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Die polarographische und photometrische bestimmung von tocopheronolacton in wässriger lösung unter verwendung der dünnschichtchromatographie
CLINICA
DIE
CHIMICA
ACTA
491
POLAROGRAPHISCHE
TOCOPHERONOLACTON DER
UND
PHOTOMETRISCHE
IN WASSRIGER
LijSUNG
BESTIMMUNG UNTER
VON
VERWENDUNG
DUNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
H. SCHMANDKE
UND
H. GOHLKE
Institut fiir Erniihrung der Deutschen Potsdam-Rehbriicke (Deutschland)
(Eingegangen
A
kademie der
Wissenschaften
zu Berlin,
den 16. Juni, 1964)
SUMMARY
The Polarographic and Photometric Determination Solution After Thidayer Chromatogra$hy
of Tocopheronolactone
in Watery
A polarographic and photometric method after thin-layer chromatography is described for determining tocopheronolactone in watery solution. The photometric determination was carried out after conversion of tocopheronolactone into 2,5,7,8tetramethyl-a-@‘-carboxyethyl)-6-hydroxychroman Both methods give similar results.
with
Emmerie-Engel
reagent.
EINFiiHRUNG
Das y-Lacton des 2-(3-Hydroxy-3-methyl-5-carboxypentyl)-3,5,6-trimethylbenzochinon-I,4 (Tocopheronolacton) ist ein Stoffwechselprodukt des cr-Tocopherols, das von Mensch und Tier mit dem Harn bereits synthetisch dargestellt wurde 2, 3. lactons stehen,
Da bisher vorliegt,
als Glucuronid
ausgeschieden
keine Methode zur quantitativen Bestimmung sol1 im Modellversuch geprtift werden, welche
die genannte
Substanz
in wassriger
Losung
quantitativ
wirdl
und
des TocopheronoMoglichkeiten be-
zu erfassen.
EXPERIMENTELLES
Urn auf den Harn tibertragbare Verhaltnisse zu erhalten, die eine Hydrolyse des Glucuronids wahrscheinlich unumganglich machen, wurden IOO ml einer wassrigen Tocopheronolactonldsung grundsatzlich mit konz. Salzsaure auf eine 2N salzsaure Losung eingestellt und diese I Std. bei 100~ hydrolysiertl. Anschliessend extrahiert man das Tocopheronolacton mit 4x50 ml Ather, gibt den Extrakt zum Trocknen durch eine mit Natriumsulfat geftillte Saule, wascht mit 15 ml Ather nach und dampft das gesamte Atherfiltrat bis zur Trockene ein. C&n. Chim.
Acta,
II (1965)
491-494
H. SCHMANDKE,
492
H. GOHLKE
Polarogra$hische Bestimmung Fur die Untersuchungen wurde der Polarograph LP 55 (CSSR) verwandt. Die Tropfzeit der Kapillare betrug t = 2.91 set, die Ausstrijmgeschwindigkeit m = 2.45 mg x secl. Zur Bestimmung selbst wurde der zur Trockene eingedampfte Atherextrakt in 0.5 ml absolutem Athanol aufgenommen und ein aliquoter Teil auf ZinkcarbonatSilicagel-Platten
mit
dem Entwickler
Chloroform-Benz01
(I : I)
der Dtinnschicht-
chromatographie unterworfen4. Nach der Sichtbarmachung des Tocopheronolactons mit o.z”J$ger athanolischer Rhodamin B-L&sung im UV-Licht wird vom nichtbesprtihten Teil der Platte die entsprechende Lactonflache mit einem Spate1 abgetragen
+
und mit 3 ml absolutem
Athanol
-
konz.
30 min eluiert,
zentrifugiert
und davon 2 ml mit
HCI
+ L-Ascorbmtiure
%-
CHP-CHz-COOH
CH,-CH,-COOH CH3
III
IZL
Fig. I. Uberfiihrung hydroxychroman (IV)
2
des Tocopheronolactons (I) in z,5,7,8-Tetramethyl-z-@carboxyPthyl)-6. durch Reduktion mit L-Ascorbins%ure in konz. salzsaurer Msung.
ml eines Acetatpuffers
von einem PH 5.33 (2 M Essigsaure:
2 M Natriumacetat
I : 5) in die polarographische Zelle tiberfiihrt. Nach dem Entliiften Stickstoff polarographiert man anodisch im Spannungsbereich -0.4
=
mit gereinigtem bis +-0.2 V mit
einer Hg-Tropfelektrode gegen eine gesattigte Kalomelelektrode. Die quantitative Auswertung erfolgte aufgrund eines Standardzusatzes. bestimmbar sind noch 1.5 ,ug/ml Gesamtlijsung der polarographischen Zelle.
Gut
Photometrische Bestimmang Der eingedampfte Atherextrakt wurde wie bei der polarographischen Methode verarbeitet. Er wurde in 20 ml konz. Salzsaure aufgenommen und unter Stickstoff 3 Std. bei 50’ mit IOO mg L-Ascorbinsaure behandelt. Wie in Fig. I dargestellt, wird durch konz. Salzsaure das Tocopheronolacton (I) zur entsprechenden Saure (II) gespalten und unter r_-Ascorbinsaureeinwirkung iiber das Zwischenprodukt (III) zum 2,5,7,8-Tetramethyl-z-(B-carboxy~thyl)-6-hydroxychroman (IV) 2,s umgewandelt *. Dann wird mit 4 x 50 ml peroxydfreiem Ather extrahiert, mit Natriumsulfat getrocknet und unter reinem Stickstoff -* Die Methode ist prlparativ ebenfalls gut verwendbar; die Ausbeute betr%gt75°,0
UnverBffentlicht)
Clin. Chim. Acta,
II (1965) 491-494
zur Trockene (H. Schmandke.
BESTIMMUNG VON TOCOPHERONOLACTON
493
eingedampft. Es wurde dann in 0.5 ml absolutem Athanol aufgenommen und ein aliquoter Teil auf eine Silicagel-Gips-Platte (IO g Silicagel, I g Gips, 60 ml Wasser; Aktivierung 30 min bei 110~) aufgetragen, die mit Acetonitril-Wasser (9 : I) entwickelt wurde. Nach dem Bespriihen eines Teils der Platte mit einer ro”/&en athanolischen Phosphormolybdansaure-Losung oder einer o.z%igen athanolischen Rhodamin BLosung wird das so nachgewiesene 2,5,7,8-Tetramethyl-2-(/3-carboxyathyl)-6-hydroxychroman (siehe Fig. 2) vonl nichtbesprtihten Teil des Chromatogramms, wie bei der polarographischen Bestimmung beschrieben, mit 3 x 3 ml absolutem Athanol eluiert und das Eluat in einen IO ml Messkolben gegeben. Nach Zugabe von 0.5 ml einer o.z”/,igen athanolischen 2,2’-Dipyridylund 0.5 ml einer o.50/uigen athanolischen
Fig. z.. lXinnschichtchromatogramm des *,5,7,8-Tetramethyl-z-(B-carboxy~thyl)-6-hydroxychroman (IV) nach dem Bespriihen mit sthanolischer Rhodamin B-Ltisung im UV-Licht (I = Probe, z = Standard, 3 = Probe + Standard).
Eisen(III)chlorid-Losung wird mit absolutem .&than01 auf IO ml aufgeftillt und 2 min nach der Eisen(III)chlorid-Zugabe am Zeiss-Universal-Spektrophotometer bei 520 rnp gemessen. Die Reagenszugabe und das Messen erfolgen im Dunkeln. Die Berechnung wird mittels eines entsprechenden Standards oder einer Eichkurve durchgefuhrt. Nach dieser Methode kijnnen 5 pg noch gut bestimmt werden. ERGEBNISSE
Das Halbstufenpotential des Tocopheronolactons wurde zu -0.108 V bestimmt. Aus Tabelle I ist zu ersehen, dass die polarographische und photometrische Bestimmungsmethode von Tocopheronolacton in wassriger Lijsung im wesentlichen Clin.
Chim.
Acta,
II (1965)
491-494
H. SCHMANDKE,
494 ThBELLE
I
POLAROGRAPHISCHE UND PHOTOMETRISCHE
W.&SRIGER
H. GOHLKE
BESTIMMUNC
VON
TOCOPNERONOLRCTON
L&SUNG
IN
-
~__
7‘ocopheronolactongehnlt dev Probe in pg
Wiedergefundene .___ ____--__ polarographisch in pg
91
100
98 19X 186 I82 192 368
200
400
Menge __.--.-
s12 O/b 91 98 99 93 91 96 92
_--
.~_ -.photomeirisch __.._ ._zpz $; in pg 95 100 180 190 180
I88 360
gleiche Resultate ergeben. Von der zu bestimmenden werden 90 bis IOO~/~ wiedergefunden.
9.5 100 00 9.5 go 94 go
Menge an Toco~heronolacton
ZUSAMMENF.4SSUNG
Es wird eine polarographische und photometrische Methode nach Verwendung der Dtinnschichtchromatographie zur BestimmungvonTocopheronolacton in w%sriger Losung beschrieben. Die photometrische Bestimmung erfolgt nach Umwandlung des Tocopheronolactons in 2,~,~,8-Tetramethyl-z-(B_carboxyHthyl)-6-hydroxychroman mit Emmerie-Engel-Reagens. Beide Methoden ergeben tibereinstimmende Resultate.
LITER:ZTUR I E. J, SIMON,.%. EISENGART, L. SUNDHEIM UND 4. T. MILHORAT.J.B~OZ. Chem., 221 (1956)807. 2 J, WHICHET, L. BLAHa UND B. KAKAC, Collection Czech. Chem. Commun., q (1959) 1689. 3 H. MAVER,P.SCHUDEL, R. R~~EGG UND 0. IsLER,N~~v. Chim. Acta, 47 (1964) 229. 4 H. SCHMANDKE, J. Ch~~rnu~og., 14 (1964) 123. 5 _X. E~NERXE UND C. ENGEL. Rec. Trau. China., 57 (r938) 1351; cbenda 58 (1939) 58,283 und 895. Cli~z. Chim.
Acta,
II
(1965) 491-494
DIE
CHIMICA
ACTA
491
POLAROGRAPHISCHE
TOCOPHERONOLACTON DER
UND
PHOTOMETRISCHE
IN WASSRIGER
LijSUNG
BESTIMMUNG UNTER
VON
VERWENDUNG
DUNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
H. SCHMANDKE
UND
H. GOHLKE
Institut fiir Erniihrung der Deutschen Potsdam-Rehbriicke (Deutschland)
(Eingegangen
A
kademie der
Wissenschaften
zu Berlin,
den 16. Juni, 1964)
SUMMARY
The Polarographic and Photometric Determination Solution After Thidayer Chromatogra$hy
of Tocopheronolactone
in Watery
A polarographic and photometric method after thin-layer chromatography is described for determining tocopheronolactone in watery solution. The photometric determination was carried out after conversion of tocopheronolactone into 2,5,7,8tetramethyl-a-@‘-carboxyethyl)-6-hydroxychroman Both methods give similar results.
with
Emmerie-Engel
reagent.
EINFiiHRUNG
Das y-Lacton des 2-(3-Hydroxy-3-methyl-5-carboxypentyl)-3,5,6-trimethylbenzochinon-I,4 (Tocopheronolacton) ist ein Stoffwechselprodukt des cr-Tocopherols, das von Mensch und Tier mit dem Harn bereits synthetisch dargestellt wurde 2, 3. lactons stehen,
Da bisher vorliegt,
als Glucuronid
ausgeschieden
keine Methode zur quantitativen Bestimmung sol1 im Modellversuch geprtift werden, welche
die genannte
Substanz
in wassriger
Losung
quantitativ
wirdl
und
des TocopheronoMoglichkeiten be-
zu erfassen.
EXPERIMENTELLES
Urn auf den Harn tibertragbare Verhaltnisse zu erhalten, die eine Hydrolyse des Glucuronids wahrscheinlich unumganglich machen, wurden IOO ml einer wassrigen Tocopheronolactonldsung grundsatzlich mit konz. Salzsaure auf eine 2N salzsaure Losung eingestellt und diese I Std. bei 100~ hydrolysiertl. Anschliessend extrahiert man das Tocopheronolacton mit 4x50 ml Ather, gibt den Extrakt zum Trocknen durch eine mit Natriumsulfat geftillte Saule, wascht mit 15 ml Ather nach und dampft das gesamte Atherfiltrat bis zur Trockene ein. C&n. Chim.
Acta,
II (1965)
491-494
H. SCHMANDKE,
492
H. GOHLKE
Polarogra$hische Bestimmung Fur die Untersuchungen wurde der Polarograph LP 55 (CSSR) verwandt. Die Tropfzeit der Kapillare betrug t = 2.91 set, die Ausstrijmgeschwindigkeit m = 2.45 mg x secl. Zur Bestimmung selbst wurde der zur Trockene eingedampfte Atherextrakt in 0.5 ml absolutem Athanol aufgenommen und ein aliquoter Teil auf ZinkcarbonatSilicagel-Platten
mit
dem Entwickler
Chloroform-Benz01
(I : I)
der Dtinnschicht-
chromatographie unterworfen4. Nach der Sichtbarmachung des Tocopheronolactons mit o.z”J$ger athanolischer Rhodamin B-L&sung im UV-Licht wird vom nichtbesprtihten Teil der Platte die entsprechende Lactonflache mit einem Spate1 abgetragen
+
und mit 3 ml absolutem
Athanol
-
konz.
30 min eluiert,
zentrifugiert
und davon 2 ml mit
HCI
+ L-Ascorbmtiure
%-
CHP-CHz-COOH
CH,-CH,-COOH CH3
III
IZL
Fig. I. Uberfiihrung hydroxychroman (IV)
2
des Tocopheronolactons (I) in z,5,7,8-Tetramethyl-z-@carboxyPthyl)-6. durch Reduktion mit L-Ascorbins%ure in konz. salzsaurer Msung.
ml eines Acetatpuffers
von einem PH 5.33 (2 M Essigsaure:
2 M Natriumacetat
I : 5) in die polarographische Zelle tiberfiihrt. Nach dem Entliiften Stickstoff polarographiert man anodisch im Spannungsbereich -0.4
=
mit gereinigtem bis +-0.2 V mit
einer Hg-Tropfelektrode gegen eine gesattigte Kalomelelektrode. Die quantitative Auswertung erfolgte aufgrund eines Standardzusatzes. bestimmbar sind noch 1.5 ,ug/ml Gesamtlijsung der polarographischen Zelle.
Gut
Photometrische Bestimmang Der eingedampfte Atherextrakt wurde wie bei der polarographischen Methode verarbeitet. Er wurde in 20 ml konz. Salzsaure aufgenommen und unter Stickstoff 3 Std. bei 50’ mit IOO mg L-Ascorbinsaure behandelt. Wie in Fig. I dargestellt, wird durch konz. Salzsaure das Tocopheronolacton (I) zur entsprechenden Saure (II) gespalten und unter r_-Ascorbinsaureeinwirkung iiber das Zwischenprodukt (III) zum 2,5,7,8-Tetramethyl-z-(B-carboxy~thyl)-6-hydroxychroman (IV) 2,s umgewandelt *. Dann wird mit 4 x 50 ml peroxydfreiem Ather extrahiert, mit Natriumsulfat getrocknet und unter reinem Stickstoff -* Die Methode ist prlparativ ebenfalls gut verwendbar; die Ausbeute betr%gt75°,0
UnverBffentlicht)
Clin. Chim. Acta,
II (1965) 491-494
zur Trockene (H. Schmandke.
BESTIMMUNG VON TOCOPHERONOLACTON
493
eingedampft. Es wurde dann in 0.5 ml absolutem Athanol aufgenommen und ein aliquoter Teil auf eine Silicagel-Gips-Platte (IO g Silicagel, I g Gips, 60 ml Wasser; Aktivierung 30 min bei 110~) aufgetragen, die mit Acetonitril-Wasser (9 : I) entwickelt wurde. Nach dem Bespriihen eines Teils der Platte mit einer ro”/&en athanolischen Phosphormolybdansaure-Losung oder einer o.z%igen athanolischen Rhodamin BLosung wird das so nachgewiesene 2,5,7,8-Tetramethyl-2-(/3-carboxyathyl)-6-hydroxychroman (siehe Fig. 2) vonl nichtbesprtihten Teil des Chromatogramms, wie bei der polarographischen Bestimmung beschrieben, mit 3 x 3 ml absolutem Athanol eluiert und das Eluat in einen IO ml Messkolben gegeben. Nach Zugabe von 0.5 ml einer o.z”/,igen athanolischen 2,2’-Dipyridylund 0.5 ml einer o.50/uigen athanolischen
Fig. z.. lXinnschichtchromatogramm des *,5,7,8-Tetramethyl-z-(B-carboxy~thyl)-6-hydroxychroman (IV) nach dem Bespriihen mit sthanolischer Rhodamin B-Ltisung im UV-Licht (I = Probe, z = Standard, 3 = Probe + Standard).
Eisen(III)chlorid-Losung wird mit absolutem .&than01 auf IO ml aufgeftillt und 2 min nach der Eisen(III)chlorid-Zugabe am Zeiss-Universal-Spektrophotometer bei 520 rnp gemessen. Die Reagenszugabe und das Messen erfolgen im Dunkeln. Die Berechnung wird mittels eines entsprechenden Standards oder einer Eichkurve durchgefuhrt. Nach dieser Methode kijnnen 5 pg noch gut bestimmt werden. ERGEBNISSE
Das Halbstufenpotential des Tocopheronolactons wurde zu -0.108 V bestimmt. Aus Tabelle I ist zu ersehen, dass die polarographische und photometrische Bestimmungsmethode von Tocopheronolacton in wassriger Lijsung im wesentlichen Clin.
Chim.
Acta,
II (1965)
491-494
H. SCHMANDKE,
494 ThBELLE
I
POLAROGRAPHISCHE UND PHOTOMETRISCHE
W.&SRIGER
H. GOHLKE
BESTIMMUNC
VON
TOCOPNERONOLRCTON
L&SUNG
IN
-
~__
7‘ocopheronolactongehnlt dev Probe in pg
Wiedergefundene .___ ____--__ polarographisch in pg
91
100
98 19X 186 I82 192 368
200
400
Menge __.--.-
s12 O/b 91 98 99 93 91 96 92
_--
.~_ -.photomeirisch __.._ ._zpz $; in pg 95 100 180 190 180
I88 360
gleiche Resultate ergeben. Von der zu bestimmenden werden 90 bis IOO~/~ wiedergefunden.
9.5 100 00 9.5 go 94 go
Menge an Toco~heronolacton
ZUSAMMENF.4SSUNG
Es wird eine polarographische und photometrische Methode nach Verwendung der Dtinnschichtchromatographie zur BestimmungvonTocopheronolacton in w%sriger Losung beschrieben. Die photometrische Bestimmung erfolgt nach Umwandlung des Tocopheronolactons in 2,~,~,8-Tetramethyl-z-(B_carboxyHthyl)-6-hydroxychroman mit Emmerie-Engel-Reagens. Beide Methoden ergeben tibereinstimmende Resultate.
LITER:ZTUR I E. J, SIMON,.%. EISENGART, L. SUNDHEIM UND 4. T. MILHORAT.J.B~OZ. Chem., 221 (1956)807. 2 J, WHICHET, L. BLAHa UND B. KAKAC, Collection Czech. Chem. Commun., q (1959) 1689. 3 H. MAVER,P.SCHUDEL, R. R~~EGG UND 0. IsLER,N~~v. Chim. Acta, 47 (1964) 229. 4 H. SCHMANDKE, J. Ch~~rnu~og., 14 (1964) 123. 5 _X. E~NERXE UND C. ENGEL. Rec. Trau. China., 57 (r938) 1351; cbenda 58 (1939) 58,283 und 895. Cli~z. Chim.
Acta,
II
(1965) 491-494