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Dosage des formes d et l de l'acide glutamique dans les protéines des tissus normaux et néoplasiques et dans les corps microbiens
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BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA
VOL. S
(195o)
DOSAGE DES FORMES D ET L DE L'ACIDE GLUTAMIQUE D A N S L E S PROT1~INES D E S T I S S U S N O R M A U X E T N I ~ O P L A S I Q U E S E T DANS LES CORPS MICROBIENS par P. B O U L A N G E R
ST R. O S T E U X "
Inctitut de Re~hemhes suv le Cancer, Lille (France)
A. TECHNIQUES DE DOSAGE
Plusieurs m~thodes ont ~t~ propos~es pour la caract~risation et le dosage des deux isom~res optiques d'un amino-acide. C'est d'abord l'isolement de l'acide amin~ ~ l'~tat p u r e t la mesure de son pouvoir rotatoire; c'est ensuite l'application r~cente ~ ce cas particulier de la technique g~n~rale de dosage par dilution isotopique; c'est enfin la d~tection et l'estimation de la forme D par la D-acidaminod~hydrase r~nale. La p r e m i s e m~thode serait parfaite, bien qu'elle n~cessite une quantit6 de substance assez importante, si les sels des deux antipodes optiques poss6daient toujours les m6mes solubilit6s. Or, en ce qui concerne l'acide glutamique, par exemple, K6GL et col. 1 ont pu montrer que le rac~mate de baryum ~tait beancoup plus soluble que le L-glutamate et que l'isom~re D pouvait ainsi ~chapper en partie ou m~me en totalit~ k l'isolement. I1 semble bien que ce comportement particulier soit au moins l'une des causes des discordances que l'on constate dans les r~sultats d'analyse de prot~ines tumorales publi6s jusqu'k pr6sent. Il est frappant de voir certains auteurs (par exemple CHIBSALLet col. 2) obtenir de l'acide L-glutamique ,,optiquement" pur l~ oh K6~L d~c~le la presence d'un taux appr6ciable de forme D. On ne peut s'emp~cher de penser que le mode op6ratoire dolt ~tre en d6faut dans l'un ou l'autre cas. La m~thode de dosage par dilution isotopique, dont on trouvera des exemples d'application dans les articles de RITTENBERG et col. 3 et de KOGL a colA, est 6videment tr~s ~16gante et th6oriquement inattaquable: il semble qu'elle doive toujours conduire des r~sultats indJscutables et sa mise en ceuvre aurait dl~ permettre en particulier de trancher d~finitivement la question de la prdsence d'acide D-glutamique dans les prot~ines n~oplasiques. Or, on salt qu'ici encore, les conclusions auxqueUes sont parvenus RITTENBERG et ses collaborateurs 3, grace k des molecules marqu6es par l'azote N '6, sont enti~rement n6gatives* * alors que celles de K6GL4, qui a eu recours k l'acide deut~roglutamique, sont en parfait accord avec les r~sultats initiaux de cet auteur. Quant k la d6termination des D-amino-acides par la n-acida_minod6hydrase, eUe a l'avantage d'etre ~troitement sp6cifique, mais tout d'abord, eUe permet seulement un dosage global des D-amino-acides, et ensuite elle ne s'applique pas 6galement h tousles acides amines. L'acide D-glutamique, notamment, est assez r~sistant ~ l'action de la • A v e c la c o l l a b o r a t i o n t e c h n i q u e de M a d e m o i s e l l e CHR. BACHY. • * I1 en est a i n s i 6 g a l e m e n t des d ~ t e r m i n a t i o n s p l u s r 6 c e n t e s de WIELAND ET PAUL~.
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d i a s t a s e , et il est n6cessaire d ' o p 6 r e r avec des c o n c e n t r a t i o n s 61evdes d ' e n z y m e et de s u b s t r a t . N o u s a v o n s r a p p o r t d et discut6 d a n s des p u b l i c a t i o n s antdrieures 6 les r~sultats positifs que nous a v o n s o b t e n u s darts ces conditions en o l ~ r a n t sur des h y d r o l y s a t s acides e t d i a s t a s i q u e s de p r o t d i n e s n o r m a l e s et ndoplasiques. N o u s avons pensd q u ' i l serait int6ressant de m e t t r e au p o i n t une t e c h n i q u e qui, t o u t en 6 c h a p p a n t a u x o b j e c t i o n s que nous venons de signaler, rdunirait les a v a n t a g e s qu'offre l ' i s o l e m e n t de r a c i d e g l u t a m i q u e A r d t a t p u r et ceux que p r d s e n t e n t les m d t h o d e s qui font a p p e l ~ une a c t i o n e n z y m a t i q u e spdcifique. L a c o m b i n a i s o n de la c h r o m a t o g r a p h i e selon TH. WIELAND? et de la d d c a x b o x y l a t i o n p a r la g l u t a m o - d d c a x b o x y l a s e b a c t d r i e n n e prdconisde p a r GALEs nous a sembld r 6 p o n d r e ~ ces exigences. Le p r i n c i p e du dosage sdp a r k des formes D et L sera donc le s u i v a n t : I. apr~s isolement de l'acide g l u t a m i q u e , une m ~ t h o d e de dosage chimique d o n n e l ' a c i d e g l u t a m i q u e t o t a l (formes L, D et DL) ; 2. une m d t h o d e e n z y m a t i q u e p e r m e t ensuite d ' o b t e n i r le t a u x d ' a c i d e L; si le prod u i t analysd ne c o n t i e n t que de l ' a c i d e naturel, les r d s u l t a t s trouv6s pax les d e u x m d t h o des sont i d e n t i q u e s ; sinon, la diffdrence e n t r e le t a u x d ' a c i d e t o t a l dosd pax voie c h i m i q u e et le t a u x d ' a c i d e I. o b t e n u pax la m d t h o d e e n z y m a t i q u e c o r r e s p o n d r a ~ la t e n e u r de r a c i d e g l u t a m i q u e en forme D. L a mdthode enzymatique utilisde est celle de G A L # , qui repose sur l'action ddcarboxylante de la souche S R x2 de Clostvidium Welc]tii. Sa spdcificitd est tr~s grande, non seulement pour racide glutamique parmi les autres acides aminds, mais encore pour la forme L. Voici un exemple numdrique des rdsultats obtenus:
Substrat
COt ddgagd en/,1
Acide L trouvd en mg
Acide L-glutamique x mg
x52.5
1.00
Acide D-glutamique 2 mg
o
Acide DL-glutamique 2 mg
x53.5
0
I.oo 7
C'est le dosage chimique qui nous a donnfi le plus de difficultds. II fallait en effet doser uniquement l'acide glutamique et nous avions primitivement essayd d'appliquer directement ~ des mdlanges complexes la mdthode ddcrite par Co~*x~D et utilisde par cet auteur dans ses dtudes sur la transamination (oxydation en nitrile succinique par la chloramine, hydrolyse du nitrile en acide succinique et dosage par la succinoddhydrase). Nous avons abouti ~ un dchec; les rdsultats sont remarquablement prdcis et constants lorsqu'on opgre sur des solutions ne contenant pratiquement que de racide glutamique, mais deviennent tr~s infid~les lorsqu'on part d'hydrolysats protdiques; nos nombreuses tentatives pour diminuer les ¢carts observds entre plusieurs dosages parall~les n'ont pas dtd couronndes de succ~s. Aussi, nous avons jugd plus simple d'isolcr au prdalable l'acide glutamique et nous avons portd notre choix sur la mdthode la plus rapide et la plus dldgante: la sdparation chromatographique sur alumine "acide" ddcrite par W I E L A N D ?. L a chromatographie de partage sur papier, selon CONSDEN, G O R D O N ET M A R T I N I0, nous permettait en outre de vdrifier si l'dluat contenait exclusivcment de l'acide glutamique. Nous avons ainsi dtd amends tt modifier IdgArement les conditions expdrimentales de W I E L A N D et ~ employer c o m m e dluant sdlectifde l'acide acdtique non pas N/2 mais N/3. E n effet, toutes les dlutions rdalisdes avec de l'acide acdtique N[2 entratnent des quantitds apprdciables d'acide aspartique. Or, il dtait indispensable d'dviter cettc contamination, car parmi les dosages flue nous effectuons sur l'dluat figure celui de l'azote amind selon V A N S L V K S et nous risquions d'exprimer en acide glutamique de l'azote appartenant tt d'autres amino-acides. II restait dvidemment ~t ddmontrer que les isom~res optiques de racide glutamique se comportalent idcntiquement lors de l'adsorption chromatographique et de l'dlution consdcutive. Nous avons done adsorbd sur 2o g d'alumine "acide" une solution contenant x6 m g d'acide L e t 4 m g d'acide D-glutamique; puis, apr~s lavage, nous avons dlud avec 2oo ml d'acide acdtique N/3. Dans rdluat,
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nous avons dosd l'azote amind par la mdthode de V A N S L Y K E ~tl'acide nitreux et nous avons ddtermind la proportion d'acide L au m o y e n de la glutamo-ddcarboxylase bactdrienne. Nous avons obtenu les chiffres suivants: Acide glutamique total (calculd d'apr&s le taux de N.NHt) 15.45 Acide L-glutamique I2.O9
le rapport acide total draft de 2~ _~ L25; le rapport trouvd est de 15'45 = x.27. acide L 12.o9 Les deux dnantiomorphes se comportent donc bien de la m~me fa$on. La proportion d'acide glutamique retrouvde est de 77.2% de l'acide total et 75.6% de la Iorme L. On voit que rdlution par racide acdtique N/3 n'est pas quantitative, mais ce que nous cherchons a v a n t tout c'est ~t obtenir l'acide glutamique rigoureusement pur; comme le rapport des deux isom~res optiques reste constant, il n'est pas ndcessaire de rdcupdrer la totalitd de l'acide glutamique pour connattre les proportions rdelles des formes D et L. La ddtermination des proportions relatives des deux isom~res dtant rdalisde, il est facile d'en ddduire les taux rdellement prdsents dans la solution initiale: il suffit de doser la forme L directement dans celle-ci par la mdthode de GALES; une simple r~gle de trois donnera ensuite le pourcentage exact de forme D.
Nous avons confirmd nos r~sultats au moyen d'une deuxi~me technique qui n'est pas strictement quantitative mais dont la spdcificit6 est tr~s grande pour la mise en 6vidence de racide I)-glutamique. Elle repose sur le fair que les corps microbiens de Clostridium Welchii, agissant sur racide L-glutamique, le transforment quantitativement en acide y-aminobutyrique, dont le comportement en chromatographie de partage sur papier est tout ~ fair diff6rent: le R~ dans le ph6nol-NH s 3% est dgal k o.76, alors que celui de racide glutamique est de 0.25. Si donc, sur un hydrolysat protdique, on fair agir la ddcarboxylase, de telle fa~on que son action soft tota/e, on ne retrouvera plus l'acide glutamique sur le chromatogramme, ~ moins qu'il n'existe dans rhydrolysat une certaine quantit~ de forme D, dont la teneur pourra 6tre estimde d'apr~s l'importance de la tache obtenue par r6vdlation ~ la ninhydrine. On fair agir p e n d a n t une heure les corps bactdriens sur une pattie aliquote de l'hydrolysat protdique, contenant environ x mg d'acide L-glutamique; on traite ensuite par un volume dgal d'acdtone, qui prdcipite la suspension microbienne; on centrifuge et on distille sous pression rdduite ~t la t e m l ~ r a t u r e de 4 °0 C. Le rdsidu est repris par une quantitd calculde d'eau bi-distillde telle que IOO jMI sont rdpartis en quatre "spots" de ddpart sur la feuille de papier-filtre. La m~me opdration est rdpdtde avec les tdmoins, dont Fun correspond ~ un essai avec les microbes seuls, et l'autre ~t un essai avec les microbes ayant agi sur I m g d'acide L-glutamique. Enfin, en partant d'une solution pure d'acide L-glutamique, on fait 4 spots contenant en tout zo #g d'acide glutamique. Pour vdrifier si la rdcupdration ultdrieure est bien complete, on double les essais sur les hydrolysats par une seconde sdrie de quatre "spots" A laquelle on ajoute, sur le papier m~me, une quantitd totale de Io Igg d'acide glutamique. Le s c h d m x reproduit la disposition d'un chromatogramme au ddpart. SCHI~MA I DISPOSITION DES SPOTS SUR LES F E U I L L E S POUR LA P R E M I E R E CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
Les bandes p o r t a n t les spots reprdsentds par un disque noir sont apr~s chromatographie sdpar6es et rdvdldes ~t la ninhydrine pour permettre de situer la hauteur de migration de l'acide glutamique sur le chromatogramme. Spots x: Solution d'acide glutamique pur (R F thdorique o.25 : pouvant varier a v e c l a f 2 3 f 4. f tempdrature). "l "1 .~t Spots 2: Hydrolysat traitd par les Clostridium. Son chromatogramme ddveloppd fixera la hauteur de la bande transversale ddcouper pour ne pas entratner d'acide aspartique ni de glycocolle. Spots 3: Ensemble de 4 spots contenant en t o u t xoo /~1 de la solution obtenue de la fa~;on ddcrite dans le texte et correspondant ~t 200/Jg d'acide L-glutamique ddcarboxyld. Spots 4: Ensemble de 4 spots identiques, mais auxquels on a ajoutd sur papier zo #g d'acide glutamique.
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La chromatographie de partage est r6alis~e avec le solvant ph~nol-NH~; apr~s d~veloppement et s~chage, on d~coupe les bandes longitudinodes correspondant ~ chaque s~rie de spots; les t~moins qui les encadrent sont r~v616s ~ la ninhydrine et p e r m e t t e n t de situer tr~s exactement la position de l'acide glutamique sur le chromatogramme. !
SCH~-MA 2 D]~COUPAGE D E S P R E M I E R S CHROMATOGRAMMES
Les 5 bandes longitudinales sont replac~es en position primitive, ce qui permet de d~terminer l'emplacement des bandes transversales A et B qui ne contiennent p r a t i q u e m e n t que de l'acide glutamique. Chacune des bandes sera ~lu~e et la solution, apr~s concentration, sera dispos~e en un seul spot sur un deuxi~me c h r o m a t o g r a m m e qui comportera lui aussi un t~moin conten a n t exactement Io/~g d'acide glutamique; on pourra ainsi juger si lea r~cup~rations ont ~t~ quantitatives.
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O n peut alors tracer les limites d'une b a n d e transversale que l'on d~coupe et qui doit contenir la totalit~ de l'acide glutamique present dans chaque essai (Schema 2). Les bandes transversales sont ~lu~es par de l'eau bidistill~e selon la technique de DENT tl et l'on obtient une solution qui ne contient p r a t i q u e m e n t que de l'acide glutamique; on s'est ainsi d6barrass6 des autres acides amines et surtout des ions Na + (provenant du t a m p o n acetate M/5 utilis~ pour Is d6carboxylation), qui constituent une g6ne s~rieuse dans la chromatographie de partage sur papier. La solution r~cul~r6e est 6vapor6e siccit6 sous pression r6duite ~ la tempdrature du laboratoire*; le r6sidu eat repris q u a n t i t a t i v e m e n t par quelques microlitres d'eau qui seront concentr6s cette fois en un seul spot pour u n nouveau chromatogramme. Les taches d'acide glutamique obtenus apr~s r6v61ation ~. la ninhydrine sont estim~es par comparaison avec les taches des t6moins de io/ag. E n g~u~ral, les t6moins "microbes" et "L-glutamique d6carboxyl6" ne contiennent pas la moindre trace d'acide glutamique. Dans les hydrolysats trait~s par la glutamo-d/~:arboxylase l'acide L-glutamique a disparu et la tache que l'on obtient est due u n i q u e m e n t ~t l'isom~re D. Cette tache est tr~s discrete dans le cas des prot6ines normales, mais peut nc~.anmoins ~tre tacilement rel~r6e. E t a n t donn6 la marche des ol~rations et en particulier les dilutions et concentrations effectuc~es, si l'on trouve pour un hydrolysat une tache correspondant ~ environ 3 #g d'acide glutamique, on peut dire que la teneur en forme D par rapport ~t l'acide glutamique total contenu dana l'hydrolysat eat de 1.5~/o. Comme on peut tr~s facilement apprScier une tache de I #g, on d6c~le une teneur en acide D aussi faible que o.5~/o . L'estimation est naturellement plus aisle lorsque le t a u x d'acide D-glutamique est plus important.
La chromatographie de partage sur papier permet donc une v~rification des r~sultats fournis par notre premiere technique. Elle permet d'affmner avec certitude l'abs e n c e o u l a p r e s e n c e d e f o r m e D d a n s les h y d r o l y s a t s p r o t ~ i q u e s . L a m ~ t h o d e g ~ n ~ r a l e q u e n o u s p r o p o s o n s n o u s p a r a t t offrir t o u t e s les g a r a n t i e s i n d i s p e n s a b l e s p o u r la c a r a c t ~ r i s a t i o n e t le d o s a g e d e l ' a c i d e D - g l u t a m i q u e d a n s les p r o duits naturels. Son application aux prot~ines n~cessite des ol~rations pr~liminaires que nous r~sumerons bri~vement.
L La p~paro~ion des protdi~s s~ches s'effectue selon le mode op~ratoire d~crit par K6GLI|; apr~s dessication et pulv~risation, les prot~ines solubles et insolubles dans la solution de chlorure de sodium ~ 6 g p. t ooo sont de nouveau i n t i m e m e n t m~lang~es; la poudre obtenue constitue le produie de d~part pour l'analyse. 2. L'hydrolyse est r6alis~e au moyen d'un exc~s d'acide chlorhydrique pur concentr~ (D = t. ~8), par chauffage ~ reflux p e n d a n t sept heures au bain d'huile ~ ~35 ° C**. On chasse sons pression r~duite, " O n ~vite ainsi une t r a n s f o r m a t i o n en acide pyrrolidone-carboxyliqne, qui ne donne plus la r6action de la ninhydrine. *° Voir l ' A d d e n d u m en fin d'article page 423.
Bibliographie p. 4e5.
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b. 4 °0 C, la p l u s g r a n d e p a r t i e de l'acide c h l o r h y d r i q u e d u liquide d ' h y d r o l y s e ; o n ~ v a p o r e ~ sec, r e p r e n d p a r l ' e a u et n e u t r a l i s e p a r la sonde. Apr~s x2 h e u r e s de repos, les m a t i ~ r e s h u m i q u e s et la c y s t i n e s o n t s~par~es p a r filtration; le pr~cipit~ est lav~ a b o n d a m m e n t et le filtrat compl~t~ tt u n v o l u m e de 5 ° ~ xoo m l p a r g r a m m e de prot~ine trait& 3. Le dosage de l'acide L-glutamique dans l'hydrolysat se Iait selon la m ~ t h o d e de GALEs, en o p e r a n t d a n s des fioles m a n o m ~ t r i q u e s de WARBURG tt u n a p p e n d i c e , s o n s a t m o s p h e r e d'azote. L a disposition e s t la s u i v a n t e : T~moin "microbes"
Espace principal
e. 5 ml t a m p o n a c e t a t e M/5 PH 4.5
T ~ m o i n acide glutamique
x ml sol. ac. glut. ( = ~ mg) r. 5 ml t a m p o n id.
Dosage
o. 5 m l h y d r o l y s a t ~ m l t a m p o n id.
0.5 ml de s u s p e n s i o n de CI. Welchii
A p p e n d i c e lateral
L a s u s p e n s i o n de corps m i c r o b i e n s c o n t i e n t e n v i r o n 5 ° m g de s u b s t a n c e s~che p a r fiole, c ' e s t Z-dire le p r o d u i t de 5 ° m l e n v i r o n d ' u n e c u l t u r e de q u i n z e h e u r e s . L a q u a n t i t ~ d ' h y d r o l y s a t raise en ]eu doit c o r r e s p o n d r e b. u n poids d ' a c i d e g l n t a m i q u e de l'ordre de x m g . L e t e m p s d ' a c t i o n est de I heure, t e m p s l a x g e m e n t s u f l i s a n t p u i s q u e le d ~ g a g e m e n t de CO i e s t g 6 n ~ r a l e m e n t t e r m i n 6 a u b o u t de 15 m i n u t e s .
Exemple nun~rique P r i s e initiale: 2 g de p r o t ~ i n e s t o t a l e s de m u s c l e de b o e u f ; v o l u m e final compl6t6 ~ xoo ml. Le d o s a g e e s t e ~ e c t u ~ s u r o. 5 ml. CO 2 d~gag~: 214. 5
~l
Acide z - g l u t a m i q u e c a l c u l i : 214'5" x.47 x.4o6 m g d a n s la prise d°essai; 224 Acide L - g l u t u m i q n e p a r g de p r o t ~ i n e : o.I4o6 g, soit x4.o6 % . A p r ~ s la l e c t u r e m a n o m ~ t r i q u e finale, le c o n t e n u d e s fioles e s t t r a n s v a ~ d a n s d e s t u b e s ~ centril u g e r c o n i q u e s et a d d i t i o n n ~ de 3 m l d ' a c ~ t o n e . O n c e n t r i f u g e apr~s xo m i n u t e s de c o n t a c t et on distiUe s o n s p r e s s i o n r6duite, ~ 45 ° C, le l i q u i d e l i m p i d e s u r n a g e a n t . L e r6sidu de c h a c u n d e s d e u x t ~ m o i n s e s t repris p a r 0. 5 m l d ' e a u distil16e et le r~sidu dn d o s a g e p r o p r e m e n t d i t p a r o. 7 ml, de telle s o r t e q u e xoo/L1 de s o l u t i o n c o r r e s p o n d r o n t ~ e n v i r o n 200 /~g d ' a c i d e L - g l u t a m i q u e (d6carboxyl6). O n proc~de ave¢ ces s o l u t i o n s a u x essais d e c h r o m a t o g r a p h i e de p a r t a g e d~crits p l u s h a u t : le c h r o m a t o g r a m m e final e s t c o m p l ~ t e m e n t e x e m p t d ' a c i d e g l u t a m i q u e p o u r les d e u x t ~ m o i n s et la t a c h e corresp o n d a n t ~ l ' h y d r o l y s a t e s t e s t i m 6 e p a r c o m p a r a i s o n a v e c l a t a c h e donn~e p a r u n e s o l u t i o n titr~e d ' a e i d e g l u t a m i q u e : o n t r o u v e 2 /~g d ' a c i d e g l u t a m i q u e , ce q u i c o r r e s p o n d ~t u n e t e n e u r de x % en f o r m e D p a r r a p p o r t b. l'acide total. 4. La chromatographie sur alurnine s ' e ~ e c t u e selon les p r e s c r i p t i o n s de WlELAND 7, a v e c les 16g~res m o d i f i c a t i o n s q u e n o u s leur a v o n s apport~es. E n g~ndral, n o u s o p & o n s avec 25 ou 3 ° g d ' a l u m i n e * et u n v o l u m e d ' h y d r o l y s a t c o n t e n a n t u n p e u m o i n s de 25 m g d ' a c i d e g l u t a m i q u e . L'$1uat e s t distill~ s o n s p r e s s i o n r 6 d u i t e ~ 45 ° C et le r~sidu e s t repris p a r u n e q u a n t i t 6 d ' a c i d e a c d t i q u e N/2 e x a c t e m e n t m e s u r 6 e et telle q u e la t e n e u r en acide g l u t a m i q u e s o i t a u m o i n s de 3 m g p a r ml. C e t t e s o l u t i o n sert a u d o s a g e de l'acide g l u t a m i q u e t o t a l p a r la m 6 t h o d e g a z o m ~ t r i q u e de VAN SLYKE et a u d o s a g e de la f o r m e L p a r le proc~d$ de GALE. A u p a r a v a n t , o n s ' a s s u r e p a r u n e c h r o m a t o g r a p h i e de p a r t a g e s u r p a p i e r de la p u r e t 6 de l'~luat; o n r e j e t t e o u on r e p a s s e s u r c o l o n n e d ' a l u m i n e t o u t ~ l u a t souill~ d ' a c i d e a s p a r t i q u e . Voici la s u i t e des o p S r a t i o n s p o u r l ' e x e m p l e d~j~ d$crit: A l u m i n e 30 g; h y d r o l y s a t ~o m l ; ~luat distill~ et r~sidu repris p a r 5 m l de CHaCOaH N/2. Dosage de l'a¢ote amin~: P r i s e d ' e s s a i : 2 m l ; t e m l ~ r a t u r e : x8°; p r e s s i o n : 764 r a m ; t e m p s de rSaction: 5 m i n u t e s . Volume d'azote x.2o 5 m l Volume d'azote du t~moin o.zio ml V o l u m e d ' a z o t e de l'acide g l u t a m i q u e LO95 m l Acide g l u t a m i q u e e o n t e n u darts l'~luat: ~.o95 • 0.578 • ~ 4 7 . 5 = x6.6z rag. ~4 2 " Alumine R.P. pour chromatographie.
Bibliographie p. 4~5.
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FORblES D ET L DE L'ACIDE GLUTAMIQUE
4ZI
Dosage de l'a~ide L-glutamique: L'61uat est dilu6 au quart et le dosage est effectu6 sur une prise d'essai de x ml. COt d6gag6:I25.8/J1 Ac. L-glutamique dans la prise d'essai: I25.8 • 1.47 = 0.825 mg 224 Ae. L-glutamique darts l'61uat: 0.825 • 20 = 16.5o rag. Si ron calculait A partir de ces chiftres, obtenus avec le liquide d'61ution, le pourcentage d'acide glutamique contenu darts les prot~ines initiales, on trouverait respectivement: - - pour l'acide glutarnique total: 8.3t ~/o - - pour l'acide L-glutamique: 8.25~/o Or, le taux d'acide L-glutamique dos~ directement dans l'hydrolysat, avant chromatographie, e s t de 14.o6~/o. En effet, la fa~on dont nous op~rons ne conduit pas b. une r6cul~ration quantitative de l'acide glutamique, dont une pattie reste adsorb6e sur l'alumine (voir plus haut). Mais ce qui nous int6resse, c'est de connaftre exactement le rapport de l'acide glutamique total ¢~l'a~ide L-glutamique, qui nous permettra, par une simple r6gle de trois, de calculer les teneurs v~elles de l'hydrolysatinitial et par suite de la prot6ine. Dans l'exemple qui nous occupe, nous avons: Acide glutamique total: 74"06" ~6.516.62 °
14.I6~/o du poids de prot~ines s~ches.
II y a done i 4 . 1 6 - 14.o6 = o.io~/o d'acide D-glutamique et le pourcentage de iorme 1) par rapport l'acide total est de 0.7%. Ce chiffre est 6videmment inf6rieur b. la limite de pr6cision de la m6thode; on peut n~anmoinsconsid6rer qu'il indique un l~ger degr6 de racAmisation, tel qu'on l'observe toujours la suite d'une hydrolyse aeide.
B. RI~SULTATS EXP~RIMENTAUX NOUS avons ~tudi~ des prot~ines tissulairesnormales qui nous ont servi en quelque sorte de t~moins et nous avons ensuite soumis ~tl'analyseune s~riedem~langesprot~iques provenant de tumeurs exp~rimentales provoqu~es ou greff~es.Enfin, nous avons trait~ des hydrolysats totaux de corps microbiens de plusieurs exp~es, parmi celles-cifigure Bacillus anthracis, chez lequel on a d~cel~ pour la premiere fois l'acide D-glutamique l'~tat n a t u r e l (BRucKNER ET IVANOVICZlS). Nous a v o n s rassembl6 nos r~sultats d a n s le t a b l e a u ci-contre (Tableau I). Les chiffres appellent quelques brefs commentaires. T o u t d ' a b o r d , nous r e t r o u v o n s dans B . anthracis la p r o p o r t i o n ~lev~e d'acide Dg l u t a m i q u e pr~c6demment signaler; les corps microbiens c o n t i e n n e n t de l'acide g l u t a rnique presque c o m p l ~ t e m e n t rac6mis~, puisque l'acide L-glutamique en execs ne repr~sente que 17 % du total. U n e a u t r e esp~ce microbienne, Streptococcus/aecalis, renferme ~galement de l'acide D-glutamique, mais h u n t a u x consid6rablement plus faible. Cette c o n s t a t a t i o n , d~j~ int~ressante en elle-m~me, poss6de ~ nos y e u x l ' a v a n t a g e de justifier la m6thode que n o u s avons proposer; nous a v o n s pu en effet d~celer et doser tr~s faciler n e n t u n t a u x de forme D de 7.6 % (par r a p p o r t ~t l'acide g l u t a m i q u e total). Aussi, les chiffres p r a t i q u e m e n t n o r m a u x que nous o n t donn~s les t u m e u r s exp~rim e n t a l e s apparaissent-ils, p a r contraste, encore plus c o n v a i n c a n t s . I1 n ' y a a u c u n e difference sensible e n t r e les prot6ines des tissus n o r m a u x et celles des tissus n60plasiques. Les t a u x de I ~t :2 % sont g6ndralement consid6rds comme r ~ s u l t a n t de la r a c 6 m i s a t i o n de l'acide g l u t a m i q u e au cours de l'hydrolyse et on ne p e u t leur a t t r i b u e r de signification biologique. I1 ne n o u s a done pas 6t6 possible, j u s q u ' h pr6sent, de confirmer les conclusions de K6GL, que cet a u t e u r v i e n t de reprendre r ~ c e m m e n t 14 en les a p p u y a n t sur u n e exp6rim e n t a t i o n a p p a r e m m e n t i n a t t a q u a b l e . Les causes d u d6saccord qui persiste entre K6GL Bibliographie p. 425 .
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422
TABLEAU
I
Acide g l u t a m i q u e t r o u v 6 (en g p o u r ioo g de prot~ines s~ches) Prot~ines
L e t DL dans l'~luat
(VAN SLVKE)
L
L
dans l'~luat (GALE)
total (GALE)
Let
DL
D
total
total
% deD par rapport b. l ' a c i d e total
Chromatographie sur papier Estimation de la tache (en/zg)
% de D
I. A N I M A L E S
Muscle de boeuf
8.33
8.25
I4.O6
I4.2o
o.I 4
I
2
1
C o e u r de porc
9.22
9.08
I2.32
12.5I
o. 19
1.5
3
1.5
R e i n de porc
7.52
7.41
9.25
9.38
o.I 3
I. 5
3
1.5
6.27
5.6o
9.32
Io.43
10.6
20
7.09
6.63
9.27
9.92
o.65
6.55
6.95
6.80
IO.I 5
IO.37
0.22
2.1
2. 5
1.2
7.51
7.24
I;.37
11.5o
o.13
1.2
2
I
6.79
6.67
8.76
8.92
o.16
1.8
3
1.5
6.52
6.36
8. xo
8.30
0.20
2.4
3
1.5
7.09
7.05
8.82
8.87
0.05
0.6
I
0. 5
4'77
2.80
7.4 °
I 2.60
5.2
41.3
7°
4°
3.92
3.87
7. IO
7.19
0.09
1.2
2
I
6.04
5.96
I 1.9 °
12.O6
o. I6
1.3
4
2
5.83
5.7 °
9.2I
9-42
O.2I
2.2
5
2.5
7.15
6.61
7-94
8.59
0.65
7.64
15
7-5
R e i n de porc i g + ac. D-glut. 1o m g (D th~or. : Io.9% par rapp o r t b. I'A. G1. total) R e i n de porc I g+ac. D-glut. 5 m g (D th~or. : 6.37%)
I,II
r5
IO
7.5
If. N~OPLASIQUES
B e n z o p y r ~ n e (rat) Epith~lioma de G u 6 r i n (rat) Sarcome de J e n s e n (rat) Carcinome de W a l k e r (rat) Liposarcome de Dael (cobaye)
III. MICROBIENNES
Bacillus Anthravis (I.P. Lille no 44) Cholera Ogawa (I.P. Lille no 4 x) Clostridium Welchii S R 12 (NCTC no 6784) Clostridium Welchii B W 2 I (NCTC no 6785) Streptococcus / aecalis (NCTC no 6783)
VOL. ~
(x95o)
FORMES D ET L DE L'ACIDE GLUTAMIOUE
423
et ses c o n t r a d i c t e u r s r e s t e n t myst6rieuses. N o u s avons peine ~ croire, p o u r n o t r e p a r t , qu'elles r~sident u n i q u e m e n t d a n s des diff6rences d ' i m p o r t a n c e secondaire e n t r e les m o d e s op6ratoires suivis de p a r t et d ' a u t r e , et nous pensons clue l ' e x p l i c a t i o n des discordances p e r m e t t r a i t p e u t - ~ t r e de faire des progrbs sensibles vers la solution du probl6me f o n d a m e n t a l de la s t r u c t u r e des p r o t $ i n e s canc~reuses. C'est dans cet esprit, - - et sans a u c u n d~sir de pol6mique, - - que n o u s a v o n s t e n u ~ r a p p o r t e r nos r~sultats. Ils o n t 6t6 o b t e n u s g r a c e ~ une m 6 t h o d e q u i nous p a r a t t 6viter la p l u p a r t des objections pr~sent6es t o u s l e s proc6d6s a u x q u e l s on a eu recours j u s q u ' h present. ADDENDUM
Alors que ce t r a v a i l 6 t a i t pros d ' e t r e achev~, nous a v o n s eu connaissance du dernier m6moire de F. K6GL 14, darts lequel l ' a u t e u r insiste sur l ' i m p o r t a n c e f o n d a m e n t a l e des conditions d ' h y d r o l y s e des prot~ines p o u r l'isolement de l ' a c i d e g l u t a m i q u e et en p a r t i c u lier de la forme D. K6GL pr~conise en effet une h y d r o l y s e de 2o heures ~ reflux, au b a i n d ' h u i l e ~ I 3 5 ° - I 6 O ° C, avec 3 v o l u m e s d ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e concentr6. Or, d a n s nos recherches, nous nous s o m m e s c o n t e n t 6 s d ' u n e dur~e de 7 heures d a n s les m~mes conditions de t e m p e r a t u r e et de c o n c e n t r a t i o n en acide. P o u r pr6venir t o u t e o b j e c t i o n de ce c6t~, nous a v o n s a p p l i q u 6 n o t r e m ~ t h o d e de caract~risation et de dosage de l'acide Dg l u t a m i q u e ~ des h y d r o l y s a t s de 20 heures et de 7 heures, o b t e n u s ~ paxtir de prot6ines tissulaires n o r m a l e s et n6oplasiques. Voici le r 6 s u l t a t de la c o m p a r a i s o n des degr~s d ' h y drolyse. Prise d'essai: x g de prot6ines tissulaires sc~ch~es; addition de 3 ml de HC1 concentr6 pur; chaufl[age h reflux/~ x45° C. L'hydrolysat dilu6 est filtr6 et le filtre lav~ avec de l'eau chaude jusqu'~t ce que les eaux de lavage passent incolores. Le filtrat est compl~t6/~ 5° m l et on procSde au dosage de l'azote total, de l'azote amin6 (mfithode ~ l'acide nitreux de VAN SLYKE), de l'acide L-glutamique (m6thode de GALE), et ~. une chromatographie sur alumine "acide" apr6s neutralisation prdalable sous contr61e ~lectromfitrique. TABLEAU II N total en mg par ml
N.NH I en mg par ml
N.NH 2 N total
Acide L-glutamique en mg par ml
% de la prot~ine
I
!eins de pore
[ydrolyse de "-'0heures
2.42
! .96
si%
1.88
9.4 °
[ydrolyse de 7 heures
2.42
1.9 2
79%
I "77
8.85
[ydrolyse de 2o heures
2.63
2.o9
79.5%
2.08
io.4o
[ydrolyse de 7 heure~
2.42
i
.92
79%
2.00
IO.OO
U:m£Ulr
u benzopyr~ne (rat)
On v o i t donc ( T a b l e a u I I ) q u ' a p r ~ s u n e h y d r o l y s e de 20 h le t a u x d ' a z o t e amin~ lib~r~ est tr~s l~g~rement sup6r4eur; m a i s la difference r e s t e minime. I1 en est de m~me p o u r la t e n e u r en acide g l u t a m i q u e et les 6carts sont, ici encore, p e u significatifs. Les dosages d o n n e n t 6 v i d e m m e n t la t e n e u r en acide L - g l u t a m i q u e et si l ' o n d e v a i t a d m e t t r e Bibliographie p. 425.
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VOL. S (195o)
q u e l ' h y d r o l y s e p r o l o n g 6 e lib~re, d a n s le c a s d e s p r o t 6 i n e s t u m o r a l e s , l ' a c i d e D - g l u t a m i q u e , e n g a g ~ d a n s d e s l i a i s o n s p l u s difficiles ~ b r i s e r , l a d i f f 6 r e n c e n ' a p p a r a i t r a i t p a s d a n s les c h i f f r e s d u t a b l e a u c i - d e s s u s . M a i s c ' e s t ici q u e l a c h r o m a t o g r a p h i e d e p a r t a g e n o u s e s t d ' u n s e c o u r s p r ~ c i e u x . E n effet, les h y d r o l y s a t s " d 6 c a r b o x y l ~ s " n e c o n t i e n n e n t p r a t i q u e m e n t p l u s d ' a c i d e g l u t a m i q u e , ce q u e v i e n n e n t e n c o r e c o n f l r m e r les c h i f f r e s du Tableau III, qui sont particulierement d6monstratifs. Le chauffage prolong6 dans les c o n d i t i o n s e x a c t e s q u e r e c o m m a n d e K 6 G L n o u s a d o n c c o n d u i t s ~ d e s r 6 s u l t a t s q u i confirment enti~rement nos conclusions. TABLEAU III Acide glutamique trouv6 (en g pour 1oo g de prot6ines s~ches) Prot6ines
L e t DL
D
total
total
~/o d e D par rapport ~. l'acide total
9.4 °
9.55
O.15
5.45
8.8 5
8.93
6.76
6.65
1o.4 °
7.31
7.20
IO.OO
t i LetDL
L
I
Estimation de la tache (en pg)
°/o de n
1.5
2
I
0.08
0.9
2
I
Io.57
O.I 7
1.6
2
I
lO.15
o.15
I. 5
2
I
L
dans l'~luat
dans l'~luat
total
(VAN SLYKE)
(GALE)
(GALE)
Hydrolyse de 2o h
5.65
5.55
Hydrolyse de 7 h
5.5 °
Hydrolyse de 20 h Hydrolyse de 7 h
Chromatographie sur papier
Reins de pore
Tl~l~lel,r
au benzopyrene
RI~SUM]~ Une m6thode de caract6risation et de dosage des deux formes D et L de l'acide glutamique est d6crite; elle repose ~ la lois sur la d~carboxylation 61ective de l'acide L-glutamique par la glutamod6carboxylase de Clostridium Welchii S R 12 suivant GALE et sur la s~paration de l'acide glutamique p a r chromatographie sur alumine acide selon WIELAND. La chromatographie de partage sur papier permet en outre de contr61er et de confirmer d'une fa~on rigoureuse les r~sultats obtenus. L'applicatio n ~t des prot6ines tissulaires normales et n6oplasiques et /~ des corps microbiens de diverses esp~ces montre que le t a u x d'acide D-glutamique est de l'ordre de I ~ 2% (par rapport A l'acide glutamique total) aussi bien dans les prot~ines de tumeurs exp~rimentales (tumeurs au benzopyr~ne, ~pith6lioma de GUgRIN, carcinome de WALKER, sarcome de JENsm% liposarcome de DAEL) que dans celles des tissus normaux. On rctrouve au contraire une proportion i m p o r t a n t e de forme D darts Bacillus anthracis, - - ce qui confirme les donn6es ant~rieurement publi6es, - - et u n taux appreciable dans Streptococcus /aecalis. Nous avons donc la preuve que notre m6thode est bien adapt~e au b u t poursuivi, ce qui ne peut m a n q u e r d ' a u g m e n t e r la port~e des r~sultats n~gatifs obtenus avec les prot6ines n~oplasiques. SUMMARY A method is described for the identification a n d the estimation of the two forms, n and L. of glutamic acid; the principles are: I. the specific docaxboxylation of L-glutamic acid by the glutamodecarboxylase of Clostridium Welchii S R 12 (GALE) and 2. the isolation of glutamic acid b y adsorption on acid alumina (WmLAND). The paper partition c h r o m a t o g r a p h y gives the possibility of a strict Bibliographie p. 425.
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(195o)
FORMES D ET L DE L'ACIDE GLUTAMIQUE
425
control and affords a confirmation of the results. The application to normal, cancerous and bacterial proteins shows that in proteins of experimental tumors (benzpyrene-tumors, GUERIN epithelioma, W A L K E R carcinoma, JEt,SEn sarcoma, D A E L liposarcoma) and in proteins of normal tissues the proportion of D-glutamic acid does not exceed x to 2 % of the total glutamic acid. However, a great proportion of D form is found in Bacillus anthrax.is and this fact affords a confirmation of the results already obtained by other authors. Streptococcus/Recalls also contains a definite but smaller proportion of v-glutamic acid. So the method has proved to be reliable, and the significance of the negative results obtained with cancerous proteins is strengthened. ZUSAMMENFASSUNG Eine Methode zur Identifizierung und Bestimmung der D- und L-Glutamin~ure wird beschrieben; sic griindet sich auf die selektive Decarboxylierung der L-Glutamin~ure dutch die Glutamodecarboxylase yon Clostridium Welchii S R r2 (GALE) und auf die Isolierung der G l u t a m i n ~ u r e durch Adsorption an saurem Aluminiumoxyd (WI~LAND). Die Verteilungschromatographie an Papier erlaubt ausserdem eine genaue Kontrolle und Best~tigung der erhaltenen Ergebnisse. Die Anwendung dieser Methode auf Eiweisstoffe aus normalen und aus Krebsgeweben sowie aus verschiedenen Bakterienarten zeigt, d a ~ in den Proteinen aus experimentellen Tumoren (BenzpyrenTumor, GuERIn-Epitheliom, W&LKER-Carcinom, JEnsgn-Sarcom, DAxL-Liposarcom) und in den Proteinen aus normalen Geweben die D-Glutamins~ure x-2% der Gesamtglutamins~ure nicht iibersteigt. Man findet dagegen eine g r o ~ e Menge D-Form in Bacillus anthracis, was die Ergebnisse frttherer Arbeiten best~tigt, und auch Streptococcus/accalis enth~lt eine nicht unbedeutende Menge D-Form. Dies beweist die Verl/isslichkeit unserer Methode und erh6ht dadurch die Bedeutung der mit den Krebsproteinen erhaltenen negativen Ergebnisse. BIBLIOGRAPHIE 1 F. K6GL ET H. ERXLEBEn, Z. physiol. Chem., 26I (I939) 154. I A. C. CHIBNALL,M. W. RKES, E. F. WILLIAMS ET E. BOYLAND,Biochern. J., 34 (I94 °) 285. S S. GRAFF, D. RITTENBERG ET G. L. FOSTER, J. Biol. Chem., z33 (I94 o) 745; D. RITTENBERG, Ann. ReD. Biochem., 15 (I946) 26o. • F. K6aL, H. ERXLEEEN ET G. J, VA~r VEgRSRn, Z. physiol. Chem., 277 (1942) 25 z. 5 TH. WIELAnD ET W. PAUL, BET., 77B (1944) 34. 6 p. BOULAnGER, Compl. rend. see. biol., 137 (1943) 52I; 538 (I944) 686. TH. WIELAND ET L. WIRTH, Ber., 76 (I943) 823. s E. P. GALE, Biochem. J., 39 (r945) 46. 9 p. p. COHEn, Biochem. J., 33 (5939) 555. l0 R. CONSDEn, A. H. GORDOn ET J. P. MARTIn, Biochem. J., 38 (7944) 224. n C. E. DENT, Biochem. J., 4 r (I947) 24o. 12 F. K6GL ET H. ERXLEBEn, Z. physiol. Chemic, 258 (1939) 57. as G. IVAnOWlCZ ET V. BRUCKn~R, Z. Immunilalslovsch., 90 (I937) 304. 14 F. K6GL, Experientia, 5 (x949) I73. R e ~ u le 14 s e p t e m b r e 194 9
BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA
VOL. S
(195o)
DOSAGE DES FORMES D ET L DE L'ACIDE GLUTAMIQUE D A N S L E S PROT1~INES D E S T I S S U S N O R M A U X E T N I ~ O P L A S I Q U E S E T DANS LES CORPS MICROBIENS par P. B O U L A N G E R
ST R. O S T E U X "
Inctitut de Re~hemhes suv le Cancer, Lille (France)
A. TECHNIQUES DE DOSAGE
Plusieurs m~thodes ont ~t~ propos~es pour la caract~risation et le dosage des deux isom~res optiques d'un amino-acide. C'est d'abord l'isolement de l'acide amin~ ~ l'~tat p u r e t la mesure de son pouvoir rotatoire; c'est ensuite l'application r~cente ~ ce cas particulier de la technique g~n~rale de dosage par dilution isotopique; c'est enfin la d~tection et l'estimation de la forme D par la D-acidaminod~hydrase r~nale. La p r e m i s e m~thode serait parfaite, bien qu'elle n~cessite une quantit6 de substance assez importante, si les sels des deux antipodes optiques poss6daient toujours les m6mes solubilit6s. Or, en ce qui concerne l'acide glutamique, par exemple, K6GL et col. 1 ont pu montrer que le rac~mate de baryum ~tait beancoup plus soluble que le L-glutamate et que l'isom~re D pouvait ainsi ~chapper en partie ou m~me en totalit~ k l'isolement. I1 semble bien que ce comportement particulier soit au moins l'une des causes des discordances que l'on constate dans les r~sultats d'analyse de prot~ines tumorales publi6s jusqu'k pr6sent. Il est frappant de voir certains auteurs (par exemple CHIBSALLet col. 2) obtenir de l'acide L-glutamique ,,optiquement" pur l~ oh K6~L d~c~le la presence d'un taux appr6ciable de forme D. On ne peut s'emp~cher de penser que le mode op6ratoire dolt ~tre en d6faut dans l'un ou l'autre cas. La m~thode de dosage par dilution isotopique, dont on trouvera des exemples d'application dans les articles de RITTENBERG et col. 3 et de KOGL a colA, est 6videment tr~s ~16gante et th6oriquement inattaquable: il semble qu'elle doive toujours conduire des r~sultats indJscutables et sa mise en ceuvre aurait dl~ permettre en particulier de trancher d~finitivement la question de la prdsence d'acide D-glutamique dans les prot~ines n~oplasiques. Or, on salt qu'ici encore, les conclusions auxqueUes sont parvenus RITTENBERG et ses collaborateurs 3, grace k des molecules marqu6es par l'azote N '6, sont enti~rement n6gatives* * alors que celles de K6GL4, qui a eu recours k l'acide deut~roglutamique, sont en parfait accord avec les r~sultats initiaux de cet auteur. Quant k la d6termination des D-amino-acides par la n-acida_minod6hydrase, eUe a l'avantage d'etre ~troitement sp6cifique, mais tout d'abord, eUe permet seulement un dosage global des D-amino-acides, et ensuite elle ne s'applique pas 6galement h tousles acides amines. L'acide D-glutamique, notamment, est assez r~sistant ~ l'action de la • A v e c la c o l l a b o r a t i o n t e c h n i q u e de M a d e m o i s e l l e CHR. BACHY. • * I1 en est a i n s i 6 g a l e m e n t des d ~ t e r m i n a t i o n s p l u s r 6 c e n t e s de WIELAND ET PAUL~.
Bibliogvaphie p. 425 .
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d i a s t a s e , et il est n6cessaire d ' o p 6 r e r avec des c o n c e n t r a t i o n s 61evdes d ' e n z y m e et de s u b s t r a t . N o u s a v o n s r a p p o r t d et discut6 d a n s des p u b l i c a t i o n s antdrieures 6 les r~sultats positifs que nous a v o n s o b t e n u s darts ces conditions en o l ~ r a n t sur des h y d r o l y s a t s acides e t d i a s t a s i q u e s de p r o t d i n e s n o r m a l e s et ndoplasiques. N o u s avons pensd q u ' i l serait int6ressant de m e t t r e au p o i n t une t e c h n i q u e qui, t o u t en 6 c h a p p a n t a u x o b j e c t i o n s que nous venons de signaler, rdunirait les a v a n t a g e s qu'offre l ' i s o l e m e n t de r a c i d e g l u t a m i q u e A r d t a t p u r et ceux que p r d s e n t e n t les m d t h o d e s qui font a p p e l ~ une a c t i o n e n z y m a t i q u e spdcifique. L a c o m b i n a i s o n de la c h r o m a t o g r a p h i e selon TH. WIELAND? et de la d d c a x b o x y l a t i o n p a r la g l u t a m o - d d c a x b o x y l a s e b a c t d r i e n n e prdconisde p a r GALEs nous a sembld r 6 p o n d r e ~ ces exigences. Le p r i n c i p e du dosage sdp a r k des formes D et L sera donc le s u i v a n t : I. apr~s isolement de l'acide g l u t a m i q u e , une m ~ t h o d e de dosage chimique d o n n e l ' a c i d e g l u t a m i q u e t o t a l (formes L, D et DL) ; 2. une m d t h o d e e n z y m a t i q u e p e r m e t ensuite d ' o b t e n i r le t a u x d ' a c i d e L; si le prod u i t analysd ne c o n t i e n t que de l ' a c i d e naturel, les r d s u l t a t s trouv6s pax les d e u x m d t h o des sont i d e n t i q u e s ; sinon, la diffdrence e n t r e le t a u x d ' a c i d e t o t a l dosd pax voie c h i m i q u e et le t a u x d ' a c i d e I. o b t e n u pax la m d t h o d e e n z y m a t i q u e c o r r e s p o n d r a ~ la t e n e u r de r a c i d e g l u t a m i q u e en forme D. L a mdthode enzymatique utilisde est celle de G A L # , qui repose sur l'action ddcarboxylante de la souche S R x2 de Clostvidium Welc]tii. Sa spdcificitd est tr~s grande, non seulement pour racide glutamique parmi les autres acides aminds, mais encore pour la forme L. Voici un exemple numdrique des rdsultats obtenus:
Substrat
COt ddgagd en/,1
Acide L trouvd en mg
Acide L-glutamique x mg
x52.5
1.00
Acide D-glutamique 2 mg
o
Acide DL-glutamique 2 mg
x53.5
0
I.oo 7
C'est le dosage chimique qui nous a donnfi le plus de difficultds. II fallait en effet doser uniquement l'acide glutamique et nous avions primitivement essayd d'appliquer directement ~ des mdlanges complexes la mdthode ddcrite par Co~*x~D et utilisde par cet auteur dans ses dtudes sur la transamination (oxydation en nitrile succinique par la chloramine, hydrolyse du nitrile en acide succinique et dosage par la succinoddhydrase). Nous avons abouti ~ un dchec; les rdsultats sont remarquablement prdcis et constants lorsqu'on opgre sur des solutions ne contenant pratiquement que de racide glutamique, mais deviennent tr~s infid~les lorsqu'on part d'hydrolysats protdiques; nos nombreuses tentatives pour diminuer les ¢carts observds entre plusieurs dosages parall~les n'ont pas dtd couronndes de succ~s. Aussi, nous avons jugd plus simple d'isolcr au prdalable l'acide glutamique et nous avons portd notre choix sur la mdthode la plus rapide et la plus dldgante: la sdparation chromatographique sur alumine "acide" ddcrite par W I E L A N D ?. L a chromatographie de partage sur papier, selon CONSDEN, G O R D O N ET M A R T I N I0, nous permettait en outre de vdrifier si l'dluat contenait exclusivcment de l'acide glutamique. Nous avons ainsi dtd amends tt modifier IdgArement les conditions expdrimentales de W I E L A N D et ~ employer c o m m e dluant sdlectifde l'acide acdtique non pas N/2 mais N/3. E n effet, toutes les dlutions rdalisdes avec de l'acide acdtique N[2 entratnent des quantitds apprdciables d'acide aspartique. Or, il dtait indispensable d'dviter cettc contamination, car parmi les dosages flue nous effectuons sur l'dluat figure celui de l'azote amind selon V A N S L V K S et nous risquions d'exprimer en acide glutamique de l'azote appartenant tt d'autres amino-acides. II restait dvidemment ~t ddmontrer que les isom~res optiques de racide glutamique se comportalent idcntiquement lors de l'adsorption chromatographique et de l'dlution consdcutive. Nous avons done adsorbd sur 2o g d'alumine "acide" une solution contenant x6 m g d'acide L e t 4 m g d'acide D-glutamique; puis, apr~s lavage, nous avons dlud avec 2oo ml d'acide acdtique N/3. Dans rdluat,
BibHogmphie p. 4z5.
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nous avons dosd l'azote amind par la mdthode de V A N S L Y K E ~tl'acide nitreux et nous avons ddtermind la proportion d'acide L au m o y e n de la glutamo-ddcarboxylase bactdrienne. Nous avons obtenu les chiffres suivants: Acide glutamique total (calculd d'apr&s le taux de N.NHt) 15.45 Acide L-glutamique I2.O9
le rapport acide total draft de 2~ _~ L25; le rapport trouvd est de 15'45 = x.27. acide L 12.o9 Les deux dnantiomorphes se comportent donc bien de la m~me fa$on. La proportion d'acide glutamique retrouvde est de 77.2% de l'acide total et 75.6% de la Iorme L. On voit que rdlution par racide acdtique N/3 n'est pas quantitative, mais ce que nous cherchons a v a n t tout c'est ~t obtenir l'acide glutamique rigoureusement pur; comme le rapport des deux isom~res optiques reste constant, il n'est pas ndcessaire de rdcupdrer la totalitd de l'acide glutamique pour connattre les proportions rdelles des formes D et L. La ddtermination des proportions relatives des deux isom~res dtant rdalisde, il est facile d'en ddduire les taux rdellement prdsents dans la solution initiale: il suffit de doser la forme L directement dans celle-ci par la mdthode de GALES; une simple r~gle de trois donnera ensuite le pourcentage exact de forme D.
Nous avons confirmd nos r~sultats au moyen d'une deuxi~me technique qui n'est pas strictement quantitative mais dont la spdcificit6 est tr~s grande pour la mise en 6vidence de racide I)-glutamique. Elle repose sur le fair que les corps microbiens de Clostridium Welchii, agissant sur racide L-glutamique, le transforment quantitativement en acide y-aminobutyrique, dont le comportement en chromatographie de partage sur papier est tout ~ fair diff6rent: le R~ dans le ph6nol-NH s 3% est dgal k o.76, alors que celui de racide glutamique est de 0.25. Si donc, sur un hydrolysat protdique, on fair agir la ddcarboxylase, de telle fa~on que son action soft tota/e, on ne retrouvera plus l'acide glutamique sur le chromatogramme, ~ moins qu'il n'existe dans rhydrolysat une certaine quantit~ de forme D, dont la teneur pourra 6tre estimde d'apr~s l'importance de la tache obtenue par r6vdlation ~ la ninhydrine. On fair agir p e n d a n t une heure les corps bactdriens sur une pattie aliquote de l'hydrolysat protdique, contenant environ x mg d'acide L-glutamique; on traite ensuite par un volume dgal d'acdtone, qui prdcipite la suspension microbienne; on centrifuge et on distille sous pression rdduite ~t la t e m l ~ r a t u r e de 4 °0 C. Le rdsidu est repris par une quantitd calculde d'eau bi-distillde telle que IOO jMI sont rdpartis en quatre "spots" de ddpart sur la feuille de papier-filtre. La m~me opdration est rdpdtde avec les tdmoins, dont Fun correspond ~ un essai avec les microbes seuls, et l'autre ~t un essai avec les microbes ayant agi sur I m g d'acide L-glutamique. Enfin, en partant d'une solution pure d'acide L-glutamique, on fait 4 spots contenant en tout zo #g d'acide glutamique. Pour vdrifier si la rdcupdration ultdrieure est bien complete, on double les essais sur les hydrolysats par une seconde sdrie de quatre "spots" A laquelle on ajoute, sur le papier m~me, une quantitd totale de Io Igg d'acide glutamique. Le s c h d m x reproduit la disposition d'un chromatogramme au ddpart. SCHI~MA I DISPOSITION DES SPOTS SUR LES F E U I L L E S POUR LA P R E M I E R E CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
Les bandes p o r t a n t les spots reprdsentds par un disque noir sont apr~s chromatographie sdpar6es et rdvdldes ~t la ninhydrine pour permettre de situer la hauteur de migration de l'acide glutamique sur le chromatogramme. Spots x: Solution d'acide glutamique pur (R F thdorique o.25 : pouvant varier a v e c l a f 2 3 f 4. f tempdrature). "l "1 .~t Spots 2: Hydrolysat traitd par les Clostridium. Son chromatogramme ddveloppd fixera la hauteur de la bande transversale ddcouper pour ne pas entratner d'acide aspartique ni de glycocolle. Spots 3: Ensemble de 4 spots contenant en t o u t xoo /~1 de la solution obtenue de la fa~;on ddcrite dans le texte et correspondant ~t 200/Jg d'acide L-glutamique ddcarboxyld. Spots 4: Ensemble de 4 spots identiques, mais auxquels on a ajoutd sur papier zo #g d'acide glutamique.
Bibliographie p. 425.
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La chromatographie de partage est r6alis~e avec le solvant ph~nol-NH~; apr~s d~veloppement et s~chage, on d~coupe les bandes longitudinodes correspondant ~ chaque s~rie de spots; les t~moins qui les encadrent sont r~v616s ~ la ninhydrine et p e r m e t t e n t de situer tr~s exactement la position de l'acide glutamique sur le chromatogramme. !
SCH~-MA 2 D]~COUPAGE D E S P R E M I E R S CHROMATOGRAMMES
Les 5 bandes longitudinales sont replac~es en position primitive, ce qui permet de d~terminer l'emplacement des bandes transversales A et B qui ne contiennent p r a t i q u e m e n t que de l'acide glutamique. Chacune des bandes sera ~lu~e et la solution, apr~s concentration, sera dispos~e en un seul spot sur un deuxi~me c h r o m a t o g r a m m e qui comportera lui aussi un t~moin conten a n t exactement Io/~g d'acide glutamique; on pourra ainsi juger si lea r~cup~rations ont ~t~ quantitatives.
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O n peut alors tracer les limites d'une b a n d e transversale que l'on d~coupe et qui doit contenir la totalit~ de l'acide glutamique present dans chaque essai (Schema 2). Les bandes transversales sont ~lu~es par de l'eau bidistill~e selon la technique de DENT tl et l'on obtient une solution qui ne contient p r a t i q u e m e n t que de l'acide glutamique; on s'est ainsi d6barrass6 des autres acides amines et surtout des ions Na + (provenant du t a m p o n acetate M/5 utilis~ pour Is d6carboxylation), qui constituent une g6ne s~rieuse dans la chromatographie de partage sur papier. La solution r~cul~r6e est 6vapor6e siccit6 sous pression r6duite ~ la tempdrature du laboratoire*; le r6sidu eat repris q u a n t i t a t i v e m e n t par quelques microlitres d'eau qui seront concentr6s cette fois en un seul spot pour u n nouveau chromatogramme. Les taches d'acide glutamique obtenus apr~s r6v61ation ~. la ninhydrine sont estim~es par comparaison avec les taches des t6moins de io/ag. E n g~u~ral, les t6moins "microbes" et "L-glutamique d6carboxyl6" ne contiennent pas la moindre trace d'acide glutamique. Dans les hydrolysats trait~s par la glutamo-d/~:arboxylase l'acide L-glutamique a disparu et la tache que l'on obtient est due u n i q u e m e n t ~t l'isom~re D. Cette tache est tr~s discrete dans le cas des prot6ines normales, mais peut nc~.anmoins ~tre tacilement rel~r6e. E t a n t donn6 la marche des ol~rations et en particulier les dilutions et concentrations effectuc~es, si l'on trouve pour un hydrolysat une tache correspondant ~ environ 3 #g d'acide glutamique, on peut dire que la teneur en forme D par rapport ~t l'acide glutamique total contenu dana l'hydrolysat eat de 1.5~/o. Comme on peut tr~s facilement apprScier une tache de I #g, on d6c~le une teneur en acide D aussi faible que o.5~/o . L'estimation est naturellement plus aisle lorsque le t a u x d'acide D-glutamique est plus important.
La chromatographie de partage sur papier permet donc une v~rification des r~sultats fournis par notre premiere technique. Elle permet d'affmner avec certitude l'abs e n c e o u l a p r e s e n c e d e f o r m e D d a n s les h y d r o l y s a t s p r o t ~ i q u e s . L a m ~ t h o d e g ~ n ~ r a l e q u e n o u s p r o p o s o n s n o u s p a r a t t offrir t o u t e s les g a r a n t i e s i n d i s p e n s a b l e s p o u r la c a r a c t ~ r i s a t i o n e t le d o s a g e d e l ' a c i d e D - g l u t a m i q u e d a n s les p r o duits naturels. Son application aux prot~ines n~cessite des ol~rations pr~liminaires que nous r~sumerons bri~vement.
L La p~paro~ion des protdi~s s~ches s'effectue selon le mode op~ratoire d~crit par K6GLI|; apr~s dessication et pulv~risation, les prot~ines solubles et insolubles dans la solution de chlorure de sodium ~ 6 g p. t ooo sont de nouveau i n t i m e m e n t m~lang~es; la poudre obtenue constitue le produie de d~part pour l'analyse. 2. L'hydrolyse est r6alis~e au moyen d'un exc~s d'acide chlorhydrique pur concentr~ (D = t. ~8), par chauffage ~ reflux p e n d a n t sept heures au bain d'huile ~ ~35 ° C**. On chasse sons pression r~duite, " O n ~vite ainsi une t r a n s f o r m a t i o n en acide pyrrolidone-carboxyliqne, qui ne donne plus la r6action de la ninhydrine. *° Voir l ' A d d e n d u m en fin d'article page 423.
Bibliographie p. 4e5.
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b. 4 °0 C, la p l u s g r a n d e p a r t i e de l'acide c h l o r h y d r i q u e d u liquide d ' h y d r o l y s e ; o n ~ v a p o r e ~ sec, r e p r e n d p a r l ' e a u et n e u t r a l i s e p a r la sonde. Apr~s x2 h e u r e s de repos, les m a t i ~ r e s h u m i q u e s et la c y s t i n e s o n t s~par~es p a r filtration; le pr~cipit~ est lav~ a b o n d a m m e n t et le filtrat compl~t~ tt u n v o l u m e de 5 ° ~ xoo m l p a r g r a m m e de prot~ine trait& 3. Le dosage de l'acide L-glutamique dans l'hydrolysat se Iait selon la m ~ t h o d e de GALEs, en o p e r a n t d a n s des fioles m a n o m ~ t r i q u e s de WARBURG tt u n a p p e n d i c e , s o n s a t m o s p h e r e d'azote. L a disposition e s t la s u i v a n t e : T~moin "microbes"
Espace principal
e. 5 ml t a m p o n a c e t a t e M/5 PH 4.5
T ~ m o i n acide glutamique
x ml sol. ac. glut. ( = ~ mg) r. 5 ml t a m p o n id.
Dosage
o. 5 m l h y d r o l y s a t ~ m l t a m p o n id.
0.5 ml de s u s p e n s i o n de CI. Welchii
A p p e n d i c e lateral
L a s u s p e n s i o n de corps m i c r o b i e n s c o n t i e n t e n v i r o n 5 ° m g de s u b s t a n c e s~che p a r fiole, c ' e s t Z-dire le p r o d u i t de 5 ° m l e n v i r o n d ' u n e c u l t u r e de q u i n z e h e u r e s . L a q u a n t i t ~ d ' h y d r o l y s a t raise en ]eu doit c o r r e s p o n d r e b. u n poids d ' a c i d e g l n t a m i q u e de l'ordre de x m g . L e t e m p s d ' a c t i o n est de I heure, t e m p s l a x g e m e n t s u f l i s a n t p u i s q u e le d ~ g a g e m e n t de CO i e s t g 6 n ~ r a l e m e n t t e r m i n 6 a u b o u t de 15 m i n u t e s .
Exemple nun~rique P r i s e initiale: 2 g de p r o t ~ i n e s t o t a l e s de m u s c l e de b o e u f ; v o l u m e final compl6t6 ~ xoo ml. Le d o s a g e e s t e ~ e c t u ~ s u r o. 5 ml. CO 2 d~gag~: 214. 5
~l
Acide z - g l u t a m i q u e c a l c u l i : 214'5" x.47 x.4o6 m g d a n s la prise d°essai; 224 Acide L - g l u t u m i q n e p a r g de p r o t ~ i n e : o.I4o6 g, soit x4.o6 % . A p r ~ s la l e c t u r e m a n o m ~ t r i q u e finale, le c o n t e n u d e s fioles e s t t r a n s v a ~ d a n s d e s t u b e s ~ centril u g e r c o n i q u e s et a d d i t i o n n ~ de 3 m l d ' a c ~ t o n e . O n c e n t r i f u g e apr~s xo m i n u t e s de c o n t a c t et on distiUe s o n s p r e s s i o n r6duite, ~ 45 ° C, le l i q u i d e l i m p i d e s u r n a g e a n t . L e r6sidu de c h a c u n d e s d e u x t ~ m o i n s e s t repris p a r 0. 5 m l d ' e a u distil16e et le r~sidu dn d o s a g e p r o p r e m e n t d i t p a r o. 7 ml, de telle s o r t e q u e xoo/L1 de s o l u t i o n c o r r e s p o n d r o n t ~ e n v i r o n 200 /~g d ' a c i d e L - g l u t a m i q u e (d6carboxyl6). O n proc~de ave¢ ces s o l u t i o n s a u x essais d e c h r o m a t o g r a p h i e de p a r t a g e d~crits p l u s h a u t : le c h r o m a t o g r a m m e final e s t c o m p l ~ t e m e n t e x e m p t d ' a c i d e g l u t a m i q u e p o u r les d e u x t ~ m o i n s et la t a c h e corresp o n d a n t ~ l ' h y d r o l y s a t e s t e s t i m 6 e p a r c o m p a r a i s o n a v e c l a t a c h e donn~e p a r u n e s o l u t i o n titr~e d ' a e i d e g l u t a m i q u e : o n t r o u v e 2 /~g d ' a c i d e g l u t a m i q u e , ce q u i c o r r e s p o n d ~t u n e t e n e u r de x % en f o r m e D p a r r a p p o r t b. l'acide total. 4. La chromatographie sur alurnine s ' e ~ e c t u e selon les p r e s c r i p t i o n s de WlELAND 7, a v e c les 16g~res m o d i f i c a t i o n s q u e n o u s leur a v o n s apport~es. E n g~ndral, n o u s o p & o n s avec 25 ou 3 ° g d ' a l u m i n e * et u n v o l u m e d ' h y d r o l y s a t c o n t e n a n t u n p e u m o i n s de 25 m g d ' a c i d e g l u t a m i q u e . L'$1uat e s t distill~ s o n s p r e s s i o n r 6 d u i t e ~ 45 ° C et le r~sidu e s t repris p a r u n e q u a n t i t 6 d ' a c i d e a c d t i q u e N/2 e x a c t e m e n t m e s u r 6 e et telle q u e la t e n e u r en acide g l u t a m i q u e s o i t a u m o i n s de 3 m g p a r ml. C e t t e s o l u t i o n sert a u d o s a g e de l'acide g l u t a m i q u e t o t a l p a r la m 6 t h o d e g a z o m ~ t r i q u e de VAN SLYKE et a u d o s a g e de la f o r m e L p a r le proc~d$ de GALE. A u p a r a v a n t , o n s ' a s s u r e p a r u n e c h r o m a t o g r a p h i e de p a r t a g e s u r p a p i e r de la p u r e t 6 de l'~luat; o n r e j e t t e o u on r e p a s s e s u r c o l o n n e d ' a l u m i n e t o u t ~ l u a t souill~ d ' a c i d e a s p a r t i q u e . Voici la s u i t e des o p S r a t i o n s p o u r l ' e x e m p l e d~j~ d$crit: A l u m i n e 30 g; h y d r o l y s a t ~o m l ; ~luat distill~ et r~sidu repris p a r 5 m l de CHaCOaH N/2. Dosage de l'a¢ote amin~: P r i s e d ' e s s a i : 2 m l ; t e m l ~ r a t u r e : x8°; p r e s s i o n : 764 r a m ; t e m p s de rSaction: 5 m i n u t e s . Volume d'azote x.2o 5 m l Volume d'azote du t~moin o.zio ml V o l u m e d ' a z o t e de l'acide g l u t a m i q u e LO95 m l Acide g l u t a m i q u e e o n t e n u darts l'~luat: ~.o95 • 0.578 • ~ 4 7 . 5 = x6.6z rag. ~4 2 " Alumine R.P. pour chromatographie.
Bibliographie p. 4~5.
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FORblES D ET L DE L'ACIDE GLUTAMIQUE
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Dosage de l'a~ide L-glutamique: L'61uat est dilu6 au quart et le dosage est effectu6 sur une prise d'essai de x ml. COt d6gag6:I25.8/J1 Ac. L-glutamique dans la prise d'essai: I25.8 • 1.47 = 0.825 mg 224 Ae. L-glutamique darts l'61uat: 0.825 • 20 = 16.5o rag. Si ron calculait A partir de ces chiftres, obtenus avec le liquide d'61ution, le pourcentage d'acide glutamique contenu darts les prot~ines initiales, on trouverait respectivement: - - pour l'acide glutarnique total: 8.3t ~/o - - pour l'acide L-glutamique: 8.25~/o Or, le taux d'acide L-glutamique dos~ directement dans l'hydrolysat, avant chromatographie, e s t de 14.o6~/o. En effet, la fa~on dont nous op~rons ne conduit pas b. une r6cul~ration quantitative de l'acide glutamique, dont une pattie reste adsorb6e sur l'alumine (voir plus haut). Mais ce qui nous int6resse, c'est de connaftre exactement le rapport de l'acide glutamique total ¢~l'a~ide L-glutamique, qui nous permettra, par une simple r6gle de trois, de calculer les teneurs v~elles de l'hydrolysatinitial et par suite de la prot6ine. Dans l'exemple qui nous occupe, nous avons: Acide glutamique total: 74"06" ~6.516.62 °
14.I6~/o du poids de prot~ines s~ches.
II y a done i 4 . 1 6 - 14.o6 = o.io~/o d'acide D-glutamique et le pourcentage de iorme 1) par rapport l'acide total est de 0.7%. Ce chiffre est 6videmment inf6rieur b. la limite de pr6cision de la m6thode; on peut n~anmoinsconsid6rer qu'il indique un l~ger degr6 de racAmisation, tel qu'on l'observe toujours la suite d'une hydrolyse aeide.
B. RI~SULTATS EXP~RIMENTAUX NOUS avons ~tudi~ des prot~ines tissulairesnormales qui nous ont servi en quelque sorte de t~moins et nous avons ensuite soumis ~tl'analyseune s~riedem~langesprot~iques provenant de tumeurs exp~rimentales provoqu~es ou greff~es.Enfin, nous avons trait~ des hydrolysats totaux de corps microbiens de plusieurs exp~es, parmi celles-cifigure Bacillus anthracis, chez lequel on a d~cel~ pour la premiere fois l'acide D-glutamique l'~tat n a t u r e l (BRucKNER ET IVANOVICZlS). Nous a v o n s rassembl6 nos r~sultats d a n s le t a b l e a u ci-contre (Tableau I). Les chiffres appellent quelques brefs commentaires. T o u t d ' a b o r d , nous r e t r o u v o n s dans B . anthracis la p r o p o r t i o n ~lev~e d'acide Dg l u t a m i q u e pr~c6demment signaler; les corps microbiens c o n t i e n n e n t de l'acide g l u t a rnique presque c o m p l ~ t e m e n t rac6mis~, puisque l'acide L-glutamique en execs ne repr~sente que 17 % du total. U n e a u t r e esp~ce microbienne, Streptococcus/aecalis, renferme ~galement de l'acide D-glutamique, mais h u n t a u x consid6rablement plus faible. Cette c o n s t a t a t i o n , d~j~ int~ressante en elle-m~me, poss6de ~ nos y e u x l ' a v a n t a g e de justifier la m6thode que n o u s avons proposer; nous a v o n s pu en effet d~celer et doser tr~s faciler n e n t u n t a u x de forme D de 7.6 % (par r a p p o r t ~t l'acide g l u t a m i q u e total). Aussi, les chiffres p r a t i q u e m e n t n o r m a u x que nous o n t donn~s les t u m e u r s exp~rim e n t a l e s apparaissent-ils, p a r contraste, encore plus c o n v a i n c a n t s . I1 n ' y a a u c u n e difference sensible e n t r e les prot6ines des tissus n o r m a u x et celles des tissus n60plasiques. Les t a u x de I ~t :2 % sont g6ndralement consid6rds comme r ~ s u l t a n t de la r a c 6 m i s a t i o n de l'acide g l u t a m i q u e au cours de l'hydrolyse et on ne p e u t leur a t t r i b u e r de signification biologique. I1 ne n o u s a done pas 6t6 possible, j u s q u ' h pr6sent, de confirmer les conclusions de K6GL, que cet a u t e u r v i e n t de reprendre r ~ c e m m e n t 14 en les a p p u y a n t sur u n e exp6rim e n t a t i o n a p p a r e m m e n t i n a t t a q u a b l e . Les causes d u d6saccord qui persiste entre K6GL Bibliographie p. 425 .
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422
TABLEAU
I
Acide g l u t a m i q u e t r o u v 6 (en g p o u r ioo g de prot~ines s~ches) Prot~ines
L e t DL dans l'~luat
(VAN SLVKE)
L
L
dans l'~luat (GALE)
total (GALE)
Let
DL
D
total
total
% deD par rapport b. l ' a c i d e total
Chromatographie sur papier Estimation de la tache (en/zg)
% de D
I. A N I M A L E S
Muscle de boeuf
8.33
8.25
I4.O6
I4.2o
o.I 4
I
2
1
C o e u r de porc
9.22
9.08
I2.32
12.5I
o. 19
1.5
3
1.5
R e i n de porc
7.52
7.41
9.25
9.38
o.I 3
I. 5
3
1.5
6.27
5.6o
9.32
Io.43
10.6
20
7.09
6.63
9.27
9.92
o.65
6.55
6.95
6.80
IO.I 5
IO.37
0.22
2.1
2. 5
1.2
7.51
7.24
I;.37
11.5o
o.13
1.2
2
I
6.79
6.67
8.76
8.92
o.16
1.8
3
1.5
6.52
6.36
8. xo
8.30
0.20
2.4
3
1.5
7.09
7.05
8.82
8.87
0.05
0.6
I
0. 5
4'77
2.80
7.4 °
I 2.60
5.2
41.3
7°
4°
3.92
3.87
7. IO
7.19
0.09
1.2
2
I
6.04
5.96
I 1.9 °
12.O6
o. I6
1.3
4
2
5.83
5.7 °
9.2I
9-42
O.2I
2.2
5
2.5
7.15
6.61
7-94
8.59
0.65
7.64
15
7-5
R e i n de porc i g + ac. D-glut. 1o m g (D th~or. : Io.9% par rapp o r t b. I'A. G1. total) R e i n de porc I g+ac. D-glut. 5 m g (D th~or. : 6.37%)
I,II
r5
IO
7.5
If. N~OPLASIQUES
B e n z o p y r ~ n e (rat) Epith~lioma de G u 6 r i n (rat) Sarcome de J e n s e n (rat) Carcinome de W a l k e r (rat) Liposarcome de Dael (cobaye)
III. MICROBIENNES
Bacillus Anthravis (I.P. Lille no 44) Cholera Ogawa (I.P. Lille no 4 x) Clostridium Welchii S R 12 (NCTC no 6784) Clostridium Welchii B W 2 I (NCTC no 6785) Streptococcus / aecalis (NCTC no 6783)
VOL. ~
(x95o)
FORMES D ET L DE L'ACIDE GLUTAMIOUE
423
et ses c o n t r a d i c t e u r s r e s t e n t myst6rieuses. N o u s avons peine ~ croire, p o u r n o t r e p a r t , qu'elles r~sident u n i q u e m e n t d a n s des diff6rences d ' i m p o r t a n c e secondaire e n t r e les m o d e s op6ratoires suivis de p a r t et d ' a u t r e , et nous pensons clue l ' e x p l i c a t i o n des discordances p e r m e t t r a i t p e u t - ~ t r e de faire des progrbs sensibles vers la solution du probl6me f o n d a m e n t a l de la s t r u c t u r e des p r o t $ i n e s canc~reuses. C'est dans cet esprit, - - et sans a u c u n d~sir de pol6mique, - - que n o u s a v o n s t e n u ~ r a p p o r t e r nos r~sultats. Ils o n t 6t6 o b t e n u s g r a c e ~ une m 6 t h o d e q u i nous p a r a t t 6viter la p l u p a r t des objections pr~sent6es t o u s l e s proc6d6s a u x q u e l s on a eu recours j u s q u ' h present. ADDENDUM
Alors que ce t r a v a i l 6 t a i t pros d ' e t r e achev~, nous a v o n s eu connaissance du dernier m6moire de F. K6GL 14, darts lequel l ' a u t e u r insiste sur l ' i m p o r t a n c e f o n d a m e n t a l e des conditions d ' h y d r o l y s e des prot~ines p o u r l'isolement de l ' a c i d e g l u t a m i q u e et en p a r t i c u lier de la forme D. K6GL pr~conise en effet une h y d r o l y s e de 2o heures ~ reflux, au b a i n d ' h u i l e ~ I 3 5 ° - I 6 O ° C, avec 3 v o l u m e s d ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e concentr6. Or, d a n s nos recherches, nous nous s o m m e s c o n t e n t 6 s d ' u n e dur~e de 7 heures d a n s les m~mes conditions de t e m p e r a t u r e et de c o n c e n t r a t i o n en acide. P o u r pr6venir t o u t e o b j e c t i o n de ce c6t~, nous a v o n s a p p l i q u 6 n o t r e m ~ t h o d e de caract~risation et de dosage de l'acide Dg l u t a m i q u e ~ des h y d r o l y s a t s de 20 heures et de 7 heures, o b t e n u s ~ paxtir de prot6ines tissulaires n o r m a l e s et n6oplasiques. Voici le r 6 s u l t a t de la c o m p a r a i s o n des degr~s d ' h y drolyse. Prise d'essai: x g de prot6ines tissulaires sc~ch~es; addition de 3 ml de HC1 concentr6 pur; chaufl[age h reflux/~ x45° C. L'hydrolysat dilu6 est filtr6 et le filtre lav~ avec de l'eau chaude jusqu'~t ce que les eaux de lavage passent incolores. Le filtrat est compl~t6/~ 5° m l et on procSde au dosage de l'azote total, de l'azote amin6 (mfithode ~ l'acide nitreux de VAN SLYKE), de l'acide L-glutamique (m6thode de GALE), et ~. une chromatographie sur alumine "acide" apr6s neutralisation prdalable sous contr61e ~lectromfitrique. TABLEAU II N total en mg par ml
N.NH I en mg par ml
N.NH 2 N total
Acide L-glutamique en mg par ml
% de la prot~ine
I
!eins de pore
[ydrolyse de "-'0heures
2.42
! .96
si%
1.88
9.4 °
[ydrolyse de 7 heures
2.42
1.9 2
79%
I "77
8.85
[ydrolyse de 2o heures
2.63
2.o9
79.5%
2.08
io.4o
[ydrolyse de 7 heure~
2.42
i
.92
79%
2.00
IO.OO
U:m£Ulr
u benzopyr~ne (rat)
On v o i t donc ( T a b l e a u I I ) q u ' a p r ~ s u n e h y d r o l y s e de 20 h le t a u x d ' a z o t e amin~ lib~r~ est tr~s l~g~rement sup6r4eur; m a i s la difference r e s t e minime. I1 en est de m~me p o u r la t e n e u r en acide g l u t a m i q u e et les 6carts sont, ici encore, p e u significatifs. Les dosages d o n n e n t 6 v i d e m m e n t la t e n e u r en acide L - g l u t a m i q u e et si l ' o n d e v a i t a d m e t t r e Bibliographie p. 425.
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VOL. S (195o)
q u e l ' h y d r o l y s e p r o l o n g 6 e lib~re, d a n s le c a s d e s p r o t 6 i n e s t u m o r a l e s , l ' a c i d e D - g l u t a m i q u e , e n g a g ~ d a n s d e s l i a i s o n s p l u s difficiles ~ b r i s e r , l a d i f f 6 r e n c e n ' a p p a r a i t r a i t p a s d a n s les c h i f f r e s d u t a b l e a u c i - d e s s u s . M a i s c ' e s t ici q u e l a c h r o m a t o g r a p h i e d e p a r t a g e n o u s e s t d ' u n s e c o u r s p r ~ c i e u x . E n effet, les h y d r o l y s a t s " d 6 c a r b o x y l ~ s " n e c o n t i e n n e n t p r a t i q u e m e n t p l u s d ' a c i d e g l u t a m i q u e , ce q u e v i e n n e n t e n c o r e c o n f l r m e r les c h i f f r e s du Tableau III, qui sont particulierement d6monstratifs. Le chauffage prolong6 dans les c o n d i t i o n s e x a c t e s q u e r e c o m m a n d e K 6 G L n o u s a d o n c c o n d u i t s ~ d e s r 6 s u l t a t s q u i confirment enti~rement nos conclusions. TABLEAU III Acide glutamique trouv6 (en g pour 1oo g de prot6ines s~ches) Prot6ines
L e t DL
D
total
total
~/o d e D par rapport ~. l'acide total
9.4 °
9.55
O.15
5.45
8.8 5
8.93
6.76
6.65
1o.4 °
7.31
7.20
IO.OO
t i LetDL
L
I
Estimation de la tache (en pg)
°/o de n
1.5
2
I
0.08
0.9
2
I
Io.57
O.I 7
1.6
2
I
lO.15
o.15
I. 5
2
I
L
dans l'~luat
dans l'~luat
total
(VAN SLYKE)
(GALE)
(GALE)
Hydrolyse de 2o h
5.65
5.55
Hydrolyse de 7 h
5.5 °
Hydrolyse de 20 h Hydrolyse de 7 h
Chromatographie sur papier
Reins de pore
Tl~l~lel,r
au benzopyrene
RI~SUM]~ Une m6thode de caract6risation et de dosage des deux formes D et L de l'acide glutamique est d6crite; elle repose ~ la lois sur la d~carboxylation 61ective de l'acide L-glutamique par la glutamod6carboxylase de Clostridium Welchii S R 12 suivant GALE et sur la s~paration de l'acide glutamique p a r chromatographie sur alumine acide selon WIELAND. La chromatographie de partage sur papier permet en outre de contr61er et de confirmer d'une fa~on rigoureuse les r~sultats obtenus. L'applicatio n ~t des prot6ines tissulaires normales et n6oplasiques et /~ des corps microbiens de diverses esp~ces montre que le t a u x d'acide D-glutamique est de l'ordre de I ~ 2% (par rapport A l'acide glutamique total) aussi bien dans les prot~ines de tumeurs exp~rimentales (tumeurs au benzopyr~ne, ~pith6lioma de GUgRIN, carcinome de WALKER, sarcome de JENsm% liposarcome de DAEL) que dans celles des tissus normaux. On rctrouve au contraire une proportion i m p o r t a n t e de forme D darts Bacillus anthracis, - - ce qui confirme les donn6es ant~rieurement publi6es, - - et u n taux appreciable dans Streptococcus /aecalis. Nous avons donc la preuve que notre m6thode est bien adapt~e au b u t poursuivi, ce qui ne peut m a n q u e r d ' a u g m e n t e r la port~e des r~sultats n~gatifs obtenus avec les prot6ines n~oplasiques. SUMMARY A method is described for the identification a n d the estimation of the two forms, n and L. of glutamic acid; the principles are: I. the specific docaxboxylation of L-glutamic acid by the glutamodecarboxylase of Clostridium Welchii S R 12 (GALE) and 2. the isolation of glutamic acid b y adsorption on acid alumina (WmLAND). The paper partition c h r o m a t o g r a p h y gives the possibility of a strict Bibliographie p. 425.
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FORMES D ET L DE L'ACIDE GLUTAMIQUE
425
control and affords a confirmation of the results. The application to normal, cancerous and bacterial proteins shows that in proteins of experimental tumors (benzpyrene-tumors, GUERIN epithelioma, W A L K E R carcinoma, JEt,SEn sarcoma, D A E L liposarcoma) and in proteins of normal tissues the proportion of D-glutamic acid does not exceed x to 2 % of the total glutamic acid. However, a great proportion of D form is found in Bacillus anthrax.is and this fact affords a confirmation of the results already obtained by other authors. Streptococcus/Recalls also contains a definite but smaller proportion of v-glutamic acid. So the method has proved to be reliable, and the significance of the negative results obtained with cancerous proteins is strengthened. ZUSAMMENFASSUNG Eine Methode zur Identifizierung und Bestimmung der D- und L-Glutamin~ure wird beschrieben; sic griindet sich auf die selektive Decarboxylierung der L-Glutamin~ure dutch die Glutamodecarboxylase yon Clostridium Welchii S R r2 (GALE) und auf die Isolierung der G l u t a m i n ~ u r e durch Adsorption an saurem Aluminiumoxyd (WI~LAND). Die Verteilungschromatographie an Papier erlaubt ausserdem eine genaue Kontrolle und Best~tigung der erhaltenen Ergebnisse. Die Anwendung dieser Methode auf Eiweisstoffe aus normalen und aus Krebsgeweben sowie aus verschiedenen Bakterienarten zeigt, d a ~ in den Proteinen aus experimentellen Tumoren (BenzpyrenTumor, GuERIn-Epitheliom, W&LKER-Carcinom, JEnsgn-Sarcom, DAxL-Liposarcom) und in den Proteinen aus normalen Geweben die D-Glutamins~ure x-2% der Gesamtglutamins~ure nicht iibersteigt. Man findet dagegen eine g r o ~ e Menge D-Form in Bacillus anthracis, was die Ergebnisse frttherer Arbeiten best~tigt, und auch Streptococcus/accalis enth~lt eine nicht unbedeutende Menge D-Form. Dies beweist die Verl/isslichkeit unserer Methode und erh6ht dadurch die Bedeutung der mit den Krebsproteinen erhaltenen negativen Ergebnisse. BIBLIOGRAPHIE 1 F. K6GL ET H. ERXLEBEn, Z. physiol. Chem., 26I (I939) 154. I A. C. CHIBNALL,M. W. RKES, E. F. WILLIAMS ET E. BOYLAND,Biochern. J., 34 (I94 °) 285. S S. GRAFF, D. RITTENBERG ET G. L. FOSTER, J. Biol. Chem., z33 (I94 o) 745; D. RITTENBERG, Ann. ReD. Biochem., 15 (I946) 26o. • F. K6aL, H. ERXLEEEN ET G. J, VA~r VEgRSRn, Z. physiol. Chem., 277 (1942) 25 z. 5 TH. WIELAnD ET W. PAUL, BET., 77B (1944) 34. 6 p. BOULAnGER, Compl. rend. see. biol., 137 (1943) 52I; 538 (I944) 686. TH. WIELAND ET L. WIRTH, Ber., 76 (I943) 823. s E. P. GALE, Biochem. J., 39 (r945) 46. 9 p. p. COHEn, Biochem. J., 33 (5939) 555. l0 R. CONSDEn, A. H. GORDOn ET J. P. MARTIn, Biochem. J., 38 (7944) 224. n C. E. DENT, Biochem. J., 4 r (I947) 24o. 12 F. K6GL ET H. ERXLEBEn, Z. physiol. Chemic, 258 (1939) 57. as G. IVAnOWlCZ ET V. BRUCKn~R, Z. Immunilalslovsch., 90 (I937) 304. 14 F. K6GL, Experientia, 5 (x949) I73. R e ~ u le 14 s e p t e m b r e 194 9