Microméthode de dosage spectrofluorimétrique des benzoquinolizines dans les liquides et tissus biologiques

453

CLINICA CHIMICA ACTA

MICROMEtTHODE

DE DOSAGE

SPECTROFLUORIMl?TRIQUE

DES BENZOQUINOLIZINES

DANS LES LIQUIDES

ET TISSUS BIOLOGIQUES D. E. SCHWARTZ

ET

J. RIEDER

Dbpartement de recherches me’dicales, F. Hogmann-La (Rep

le 26 novembre

Roche, Bdle (.%&se)

1960)

La technique d&rite est adaptee au dosage du Nitoman r, de la z-dehydroCmCtine * et de l’emetine naturelle dans les liquides biologiques et les tissus d’animaux de laboratoire. Elle se prete entre autres a l’etude du metabolisme de ces trois substances

chez l’animal.

CH,-CH

/f-C% \CH, OCH, OCH, r-dChydro-CmCtine

Nitoman *

Pour les besoins de la clinique,

une modification

de la technique

permet,

en tra-

vaillant avec des prises plus considerables, d’elever encore la sensibilite de la methode. 11 devrait alors etre possible de l’utiliser pour le dosage des dites substances chez l’homme, apres administration de doses therapeutiques. Dans le cas du Nitoman, la methode a deja CtC utilisee pour suivre la distribution de cette preparation dans l’organisme animal et determiner, pour chaque organe, sa periode de demidlimination 3. Dans le cas de 1’CmCtine et de la z-dehydro-CmCtine, elle a permis une comparaison exacte de la periode de demi-Climination4. PRINCIPE DE LA MkTHODE

Extraction Chacune des preparations citees se trouve dans le corps essentiellement sous forme de base libre. Par agitation avec un tampon de pH 3.0, elle forme un se1 qui passe en solution. L’extrait aqueux &pare est ensuite alcalinise pour liberer a nouveau la base. Celle-ci est extraite dans un solvant organique (benzene, resp. acetate d’isoamyle), en presence de sulfate de soude a saturation. Apres centrifugation, une prise * Marque de fabrique. Clin. Chim. Acta, 6 (1961) 453-463

D.

454

E. SCHWARTZ,

J. RIEDER

aliquote de la phase organique est agitee avec un petit volume d’acide sulfurique dilue (Cventuellement apres addition d’heptane). La preparation se trouve ainsi concentree dans l’acide sulfurique. Dosage

firopremezt

dit

Une partie aliquote de l’extrait sulfurique est utilisee pour transformer la substance recherchee en un derive fluorescent. Cette reaction est realiske par chauffage de l’extrait sulfurique en presence d’acetate mercurique en milieu fortement tamponne a pH 4.0. Dans le cas du Nitoman et de la z-dehydro-em&tine, la formule exacte des produits fluorescent form& n’a pas Cte etablie; dans celui de l’emetine, la reaction conduirait a la formation de rubremetine5>6. RlkXTIFS I.

Tampo?a MC Ilvaine,

de concentration

double,

ajuste’ d pH 3.0

IOO ml de solution tampon sont obtenus par melange de 79.45 ml d’une solution mol d’acide citrique (= C,H,O, t- H?O) pour analyse (Merck) dans de l’eau distillee et de 20.55 ml d’une solution 0.4 mol de phosphate disodique (= Na,HPO, + zH,O) 0.2

pour analyse (Merck) un mois & 4’.

dans de l’eau distillee.

Le tampon

peut etre conserve

environ

2. Ben&c Du benzene (Merck “pour analyse et pour chromatographie”) est a&i: uneheurc, sur une secoueuse avec I 120 de son volume d’acide sulfurique 4 TV, puis lave plusieurs fois par agitation 3. A&ate

avec de l’eau distill&e.

d’isoamyle

L’acetate d’isoamyle chimiquement pur (Riedel-deHaen) est sature par agitation avec de l’eau distillee. Le solvant est conserve sur eau distill&e pour assurer une saturation permanente. Pour le dosage, on ne preleve strictement que la phase organique superieure. 4. Mt%ange d’oxyde

de magnbium

et de sulfate

de soude

Une partie en poids d’oxyde de magnesium (Merck) et 5 parties en poids de sulfate de soude anhydre pour analyse (Merck) sont melangees jusqu’a homogeneite complete. 5, Sulfate

de soude

Na,SO,

anhydre

6. Soude caustiyue, 7. Acide

pour analyse

exactement

(Merck).

5 S

sulfurique

H&SO, pour analyse (Merck) : I AV pour le dosage du Nitoman; dosage de l’emetine et de la a-dehydro-emetine.

0.1 A; pour le

8. n-Heptane Qualite purum 99yd de Fluka de Philips.

S.A., Buchs,

ou qualiti: pure pour chromatographie

SPECTROFLUORIMl?TRIE

DES

455

BEhXOQUINOLIZINES

9. Rt!actif d l’ac&ate mercurique On Porte

2 g

d’acetate

mercurique

a IOO ml avec un tampon

de

pH

4

de composi-

tion suivante: 96 ml d’acide acetique glac. pour anal. (Merck); 4 ml d’eau distill&e; 32 ml de soude caustique a 40% (Melanger et refroidir a temp. ambiante). Le reactif est stable au moins deux mois a 20’. IO.

Solution d 257,,

II.

Solutions

d’oxalate de potassium pour analyse (Merck) dans de l’eau distill&e.

standard

Standard stock: une quantite equimolaire a 20 mg de la base libre de la preparation est pesee dans un flacon jauge de 20 ml. On complete au trait par de l’acide sulfurique, H&O, X dans le cas du Nitoman, H,SO, 0.1 N dans le cas de l’emetine et de la z-dehydro-Cmetine. La solution peut etre conservee un mois a 4’. Standard de travail: Pour chaque nouvelle serie d’analyses, le standard stock est dilue 500 fois a\Tec de l’acide sulfurique I N pour le Nitoman, resp. 0.1 N pour l’emetine et la a-dehydro-emetine. ration,

Le standard

de travail contient

z pg par ml de la prepa-

sous forme de base libre. MkTHODE

A.

PrLparation et conservation des @rises d’essai jusqu’au moment de l’analyse

I. Plasma Une analyse a double exige dans le cas du Nitoman tine et de la z-dehydro-emetine 4 ml de sang complet.

I

ml, dans le cas de l’eme-

Le sang est recolte dans des tubes prealablement jaugits a I, resp. 4 ml, renfermant, pour chaque ml de sang, 6 ,ul d’une solution d’oxalate de potassium a 25oj. Le tube est immediatement ferme avec du parafilm ou un bouchon de polyethylene, puis renverse plusieurs fois sans agitation. Le sang doit Ctre centrifuge au plus tard 20 min aprits la prise de sang. Lorsque l’analyse ne peut pas suivre immediatement, il est possible de conserver le plasma congele a -18”. 11 est cependant recommande de ne pas retarder l’analyse plus de 24 h. 2.

A&es

liquides biologiques

L’urine plasma.

et le liquide

cephalorachidien

sont conserves

comme

indique

pour le

3. Ovganes Plusieurs organes, notamment le foie, conservent sous forme d’homogenats la propriete de metaboliser rapidement le Nitoman; l’emetine et la 2-dehydro-emetine sont plus lentement transformees par les systemes enzymatiques de l’organisme. Pour Cviter ces reactions, nous recommandons de preparer les organes de la facon suivante : L’animal est saigni: aussi completement que possible, les organes preleves sit& apriis la mort, sont pest%, coupes avec des ciseaux, puis immediatement broyes dans un homogeneisateur en verre avec 5 parties (ml/g) de tampon McIlvaine de pH 3.0. .h. ce pH, la plupart des enzymes sont inactives. I1 est done possible de conserver les itpreuves, a ce stade, meme plusieurs jours a l’etat congele (- 18~). Les homogenats sont agites 30 min sur une secoueuse, puis centrifuges 30 min a C/i%

Chirn.

.4ctn,

6 (1961)

453-463

1). E. SCHWARTZ,

456 2500 t /min. Une aliquote (voir Tableau I).

de 4 ml du surnageant

J. RIEDER

est prelevee pour la suite de l’analyse

Lorsque, pour une raison ou une autre, les organes deja prelevks ne peuvent pas etre immediatement homogCn&sCs avec le tampon (ce qui se presente en particulier lorsque plusieurs organes doivent etre simultanement examines), on prendra la precaution de les congeler immediatement dans un flacon ferme, entoure de neige carbonique. Dans le cas du dosage de l’emetine et de la 2-dehydro-emetine dans le cceur et le foie, nous avons souvent observe la formation d’emulsions au tours de l’extraction de retour dans l’acide sulfurique. Pour kiter cet inconvenient, nous chauffons apres agitation, les homogenats de ces deux organes dans le tampon de PH 3.0 pendant IO min a 100'. Ce chauffage ne diminue pas le rendement de l’extraction. Apres refroidissement des epreuves, on procede comme indique plus haut pour les autres organes. Si la formation d’une emulsion devait cependant persister, on pourrait alors la detruire par une centrifugation de IO min a 10,000 t /min.

B. Marche & suivre de l’analyse Les marches a suivre ne sont pas identiques pour la z-dehydro-Cmetine, l’emetine ou le Nitoman. Elles sont cependant suffisamment sembiables pour que nous ayions jug& utile de les reunir dans le Tableau I. C. Mesure de la fluorescence La solution de mesure du Tableau

I est stable

en tous cas 2 h a temperature

ambiante et 24 h a 4’. On Cvitera cependant l’evaporation, l’exposition a la lumiere ou la congelation. Pour determiner la concentration de la substance recherchee, on compare la fluorescence de la solution de mesure a celle d’un standard de travail de la meme preparation, developpe simultanement et dans les mCmes conditions Tableau I, points 15 et suivants de la marche a suivre et Reactifs, II).

(voir

Conditions de mesure de la fluorescence a. Appareil. Spectrofluorimetre, type Aminco-Bowman ou Farrand. b. Source de lumidre. Pour la determination des maxima d’activation et de tluorescence, on utilisera une lampe au Xenon, dont l’intensite du spectre est relativement uniforme. Pour la mesure des analyses, et refroidissement

une lampe a vapeurs de mercure sous haute pression

a eau, type Philips

SP 500 W, est a preferer

en raison de la plus

grande stabilite et intensite de son emission. c. Cuvettes. Cuvettes en quarz de section carree, de I cm de c&e, polies sur les 4 faces. d. Choix des longueurs d’ondes. Pour le Nitoman: maximum d’activation = 330 m,u; maximum de fluorescence = 450 rnp. Pour la a-dehydro-em&tine et l’emetine: maximum d’activation = 365 m,u; maximum de fluorescence = 470 m,u. D. Possibilitb

d’emfiloi de la mbthode en clinique

La methode telle que nous l’avons resumee dans le Tableau I, a Cte &labor&e pour des essais sur animaux. Pour le dosage de la 2-dehydro-Cmetine, de l’emetine et

SPECTROFLUORIMkTRIE

457

DES BENZOQUINOLIZINES

du Nitoman dans le plasma humain, la technique d&rite ne suffirait vraisemblablement pas a deceler les quantites presentes apres administration de doses thhapeutiques. Pour ce genre de recherche, nous suggerons suivantes dans la marche a suivre du Tableau I:

d’introduire

les modifications

i?tape I de la marche k suivre On remplacera rod&

Ctanches,

les tubes a centrifuger

d’environ

de 50 ml par des flacons Pyrex a bouchons

120 ml de capacite.

&tapes 2 d 6 a-Dbhydro-t!m&tine et &me&e:

on reunira

20 ml de tampon

MC Ilvaine ; 4 ml de

plasma; 50 ml d’adtate d’isoamyle; 8 g Na,SO, anhydre; 2.4 ml NaOH 5 N. Nitoman: on reunira 12 ml de tampon MC Ilvaine; 4 ml de plasma; 50 ml de benzene; 6 g de melange MgO + Na,SO,. les Aapes 7 et 8 sans modification.

Suivent &ape

g

2-De’hydro-tfmkine et t2mkine : On preleve Porte dans un tube a centrifuger de 50 ml.

40 ml de l’extrait

isoamylique

et les

Suivent sans modification les autres Ctapes du Tableau I, telles qu’elles sont donnees pour le dosage de la 2-dehydro-CmCtine et de l’emetine. Contrairement au Nitoman, la 2-dehydro-Cmetine et l’emetine sont facilement solubles dans l’acide sulfurique. 11 est done possible de les extraire presque sans perte de 40 ml de phase acetate isoamylique par simple agitation avec 2 ml d’acide sulfurique 0.1 N. De cette facon, on augmente la sensibilite de la methode de 4 fois. Nitoman: la prkparation presente dans les 40 ml d’extrait benzenique ne peut etre reprise sans perte dans 2 ml d’acide sulfurique. 11 faut dans ce cas concentrer par evaporation l’extrait benzknique a IO ml. Un tube de 50 ml de capacite est jaugk a IO ml, on y Porte 40 ml de l’extrait benzenique (voir Ctape 8 de la marche a suivre), plonge le tube dans un bain a 37” et entraine le solvant par un courant d’azote jusqu’a ce que le menisque du benzene atteigne ou d&passe Iegerement le trait de jauge (Une evaporation bain et complete,

a set peut entrainer une perte de Nitoman!). On sort les tubes du si cela est necessaire, jusqu’au trait de jauge par du benzene.

Suivent sans modification les autres don&es pour le dosage du Nitoman.

&apes

du Tableau

I, telles

qu’elles

sont

CALCUL

La fluorescence des solutions de mesure doit etre rapportke & celle d’un standard de concentration connue de la substance recherchee, que l’on prepare fraichement pour chaque serie d’analyses. La soustraction des blancs (blanc de I’kpreuve et blanc du standard) est faite par calcul. D&&ions Blanc de l’tfppreuve(= BE). 11 est obtenu en traitant une prise biologique de m&me nature d’un animal temoin n’ayant pas recu la preparation. Blanc dzt standard (= B.?). 11 est obtenu en traitant la solution d’acide sulfurique Clin.Chim. Acta,6 (196x)453-463

0

5

4

3

:

biologiquc:

d’dprcuvc

5 X (voir

XaOH

R&ctifs,

6)

j)

(voir

Rkctifs,

$ Sa,SO,

(voir

anhytlrc

Sn,SO,

(1 air RCactifs,

z)

le lwuchon)

mClnnge de MgO

.\cltlition de:

d’isoamylc

acktte

:

Reactifs,

(voir

dc solvant

bcnzkne

.\tldition

: aprk

I)

centri-

Rkctils,

: capacitb

RCactifs,

3)

4)

et laisser rcposcr

cl’organc,

scion MGthotlc -1.3.

JIClangcr (sans mouiller

fugntion,

sumxgeant de l’homogkat

liquidc

(voir

i lmuchon rodd

1lcIl\-nine

centrifugcr

de tampon

tube i

.\cldition de matdricl

Introduction

lidcipient

TABLEAU

I

4.0

5o

ml

g

g

ml

ml

0.6

2

r2.5

I.5

Il.-j

5 min & tcmpC%ature ambiantc.

ml

1.o

5

ml

ml

5o

ml

MARCHE A SUIVRE DE L'ANALYSE

0.6

1

1r.,j

_

1.o

5

50

1.5

12.5

4.0

5o

0.3

12.5

0.2

O.jj

12.5

2.0

SPECTROFLUORIM6TRIE

DES

BENZOQUINOLIZINES

459

460

D. E. SCHWARTZ, J. RIEDER

pure utilisee pour la preparation du standard de travail (z-ddhydro-emetine et em& tine H&SO, 0.1 N; Nitoman H&O, N) comme indique dans les ittapes 15 B 20 du Tableau I. Courbes d’tftalonnage (voir Fig. I) Pour les mirthodes d&rites

ici, les courbes d’etalonnage

serviront

exclusivement

I. au controle

de la methode et du spectrofluorimetre; 3. A determiner la dilution appropriee des epreuves. Cette dilution doit etre choisie

,

12.5

5

10 Concentration

20 (pg/ml)

Fig. I. Courbcs SpectrofluorimGtriques d’ktolonnage de 1’CmCtine (E), du Nitoman (N) et de la z-dChydro-Cmktine (D), aprks diveloppement de la fluorescence & l’aide du rCactif B 1’acCtate mercurique (division de l’ordonnk en unit& arbitrairement choisies).

de man&e a ramener la fluorescence sur la zone rectiligne de la courbe d’etalonnage, aussi pres que possible de celle du standard. Dans le cas du Nitoman et de la z-dehydroemetine, cette zone s’etend entre les concentrations de o a 4 ,ug, pour l’emetine de o & IO rug/ml de l’extrait sulfurique final. Les concentrations rencontrees lors de nos essais oscillaient pour la plupart entre 0.1 et I0 pg/ml ou g. Pour ces raisons, nous avons choisi de fixer la concentration du standard a 2 ,ug/ml. Les solutions de mesure dont les valeurs de fluorescence depassent la zone rectiligne de la courbe d’etalonnage peuvent &tre directement diluees avec le reactif 21l’acetate mercurique.

Pour le calcul, on utilisera la formule :

CEC ;$232! dans laquelle les symboles ont la signification suivante: Clan.

Chim.

.4&z,

6 (1961)

453-463

:

SPECTROFLUORIMlkTRIE

CE ME

cs MS F

461

DES BENZOQUINOLIZINES

= concentration de la preparation dans la prise d’epreuve = mesure de la solution finale de l’epreuve apres soustraction du blanc de l’epreuve (BE) = concentration de la preparation dans le standard = mesure de la solution finale du standard, apres soustraction du blanc du standard (Es) = facteur tenant compte du changement global de concentration que subit la prise d’essai en tours d’analyse ainsi que des pertes connues, dues aux aliquotes.

Si l’on veut exprimer la concentration de la preparation contenue dans l’epreuve biologique en ,ug/ml resp. g, F prendra dans le schema d’analyse, que nous avons trace, les valeurs suivantes : Pour le dosage de la 2-dkhydro-kmdi?ae et de l’Lm&ine : Pour une prise de I ml de liquide biologique Pour une prise de 4 ml de liquide biologique (avec concentration) Pour une prise de 4 ml du surnageant du melange de I g d’homogenat tampon de PH 3

=

2.5 0.625

=

3.75

de tissu + 5 ml

Pour le dosage du Nitoman : Pour une prise de 0.2 ml de liquide biologique Pour une prise de 4 ml de liquide biologique (avec concentration) Pour une prise de L ml du surnageant du melange de I g d’homogenat de tampon de pn 3 CARACTkRISTIQUES I.

= 12.5 = 0.625 de tissu + 5 ml =

7.5

DE L-4 M$THODE

Sensibilite’

Nous prenons comme limite de sensibilite la prise d’epreuve qui donne une fluorescence dans ce cas, en utilisant vantes :

la concentration de la substance dans double de celle du blanc. On obtient

la lampe a vapeurs de mercure,

z-dehydro-6mCtine: Cmetine : Nitoman :

0.05 a 0.1

les limites de sensibilite

sui-

,ug/ml ou g de prise d’epreuve

0.2 & 0.4 pug/ml ou g de prise d’epreuve 0.03 a 0.06 pg/ml

Le seuil de sensibilite peut &tre encore que nous avons decrit a propos du dosage (cf. MCthode, D). Dans ce cas, on atteindrait, une sensibiliti: de 0.01 ?I 0.02 ,ug/ml; pour

ou g de prise d’epreuve

abaisse par le pro&de de concentration des m&mes preparations chez l’homme pour la 2-dehydro-Cmetine et le Nitoman, l’emetine de 0.05 a 0.1 pg/ml.

Notre technique, appliquee au dosage compare de solutions standard, permet de mesurer des concentrations 50 a IOO fois plus faibles en Nitoman que la technique de QUINN et aL7, et 25 fois plus faibles en emetine que la technique de GIMBLE et al.s3 9. 2. Rendement

Le rendement de notre methode a CtC determine en ajoutant des quantites connues de 2-dehydro-CmCtine, d’emetine ou de Nitoman a de l’urine, du plasma ou des homogenats de foie. Le Tableau II donne la moyenne des rendements primes en pourcentage de la quantite ajoutee (== 4pg/ml resp. g). TABI,EAU

obtenus

ex-

II

a-De’hydro-e’me’tine

Dans l’urine Dans le plasma Dans l’homogenat

de foie

89.0

83.0

92.5

90.3 87.5

87.0 85.6

95.’

Clin. Cl&.

90.7 Acta, 6 (1961) 453-463

462

L). E. SCHWARTZ,

J. RIEDER

3. Refivoductihilife’ La reproductibilite sur IO prises d’epreuves

de la methode a Pte dkterminee pour chaque preparation de mime nature, contenant 4 ,~g de la preparation par mi

resp. g. Le Tableau III donne les valeurs moyennes standard correspondantes.

obtenues,

ainsi que les deviations

Notre methode ne dose que les substances susceptibles de developper une fluorescence par reaction avec l’acetate mercurique. Elle esclut d’autre part tous lcs corps qui ne repondent pas a l’activation de longueur d’ondes choisie. Le pro&de d’extraction enfin contribue lui-mirme aussi a la specificit de la methode. Dans l’etude des substances qui pourraient intervenir pour gener le dosage, now noun sommes surtout interesses, pour le Nitoman, aus metabolites susceptibles d’etre inclus dans la mesure de sa fluorescence. Dans ce but, nous avons soumis des extraits de foie, de reins, de cer\.eau, d’intestin grele ainsi que d’urine a une separation chromatographique sur papier. Les systemes solvants utilises pour le developpement des chromatogrammes permettent une separation franche de la preparation inchangee et de ses metabolites fluorescents, La position des substances fluorescentes est determinee sur une bande de controle toupee dans la longueur du chromatogramme. Cette bande est revelee par une technique appropriee. Le reste du chromatogramme est alors coupe transversalement et les bandes eludes par de l’ethanol. Les eluats sont concentres a src-al-ec des precautions speciales--& temperature de laboraroire sous courant d’azote. Le residu cst repris dans dc l’acide sulfurique normal et analyse par notre m&ode de fluorescence. Nous avons pu de cette facon comparer l’intensite de fluorescence de l’eluat de la preparation inchangee (a) avec celui renfermant l’ensemble des metabolites fluoresccnts (h), et determiner la part que prend chacun de ces deux eluats a la production de la fluorescence globale mesuree (= II -C 21). Dans le cas du Nitoman, ce test nous a permis de comparer la specificite de notrc methode a celle de la methode de QUINN et al.‘. 11 nous a montre que la part de fluorescence imputable B la preparation inchangee etait pour notre methode, rcsp. pour la m&ode de QUIKN et al. (x-aleurs indiquees entre parentheses) : foie = 880 cl (I 5’: ,,) ; cerveau = 82”,, (30”;); inrestin grele = p(jy,, (34O,,); rein #I”,, [IIoL,). Bien que la specificit de notre technique, appliquee au Nitoman, ne soit pas parfaite, elle est cependant meilleur-e clue czlle tlu seul autre pro&de d’analyse actuellement connu pour le dosage de cette preparation.

SPECTROFLUORIMJkTRIE

Dans le cas de l’emetine metabolite

qui, dans l’emploi

de la preparation

DES

463

BENZOQUINOLIZINES

et de la e-dehydro-emetine, de notre methode,

nous n’avons

soit susceptible

pas trouve de

de gkrer le dosage

inchangee.

Une nouvelle

micromethode

de dosage fluorimetrique

des benzoquinolizines

est

d&rite. Elle consiste en un procede d’extraction adapt6 a chaque preparation, suit-i du developpement de la fluorescence par une reaction de deshydrogenation au moyen d’acetate mercurique. La technique est adapt&e plus specialement a la mesure de concentration du Kitoman, de la z-dithydro-emetine et de l’emetine dans les liquidcs biologiques et les tissus d’animaux de laboratoire. La limite de sensibilite est de 0.03 ,ug/ml resp. g de prise d’epreuve. La combinaison de cette technique avec un pro&de de concentration permet de pousser encore plus loin la limite de sensibilite de la methode. Sous cette forme, elle devrait pouvoir &tre utilisee pour le dosage des & 0.2

mcmes preparations chez I’homme apres administration de doses therapeutiques. La methode est nettement superieure aux autres procedes d’analyse utilises jusqu’ici pour le dosage du Nitoman et de l’emetine, tant par sa haute sensibilite, sa specificite que par la bonne reproductibiliti: des mesures.

SPECTROFLUORIMETRIC OF A

BENZOQUINOLIZINES

new spectrofluorimetric

MICROMETHOD IN

FOR

BIOLOGICAL

micromethod

THE

FLUIDS

DETERMIN.ATION AND

TISSUES

for the quantitative

determination

of

benzoquinolizines is described. It consists of an extraction procedure suitably adapted to each preparation followed by measurement of the fluorescence produced by a dehydrogenation reaction with mercury acetate. The present technique was developed especially for the determination of the content of Nitoman, 2-dehydro-emetine and emetine in biological fluids and tissues of laboratory animals. The limit of sensitivit! lies between 0.03 and 0.2 ,ug/ml or g of biological material. W’hen the method is combined with a concentration procedure these limits can be further reduced. In this form the technique should be suitable for the estimation of the same drugs in humans who have received therapeutic doses. Because of the high sensitivity, adequate specificity and the good reproducibility of the measurements, the method is distinctly superior to the other procedures that have been used up to the present for the estimation of Nitoman and emetine.

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