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Die wirkung von 3,4-benzpyren auf die ultrastruktur der grünalge Scenedesmus quadricauda
Arch. Protistenk. 127 (1983): 103-113
Sektion Biologie der Wilhelm-Pieck-Universitiit Restock und Elektronenmikroskopisches Zentrum der Wilhelm-Pieck- Universitiit Rostock, DDR
Die Wirkung von 3,4-Benzpyren auf die Ultrastruktur der Grtinalge Scenedesmus quadricauda Influence of 3,4-Benzopyrene on the Ultrastructure of the Green Alga Scenedesmus quadricauda Von A.-S. ABARZUA, L. JONAS, H.-P. PUTZKE und E. WITTENBURG Mit 7 Abbildungen Schliisselworte: Scenedesmue quadricauda, 3,4-Benzpyren, Ultrastruktur
Summary After a single 3,4-Benzopyrene-application (5 mg/l) we obtained significant changes of the ultrastructure of Scenedesmus quadricauda (nucleus, thylakoids, cell wall, plasmalemma, ground plasma). These modifications are described and discussed.
Einleitung 3,4-Benzpyren (Bp) und andere polyzyklische Kohlenwasserstoffe sind als wirksame Carcinogene bekannt (I"ITTLE und O'TOOLE 1974; BARTHOLOMEW et al. 1975; SELKIRK et al. 1976 und THOMSON et al. 1978). Sie reichern sich durch Abgase, kommunale oder industrieHe Abwasser und Olverschmutzungen weltweit im Boden, in der Luft und im Wasser an (BONEY et al. 1962; ANDELMANN und SUESS 1970; ISHIo et al. 1971; BLUMER und YOUNGBLOOD 1975). So wurden in der Luft von 3 Stadten der BRD Bp-Konzentrationen bis zu 0,244 ""g Bp(m3 (PREUSSMANN 1978), im Rhein 0,1-1,0,ug(1 und in Abwassem 1O-100,ug(1 (BORNEFF 1973) nachgewiesen. Auch in zahlreichen marinen Organismen wurde Bp festgestellt. Nach VELDRE et al. (1979) konzentriert sich Bp vor allem im Zooplankton, in Wasserpflanzen und in Algen. Die Bp-Konzentration in Wasserlinsen und im Schilfrohr einiger Seen Estlands betragf ca. 120 pg(mg Trockensubstanz, wahrend sie im Aal und Schlei nur ca. 1 pg Bp(mg Fischmasse betragt (VELDRE et al. 1979). In Meeresalgen der Westkiiste Gr6nlands und der franz6sischen Kanalkiiste wurden bis zu 100 pg Bp(mg Trockenmasse nachgewiesen (SUESS 1971). Die carcinogene, mutagene und cytotoxische Wirkung von Bp und seinen Metaboliten wurden bisher fast nur bei tierischen und human ZeHen nachgewiesen (FREUDENTHAL et al. 1975; HUBERMANN et al. 1976; LUTZ et al. 1978; WEINSTEIN et al. 1976; JERINA und DALY 1974 und IVANOVICH et al. 1978). Uber die Wirkung und
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Anreicherung von Bp und seinen Metaboliten bei pflanzlichen Zellen gibt es dagegen relativ wenige Untersuchungen (TRENCK und SANDERMANN 1978; DURMISHIDZE et al. 1974; DURMISHIDZE 1975; DURMISHIDZE et al. 1979). Wegen der Bedeutung der photosyntheseaktiven Primarproduzenten im Nahrungskettengefiige von Okosystemen wurde der Bp-EinfluB am Beispiel der coenobialen Griinalge Scenedemus quadricauda, die in limnischen und Brackwasser.Okosystemen zeitweilig eine hervorragende Rolle spielt, naher untersucht (ABARZUA 1980). In dieser Arbeit soll iiber die Bp- Wirkung auf die Ultrastruktur von Scenedesmus quadricauda in Laborkultur berichtet werden. Die Ergebnisse werden mit den in der Literatur beschriebenen (BrsALPuTRA und WEIER 1963; BISALPUTRA et al. 1964; KOMAREK und LUDViK 1972; BURCZYK 1977; SULEK und NECAS 1977) und den durch uns erneut elektronenmikroskopisch ermittelten Ultrastrukturen von Scenedesmue quadricauda unter Normalbedingungen vergleichsweise diskutiert.
Material und Methoden 1. Anzucht Die Untersuchungen wurden an teilsynchron wachsenden, unsterilen Kulturen del' chlorococcalen Griinalge Scenedesmus quadricauda (TURF.) BREB. del' Algensammlung Greifswald, Stamm 15, vorgenommen. Die Algen wurden in Batch-Kultur in einern Medium nach KRAUSS und THOMAS (1954) bei 6000 lx, 27°C, pH 7,0 und einem Licht-Dunkel-Wechsel von 14: 10 h und st.aridiger Beliiftung (451 Normalluft/h; Taumelscheibenpumpen, VEB Elmet Hettstedt) angezogen. 2. Errnitt.Iung del' subletalen Bp-Konzentration Es wurde die Langzeitwirkung (6 d) del' subletalen Bp-Konzentration von 5 mg/l (Dosis nach 24 h Vorkultur unter Normalbedingungen) getestet. Die Zellkonzentrationen beim Start betrug 0,48 X 10 6 Zellen, nach Bp-Zugabe 0,60 X 10 6 Zellen. Die subletale Bp-Konzentration (5 mg Bp/l), die wir fur die Ultrastrukturuntersuchungen verwendeten, wurde mittels Wachstums-, Pigmentgehalts- und Photosyntheseintensitatsuntersuchungen unter verschiedcnen Bp-Konzentrationen ermittelt (ABARZUA und WITTENBURG 1982, in Vorbereitung). In diesel' Arbeit werden nul' die Wachstumsuntersuchungen (Zellzahl) vorgestellt. Die Bestimmung del' Zellzahl erfolgte mittels del' Zahlkammer nach THOMA (VEB Carl Zeiss .rENA). 3. Ultradunnschnitt-Methode Die unmittelbar nach del' Algenernte, 5 d nach Bp-Zugabe, abzentrifugierten Algen wurden mit 10 gil OSOi in 0,1 mol Cacodylatpuffer (pH 7,2) I h im Kiihlschrank (+ 4°C) fixiert. Die fixierten Algen wurden anschlief.lend fur 2 X 10 min mit reiner Cacodylatpufferlosung gewaschen und in 10 gil waf.lriger Agarlosung aufgenommen. Danach wurrlen sie in kleinen Blacken in aufsteigender Alkoholroihe entwassert, mit Propylenoxid zwisehenbehandelt und in Gelatineka.pseln mit frischem Durcupangemisch (FLUKA AG, Buchs, Schweiz) eingebettet. Die mit einem LKBUltramikrotom III (Schweden) hergestellten Ultradiinnsehnitte wurden auf Kupfer-Netzblenden aufgezogen, mit einer Losung von Uru.nylacet.at und Bloieitrnt nach REYNOLDS (19f\3) kontrastiert und im Elektronenmikroskop SEM-3/l (VEB Work fur Femsehelektronik, Berlm-Oberschoneweise) ausgewertet.,
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Ergebnisse 1. Wachstums- und Teilungsprozesse unter verschiedenen Bp-Konzentrationen Die Abb. 1 zeigt, daB unter der Einwirkung der von 50 und 20 mg Bpjl die Zellteilung signifikant gehemmt ist. Die Zellen bleichen total aus (Chlorophyllverlust) und sterben schlieBlich unter der Belastung derartiger letaler Konzentrationen abo Bei der Applikation von 5 und 10 mg/Bp/l sind Wachstum und Zellteilung noch zu verzeichnen, jedoch treten signifikante Hemmeffekte auf. Wahrend in der mit 10 mg Bpjl behandelten Kultur teilweise abgestorbene Zellen auftreten, bewirken 5 mg Bpjl keinen letalen Effekt. Beim Einsatz von geringen Bp-Konzentrationen wie 0,05 und 0,5 mg Bpjl ist eine teilweise nicht signifikante Stimulierung der Zellteilung zu beobachten. 2. Ultrastruktur 2.1. Normalstruktur In den Abb. 2, 3 und 4 werden die Ultrastrukturen von Scenedesmus quadricauda unter Normalbedingungen (ohne Bp-Zusatz) vorgestellt. In Ubereinstimmung mit den in der Literatur mitgeteilten Ergebnissen (BISALPUTRA und WEIER 1963; BISALPUTRA et al. 1964; DODGE 1973; PICKETT-HEAPS 1975; BURCZYK 1977; STAEHELIN und PICKETT-HEAPS 1975; PICKETT-HEAPS und STAEHELIN 1975) kann man folgende Strukturen deutlich erkenncn: 0
5
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0.; 5 mg Bpll I.
3 J.SO mg 8pll
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rage Abb, 1. Wachstumsverlauf von Scenedesmus quadricauda unter dern Einflut3 verschiedener BpKonzentrationen im Verlauf einer 8tagigen Kultivierungsperiode. • Kontrolle (K), • 0,05 mg Bpll, .. 0,5 mg Bpll, • 5 mg Bpll, X 10 mg Bpll, 0 20 mg Bpll, 6 50 mg Bpll, I Konfidenzintervall.
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Die Zellwand besteht aus 3 Schichten - der inneren Cellulose- (La), der mittleren (L 2 ) und der auBeren Schicht (L1 ) , die auch als Retikularschicht (R) bezeichnet wird (Abb. 2, 3, 4). Die Retikularschicht ist netzartig und reich an Epistrukturen, zu denen z. B. die sogenannten Saulchen (SL) gehoren. Das Plasmalemma (PL) ist deutlich von der Zellwand abgegrenzt (Abb. 2, 3,4). Im Innern der Zelle befindet sich ein groBer Chloroplast (CR), der von in Biindeln angeordneten Thylakoiden (TL) durchzogen wird. Zwischen den Lamellen des Chloroplasten werden Starkekorner (S) gespeichert (Abb. 2, 3, 4). In der Mitte des Chloroplasten ist ein Pyrenoid (PY) eingebettet. Die Pyrenoidregion ist frei von Thylakoiden und in der Regel von einem Starkegiirtel (SG) umgeben (Abb. 3). Die Zahl der Mitochondrien (M) ist gering, mehr als 5 wurden in einem Querschnitt nicht beobachtet. Sie sind kugel- oder ovalformig, sind von 2 Membranen (MM) umgeben und gehOren zum Christae-Typ (Abb. 2). Die Zelle besitzt ein langes Dictyosom (D), das dem Nucleus (N) anliegt. Der Nucleus besteht aus dem Nucleolus (n), dem Nucleoplasma (NP) und der Kernhiille (KR), die aus 2 Membranen besteht und an einigen Stellen mit dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) verbunden ist (Abb. 4). Polyphosphatvakuolen (PV) und Lipidtropfen (LI) wurden oft beobachtet (Abb. 2, 3). Das Grundplasma (G) stellt die elektronenoptisch homogene Grundmasse des Cytoplasmas dar (Abb. 2, 3, 4).
'. Abb.2. Kontrolle. x 15333. Sehr deutlieh sind Zellwand, bestehend aus den 3 Sehichten (R, L z• La)' Plasmalemma (PL), Mitoehondrien (M), Thylakoide (TL), Starkekorner (S) und Polyphosphatvakuolen (PV) zu erkennen.
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Abb.3. Kontrolle. X 16 000. Ul t rastruktur des P yren oid (PY). Lipidtropfen (LI) und Saulchen (SL) sind kl ar zu erken nen,
Abb.4. Kontrolle. X 12000. Aufbau des Nucleu s (N). Deutlich zeichnen sich auc h Dict yoso m (D) und E n doplas ma t isches R etikulum (ER) a bo
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2.2. Bp-Behandlung Bp-behandelte Kulturen von Scenedesmus quadricauda zeigen im Vergleich zur Kontrolle folgende eindeutig veranderte Ultrastrukturen (Abb. 5, 6): -
stark verdickte Zellwand, Vergrolierung der inneren Celluloseschicht (L3 ) auf das ca.4fache; Schrumpfung des Plasmalemmas (PL); aufgeblahte Thylakoide (TL) in sehr vielschichtigen Stapeln; charakteristische Stiirkeakkumulation (S) innerhalb des Chloroplasten (CH) und im Starkegurtel (SG) urn das Pyrenoid (PY); verdichtetes Grundplasma (G) und diffuse Membranstrukturen im Innern del' Zelle; verdichtetes heterogenes bzw. randstandiges Chromatin (0); Dictyosomen (D), Lipidtropfen (LI) und Mitochondrien (M) sind nicht zu erkennen.
UnbeeinfluBt bleiben die Retikularschicht (R) mit ihren Epistrukturen und der Coenobialcharakter. Diskussion Bp und seine Metabolite bewirken eindeutig schwere Schiidigungen bei teilsynchronen Kulturen von Sceneslesnius quadricauda (ABARZUA 1980). Neben der Hemmung der Zellteilungsprozesse (ANDRIANOV et a1. 1971; NUZZI 1973; MIRONOV 1975) ruft, das Carcinogen signifikante Voranderungen del' Ultrastruktur hervor. So ist aulser del' Zellteilung auch die Kernteilung beeinfluBt. Die Nuclei zeigen Deformation und verdichtetes, randstiindiges bzw. heterogenes Chromatin, was bei Normalzellen in keiner Phase der Mitose beobachtet wurde (DODGE 1973; PIOKETT-HEAPS 1975). Vielmehr ist ein solches Bild Hinweis fiir eine gestorte Mitose (GRUBER 1978; BUADZE et a1. 1979; FElT und OEHLERT 1967), die wir auf Bp-Wirkung zuriickftihren. ZAeRLEDER, WITTENBURG und ABARZUA (unveroffentlioht) konnten bereits eine Hemmung der DNS-Synthese dureh Bp nachweisen. Die Differenzierung einiger Protoplasmabestandteile und -organellen fehlt (Dietyosornen, Mitochondrien, verdichtetes Grundplasma, Sehrumpfung des Plasmalem. mas). Lediglich die bei del' Autosporenfreisetzung schon vorhandenen Chloroplasten sind deutlich erkennbar, erscheinen jedoch aufgeblaht (Thylakoidstruktur). Da nach langzeitiger Bp-Behandlung (6 d) von Scenedesmue quadricauda eine Storung del' Chloroplastenfunktion (Hemmung der Chlorophyll- und Proteinsynthese sowie del' Photosyntheseintensitiit) nachgewiesen werden konnte (ABARZUA 1980; ABARZUA und WITTENBURG, in Vorbereitung), war eine Veranderung der Chloroplastenstruktur zu erwarten. Daneben ist eine Starkeakkumulation (Chloroplasten, Pyrenoidgurtel) zu beobachten, die wir als noeh vorhandene primate Chloroplastenfunktion deuten. Jedoch kann die so aufgebaute Energiereserve (Starke) nicht mehr fur notwendige energieverbrauchende und nicht direkt lichtabhangige Biosynthesen (DNS, RNS, Struktur- und Enzymproteine, Lipide, Membranstrukturen) genutzt werden. Dafiir
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Abb. 5. Bp-behandelte Zelle. X 22 000. K ern- und Zellteilung geh em mt. Vora n de ru ng der Norm alst ruk t ur der Thylakoide (TL) und des Nucleus (N) . Verdiekung der inner en Celluloseschicht (LJ ) .
TL PL
2
R
S:
R
Abb.6. Bp-behandelte Zelle. X 22 000. Auffall end ist die Ak kumula t ion von Starke in Form des Starkegurtel s (SG) urn das Pyrenoid (PY). Retikularschi cht (R) unbeeinflul3t.
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spricht auch die offensichtliche Schadigung der Mitochondrien. Statt dessen wird die iiberschiissige Energiereserve nur noch fur die Fortsetzung des Aufbaues der Zellwand benutzt mit der Folge der betrachtlichen Verdickung der Zellwand und der Celluloseschicht (L 3 ) . Die ursprlinglich vorhandene Retikularschicht kann wahrscheinlich nicht mehr aufgelost werden. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ultrastrukturveranderungen der coenobialen Grlinalge Scenedesmus quadricauda sind vermutlich Folge der durch Bp hervorgerufenen Wachstums- und Stoffwechselstorungen (ABARZUA 1980) (s. vereinfachte Ubersicht zur Wirkung von Bp). Auf die unmittelbare Veranderung von Zellmembranen lebender Zellen durch carcinogene Kohlenwasserstoffe haben BALBWIN und MooRE (1969); SEILERN-AsPANG et al. (1969a, b) und ANDRIANOV et al. (1971) hingewiesen. Daneben bewirken die Veranderungen der Membranperrneabilitat Anderungen im Stoffwechsel und in der Protoplasmastruktur (RUBIN 1966; PARISER und CUNNINGHAM 1971; ANDRIANOV et al. 1971). Bp im Medium
-----?
Penetration in Algenzelle
-----?
Metabolisierung
{, Veranderungen im DNS-RNSProtein-System des Kerns, del' Chloroplasten und Mitochondrien Hemmung del' DNS-Replikation Veranderung des Stoffwechsels Hemmung del' Mitose Umstrukturierungen in del' Zelle (Nucleus, Thylakoide, vergrii13erte Starkokorner, Verdickung del' Zellwand)
Inhibierung del' Zellteilung
Abb. 7. Vereinfachte Ubersieht zur Wirkung von Bp.
Uber weitere Untersuchungen der Bp-Wirkung auf Scenedesmus quadricauda (Photosynthese- und Respirationsintensitat, Enzymaktivitat, Synchronkulturen) werden wir an anderer Stelle berichten.
Danksagung Fur die bewahrte technische Mitarbeit danken wir Frau H. MEXZEL, Frau E. FISCHER und Frau C. LINDEMANX.
Abkiirzungen R = Retikularschicht, L 2 = mittlere Schicht, L 3 = innere Schicht, SL = Saulchon, PL = Plasmalemma, CH = Chloroplast, TL = Thylakoide, PY = Pyrenoid, SG = Starkegiirtel, S = Starkekiirner, M = Mitochondrien, D = Dictyosom, N = Nucleus, n = Nucleolus, KH = Kernhulle, NP = Nucleoplasma, C = Chromatin, ER = Endoplasmatisches Retikulum, PV = Polyphosphatvakuolen, LI = Lipidtropfen, G = Grundplasma
Die Wirkung von 3,4-Benzpyren
III
Zusammenfassung Nach einmaliger Bp-Applikation (5 mg/l) festgestellte eindeutige Voranderungen del' Ultrastruktur von Scenedesmus quadricauda (Nucleus, 'I'hylakoide, Zellwand, Plasmalemma, Grundplasma) werden beschrieben und diskutiert.
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Sektion Biologie der Wilhelm-Pieck-Universitiit Restock und Elektronenmikroskopisches Zentrum der Wilhelm-Pieck- Universitiit Rostock, DDR
Die Wirkung von 3,4-Benzpyren auf die Ultrastruktur der Grtinalge Scenedesmus quadricauda Influence of 3,4-Benzopyrene on the Ultrastructure of the Green Alga Scenedesmus quadricauda Von A.-S. ABARZUA, L. JONAS, H.-P. PUTZKE und E. WITTENBURG Mit 7 Abbildungen Schliisselworte: Scenedesmue quadricauda, 3,4-Benzpyren, Ultrastruktur
Summary After a single 3,4-Benzopyrene-application (5 mg/l) we obtained significant changes of the ultrastructure of Scenedesmus quadricauda (nucleus, thylakoids, cell wall, plasmalemma, ground plasma). These modifications are described and discussed.
Einleitung 3,4-Benzpyren (Bp) und andere polyzyklische Kohlenwasserstoffe sind als wirksame Carcinogene bekannt (I"ITTLE und O'TOOLE 1974; BARTHOLOMEW et al. 1975; SELKIRK et al. 1976 und THOMSON et al. 1978). Sie reichern sich durch Abgase, kommunale oder industrieHe Abwasser und Olverschmutzungen weltweit im Boden, in der Luft und im Wasser an (BONEY et al. 1962; ANDELMANN und SUESS 1970; ISHIo et al. 1971; BLUMER und YOUNGBLOOD 1975). So wurden in der Luft von 3 Stadten der BRD Bp-Konzentrationen bis zu 0,244 ""g Bp(m3 (PREUSSMANN 1978), im Rhein 0,1-1,0,ug(1 und in Abwassem 1O-100,ug(1 (BORNEFF 1973) nachgewiesen. Auch in zahlreichen marinen Organismen wurde Bp festgestellt. Nach VELDRE et al. (1979) konzentriert sich Bp vor allem im Zooplankton, in Wasserpflanzen und in Algen. Die Bp-Konzentration in Wasserlinsen und im Schilfrohr einiger Seen Estlands betragf ca. 120 pg(mg Trockensubstanz, wahrend sie im Aal und Schlei nur ca. 1 pg Bp(mg Fischmasse betragt (VELDRE et al. 1979). In Meeresalgen der Westkiiste Gr6nlands und der franz6sischen Kanalkiiste wurden bis zu 100 pg Bp(mg Trockenmasse nachgewiesen (SUESS 1971). Die carcinogene, mutagene und cytotoxische Wirkung von Bp und seinen Metaboliten wurden bisher fast nur bei tierischen und human ZeHen nachgewiesen (FREUDENTHAL et al. 1975; HUBERMANN et al. 1976; LUTZ et al. 1978; WEINSTEIN et al. 1976; JERINA und DALY 1974 und IVANOVICH et al. 1978). Uber die Wirkung und
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Anreicherung von Bp und seinen Metaboliten bei pflanzlichen Zellen gibt es dagegen relativ wenige Untersuchungen (TRENCK und SANDERMANN 1978; DURMISHIDZE et al. 1974; DURMISHIDZE 1975; DURMISHIDZE et al. 1979). Wegen der Bedeutung der photosyntheseaktiven Primarproduzenten im Nahrungskettengefiige von Okosystemen wurde der Bp-EinfluB am Beispiel der coenobialen Griinalge Scenedemus quadricauda, die in limnischen und Brackwasser.Okosystemen zeitweilig eine hervorragende Rolle spielt, naher untersucht (ABARZUA 1980). In dieser Arbeit soll iiber die Bp- Wirkung auf die Ultrastruktur von Scenedesmus quadricauda in Laborkultur berichtet werden. Die Ergebnisse werden mit den in der Literatur beschriebenen (BrsALPuTRA und WEIER 1963; BISALPUTRA et al. 1964; KOMAREK und LUDViK 1972; BURCZYK 1977; SULEK und NECAS 1977) und den durch uns erneut elektronenmikroskopisch ermittelten Ultrastrukturen von Scenedesmue quadricauda unter Normalbedingungen vergleichsweise diskutiert.
Material und Methoden 1. Anzucht Die Untersuchungen wurden an teilsynchron wachsenden, unsterilen Kulturen del' chlorococcalen Griinalge Scenedesmus quadricauda (TURF.) BREB. del' Algensammlung Greifswald, Stamm 15, vorgenommen. Die Algen wurden in Batch-Kultur in einern Medium nach KRAUSS und THOMAS (1954) bei 6000 lx, 27°C, pH 7,0 und einem Licht-Dunkel-Wechsel von 14: 10 h und st.aridiger Beliiftung (451 Normalluft/h; Taumelscheibenpumpen, VEB Elmet Hettstedt) angezogen. 2. Errnitt.Iung del' subletalen Bp-Konzentration Es wurde die Langzeitwirkung (6 d) del' subletalen Bp-Konzentration von 5 mg/l (Dosis nach 24 h Vorkultur unter Normalbedingungen) getestet. Die Zellkonzentrationen beim Start betrug 0,48 X 10 6 Zellen, nach Bp-Zugabe 0,60 X 10 6 Zellen. Die subletale Bp-Konzentration (5 mg Bp/l), die wir fur die Ultrastrukturuntersuchungen verwendeten, wurde mittels Wachstums-, Pigmentgehalts- und Photosyntheseintensitatsuntersuchungen unter verschiedcnen Bp-Konzentrationen ermittelt (ABARZUA und WITTENBURG 1982, in Vorbereitung). In diesel' Arbeit werden nul' die Wachstumsuntersuchungen (Zellzahl) vorgestellt. Die Bestimmung del' Zellzahl erfolgte mittels del' Zahlkammer nach THOMA (VEB Carl Zeiss .rENA). 3. Ultradunnschnitt-Methode Die unmittelbar nach del' Algenernte, 5 d nach Bp-Zugabe, abzentrifugierten Algen wurden mit 10 gil OSOi in 0,1 mol Cacodylatpuffer (pH 7,2) I h im Kiihlschrank (+ 4°C) fixiert. Die fixierten Algen wurden anschlief.lend fur 2 X 10 min mit reiner Cacodylatpufferlosung gewaschen und in 10 gil waf.lriger Agarlosung aufgenommen. Danach wurrlen sie in kleinen Blacken in aufsteigender Alkoholroihe entwassert, mit Propylenoxid zwisehenbehandelt und in Gelatineka.pseln mit frischem Durcupangemisch (FLUKA AG, Buchs, Schweiz) eingebettet. Die mit einem LKBUltramikrotom III (Schweden) hergestellten Ultradiinnsehnitte wurden auf Kupfer-Netzblenden aufgezogen, mit einer Losung von Uru.nylacet.at und Bloieitrnt nach REYNOLDS (19f\3) kontrastiert und im Elektronenmikroskop SEM-3/l (VEB Work fur Femsehelektronik, Berlm-Oberschoneweise) ausgewertet.,
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Die Wirkung von 3,4- Benzpyren
Ergebnisse 1. Wachstums- und Teilungsprozesse unter verschiedenen Bp-Konzentrationen Die Abb. 1 zeigt, daB unter der Einwirkung der von 50 und 20 mg Bpjl die Zellteilung signifikant gehemmt ist. Die Zellen bleichen total aus (Chlorophyllverlust) und sterben schlieBlich unter der Belastung derartiger letaler Konzentrationen abo Bei der Applikation von 5 und 10 mg/Bp/l sind Wachstum und Zellteilung noch zu verzeichnen, jedoch treten signifikante Hemmeffekte auf. Wahrend in der mit 10 mg Bpjl behandelten Kultur teilweise abgestorbene Zellen auftreten, bewirken 5 mg Bpjl keinen letalen Effekt. Beim Einsatz von geringen Bp-Konzentrationen wie 0,05 und 0,5 mg Bpjl ist eine teilweise nicht signifikante Stimulierung der Zellteilung zu beobachten. 2. Ultrastruktur 2.1. Normalstruktur In den Abb. 2, 3 und 4 werden die Ultrastrukturen von Scenedesmus quadricauda unter Normalbedingungen (ohne Bp-Zusatz) vorgestellt. In Ubereinstimmung mit den in der Literatur mitgeteilten Ergebnissen (BISALPUTRA und WEIER 1963; BISALPUTRA et al. 1964; DODGE 1973; PICKETT-HEAPS 1975; BURCZYK 1977; STAEHELIN und PICKETT-HEAPS 1975; PICKETT-HEAPS und STAEHELIN 1975) kann man folgende Strukturen deutlich erkenncn: 0
5
-----...,1
It
0.; 5 mg Bpll I.
3 J.SO mg 8pll
Z S,Omg d /1
-,c: ~
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'0.0 mg Bpll
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10.0 mg 8pl l
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Bpll
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J
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8
rage Abb, 1. Wachstumsverlauf von Scenedesmus quadricauda unter dern Einflut3 verschiedener BpKonzentrationen im Verlauf einer 8tagigen Kultivierungsperiode. • Kontrolle (K), • 0,05 mg Bpll, .. 0,5 mg Bpll, • 5 mg Bpll, X 10 mg Bpll, 0 20 mg Bpll, 6 50 mg Bpll, I Konfidenzintervall.
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Die Zellwand besteht aus 3 Schichten - der inneren Cellulose- (La), der mittleren (L 2 ) und der auBeren Schicht (L1 ) , die auch als Retikularschicht (R) bezeichnet wird (Abb. 2, 3, 4). Die Retikularschicht ist netzartig und reich an Epistrukturen, zu denen z. B. die sogenannten Saulchen (SL) gehoren. Das Plasmalemma (PL) ist deutlich von der Zellwand abgegrenzt (Abb. 2, 3,4). Im Innern der Zelle befindet sich ein groBer Chloroplast (CR), der von in Biindeln angeordneten Thylakoiden (TL) durchzogen wird. Zwischen den Lamellen des Chloroplasten werden Starkekorner (S) gespeichert (Abb. 2, 3, 4). In der Mitte des Chloroplasten ist ein Pyrenoid (PY) eingebettet. Die Pyrenoidregion ist frei von Thylakoiden und in der Regel von einem Starkegiirtel (SG) umgeben (Abb. 3). Die Zahl der Mitochondrien (M) ist gering, mehr als 5 wurden in einem Querschnitt nicht beobachtet. Sie sind kugel- oder ovalformig, sind von 2 Membranen (MM) umgeben und gehOren zum Christae-Typ (Abb. 2). Die Zelle besitzt ein langes Dictyosom (D), das dem Nucleus (N) anliegt. Der Nucleus besteht aus dem Nucleolus (n), dem Nucleoplasma (NP) und der Kernhiille (KR), die aus 2 Membranen besteht und an einigen Stellen mit dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) verbunden ist (Abb. 4). Polyphosphatvakuolen (PV) und Lipidtropfen (LI) wurden oft beobachtet (Abb. 2, 3). Das Grundplasma (G) stellt die elektronenoptisch homogene Grundmasse des Cytoplasmas dar (Abb. 2, 3, 4).
'. Abb.2. Kontrolle. x 15333. Sehr deutlieh sind Zellwand, bestehend aus den 3 Sehichten (R, L z• La)' Plasmalemma (PL), Mitoehondrien (M), Thylakoide (TL), Starkekorner (S) und Polyphosphatvakuolen (PV) zu erkennen.
Die Wirkung von 3,4-Benzpyrcn
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Abb.3. Kontrolle. X 16 000. Ul t rastruktur des P yren oid (PY). Lipidtropfen (LI) und Saulchen (SL) sind kl ar zu erken nen,
Abb.4. Kontrolle. X 12000. Aufbau des Nucleu s (N). Deutlich zeichnen sich auc h Dict yoso m (D) und E n doplas ma t isches R etikulum (ER) a bo
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2.2. Bp-Behandlung Bp-behandelte Kulturen von Scenedesmus quadricauda zeigen im Vergleich zur Kontrolle folgende eindeutig veranderte Ultrastrukturen (Abb. 5, 6): -
stark verdickte Zellwand, Vergrolierung der inneren Celluloseschicht (L3 ) auf das ca.4fache; Schrumpfung des Plasmalemmas (PL); aufgeblahte Thylakoide (TL) in sehr vielschichtigen Stapeln; charakteristische Stiirkeakkumulation (S) innerhalb des Chloroplasten (CH) und im Starkegurtel (SG) urn das Pyrenoid (PY); verdichtetes Grundplasma (G) und diffuse Membranstrukturen im Innern del' Zelle; verdichtetes heterogenes bzw. randstandiges Chromatin (0); Dictyosomen (D), Lipidtropfen (LI) und Mitochondrien (M) sind nicht zu erkennen.
UnbeeinfluBt bleiben die Retikularschicht (R) mit ihren Epistrukturen und der Coenobialcharakter. Diskussion Bp und seine Metabolite bewirken eindeutig schwere Schiidigungen bei teilsynchronen Kulturen von Sceneslesnius quadricauda (ABARZUA 1980). Neben der Hemmung der Zellteilungsprozesse (ANDRIANOV et a1. 1971; NUZZI 1973; MIRONOV 1975) ruft, das Carcinogen signifikante Voranderungen del' Ultrastruktur hervor. So ist aulser del' Zellteilung auch die Kernteilung beeinfluBt. Die Nuclei zeigen Deformation und verdichtetes, randstiindiges bzw. heterogenes Chromatin, was bei Normalzellen in keiner Phase der Mitose beobachtet wurde (DODGE 1973; PIOKETT-HEAPS 1975). Vielmehr ist ein solches Bild Hinweis fiir eine gestorte Mitose (GRUBER 1978; BUADZE et a1. 1979; FElT und OEHLERT 1967), die wir auf Bp-Wirkung zuriickftihren. ZAeRLEDER, WITTENBURG und ABARZUA (unveroffentlioht) konnten bereits eine Hemmung der DNS-Synthese dureh Bp nachweisen. Die Differenzierung einiger Protoplasmabestandteile und -organellen fehlt (Dietyosornen, Mitochondrien, verdichtetes Grundplasma, Sehrumpfung des Plasmalem. mas). Lediglich die bei del' Autosporenfreisetzung schon vorhandenen Chloroplasten sind deutlich erkennbar, erscheinen jedoch aufgeblaht (Thylakoidstruktur). Da nach langzeitiger Bp-Behandlung (6 d) von Scenedesmue quadricauda eine Storung del' Chloroplastenfunktion (Hemmung der Chlorophyll- und Proteinsynthese sowie del' Photosyntheseintensitiit) nachgewiesen werden konnte (ABARZUA 1980; ABARZUA und WITTENBURG, in Vorbereitung), war eine Veranderung der Chloroplastenstruktur zu erwarten. Daneben ist eine Starkeakkumulation (Chloroplasten, Pyrenoidgurtel) zu beobachten, die wir als noeh vorhandene primate Chloroplastenfunktion deuten. Jedoch kann die so aufgebaute Energiereserve (Starke) nicht mehr fur notwendige energieverbrauchende und nicht direkt lichtabhangige Biosynthesen (DNS, RNS, Struktur- und Enzymproteine, Lipide, Membranstrukturen) genutzt werden. Dafiir
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Di e Wirkung von 3,4-Ben zp yren
Abb. 5. Bp-behandelte Zelle. X 22 000. K ern- und Zellteilung geh em mt. Vora n de ru ng der Norm alst ruk t ur der Thylakoide (TL) und des Nucleus (N) . Verdiekung der inner en Celluloseschicht (LJ ) .
TL PL
2
R
S:
R
Abb.6. Bp-behandelte Zelle. X 22 000. Auffall end ist die Ak kumula t ion von Starke in Form des Starkegurtel s (SG) urn das Pyrenoid (PY). Retikularschi cht (R) unbeeinflul3t.
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spricht auch die offensichtliche Schadigung der Mitochondrien. Statt dessen wird die iiberschiissige Energiereserve nur noch fur die Fortsetzung des Aufbaues der Zellwand benutzt mit der Folge der betrachtlichen Verdickung der Zellwand und der Celluloseschicht (L 3 ) . Die ursprlinglich vorhandene Retikularschicht kann wahrscheinlich nicht mehr aufgelost werden. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ultrastrukturveranderungen der coenobialen Grlinalge Scenedesmus quadricauda sind vermutlich Folge der durch Bp hervorgerufenen Wachstums- und Stoffwechselstorungen (ABARZUA 1980) (s. vereinfachte Ubersicht zur Wirkung von Bp). Auf die unmittelbare Veranderung von Zellmembranen lebender Zellen durch carcinogene Kohlenwasserstoffe haben BALBWIN und MooRE (1969); SEILERN-AsPANG et al. (1969a, b) und ANDRIANOV et al. (1971) hingewiesen. Daneben bewirken die Veranderungen der Membranperrneabilitat Anderungen im Stoffwechsel und in der Protoplasmastruktur (RUBIN 1966; PARISER und CUNNINGHAM 1971; ANDRIANOV et al. 1971). Bp im Medium
-----?
Penetration in Algenzelle
-----?
Metabolisierung
{, Veranderungen im DNS-RNSProtein-System des Kerns, del' Chloroplasten und Mitochondrien Hemmung del' DNS-Replikation Veranderung des Stoffwechsels Hemmung del' Mitose Umstrukturierungen in del' Zelle (Nucleus, Thylakoide, vergrii13erte Starkokorner, Verdickung del' Zellwand)
Inhibierung del' Zellteilung
Abb. 7. Vereinfachte Ubersieht zur Wirkung von Bp.
Uber weitere Untersuchungen der Bp-Wirkung auf Scenedesmus quadricauda (Photosynthese- und Respirationsintensitat, Enzymaktivitat, Synchronkulturen) werden wir an anderer Stelle berichten.
Danksagung Fur die bewahrte technische Mitarbeit danken wir Frau H. MEXZEL, Frau E. FISCHER und Frau C. LINDEMANX.
Abkiirzungen R = Retikularschicht, L 2 = mittlere Schicht, L 3 = innere Schicht, SL = Saulchon, PL = Plasmalemma, CH = Chloroplast, TL = Thylakoide, PY = Pyrenoid, SG = Starkegiirtel, S = Starkekiirner, M = Mitochondrien, D = Dictyosom, N = Nucleus, n = Nucleolus, KH = Kernhulle, NP = Nucleoplasma, C = Chromatin, ER = Endoplasmatisches Retikulum, PV = Polyphosphatvakuolen, LI = Lipidtropfen, G = Grundplasma
Die Wirkung von 3,4-Benzpyren
III
Zusammenfassung Nach einmaliger Bp-Applikation (5 mg/l) festgestellte eindeutige Voranderungen del' Ultrastruktur von Scenedesmus quadricauda (Nucleus, 'I'hylakoide, Zellwand, Plasmalemma, Grundplasma) werden beschrieben und diskutiert.
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