "International Union of Biochemistry", sind nur die genetisch voneinander unabhangig gebildeten Formen als Isoenzyme zu bezeichnen, wahrend fUr aIle anderen Zellenzyme gleicher katalytischer Funktion der Begriff "multiple Form" vorgeschlagen wird. In Tabelle 2 sind deshalb aIle mit o. g. Methoden nachgewiesenen Banden als mUltiple Formen aufgelistet, auch dann, wenn die Autoren von Isoenzymen sprechen. 1974 nennt SCANDALIOS nur fUr zwei pflanzliche Objekte BPP 183 (1988) 6

457

.j:>.

0-

~

:0 00

~

QC

....

....

'"0 '"0

IJj

Ul 00

Pisum sativum (Chloroplast, Licht) (Chloroplast, Dunkel) (Cytoplasma, Licht) (Cytoplasma, Dunkel)

Avenafatua (Embryo) (Endosperm) Carylus avellana (Kotyledonen) Euglena gracilis Ipomea batatas (Wurzel) Larix laricina (Gametophyt) Lemna gibba (Chloroplast) Nicotiana tabacum (SuspensionskuItur, Gesamt-Zellextrakt) Phaseolus mungo

Anabaena flos-aquae Anacystis nidulans Anabaena spec.

Objekt

0 ,0086

0,014

7,6 und 8,5

7,6-8,0

0 , 15

0 ,033

0,018 0,33

0,47-0,56 0,33-0,56 0,29-0,60 0,32-0,90

0,16c ) 0 ,63 d )

0,22

0 , 12

0,182

0,3-0,9

0,133 0,148

0,15 0,37 0,140 ) 4,oob)

Glucose-6phosphat

0 ,023 0,010

0,01 0 ,0038")

NADP+

KM (mmoll- I)

7,6

pH Optimum

Tabelle 3. pH-Optima und kinetische Daten der G6PD phataautatrapher Organismen Vrnax

18 ,8 9,3

NADP+

29-34 34-46 34-81 4O-lll

16,8 9,9

Glucose-6phosphat

(nmol min-I mg Protein-I)

ANDERSON und DUGGAN (1976)

ASHIHARA und KOMAMINE (1976)

HOOVER et aI. (1977 a)

CORBUS, unveroff.

PITEL und CHELIAK (1986)

OHMANN et aI. (1970) MUTo und URITANI (1970)

GOSLING und Ross (1979)

ADKINS et. aI. (1980)

GROSSMAN und McGOWAN (1975) GROSSMAN und McGOWAN (1975) SCHAEFFER und STANIER (1978)

Autoren

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1.0

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el ,....,

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Anmerkungen : a) b) c) d)

7,2-7,5 7,05-7 ,2

0,060 0,050

0,Q3

7,2

8,5 7,5

0,038 0 ,02

7,4-7,5 7,2

0,38 0,31

0,55

0,2 0 ,08

0,33

0,4

0,140 0,340

0,12

0,0135 0,0013 0,0009

0 ,37

0,0024

Glucose-6phosphat

NADP+

NADP+ Glucose-6phosphat

V max (nmol min-I mg Protein-I)

(mmol rl)

KM

7,8 7,8

8,2

8,6

pH Optimum

hyperaktive Form (hyperbelfOrmige Abhiingigkeit von der G6P-Konzentration) hyporaktive Form (sigmoidale Abhiingigkeit von der G6P-Konzentration) niedrige Substratkonzentration hohe Substratkonzentration

Pisum sativum (Chloroplast, z. T. gereinigtes Enzym) Pisum salivum (Chloroplast, gereinigtes Enzym) Pisum salivum (Cytoplasma) Pisum sativum (Chloroplast, Licht) (Chloroplast, Dunkel) Spinacia oleracea (Chloroplast) (Cytoplasma) Spinacia oleracea (Chloroplast) Synechococcus spec. (6307) Synechococcus spec. (6716) Ricinus communis (Plastid) (Cytoplasma) Wolffia arrhiza (Chloroplast) (Cytoplasma)

Objekt

Fortsetzung Tabelle 3

EICHHORN (1984)

SATOH et al. (1983)

LUBBERDING und BOT (1984)

LUBBERDING und BOT (1984)

LENDZIAN (1978)

SCHNARRENBERGER et al. (1973)

YUAN und ANDERSON (1987)

FICKENSCHER und SCHEIBE (1986)

SRIVASTAVA und ANDERSON (1983)

BEN-BASSAT und ANDERSON (1981)

Autoren

multiple Fonnen (dort "Isoenzyme"), wiihrend gegenwiirtig fiir mehr als 30 Pflanzenarten entsprechende Angaben vorliegen (Tab. 2). Eine genetische Analyse - und damit die Identifizierung als Isoenzym - liegt nur fiir Secale cereale vor (SALINAS und BENITO 1983). Dnter sechs multiplen Fonnen konnte eine Form (Bande 4) als Isoenzym mit einem entsprechenden Strukturgen (G-6pd-r4) auf dem kurzen Chromosomemann bei den Sorten ,Imperial', ,King II' und ,Dakold' erkannt werden (Chromosomen-Klassifikation nach KOLLER und ZELLER 1976).

5. Kinetik Milieubedingt verlauft die Kinetik entweder hyperbelfonnig (ADKINS et al. 1980 ; EICHHORN 1984) oder sigmoid (ASHIHARA und KOMAMINE 1976). Entsprechend variieren auch die verfiigbaren -kinetischen Daten (Tab. 3); sie sind abhangig von Pflanzenart, okologischer Adaptation, Licht, Temperatur und Emahrung sowie von der Extraktions- bzw. Reinigungsmethode. Offen bleibt, ob die in vitro ennittelten Daten in allen Fallen von physiologischerRelevanz sind. Beispielsweise bewirkt Belichtung einen Mg2+ -Einstrom in den Chloroplast sowie pH-Erhohung (von etwa pH 7,0 und pH 8,0), wahrend fiir die pHOptima der chloroplastidiiren G6PD Werte zwischen pH 7,2 und 7,5 oder zwischen pH8,2 und 8,6 angegeben werden (Tab. 3). 5.1. Substratspezijitiit In tierischen und mikrobiellen Zellen liefert Glucose-6-phosphat im Vergleich mit anderen Substraten die hochsten V max- sowie die niedrigsten Km-Werte (LEVY 1979). Das gilt offenbar auch fiir pflanzliche G6PD, obwohl nur relativ wenig Daten verfugbar sind. 1983 zeigten SRIVASTAVA und ANDERSON fiir chloroplastidare G6PD (Pisum), daB auBer G6P nur noch Glucose-6-sulfat (bis 2,5mmoll- 1) umgesetzt wird; fur die cytoplasmatische G6PD fanden am gleichen Objekt FICKENSCHER und SCHEIBE (1986) ausschlieBlich G6P-Spezifitat. LEVY (1979) unterscheidet hinsichtlich des Hz-Akzeptors (NADP+, NAD+) bei G6PD 5 Gruppen, wovon in photoautotrophen Organismen nur die NADP+ -abhangigen G6PD, die mit NAD+ nicht reagieren, vorliegen. Beispielsweise fanden ASHIHARA und KOMAMINE (1976) sowie IGAVE et al. (1981) in den verschiedensten Pflanzen stets ausgepragte NADP+Spezifitat. Erst mit relativ hohen NAD+ -Mengen ist z. B. in den cytoplasmatischen Fraktionen (Wolffia arrhiza) eine geringfiigige G6PD-Aktivitat nachweisbar (Km = 3mmoll- 1); der hohe Km-Wert unterstreicht ihre physiologische Irrelevanz (EICHHORN 1984). 5.2. Aktivatoren Wahrend in mikrobiellen und tierischen ZeBen die G6PD durch Mg2+ aktivierbar ist (LEVY 1979), sind die entsprechenden Angaben fiir die cytoplasmatischen Enzym-Formen in hoheren Pflanzen nicht einheitlich. ASHIHARA und KOMAMINE (1976) zeigten, daB durch Mg2+ - und auch durch Mn 2+ - die Aktivitat des gereinigten Enzyms aus etiolierten Hypokotylen (Phaseolus mungo) erhoht wird ; andererseits beobachteten FICKEN SCHER und SCHEIBE (1986) bei gereinigter cytoplasmatischer G6PD (Pisum sativum) keinen entsprechenden Mg2+_ EinfluB. Fur die chloroplastidiire G6PD hingegen liegen ausschlieBlich aktivitatsfOrdemde durch das Milieu modifizierte - Mg2+ -Effekte vor. Dabei reagiert die thylakoidgebundene 460

BPP 183 (1988) 6

Form im Vergleich mit der loslichen des Stromas deutlich sensibler (Pisum sativum: WILDNER 1975). Bei Spinatchloroplasten sind ftir die Stimulierung niedrige Substratkonzentrationen und kleine NADPH + H+ INADP+ -Verhliltnisse erforderlich (LENDZIAN 1978). Der molekulare Mechanismus ist noch unklar. LENDZIAN (1978) diskutiert z. B. einen separaten Bindungsort ftir Mg2+ , der bei suboptimalem Substratangebot einen allosterischen Effekt auf den Substratbindungsort austibt. Moglicherweise begtinstigt Mg2+ auch die Tetramerenbildung (BONSIGNORE et al. 1971). In vitro stimulieren NaCl und KCl (bis 150mmoll- 1), wlihrend Na2S04, LiCI und CaCh unwirksam bleiben (GREENWAY und OSMOND 1972, CORBUS, unveroff. Befunde). Durch NaCI stimulierte PPW-Aktivitat im Apfelgewebe fanden auch GIANFAGNA und BERKOWITZ (1986). Eine Einschrankung der Lichtinaktivierung konnte durch hohe Pa-Mengen nachgewiesen werden (HUBER 1979) .

5.3. Inhibitoren 1m Vergleich mit den aktivierenden Effektoren ist die Zahl der Inhibitoren relativ groB (Tab . 4). Ein sehr wirksamer Inhibitor sowohl im Cytoplasma als auch im Chloroplast ist NADPH + H+ (z. B. LENDZIAN 1973; ASHIHARA und KOMAMlNE 1974; LENDZIAN und BASSHAM 1975 ; LENDZIAN 1980a, 1980b); seine Effizienz unterliegt einer pH-Kontrolle (ASHIHARA und KOMAMINE 1976 ; SCHAEFFER und STANIER 1978 ; LENDZIAN 1978). Bei Blaualgen wird die G6PD-Aktivitat zusatzlich dUTCh NADH + H+ gehemmt (SCHAEFFER und STANIER (1978) . Einige Autoren fanden eine durch ATP (teilweise auch durch ADP) ausgeloste Enzymhemmung (Cytoplasma: MUTO undURIT ANI 1972; BORRISS 1972; VELOSO et al. 1973; ASHIHARA und KOMAMINE 1974,1976), wiihrend andere keinen EinfluB beobachten konnten (Chloroplast : LENDZIAN und ZIEGLER 1970; LENDZIAN et al. 1978; Cytoplasma: FICKENSCHER und SCHEIBE 1986). Auch bei Blaualgen hemmt ATP die Enzymaktivitat (GROSSMAN und MCGOWAN 1975; SCHAEFFER und STANIER 1978). Die Inhibitoren konkurrieren entweder mit dem Substrat oder Cosubstrat, beispielsweise das ATP mit Glucose-6-P (Phaseolus mungo: ASHIHARA und KOMAMINE 1976 ; Ipomea batatas : MUTO und URITANI 1972) oder das NADPH + H+ mit NADP+ (cytoplasmatische Form aus Pisum sativum : FlCKENSCHER und SCHEIBE 1986) . Hingegen reagiert bei Prokaryoten (Cyanophyceen) das ATP gegeni.iber NADP+ nichtkompetitiv (GROSSMAN und McGaw AN 1975; SCHAEFFER und STANIER 1978). Die Wirkung der phosporylierten Kohlenhydrate ist offenbar stark von den Milieubedingungen abhangig: 5-Phosphoribosyl-I-pyrophosphat und Erythrose-4-phosphat hemmen das gereinigte Enzym aus etioliertem Gewebe, wobei im ersten Fall Mg2+ und pH modifizierend wirken (ASHIHARA und KOMAMINE 1976). Wahrend bei Aphanocapsa und Synechococcus (PELROY et al. 1972), Spinatchloroplasten (LENDZIAN und BASSHAM 1975) bzw. Anabaena (SCHAEFFER und STANIER 1978) Ribulose-I,5-bisphosphat die Enzymaktivitat inhibiert, hat der Metabolit aufG6PO aus Erbsenchloroplasten (ANDERSON et al. 1974) und Anacystis nidulans (GROSSMAN und McGowAN 1975) keine Wirkung. Nicht gehemmt wird das gereinigte cytoplamatische Enzym aus Erbsen durch Glucose-I-phosphat, Fructose-I-phosphat, Galactose-I-phosphat, Fructose-6-phosphat, Mannose-6-phosphat, Sedoheptulose-7 -phosphat, Ribose-5-phosphat, Glycerinaldehyd-3-phosphat, Dihydroxyacetonphosphat, ADP-Glucose und UDP-Glucose. Auch Schwermetallionen (Cu2+, Pb2+, Hg2+; bis 2 . 10- 5 mol 1-') bleiben unwirksam (FICKENSCHER und SCHEIBE (1986). BPP 183 (1988) 6

461

Tabelle 4. K;-Werte von G6PD-Inhibitoren photoautotropher Organismen Inhibitor

Kj-Wert (mmoll- I )

NADPH + H+ 0,13

NADP+ ATP

ATP/ADP

Bemerkungen

Objekt

Autoren

0,oI8

Anabaena flos-aquae , Anacystis nidulans Pisum sativum

0,011 0,07 0,025 0,035

Pisum sativum Spinacia oleracea Wolffia arrhiza Wolffia arrhiza

2,4

Anabaena spec.

SCHAEFFER und STANIER (1978)

Ipomea batatas Wurzel Anabaena spec . Synechococcusspec. (6307)

MUTO und URITANI (1972) SCHAEFFER und STANIER (1978) LUBBERDING und BOT (1984)

Synechococcusspec. (6717)

LUBBERDING und BOT (1984)

2,1 2-5 2,2 a ) IO,Ob) 2,8 a ) IO,Ob) 0,16

0,37') 5-Phosphoribosyl-I-pyro- 0,02 b) phosphat

GROSSMAN und MCGOWAN (1975) Chloroplast, gereinigtes Enzym Cytoplasma Chloroplast Chloroplast Cytoplasma

SRIVASTAVA und ANDERSON (1983) FICKENSCHER und SCHEIBE (1986) LENDZIAN (1980a) EICHHORN (1984)

Phaseolus mungo

SproB

ASHIHARA und KOMAMINE (1974, 1976)

Phaseolus mungo

SproB

ASHIHARA und KOMAMINE (1976)

Ribulose1,5-bisphosphat

0,2 0,8-1,3 0,9-1,2

SpitUlcia oleracea Blatt Synechococcusspec. (6307) Synechococcusspec. (6717)

Dithiothreitol

0,02 2,5

Spinacia oleracea Pisum sativum

LENDZIAN und BASSHAM (1975) LUBBERDING und BOT (1984) LUBBERDING und BOT (1984)

Chloroplast LENDZIAN (I 980 a) Chloroplast, SRIVASTAVA und ANDERSON (1983) gereinigtes Enzym

Anmerkungen: a) G6P als Iimitierendes Substrat b) NADP+ als limitierendes Subslrat

6. Regulation Die G6PD-Aktivitat wird sowohl durch Metabolit-Regulation (Konkurrenz urn Glucose-6phosphat; z. B. BASSHAM und KRAUSE 1969; KAISER und BASSHAM 1979) als auch durch Enzym-Regulation (reversible Aktivitiitsiinderung tiber Effektoren ; LENDZIAN und BASSHAM 1975; LENDZIAN 1980 a, b) beeinfluBt. Die chloroplastidiiren Formen sind dariiber hinaus einer Photomodulation zugiingJich (reversible Aktivitiitsiinderung durch vom photosynthetischen Elektronentransport beeinfluBte Redoxsysteme; LENDZIAN und BASSHAM 1975; WILDNER 1975; ANDERSON und ARNON 1976). Dber genreguJierte Apoenzym-Bildung insbesondere tiber die Entstehung multi pier Formen und Isoenzyme - welche zweifellos eine wichtige Rolle spielt, ist erst wenig bekannt.

462

BPP 183 (1988) 6

6.1. Metabolit- und Enzymregulation Es gibt zahlreiche Hinweise daflir, daB der PPW und die Glycolyse in pflanzlichen Geweben - teilweise im gleichen Kompartiment (z. B. KELLY und LATZKO 1982) nebeneinander aktiv sind. Fiir bestimmte Stoffwechsel-Situationen (bedingt durch Ontogenese oder Milieu) bestehen dann charakteristische Relationen zwischen beiden Glucose-Abbauwegen (z. B. ap REES 1980). Verantwortlich sind Aktivitiitsiinderungen an den Schliisselenzymen (Glucose-6-phosphat Dehydrogenase, Phosphofructokinase; KAISER und BASSHAM 1979; CSEKE et al. 1982). So erfolgt beispielsweise in Abhiingigkeit von der Belichtung in den SchlieBzellen (Vicia faba) eine rasche gegensiitzliche Anderung beider Enzymaktivitiiten (SCHNABL 1985; vgl. auch 3.). Unter StreBbedingungen (z. B. vermindertes Wasserpotential) reagiert Lemna minor mit erheblicher Reduktion an G6PD- und 6PGD-Aktivitiit, hingegen sind unter N-Mangel die Enzymaktivitiiten im Vergleich mit der unbelasteten Kontrolle unveriindert (DAVIES 1977; vgl. auch SCHLEE 1986) Dariiber hinaus muB mit 2 Varianten des PPW gerechnet werden (F- und L-Typ; vgl. z. B. EICHHORN 1983b). Die AktivitiitderG6PD kann sowohl durch Bereitstellung von Substrat (G6P) bzw. Cosubstrat (NADP+) als auch durch Effektoren beeinfluBt werden (z. B. OHMANN et al. 1970; SCHRADER et al. 1974; vgl. 5.). Ubereinstimmende Befunde zeigen, daB das NADPH + H+/NADP+-Verhiiltnis ein wesentliches Regulativ darstellt (NADPH + H+ als wirksamer Inhibitor und NADP+ als Cosubstrat mit sehr niedrigen Km-Wert; vgl. 5.). Beispielsweise limitiert die verfiigbare NADP+ -Menge die Glucose-Oxidation iiber den PPW (Maiswurzel: BUTT und BEEVERS 1961); andererseits stimuliert der NADPH + H+ -Bedarf den PPW (Daucus carota, Solanum tuberosum: ap REES und BEEVERS 1960a, b). Ein zusiitzlicher Bedarf an reduziertem NADP+ resultiert aus der Nitritreduktion (z. B. Wurzelgewebe: BEEVERS und HAGEMAN 1969; SARKISSIAN und FOWLER 1974; EMES und FOWLER 1979, 1983; JESSUP und FOWLER 1977; Blaualgen: BATT und BROWN 1974). Der Mechanismus der Wechselwirkung zwischen PPW und Nitritreduktase ist noch unbekannt (EMES und FOWLER 1983). Diskutiert wird ein Carrier, der den Elektronentransport mittels Diaphorase (EC 1.6.4.3) vom NADPH + H+ in der Nitritreduktase-katalysierten Reaktion auf Nitrit ermoglicht (On et al. 1985). Bei der Samenentwicklung (Ricinus communis) werden etwa 40 % des im PPW produzierten NADPH + H+ flir die Fettsiiure-Biosynthese im Endosperm genutzt (AGRAWAL und CANVIN 1971 a, b). Der PPW ist bei diesem Objekt in 2 Kompartimenten aktiv: Die erste Oxidation erfolgt im Cytoplasma, und nach dem Transport des 6-Phosphogluconats in den Plastid flihrt die weitere Metabolisierung schlieBlich zu Triglyceriden (vgl. DENNIS und MIERNYK 1982). Durch Bereitstellung von NADPH + H+ und nach Ubertragung des Wasserstoffes auf Thioredoxin (Abb. 5) erfolgt die Biosynthese von Desoxyribonucleosiddiphosphat (Abb. 6). Thioredoxine sind ubiquitiire, wasserstofflibertragende Proteine. Abb. 5 zeigt die Aminosiiuresequenz ihres aktiven Zentrums; die beiden Cystein- Reste sind aufgrund ihrer Konformation von auBen zugiinglich (Ubersicht: HOLMGREN 1981). Infolge Wechselwirkung zwischen den DithiollDisulfid-Gruppen kann das Thioredoxin als Elektronencarrier fungieren (Abb. 5B; vgl. auch 6.2.). Potentielle Regulationskomponenten sind auch Zuckerphosphate, doch sind die Vorgiinge noch wenig iibersichtlich, zumal unter bestimmten Bedingungen auch ein "recycling" BPP 183 (1988) 6

463

SH - - - - - - - - - - - -SH

® @ Abb. 5. Thioredoxin (nach

I

-Trp - Cys - Gly -

/ S Thioredox in I ~S

HOLMGREN

+

2 e-

I

Pro- Cys - Lys-

+

2H

~ Thioredoxin/

SH

~SH

1(81). A: Aminosiiuresequenz des akti ven Zentrurns. B: Redoxreaktion.

RibonucleosiddiphosphOI

Deoxy ribonucleosiddiphosphot +H2 0

Abb. 6. Biosynthese der Desoxyribol/udeosiddiphosphate. Thioredoxin Reduktase (EC 1.6.4.5) tibertragt den Wasserstoffvon NADPH + H+ auf Thioredoxin und tiber das reduzierte Thioredoxin verrnittelt die Ribonucleosiddiphosphat Reduktase (EC 1.17.4.1) die Reduktion von Ribonucleosiddiphosphat zum Desoxyribonucleosiddiphosphat.

zwischen G6P und R5P vorliegen kann (ap REES et al. 1965). Eine Stimulierung des PPW wurde in Verbindung mit verschiedenen Stoffwechselaktivitaten beobachtet: DNA-Replikation (KIKUTA et al. 1971), Ligninsynthese (Bambus: HIGUCHI und SHAMADA 1967 ; Helianthus: PRYKE und ap REES 1976, 1977) bzw. Synthese von Kutin und Wachs (WURTELE und NIKOLAU 1986) . 1m einzelnen werden aber auch Widerspriiche deutlich: Die Bildung von Phosphoribosyl-l-pyrophosphat - ein Prakursor fUr die Ribosyle der DNA - wird durch die Phosphoribosyl-1-pyrophosphat Synthetase (EC 2.7.1.18) katalysiert. Einegute Ubereinstimmung zwischen der gesteigerten Aktivitiit dieses Enzyms und erhohten G6PD- und 6PGDAktivitaten bei reduziertem CJC1-Quotienten fi.ir freigesetztes CO 2 aus markierter Glucose beobachteten KANAMORI et al. (1979) in Catharanthus roseus. ledoch wurde Phosphoribosyl1-pyrophosphat auch als Inhibitor der G6PD aus Phaseolus mungo - in Abhangigkeit von Mg2+ -Konzentration und pH - nachgewiesen (ASHIHARA und KOMAMINE 1976). 1m Zusammenhang mit der Lignifizierung von Bambus-Sprossen besteht eine Korrelation zwischen hohem Erythrose-4-phosphat-Pool und stimulierter PPW-Aktivitat (HIGUCHI und SHAMADA 1967); andererseits zeigt Erythrose-4-phosphat Inhibitoreffekte (vgl. 5.3.) . Bereits 1968 diskutierte ZIEGLER die Umschaltung auf den PPW in den altern den Splintzellen, die nach ihren Absterben das Kernholz bilden. Doch sind auch heute die physiologischen und biochemischen Vorgiinge der Verkernung pflanzlicher Zellen nicht v611ig geklart. Unter physiologischen Bedingungen ist auch eine Regulation iiber das Adenylat-System - gemein-

464

BPP 183 (1988) 6

sam mit dem verfiigbaren Pa - moglich (z. B. Wolffia arrhiza: EICHHORN und AUGSTEN 1977 a). Deutlich wirken auch veriinderte Milieu-Verhiiltnisse: Wurden beispielsweise Ribose und Saccharose unter verschiedenen Lichtbedingungen metabolisiert, liegt in Blaulicht-kultivierten Pflanzen (Wolffia) im Vergleich mit der Rotlicht-Variante eine gesteigerte G6PD-Aktivitiit VOf, die mit erhohtem Energy Charge in Beziehung steht (EICHHORN und AUGSTEN 1977b). In heterotrophem Gewebe (Kartoffel) korreliert erhohte L-Ascorbat-Menge mit hoher G6PD-Aktivitat (KAHL 1974). KAHL (1974) diskutiert in diesem Zusammenhang eine Reaktionsfolge von Glucose-6-phosphat zu L-Ascorbat und von 6-Phosphogluconat zu 3Keto-6-phosphogluconat mit nachfolgender Epimerisierung der Hydroxylgruppe in Position C-5. L-Ascorbat fungiert als starkes Reduktionsmittel und beeinfluBt mehrere Stoffwechselablaufe (z. B. Epoxidation und De-Epoxidation von Carotenoiden, Abbau von H20 2 und Oi-, Hydroxylierung aromatischer Verbindungen; Ubersicht bei GANDER 1982). Dariiber hinaus ist das AscorbatiDehydroascorbat-System offenbar Teil einer Stoffwechselsequenz, das iiber die NADPH + H+/NADP+ -Relation wirksam wird (Abb. 7). 6.2. Photosynthese-vermittelte Modulation Belichtung beeinfluBt sowohl den strukturellen als auch den physiologischen Zustand des Chloroplasten (z. B. Veranderung der Thylakoid-Abstande und des Mineralstoftbaushaltes: HIEKE 1977; HEBER 1980). Befunde zur Interaktion zwischen NADPH + H+ I NADP+-Verhaltnis, G6P, Mg2+ undpH im Chloroplast (vgl. 5.2. und 5.3.) verdeutlichen die Problematik (LENDZIAN 1978). Einerseits fiihrt Belichtung zu einem hohen NADPH + H+/NADP+-Verhaltnis (Hemmung der G6PD), andererseits schaffen die lichtinduzierte Alkalisierung des Stromas (PH 8,0 bis 8,2) und der gleichzeitige Anstieg der Mg2+ -Konzentration Bedingungen, welche die Enzymaktivitat stimulieren. Die Untersuchungen zur Aufkliirung der erstmals von LENDZIAN und ZIEGLER (1970) beobachteten revesiblen Inaktivierung der G6PD durch Licht (z. B. unter Einsatz von Dithiothreitol: JOHNSON 1972) zeigten, daB als wirksames Prinzip ein Proteinkomplex vorliegt (LEM-System: ANDERSON und AVRON 1976; ANDERSON et al. 1978). Eine Komponente konnte als losliches Ferredoxin und ein SH-haltiges Protein als isomere Form von Thioredoxin (Abb. 5) charakterisiert werden (Ubersicht: BUCHANAN 1984). In Abb. 8 sind mogliche Reaktionssequenzen der Photomodulation der G6PD dargestellt. Ausgehend vom Elektronenakzeptor iin PS I werden die Elektronen iiber 3 Systeme weitergeleitet: I. iiber Ferredoxin zum NADP+, 2. im zyklischen Elektronentransport und 3. iiber Superoxidradikale - entstanden z. B. durch direkte Ubertragung auf Sauerstoff zu H2 0 2 (MEHLER-Reaktion: KAISER 1979). In den beiden erstgenannten Reaktionen sind die Redoxsysteme Ferredoxin und Thioredoxin miteinander gekoppelt. Die Reduktion erfolgt in photoautotrophen Pro- und Eukaryoten Ferredoxin-abhangig durch die Ferredoxin-Thioredoxin Oxidoreduktase (EC 1. 6.7.1) und in heterotrophen Systemen durch die NADP+ -abhangige Ferredoxin-Thioredoxin Oxidoreduktase (EC 1.6.4.5) (BUCHANAN 1984). Ob eine bei Pflanzen nachgewiesene Reduktion von Thioredoxin mit NADPH + H+ (Chlorella: TSANG 1981; Spinatchloroplasten: SCHRIEK und SCHWENN 1984) auch durch NADP+ -abhangige Ferredoxin-Thioredoxin Oxidoreduktase vermittelt werden kann, ist nicht bekannt. Sowohl Cyanobakterien als auch ChI oro31

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465

I

I I

t=== 0~0~~[x I I red.· ~~dX~:d~~r:~p~+Gf:iaXA~~orred. red. geb.

lost. \

ox.

ox.

ox.

thlon

bat

HzOz

/'------ H2 0 + ~ °z

PSI

Abb. 7. Beziehung zwischen Glutathion-Ascorbat-Redox-System und G6PD-Aktivit/it.

0 2[S~Jr~~~e_ p700*2e~-C02r~--: 2H

1

Thio

+

EC1.6.Z1 (geb.l

2[SH

2e-

Ox.

red.

___ - . - -

,

2H+

: 2e-

2H+

...

.. ·"H 0 2 2

red·xred. FMN

Ox.

NADP'

Ox

Cyt. b 563

2H+

P700 PS I

Abb. ll. Moglich e Reaktion~sequenzell der Photomodu/alioll VOII (j6PLJ. Der photosynthetische Elektronentransport beeinfluBt iiber gebundenes oder losliches Ferredoxin (gekoppelt mit FMN und NADP+ bzw. Thioredoxin) oder iiber Superoxidradikal-Bildung die G6PD-Aktivitat (EC 1.6.4.5: Thioredoxin Reduktase; EC 1.6.7.1 : FerredoxinThioredoxin Oxidoreductase ; ?: nicht naher bekannte Reaktionsvermittler; ...... ~: MEHLER-Reaktion; _. -~: Superoxid-Radikal als Substrat flir Elektronentransport-Komponenten).

plasten hOherer Pflanzen besitzen multiple (isomere) Formen von Thioredoxin (vgl. BUCHANAN 1984). Uber das durch Oxidoreduktasen reduzierte Thioredoxin werden im Chloroplast vier Enzyme des CALVIN-Zyklus (Fructose-I,6-bisphosphatase, EC 3.1.3.11; NADP+ -abhangige Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase, EC 1.2. 1. l3 ; Ribulose-5-phosphat Kinase , EC 2.7.1.19; Sedoheptulose-l ,7-bisphosphatase, EC 3.1.1.37) aktiviert und die G6PD inaktiviert, wahrend das im Dunkeln oxidierte Thioredoxin einen entgegengesetzten Effekt hat (BUCHANAN 1980, 1984). Hinsichtlich der zwischen Thioredoxin und G6PD vermittelnden

466

BPP 183 (1988) 6

Reaktionspartner werden Glutathion bzw. losliche Proteinfaktoren diskutiert (vgl. ANDERSON 1979; SCHEIBE und ANDERSON 1981). Ein hoher Gehalt an reduziertem NADP+ (etwa 80 %, YOUNGMAN et al. 1980), kann die MEHLER-Reaktion auslosen; es ist denkbar, daB O 2- bzw. H 20 2 die inaktive G6PD oxidativ aktivieren (z . B. WOLOSIUK und BUCHANAN 1977; TAKAHASHI et al. 1980). Moglicherweise wird dieser MEHLER-Mechanismus im Dauerlicht bei hohem Elektronendruck (mit entsprechender NADPH + H+ -Bildung) partiell aktiviert. Zur Gewahrleistung einer konstanten Konzentration an reduziertem Thioredoxin ist eine ausreichende Lichtintensitat erforderlich ; laBt der Elektronentransport nach, kommt es zur oxidativen Aktivierung des Enzyms . Beispielsweise korreliert steigende PhotonenfluBrate mit abnehmender G6PD-Aktivitat und umgekehrt (Wolffia arrhiza: EICHHORN 1983 a) . Widerspriichliche Angaben liegen zum LichteinfluB auf die cytoplasmatische G6PD vor: Wahrend ANDERSON et al. (1974), ANDERSON und DUGGAN (1976) , ANDERSON und NEHRLICH (1977) bzw. YUAN und ANDERSON (1987) bei Pisum eine yom photosynthetischen Elektronentransport abhangige Hemmung beobachteten , (z . B. Inaktivierung durch Dithiothreitol) , konnten FICKENSCHER und SCHEIBE (1986) am gleichen Objekt den Befund nicht bestatigen.

6.3. Gen-Regulation Untersuchungen zur Gen-Regulation der G6PD im strengen Sinne sind nicht bekannt. Die bisher vorliegenden Befunde beziehen sich auf Veranderungen im Spektrum der multiplen Formen bei Wachstums- und Entwicklungsvorgangen. Es laBt sich aber daraus ableiten , daB eine gesteuerte Biosynthese (Genexpression) oder Reaktivierung der Enzymformen eng mit dem physiologischen Zustand der Pflanzen im Zusammenhang steht. Wahrend der Blattentwicklung von Xanthium pennsylvanicum wurden insgesamt 6 multiple Enzym-Formen beobachtet (CHEN et al. 1970). 3 Formen mit hohem Molekulargewicht sind stets nachweisbar, wahrend 3 weitere Formen zu Beginn der Blattentwicklung unregelmaBig und erst im AbschluB der Blattentfaltung stetig auftreten. In Weizenembryonen (Triticum aestivum) sind in der Keimungsphase 6 mUltiple Formen mit unterschiedlicher Aktivitat vorhanden; im SproB der etwa 5 Tage alten Keimpflanzen hingegen liegen nurnoch 5 Formen vor (TONG et al. 1980). Verwundung von Kartoffelgewebe (Solanum tuberosum) verandert die Aktivitat von 5 nachweisbaren multiplen Formen: 2 Tage nach der Verwundung wird ein Maximum und 5 Tage spater wieder der Aktivitatsspiegel vor der Verwundung erreicht (KAHL 1974, 1978). Eine Verringerung der Bandenzahl wurde bei der Keimwurzel von Allium cepa beobachtet (5 multiple Formen 4h und 3 multiple Formen 52h nach der Keimung ; MALLERY (1972) . Mit dem Phytohormon-Status im Zusammenhang stehende Veranderungen fanden KAM f NEK et al . (1981). Beispielsweise enthalt ein Cytokinin-autonomer Tabakkallus-Stamm nur 1 und der Cytokinin-abhangige Parallel stamm 4 verschiedene G6PD-Formen. Auch Licht verandert nicht nur die Enzymaktivitat, sondem eben so das Banden-Spektrum der G6PD . Zum Beispiel wird im Vergleich mit der Dunkelphase wahrend der Lichtphase in einer Synchronkultur von Chiorella pyrenoidosa die Zahl der multiplen Formen erhoht (COLE et al. \968). Untersuchungen von CHEN (1979) und CHEN und LORENZEN (1986) zeigten, daB wahrend des Zellzyklus (14: I Oh) mit Beginn der Lichtperiode 4 Banden und am Ende (12. bis 14. Lichtstunde) zusatzlich eine weitere Bande auftraten. Die Gesamtaktivitat der G6PD 31 *

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korreliert mit der Anderung des DNA- und RNA-Gehaltes und weist auf mogliche Beziehungen zwischen PPW und Nucleinsiiure-Synthese hin. Ein jahreszeitlicher, aber auch emiihrungsabhiingiger EinfluB auf das Bandenmuster wurde bei Chlorogonium elongatum nachgewiesen (KERSTEN 1973). Mehrjiihrige autotrophe Kultivierung im Lichtthermostat hatte ein von der lahreszeit abhiingiges, unterschiedliches Bandenmuster zur Folge (Sommer: 2, Winter: 5 Banden). Wiihrend Acetat als zusiitzliche CQuelle die beiden im Sommer auftretenden Formen nicht beeinfluBt, wird die Bandenzahl in den Wintermonaten von 5 auf 9 erhoht. Diese zusiitzlichen multiplen Formen sind offenbar das Resultat einer Neusynthese, da ihre Bildung durch Cycloheximid hemmbar ist. Bei Wolffia arrhiza beeinflussen die Milieuverhiiltnisse nur das Bandenmuster im Cytoplasma (autotrophe Verhiiltnisse: 2, mixotrophe Verhiiltnisse: 4 Banden), nicht aber im Chloroplast (2 Banden). Auch hier ist - wie Untersuchungen mit Cycloheximid zeigten - eine Neusynthese anzunehmen (EICHHORN 1984).

7. Ausblick In den letzten lahren konnten unsere Kenntnisse zur Regulation der G6PD in wesentlichen Punkten erweitert und vertieft werden. Beispielsweise muBte die friihere Vorstellung, daB der PPW vor allem in iilteren und die Glycolyse in jiingeren Geweben bevorzugt aktiv ist, revidiert und die Abhiingigkeit dieser Stoffwechselwege von Zellfunktion und Zellstatus zur Kenntnis genommen werden. Diese Fortschritte sind nicht zuletzt auf die wesentlich we iter entwickelten Nachweismethoden zuruckzufiihren, die nunmehr auch Aktivitiitsbestimmungen auf das Niveau der Einzelzelle und der Zellorganellen gestatten. Es konnte gezeigt werden, daB an einem Objekt erhobene Befunde zur G6PD nicht verallgemeinert werden diirfen, weil die Prozesse der Metabolit- und Enzymregulation bzw. Photomodulation nicht nur artspezifisch sein konnen, sondem auch von der Ontogenese und den Milieubedingungen abhiingig sind. Neue Aspekte ergeben sich aus der Frage nach der Koordinierung von PPW und Glycolyse und den dieser Koordinierung zugrunde liegenden Mechanismen. Durch Metabolisierung des Glucose-6-phosphats entstehen sehr unterschiedliche Priikursoren, die in vielen Bereichen des Stoffwechsels eingreifen und durch die die G6PD-Wirkung mit dem iibrigen Zellstoffwechsel verkniipft ist. Die der G6PD zugrunde liegenden genetischen Fragen wurden bisher wenig bearbeitet; mit Sicherheit darf angenommen werden, daB sich in Zukunft die Forschung auf die Aufkliirung der Gen-Struktur und Gen-Expression konzentrieren wird, zumal auch die physiologische Funktion multi pier Formen und Isoenzyme noch einer Kliirung bedarf.

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Eingegangen 5. August 1987; revidierte Fassung akzeptiert 27. November 1987 Anschrift der Verfasser: Dr. sc. MANFRED EICHHORN und Dr. BERNHARD CORBUS, Friedrich-SchillerUniversitat Jena, Sektion Biologie , Wissen schaftsbereich Pflanzenphysiologie , Von-Hase-Weg 3, Jena, DDR-6900.

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