- Email: [email protected]
UNE ultramicro-méthode fluorimétrique pour le dosage de la leucine-aminopeptidase dans les liquides biologiques
CLINICA
448
CHIMICA ACT.4
UNE ULTRAMICRO-METHODE FLUORIMGTRIQUE POUR LE DOSAGE DE LA LEUCINE-AMINOPEPTIDASE DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES MARC
ROTH
Laboratoire central, HBpital cantonal, Gendue (Suisse) (Rep
le 25 juillet 1963)
SUMMARY A FLUOROMETRIC
ULTRA-MICRO
METHOD FOR THE DETERMINATION
AMINOPEPTIDASE A fluorometric juice
assay
is described.
A
of leucine
IO ~1 sample
I-leucyl+?-naphthylamide p-naphthylamine The
for the assay The male
is measured simple
directly
and permits
urine
30 min,
duodenal
the fluorescence
in the incubation
routine
and
of a solution
work.
No
of
of the
mixture. dialysis
is necessary
of urine samples.
following
serum:
female
is very
in serum,
at 37O in presence
exactly
OF LEUCINE
FLUIDS
aminopeptidase is incubated
of pH 7.2. After
produced
method
IN BIOLOGICAL
normal
19.7-41.5
serum
values
I.U./l;
16.5-33.7
were
male
I.U./l;
found:
urine:
female
2.1-6.1
urine
I.U./24
1.5-3.7
h;
I.U./24
h.
INTRODUCTION
et al.‘, puis d’autres
GREEN naphtylamide
comme
lyse de ce substrat un colorant utilisi:
fournit
azoique
dans
substrat
decrit a partir
par photometric
d’autres
proteases
l’utilisation
de
la leucyl-/?-
de la leucine-aminopeptidase.
de la B-naphtylamine,
mesurable
le dosage
ont
auteurs2-5
pour le dosage
de laquelle
d’absorption.
scindant
des
L’hydro-
on peut
former
Le mCme principe
derives
N-acyles
est
de la B-
naphtylamine. Nous
avons
montre
dans un travail
consacre
sion de la N-cc-benzoyl-arginine-/l-naphtylamide, lib&e
peut
en effet former De
&tre mesuree
de mesurer un derive facon
plus simplement
la fluorescence
diazo
analogue
leucine-aminopeptidase Dans serum
le present
et l’urine
de l’ordre travail,
humains
avec,
de 10-l~
nous
avons
comme
ci-dessusB.
11 suffit
ce qui Cvite la necessite d’environ
de nous,
GREENBERG,
substrat,
par scis-
de p-naphtylamine
la sensibilite
et independamment comme
de la trypsine
que dans les methodes
de la ,&naphtylamine,
et, de plus, augmente
phenylalanyl-p-naphtylamide
au dosage
que la quantite
a pu mesurer
deux
de
cents fois.
employant
des concentrations
la de
M ‘. dose
substrat,
la leucine-amino-peptidase
dans
le
la leucyl-p-naphtylamide.
Clin. Chim. Acta, g (x96.4 448-453
LEUCINE-AMINOPEPTIDASE DANSLES LIQUIDES BIOLOGIQUES
449
METHODES Rt!actifs
(I) Tamfion phosphate pH 7.2 14.4 g de K,HPO, puriss. + 3.1 g de KH,PO,, selon S~~RENSEN(Merck) + H,O bid&ill&e ad IOOOml. (2) Solution stock de /?-naphtylamine A IOO pug/ml dans du methanol puriss. Stable une semaine dans un flacon brun a + 4”. (3) Solution standard ri I ,ug/ml de /?-naphtylamine Diluer IOO fois la solution stock No. 2 avec le tampon phosphate No.I. (4) Solution de substrat tampon&e 20 mg de chlorhydrate de I-leucyl$-naphtylamide puriss. (Fluka, Buchs S.G., Suisse) sont places dans un ballon jaugit de IOO ml et dissous avec 2.5 ml d’eau bidistillee. Completer a IOO ml avec le tampon phosphate No. I. Instruments
Les dosages dans le serum ont CtCeffectues avec un spectrophotometre Beckman DU muni d’un photomultiplicateur et des accessoires de fluorescence (No. 2980). Filtre d’entree: Corning 5860; filtre secondaire: Corning 3389; lampe au tungstene; ouverture du diaphragme monte sur le boitier de la lampe: IO mm. Pour les dosages dans l’urine, nous avons utilise un spectrofluorimetre Zeiss a deux monochromateurs ZFM 4 C avec lampe au xenon LX 501. Les longueurs d’onde d’excitation et de fluorescence Ctaient respectivement de 338 nm et de 410nm et l’ouverture des deux fentes de 1.2 mm. Quelques essais ont en outre CtC faits avec un fluorimbtre Photovolt modele 540 equip6 comme suit: lampe a vapeur de mercure (No. cat. 4251) ; filtre a interference 334 nm pour la lumiitre excitratrice; filtre a interference variable (spectrum scanner) rCglC sur 410 nm pour la lumiere de fluorescence. Le volume des Cchantillons de serum et d’urine (IO ~1) est mesure avec une ultramicropipette de Sanz (Beckman/Spinco). Dosage de la leucine-aminopeptidase
Mettre 4 ml de solution 4 (substrat-tampon) dans une Cprouvette et laisser 5 min ou plus au bain-marie a 37”. Ajouter IO ~1 de serum ou d’urine et mesurer la fluorescence aprb exactement 30 min d’incubation a 37”. Le zero est rCglC avec une cuvette contenant le reactif I (tampon phosphate). Pour chaque Cchantillon, faire un blanc de serum en remplacant la solution 4 par la solution I (tampon sans substrat). Dans chaque serie d’analyses, inclure un blanc de reactifs (4 ml de solution 4 + IO ~1 d’eau). Ces blancs sont incubb de la m&me man&e que les Cchantillons inconnus. Les intensites de fluorescence mesurees seront rapportees dans le calcul a celle du standard (solution 3). La quantite d’enzyme est exprimee en unites enzymatiques internationales. Une unite internationale (U.i.) est la quantite qui catalyse I’hydrolyse d’une pmole de substrat (et par consequent la formation d’une ,.umole de B-naphtylamine) par min.
C&n. Chim.
Acta, g (1964)
448-453
M. ROTH
4%
ContrGle de la reproductibilite’, T&edosage effectue dix fois sur un m&me Cchantillon de serum normal a dorm& une valeur moyenne de 38.7 U.i. /I r$l:0.8 U.i. /l de deviation standard (soit 2.17’ du resultat). Blams. Les valeurs de fluorescence des blancs de &rum et des blancs de reactifs (qui font toutes deux soustraites du resultat brut pour le calcul de la teneur en leucineaminopeptidase) sont suffisamment faibles pour ne pas g6ner le dosage chez les sujets normaux. Les blancs de serum foumissent des valeurs de l’ordre de I B 5 U.i. par litre. Valets ~~o~~a~e~.La leucine-~inopeptidase a &ii do&e dans le serum de 86 sujets normaux (donneurs du Centre de Transfusion ou personnel du laboratoire), soit 46 hommes et 40 femmes. Pour les hommes, nous avons trouve une moyenne de 30.6 U.i./l avec une deviation standard de & 5.5 et pour les femmes 25.1 U.i./l -& 4.3. Les zones de valeurs normales delimit&es par X f 2S sont done: hommes ‘9.7-4X.5 femmes 16.5-33.7
U.i.jl L’.i./l
Ces valeurs ne different guere de celles trouvees par d’autres auteurs avec des methodes par photometric d’absorption 4~5. Dosage chez des naiades. La methode a CtC essayee chez une serie de malades de I’HGpital atteints d’affections diverses. A titre d’exemple, les valeurs obtenues chez 25 patients sont reproduites avec le diagnostic clinique dans les Tableaux I et II*. Dosages duns I’urine Blancs et ~e~~od~ct~~~~~t~. L’intCret du dosage de la leucine-aminopeptidase dans l’urine a et& releve notamment par GOLDBARG ET RUTENBURG~ Afin deliminer des chromogenes de l’urine qui interferent dans le dosage par photometric d’absorption, ces auteurs pro&dent ti une dialyse prealable de l’urine. Dans une sirie d’essais preliminaires, nous avons applique la methode fluorimetrique d&rite plus haut pour le serum a des Cchantillons d’urine non dialysee, l’appareil de mesure Ctant le spectrophotometre Beckman DU muni de son complement de fluorescence No. 2980. Nous awns constate que la fluorescence des blancs d’urine Ctait relativement Clevcie et, de plus, assez variable d’une urine a l’autre. Dans certains cas, la fluorescence due an blanc depassait celle de la ~-naphtylamine liberee. Nous avons alors continue nos essais en conservant la methode utilisee pour le serum mais en employant en place du fluorimetre a frltres un spectrofluorimetre a deux monochromateurs {Zeiss). Les bngueurs d’onde d’activation et de fluorescence sont ajustees aux valeurs optimales de la ~~naphtylamine, soit respectivement 338 et 410 nm. Dans ces conditions, la majeure partie de la fluorescence propre de l’urine est Climinee et les blancs d’urine donnent des valeurs de l’ordre de I g 4 U.i. par litre. Un test de reproductibilite effectue sur une urine d’homme normal a donne pour dix dosages une valeur de leucine-aminopeptidase moyenne de 5.07 U.i./l avec une deviation standard de & 0.32 U.i./l. On peut ainsi doser la leucine-aminopeptidase urinaire en routine sans avoir besoin de dialyser l’urine. * Nous remercicms le Dr A.
cantonal
Chef de clinique, Clinique m6dicale de l’tiapital hien voulu nous communiquer le diagnostic des malades
CRUCHAUD,
(Prof. G. BICKEL), d’avoir mentionnCsdans ce travail.
C&L (‘hiw. .4&2, 9 (1964) 448-453
LEUCINE-AMINOPEPTIDASE
11 n’est toutefois pas les dosages dans l’urine. obtenu des blancs d’urine Valeurs normales. La
DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES
indispensable d’employer un spectrophotofluorimetre pour Avec le fluorimetre Photovolt modele 540, nous avons suffisamment faibles. leucine-aminopeptidase a CtCdosee dans l’urine de 24 h de TABLEAU
MALADEs AYANT
451
PRfSENTk
UN
TAUX
NORMAL
I DE
LEUCINE-AMINOPEPTIDASE
SkRIQUE
LeucineDiagnostic
Patient L.P. R.W. O.Z. X.W. L.R. C.B. A.M. M.B. E.H. C.V. L.T.
$! 8 3 J Q Q Q Q 6 6 Q
E.J. Q
TABLEAU LEUCINE-AMINOPEPTIDASE
E.S. R.T. H.F. P.C. A.R.
8
s (3 8
J.P. Q
A.S. F.M. A.V. C.B. R.V. A.M. R.C.
Q $ 3 6 9 2 $?
28.3 354 33.3 35.5 17.4 25.1 26.9 39.8 25.3 35.8 33.4
hepatite infectieuse cirrhose post-hdpatique ictus, art&ioscldrose dyskinesie biliaire, ndoplasme rectal histioreticulose maligne infarctus myocardique hypertension, insuffisance cardiaque depression, insuffisance coronarienne angine de poitrine neoplasme bronchique thrombose cbebrale, diabete leger neoplasme du sein
MALADES
Patient
aminopeptidase lJ.i./l
AYANT
PRhSENTh StRlQUE
27.2
II UN
TAUX
SUPkRlEUR
DE
A
LA
NORMALE
Leucineaminopeptidase lJ.i.11
Diagnostic
alcoolisme, steatose hepatique neoplasme gynecologique, metastases hepatiq neoplasme hepatique cholecystite lithiasique cirrhose ascitogene, hyperaldosteronisme hepatite anicterique pancreatite subaigue, lithiase vesiculaire neoplasme pulmonaire avec metastases infarctus myocardique, hyperlipemie insuffisance cardiaque, embolies pulmonaires cardiopathie arteriosclereuse periarterite noueuse insuffisance cardiaque. stase hepatique
102.0 ues
129.5 125.2 100.5 71.4 82.3 68.8 74.4 116.4 70.1 64.1 71.5 44-6
treize sujets normaux, soit six hommes et sept femmes. L’analyse statistique des rCsultats fournit les valeurs suivantes: Hommes, moyenne 4.1 U.i./24 h; deviation standard & 1.0 U.i./z4 h, valeurs normales 2.1-6.1 U.i./z4 h. Femmes, moyenne 2.6 U.i./24 h; deviation standard f 0.5 U.i./z4 h, valeurs normales 1.5-X.7 U.i./24 h. Ces valeurs sont en accord avec celles donnees par GOLDBARG ET RUTENBURG~ qui, dans un groupe beaucoup plus important de sujets normaux, trouvent une moyenne de 4.8 U.i./z4 h pour les hommes et de 2.5 U.i./z4 h pour les femmes. Dosage chez les malades. A titre d’exemple, nous donnons dans le Tableau III les Clin. Chim. Acta, 9 (1964) 448-453
M. ROTH
452
taux d’excretion urinaire de leucine-aminopeptidase onze malades.
en 24 h qui ont CtCtrouves chez
Dosage dans le lip&de duodkal
La technique d&rite pour le serum est Cgalement applicable au dosage dans le liquide duodenal. fitant don& la grande dilution de l’echantillon dans la solution a mesurer, des quantites meme importantes de pigments biliaires ne g&rent pas la determination. TABLEAU EXCRdTION
URINAIRE
DE
D’AFFECTIONS
Patients R.C. P.H. G.M. F.O. M.B. J.P. M.G. L.G. R.C. R.A. R.V.
3 3 $ d ? 9’ $? 9 ?* ? $?*
III
LEUCINE-AMINOPEPTIDASE
CHEZ
ONZE
PATIENTS
ATTEINTS
DIVERSES
Leucineaminopeptidase u.i./24 h
Diagnostic alcoolisme chronique colique nephretique neoplasme pulmonaire infarctus myocardique insuffisance coronaire hepatite anicterique insuffisance cardiaque, oedeme pulmonaire Bpanchement pleural hemorrhagique insuffisance cardiaque, stase hepatique cirrhose ascitogene cardiopathie arteriosclereuse
* Malades egalement mention& la m&me semaine.
2.9 7.1 7.2 21.1 4.2 5.1 7.4 7.5 9.2 12.5 18.8
aigu
dans le Tableau II; le dosage dans le serum a et6 effectue
CONCLUSION
La technique de dosage fluorimetrique de la leucine-aminopeptidase d&rite dans ce travail presente l’avantage d’&tre t&s simple, et tout laboratoire disposant d’un fluorimctre adequat est a mCme de l’effectuer en grande serie. Le gain de temps par rapport aux methodes reposant sur la formation d’un derive diazo est particulikement appreciable pour le dosage dans l’urine, puisqu’il n’est pas necessaire de dialyser celle-ci. REMERCIEMENTS Nous d&irons remercier ici Mlle URSULA Loos, dont la collaboration nous a CtC precieuse, ainsi que M. le Professeur DENYS MONNIER, qui a aimablement mis a notre disposition un spectrofluorimetre Zeiss. Nos remerciements s’adressent en outre au Fonds National Suisse de la Recherche Scientifique, grace auquel une partie de ce travail a Cte realisee. RESUME
Une technique de dosage fluorimetrique de la leucine-aminopeptidase dans le serum, l’urine et le liquide duodenal est decrite. La solution a doser (IO ~1) est incubee ?r 37” en presence d’une solution de I-leucyl-,8-naphtylamide de PH 7.2. Apres exacteC2in.Chim.Acta,
g (1964) 448-453
LEUCINE-AMINOPEPTIDASE DANSLES LIQUIDES BIOLOGIQUES
453
ment 30 min, on mesure directement sur le milieu d’incubation la fluorescence de la @-naphtylamine form&e. Cette methode, qui se distingue par sa simplicite, permet d’effectuer des dosages en grande s&e. Le dosage dans l’urine ne necessite pas de dialyse prealable de l’echantillon. Les valeurs normales (X f 2.9 sont les suivantes: serum homme: 19.7-41.5 U.i./l; urine homme: 2.1-6.1 U.i./24 h; serum femme : 16.5-33.7 U.i./l; urine femme: 1.5-3.7 U.i./24 h. BIBLIOGRAPHIE 1 M. N. GREEN, K. Tsou, R. BRESSLER ET A. M. SELIGMAN, Arch. Biochem. Biophys., 57 (1955) 458. 2 J. E. FOLK ET M. S. BURSTONE, Proc. Sot. Exptl. Biol. Med., 8g (1955) 473.
3 0. BRAUN-FALCO ET K. SAFFELD, Arch. Klin. Exptl. Dermatol., 204 (1957) 407. 4 U. A. GOLDBARGETA.M.RUTENBURG,C~~~~~, II (Ig58)283. 5 H. SCHBN, B. RKSSLER ET H. J. WEYERGRAF,~.Klin.Chem., I (1963) 73. B M. ROTH, Clin.Chim. Acta, 8 (1963) 574. 7 L. J. GREENBERG, Biochem.Biophys. Research Communs., g (1962) 430.
Clin. Chim. Acta, g (19641 448-453
448
CHIMICA ACT.4
UNE ULTRAMICRO-METHODE FLUORIMGTRIQUE POUR LE DOSAGE DE LA LEUCINE-AMINOPEPTIDASE DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES MARC
ROTH
Laboratoire central, HBpital cantonal, Gendue (Suisse) (Rep
le 25 juillet 1963)
SUMMARY A FLUOROMETRIC
ULTRA-MICRO
METHOD FOR THE DETERMINATION
AMINOPEPTIDASE A fluorometric juice
assay
is described.
A
of leucine
IO ~1 sample
I-leucyl+?-naphthylamide p-naphthylamine The
for the assay The male
is measured simple
directly
and permits
urine
30 min,
duodenal
the fluorescence
in the incubation
routine
and
of a solution
work.
No
of
of the
mixture. dialysis
is necessary
of urine samples.
following
serum:
female
is very
in serum,
at 37O in presence
exactly
OF LEUCINE
FLUIDS
aminopeptidase is incubated
of pH 7.2. After
produced
method
IN BIOLOGICAL
normal
19.7-41.5
serum
values
I.U./l;
16.5-33.7
were
male
I.U./l;
found:
urine:
female
2.1-6.1
urine
I.U./24
1.5-3.7
h;
I.U./24
h.
INTRODUCTION
et al.‘, puis d’autres
GREEN naphtylamide
comme
lyse de ce substrat un colorant utilisi:
fournit
azoique
dans
substrat
decrit a partir
par photometric
d’autres
proteases
l’utilisation
de
la leucyl-/?-
de la leucine-aminopeptidase.
de la B-naphtylamine,
mesurable
le dosage
ont
auteurs2-5
pour le dosage
de laquelle
d’absorption.
scindant
des
L’hydro-
on peut
former
Le mCme principe
derives
N-acyles
est
de la B-
naphtylamine. Nous
avons
montre
dans un travail
consacre
sion de la N-cc-benzoyl-arginine-/l-naphtylamide, lib&e
peut
en effet former De
&tre mesuree
de mesurer un derive facon
plus simplement
la fluorescence
diazo
analogue
leucine-aminopeptidase Dans serum
le present
et l’urine
de l’ordre travail,
humains
avec,
de 10-l~
nous
avons
comme
ci-dessusB.
11 suffit
ce qui Cvite la necessite d’environ
de nous,
GREENBERG,
substrat,
par scis-
de p-naphtylamine
la sensibilite
et independamment comme
de la trypsine
que dans les methodes
de la ,&naphtylamine,
et, de plus, augmente
phenylalanyl-p-naphtylamide
au dosage
que la quantite
a pu mesurer
deux
de
cents fois.
employant
des concentrations
la de
M ‘. dose
substrat,
la leucine-amino-peptidase
dans
le
la leucyl-p-naphtylamide.
Clin. Chim. Acta, g (x96.4 448-453
LEUCINE-AMINOPEPTIDASE DANSLES LIQUIDES BIOLOGIQUES
449
METHODES Rt!actifs
(I) Tamfion phosphate pH 7.2 14.4 g de K,HPO, puriss. + 3.1 g de KH,PO,, selon S~~RENSEN(Merck) + H,O bid&ill&e ad IOOOml. (2) Solution stock de /?-naphtylamine A IOO pug/ml dans du methanol puriss. Stable une semaine dans un flacon brun a + 4”. (3) Solution standard ri I ,ug/ml de /?-naphtylamine Diluer IOO fois la solution stock No. 2 avec le tampon phosphate No.I. (4) Solution de substrat tampon&e 20 mg de chlorhydrate de I-leucyl$-naphtylamide puriss. (Fluka, Buchs S.G., Suisse) sont places dans un ballon jaugit de IOO ml et dissous avec 2.5 ml d’eau bidistillee. Completer a IOO ml avec le tampon phosphate No. I. Instruments
Les dosages dans le serum ont CtCeffectues avec un spectrophotometre Beckman DU muni d’un photomultiplicateur et des accessoires de fluorescence (No. 2980). Filtre d’entree: Corning 5860; filtre secondaire: Corning 3389; lampe au tungstene; ouverture du diaphragme monte sur le boitier de la lampe: IO mm. Pour les dosages dans l’urine, nous avons utilise un spectrofluorimetre Zeiss a deux monochromateurs ZFM 4 C avec lampe au xenon LX 501. Les longueurs d’onde d’excitation et de fluorescence Ctaient respectivement de 338 nm et de 410nm et l’ouverture des deux fentes de 1.2 mm. Quelques essais ont en outre CtC faits avec un fluorimbtre Photovolt modele 540 equip6 comme suit: lampe a vapeur de mercure (No. cat. 4251) ; filtre a interference 334 nm pour la lumiitre excitratrice; filtre a interference variable (spectrum scanner) rCglC sur 410 nm pour la lumiere de fluorescence. Le volume des Cchantillons de serum et d’urine (IO ~1) est mesure avec une ultramicropipette de Sanz (Beckman/Spinco). Dosage de la leucine-aminopeptidase
Mettre 4 ml de solution 4 (substrat-tampon) dans une Cprouvette et laisser 5 min ou plus au bain-marie a 37”. Ajouter IO ~1 de serum ou d’urine et mesurer la fluorescence aprb exactement 30 min d’incubation a 37”. Le zero est rCglC avec une cuvette contenant le reactif I (tampon phosphate). Pour chaque Cchantillon, faire un blanc de serum en remplacant la solution 4 par la solution I (tampon sans substrat). Dans chaque serie d’analyses, inclure un blanc de reactifs (4 ml de solution 4 + IO ~1 d’eau). Ces blancs sont incubb de la m&me man&e que les Cchantillons inconnus. Les intensites de fluorescence mesurees seront rapportees dans le calcul a celle du standard (solution 3). La quantite d’enzyme est exprimee en unites enzymatiques internationales. Une unite internationale (U.i.) est la quantite qui catalyse I’hydrolyse d’une pmole de substrat (et par consequent la formation d’une ,.umole de B-naphtylamine) par min.
C&n. Chim.
Acta, g (1964)
448-453
M. ROTH
4%
ContrGle de la reproductibilite’, T&edosage effectue dix fois sur un m&me Cchantillon de serum normal a dorm& une valeur moyenne de 38.7 U.i. /I r$l:0.8 U.i. /l de deviation standard (soit 2.17’ du resultat). Blams. Les valeurs de fluorescence des blancs de &rum et des blancs de reactifs (qui font toutes deux soustraites du resultat brut pour le calcul de la teneur en leucineaminopeptidase) sont suffisamment faibles pour ne pas g6ner le dosage chez les sujets normaux. Les blancs de serum foumissent des valeurs de l’ordre de I B 5 U.i. par litre. Valets ~~o~~a~e~.La leucine-~inopeptidase a &ii do&e dans le serum de 86 sujets normaux (donneurs du Centre de Transfusion ou personnel du laboratoire), soit 46 hommes et 40 femmes. Pour les hommes, nous avons trouve une moyenne de 30.6 U.i./l avec une deviation standard de & 5.5 et pour les femmes 25.1 U.i./l -& 4.3. Les zones de valeurs normales delimit&es par X f 2S sont done: hommes ‘9.7-4X.5 femmes 16.5-33.7
U.i.jl L’.i./l
Ces valeurs ne different guere de celles trouvees par d’autres auteurs avec des methodes par photometric d’absorption 4~5. Dosage chez des naiades. La methode a CtC essayee chez une serie de malades de I’HGpital atteints d’affections diverses. A titre d’exemple, les valeurs obtenues chez 25 patients sont reproduites avec le diagnostic clinique dans les Tableaux I et II*. Dosages duns I’urine Blancs et ~e~~od~ct~~~~~t~. L’intCret du dosage de la leucine-aminopeptidase dans l’urine a et& releve notamment par GOLDBARG ET RUTENBURG~ Afin deliminer des chromogenes de l’urine qui interferent dans le dosage par photometric d’absorption, ces auteurs pro&dent ti une dialyse prealable de l’urine. Dans une sirie d’essais preliminaires, nous avons applique la methode fluorimetrique d&rite plus haut pour le serum a des Cchantillons d’urine non dialysee, l’appareil de mesure Ctant le spectrophotometre Beckman DU muni de son complement de fluorescence No. 2980. Nous awns constate que la fluorescence des blancs d’urine Ctait relativement Clevcie et, de plus, assez variable d’une urine a l’autre. Dans certains cas, la fluorescence due an blanc depassait celle de la ~-naphtylamine liberee. Nous avons alors continue nos essais en conservant la methode utilisee pour le serum mais en employant en place du fluorimetre a frltres un spectrofluorimetre a deux monochromateurs {Zeiss). Les bngueurs d’onde d’activation et de fluorescence sont ajustees aux valeurs optimales de la ~~naphtylamine, soit respectivement 338 et 410 nm. Dans ces conditions, la majeure partie de la fluorescence propre de l’urine est Climinee et les blancs d’urine donnent des valeurs de l’ordre de I g 4 U.i. par litre. Un test de reproductibilite effectue sur une urine d’homme normal a donne pour dix dosages une valeur de leucine-aminopeptidase moyenne de 5.07 U.i./l avec une deviation standard de & 0.32 U.i./l. On peut ainsi doser la leucine-aminopeptidase urinaire en routine sans avoir besoin de dialyser l’urine. * Nous remercicms le Dr A.
cantonal
Chef de clinique, Clinique m6dicale de l’tiapital hien voulu nous communiquer le diagnostic des malades
CRUCHAUD,
(Prof. G. BICKEL), d’avoir mentionnCsdans ce travail.
C&L (‘hiw. .4&2, 9 (1964) 448-453
LEUCINE-AMINOPEPTIDASE
11 n’est toutefois pas les dosages dans l’urine. obtenu des blancs d’urine Valeurs normales. La
DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES
indispensable d’employer un spectrophotofluorimetre pour Avec le fluorimetre Photovolt modele 540, nous avons suffisamment faibles. leucine-aminopeptidase a CtCdosee dans l’urine de 24 h de TABLEAU
MALADEs AYANT
451
PRfSENTk
UN
TAUX
NORMAL
I DE
LEUCINE-AMINOPEPTIDASE
SkRIQUE
LeucineDiagnostic
Patient L.P. R.W. O.Z. X.W. L.R. C.B. A.M. M.B. E.H. C.V. L.T.
$! 8 3 J Q Q Q Q 6 6 Q
E.J. Q
TABLEAU LEUCINE-AMINOPEPTIDASE
E.S. R.T. H.F. P.C. A.R.
8
s (3 8
J.P. Q
A.S. F.M. A.V. C.B. R.V. A.M. R.C.
Q $ 3 6 9 2 $?
28.3 354 33.3 35.5 17.4 25.1 26.9 39.8 25.3 35.8 33.4
hepatite infectieuse cirrhose post-hdpatique ictus, art&ioscldrose dyskinesie biliaire, ndoplasme rectal histioreticulose maligne infarctus myocardique hypertension, insuffisance cardiaque depression, insuffisance coronarienne angine de poitrine neoplasme bronchique thrombose cbebrale, diabete leger neoplasme du sein
MALADES
Patient
aminopeptidase lJ.i./l
AYANT
PRhSENTh StRlQUE
27.2
II UN
TAUX
SUPkRlEUR
DE
A
LA
NORMALE
Leucineaminopeptidase lJ.i.11
Diagnostic
alcoolisme, steatose hepatique neoplasme gynecologique, metastases hepatiq neoplasme hepatique cholecystite lithiasique cirrhose ascitogene, hyperaldosteronisme hepatite anicterique pancreatite subaigue, lithiase vesiculaire neoplasme pulmonaire avec metastases infarctus myocardique, hyperlipemie insuffisance cardiaque, embolies pulmonaires cardiopathie arteriosclereuse periarterite noueuse insuffisance cardiaque. stase hepatique
102.0 ues
129.5 125.2 100.5 71.4 82.3 68.8 74.4 116.4 70.1 64.1 71.5 44-6
treize sujets normaux, soit six hommes et sept femmes. L’analyse statistique des rCsultats fournit les valeurs suivantes: Hommes, moyenne 4.1 U.i./24 h; deviation standard & 1.0 U.i./z4 h, valeurs normales 2.1-6.1 U.i./z4 h. Femmes, moyenne 2.6 U.i./24 h; deviation standard f 0.5 U.i./z4 h, valeurs normales 1.5-X.7 U.i./24 h. Ces valeurs sont en accord avec celles donnees par GOLDBARG ET RUTENBURG~ qui, dans un groupe beaucoup plus important de sujets normaux, trouvent une moyenne de 4.8 U.i./z4 h pour les hommes et de 2.5 U.i./z4 h pour les femmes. Dosage chez les malades. A titre d’exemple, nous donnons dans le Tableau III les Clin. Chim. Acta, 9 (1964) 448-453
M. ROTH
452
taux d’excretion urinaire de leucine-aminopeptidase onze malades.
en 24 h qui ont CtCtrouves chez
Dosage dans le lip&de duodkal
La technique d&rite pour le serum est Cgalement applicable au dosage dans le liquide duodenal. fitant don& la grande dilution de l’echantillon dans la solution a mesurer, des quantites meme importantes de pigments biliaires ne g&rent pas la determination. TABLEAU EXCRdTION
URINAIRE
DE
D’AFFECTIONS
Patients R.C. P.H. G.M. F.O. M.B. J.P. M.G. L.G. R.C. R.A. R.V.
3 3 $ d ? 9’ $? 9 ?* ? $?*
III
LEUCINE-AMINOPEPTIDASE
CHEZ
ONZE
PATIENTS
ATTEINTS
DIVERSES
Leucineaminopeptidase u.i./24 h
Diagnostic alcoolisme chronique colique nephretique neoplasme pulmonaire infarctus myocardique insuffisance coronaire hepatite anicterique insuffisance cardiaque, oedeme pulmonaire Bpanchement pleural hemorrhagique insuffisance cardiaque, stase hepatique cirrhose ascitogene cardiopathie arteriosclereuse
* Malades egalement mention& la m&me semaine.
2.9 7.1 7.2 21.1 4.2 5.1 7.4 7.5 9.2 12.5 18.8
aigu
dans le Tableau II; le dosage dans le serum a et6 effectue
CONCLUSION
La technique de dosage fluorimetrique de la leucine-aminopeptidase d&rite dans ce travail presente l’avantage d’&tre t&s simple, et tout laboratoire disposant d’un fluorimctre adequat est a mCme de l’effectuer en grande serie. Le gain de temps par rapport aux methodes reposant sur la formation d’un derive diazo est particulikement appreciable pour le dosage dans l’urine, puisqu’il n’est pas necessaire de dialyser celle-ci. REMERCIEMENTS Nous d&irons remercier ici Mlle URSULA Loos, dont la collaboration nous a CtC precieuse, ainsi que M. le Professeur DENYS MONNIER, qui a aimablement mis a notre disposition un spectrofluorimetre Zeiss. Nos remerciements s’adressent en outre au Fonds National Suisse de la Recherche Scientifique, grace auquel une partie de ce travail a Cte realisee. RESUME
Une technique de dosage fluorimetrique de la leucine-aminopeptidase dans le serum, l’urine et le liquide duodenal est decrite. La solution a doser (IO ~1) est incubee ?r 37” en presence d’une solution de I-leucyl-,8-naphtylamide de PH 7.2. Apres exacteC2in.Chim.Acta,
g (1964) 448-453
LEUCINE-AMINOPEPTIDASE DANSLES LIQUIDES BIOLOGIQUES
453
ment 30 min, on mesure directement sur le milieu d’incubation la fluorescence de la @-naphtylamine form&e. Cette methode, qui se distingue par sa simplicite, permet d’effectuer des dosages en grande s&e. Le dosage dans l’urine ne necessite pas de dialyse prealable de l’echantillon. Les valeurs normales (X f 2.9 sont les suivantes: serum homme: 19.7-41.5 U.i./l; urine homme: 2.1-6.1 U.i./24 h; serum femme : 16.5-33.7 U.i./l; urine femme: 1.5-3.7 U.i./24 h. BIBLIOGRAPHIE 1 M. N. GREEN, K. Tsou, R. BRESSLER ET A. M. SELIGMAN, Arch. Biochem. Biophys., 57 (1955) 458. 2 J. E. FOLK ET M. S. BURSTONE, Proc. Sot. Exptl. Biol. Med., 8g (1955) 473.
3 0. BRAUN-FALCO ET K. SAFFELD, Arch. Klin. Exptl. Dermatol., 204 (1957) 407. 4 U. A. GOLDBARGETA.M.RUTENBURG,C~~~~~, II (Ig58)283. 5 H. SCHBN, B. RKSSLER ET H. J. WEYERGRAF,~.Klin.Chem., I (1963) 73. B M. ROTH, Clin.Chim. Acta, 8 (1963) 574. 7 L. J. GREENBERG, Biochem.Biophys. Research Communs., g (1962) 430.
Clin. Chim. Acta, g (19641 448-453