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Les réactions de caractérisation des constituants des liquides biologiques après électrophorèse en gélose
VOL.
CLINICA CHIMICA ACTA
3 (1958)
I7
LES Rl?ACTIONS DE CARACTERISATION DES CONSTITUANTS DES LIQUIDES BIOLOGIQUES APRI?S BLECTR~~H~RBSE EN GELOSE par JOSI? UHIEL* Service de Chimie Micvobienne, Institut
Pa.steur, Pa.&
(France)
Les efforts rCa.lisCspendant ces vingt dernieres annees pour le developpement
des
methodes d’etude des melanges des proteines ont CtC trb nombreux, et ils ont abouti a des reuussitesincontestables comme celle de l’electrophorese; laquelle est devenue, grke a la mise au point par Tiselius d’une methode directement applicable produits biologiques un instrument de recherche d’utilisation g&kale.
a des
Mais, malgre 1’interCt et le vaste domaine des applications de cette methode de recherche, l’experience
a montre que les donnees Clectrophoretiques,
suflisantes comme seules criteres pour Ctablir l’identite
sont tres in-
dune proteine ou l’homoge-
n&t6 dune preparation. D’autre part, l’accord des resultats fournis par l’electrophorese et par d’autres methodes, s’avere souvent difficile et parfois inutile ou vain. Pour cela, l’idee de GRARAR ET WILLIAMS de combiner dans la mCme experience une separation Clectrophoretique dun melange des constituants avec des reactions immunochimiques represente un incontestable progres. C’est aussi un premier pasvers une coordination rationelle de methodes ayant des principes tres differents et faisant appel a des proprietes distinctes dun mCme constituant. Notre propre travail dans ce domaine s’est orient6 vers le developpement techniques de caractCrisation des constituants
des liquides biologiques
des
apres leur
analyse immunoClectrophorCtique, afin de pouvoir realiser dans la mCme sCrie d’experiences la triple caracterisation dun constituant, par sa mobilit electrophoretique, son immunospCcifitC et sa structure ou sa nature chimique. Parallelement,
ces techni-
ques ont CtC appliquees a des constituants soumis seulement a une separation Clectrophoretique en gelose. L’exposC que je vais vous faire, traite des principes gCnCraux d’utilisation de ces procedes de caracterisation chimique et des modalites d’application selon les conditions particulieres de travail et selon les structures ou les fonctions qu’on veut mettre en evidence dans les differents composants en etude. Quelques unes de ces techniques ont CtC deja rCalisCes avec sucds dans l’electrophorese sur papier, mais nous avons l’avantage d’avoir affaire a un support de migration, la gelose, qui se p&e particulierement bien a ce genre de travail. A notre avis, elle presente des possibilites d’application beaucoup plus nombreuses que la plupart des supports utilises jusqu’a present en Clectrophorese de zone. I. L’RLECTROPHORRSEET L’IMMUNOJ?LECTROPHOR$SE L’emploi
de la gelose comme support de migration date du debut du siecle, mais
* Attach6 de Recherches au Centre National de la Recherche Scientifique. Bibliographic p. a~
~‘1%ii’c*st (~u’t~i It~.p) 111it’ (A ‘i1’(:1;1horation dr ccttv m6tliotlt~ lx tcchnit]w d’t:lrctrol,liori,s~, siniplt~ t’ii niilicu g:l?ilit: in ~:tc: prCcist+. (“cst ainsi tpi’tw collalxnxtion ;L\‘c’c.I. .J_ St~iIli~i)i~(;(;l~i~I, wus a\‘0113 inis ;IIL . point un proc&lC tk sGch;~p~ clcs plac~ws dv ~%JSC~ ;li2nt scr\it5 it tks st:lxtr;tt iwls c:lectrophor~ticlii~~s simplt5 011 il I’immrinot~l~ctro~l~or~~s~~; proctklC (liii 2 btb It. point (II* &part d’une s&-it>dc tt~rhnitlws cl18coloration, t~iit’ nous iivons tlCjii clt%ritt5 :. Simultanbmcwt ctt iiitl~~)~~n~lanini~~it dc IIOIIS, I3~-sswr~ Ii ;I c5plort: ~lut4tlw:’ aspects dcx I’~lrctropliori~sc~ simplc~ 1’11gi.losc~. notanimtwt Irs pht~nomi~ncs d’t:lcctroosmow et d’tkyoration dans Ita #cl, iat introduit tliwltliws modifications mintwx5 dans Ic dispositif dc (;ILw.\I< IX \\‘II.I.IAM. Plus rkrmcnt, J. .I. St-IIlillwt;c~l~l, ’ 7 a t%borit iino intcwsssntt~ mOtlwtk~ tk microimmuno~lectropht~r~~st~, ct \\‘IICNI: unc ultra-microtc~chnit~~lt! cl’t:lcctrophori,sc simplt: en gCloscx. Ik son chtt:, (;IHI I’a clkrit nussi unc tc7Alnitlue tlui n’apportc rit:n tl’css~ntic1 au prodd6 original dc (;OHI)OS. IA technique d’~lectrol)llori~sc cn gt!lose de (;ICUAII IX M’II.I.IANS est simplts cbt comportc d’cssenticl la pr+ration de la gPlosc et des plaques dc migration. IA g6low. h une concentration de I I .5 ‘I,, dans lc tampon ctioisi, g&Cralcmcnt cn tampon vProna1 sodique (p. :..- 0.03, pH S.L~),est fondur justtb avant son tqki et cor11Cesur des plaques de verre I’t”‘togral’hitll’r cn quantitt: suffisantc: pour 1~1avoir uw Ppaisseur de 3 A 4 mm. Iks Ixuidc~s de papicr filtrc, rccouwrtc:s elks aussi tic gPlost1, scrvtmt de connection aus \~nst.s-~It~ctrodcs. !$and Ic gel cst forms’. on pratitlw r‘~I’aidr d’un emporte-pikes. un petit rkcr\wir pour y mcttw Ir produit in nnalysrr. I
L~iblit~~mphis p. 1.1
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RRACTIONS DE CARACTRRISATION
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La suite des operations, une fois la migration Clectrophoretique terminee, est representee dans le Fig. I. La partie droite du schema comporte les operations desti&es a une etude par immunoelectrophorese. La partie gauche, celle pour la realisation d’une analyse Clectrophoretique simple. Nous Ctudierons brievement la signification et les modalites d’utilisation de ces differentes Ctapes operatoires. En ce qui conceme l’electrophorese simple: (a) La fixation a pour but d’immobiliser sur place les differents constituants SCpares lors de leur migration Clectrophoretique. On peut utiliser une grande variCtC de
Reactions de Coroctcrisation
El&tmphorLse
Immune-ilectrophorisc
simple
Fig. I.
fixateurs dans des solvants aqueux ou organiques. Dans chaque cas, le choix dun fixateur doit Ctre en rapport avec la nature des composants qu’on veut precipiter. et, de plus, ne pas gener les operations ultkrieures. (b) La dessication permet de reduire la couche de gelose (initialement de 4 a 5 mm d’epaisseur) a une mince feuille transparente qu’on peut decoller de la plaque de verre qui lui servait de support; et, parvenir ainsi a la realisation des mesures photometriques et a sa conservation pratiquement indefinie. On effectue la dessication en appliquant une feuille de papier filtre sur la gelose et en mettant les plaques soit a 1’Ctuve h 37 “C soit exposees a un courant d’air. Dans le cas de l’analyse immunoelectrophoretique, la fixation n’est pas n&essake, puisque les complexes specifiques antigene-anticorps qu’on d&Ye par cette methode sont des precipites insolubles; mais il faut laver les plaques pendant trois jours dans le KaClo.15 X, reouvellC une ou deux fois par jour, afin de se debarrasser de l’exces d’antigenes
et d’anticorps
qui n’ont pas reagis.
II. LES RRACTIOSS DE CARACTRRISATION Les conditions
prealables
ques apres Clectrophorese histochimiques, permettre
c’est a dire les produits
une localisation
ou facilement
decelables
exemple. Bibliographic
a l’utilisation
p. -13
des techniques
de caracterisations
chimi-
de zone, sont les memes que celles exigees pour les travaux des reactions
precise des structures par une autre propriM
doivent
&tre insolubles,
atin de
ou des fonctions CtudiCes, et color&, physico-chimique,
radioactivite
par
I)ans Ic cad clc I’~lrctrol~llori~si~ simple (‘11galosh, 1st comma: il tbst montrc: plans 1~’ Fig. r, lcs r&ctions dr carartCrisation pwwnt c’trc appliilnCi5 in tlifickwts stxl~3 ilt. l’ensemble dcs procc%l&s opCratoirc5 1111~’ coniportcc ccttr m~thotli~ I.(* choir du moment lt! plus appropri6 cast i:\idimmiwt conditionnd par la nature nii%ic~ (I(%12 rCnction. Ainsi : (a) Quand les structuws ou lcs fonctions llu’on visiit mcttrr cn AGl~wc~ sont susceptiblcs fl’Ctw alti~rck par lo tiisatcur ou par l’action dc I’osvgiw~ atmosphc~riqw lors de la dcssication. la caract&-isation doit Ctro r&disCc ilnnic:cli:ttc~lnt,l~t :tprCs la migration ~lc!ctrol)tior~ticllli~. ].a plupart cles rAwtions dc caracti~risation tl’cnz~mc5 seront done cffectuk ii cc stadr. (‘cs (lw nous a\~ns fait tlans 1~s cas suivants : dittection dcs groupcmcwts snlfhydriles drs protCinl~s natiws : c%udc tl~ I’acti\*itC cnzymatiquc dc la c~rnloplasmint, : cl+rtion du cuivri~ IiC:aus pr~Gini3 II’. (1,) Quancl lcs risiln~5 signal& dans 1~ lx1ragraph~~ (a) nc’ sont pas +ants pour la caracttirisation, ou iluand ci4lc-ci n’cbst pas rCxlisabli~ (9 miliiw ai~ii~wx, la lisation iIt la dessication des placlu~s sont clw elk-ations prCal;~blcs. 12s tcchniilucs appliiluks ilans ~(5 conditions sont cn gcGii:r;tl plus rapid~~s ilt mains 0nCrcuws. Conimc~ cwmplcs5, nous citcrons : la coloration gt!ncktlc dtas protc%ws (Amidos~tlw;lrz ou lkw tk bromophcnol) cht dcs lipidcs ct IipoprotCinw (soudan noir, oil red 0) ; la caractckisation dlas glycoprot&ws ot tlths act:talptlosphatidl,s; la caractCrisation tic>I’nrtivitC lxwsydasiiliic dcs h6moglobincs; dCtcction du cuivrc lit’! aus protkws. (c) TXS rktions dr wract&isntion pcuvcnt Ctrcl cffcctu&s cmtrc lcs stadrs de fixation ct de dcssication, clnancl wtttb dc~rniiw c,st lc scwl danger ;I craindrc et quand, d’autrr part, la fixation pwt Otrc utik dans nn but dc prkipitation s6lectiw dc c(‘rtains constituants ou d’inhihition rllb ccrtains autws cliii pourrairnt cwtrcr cw corn+ tition avrc cclui cn tituch~. En cc qui conccrnc~ l’immuno~lrctrt~l~ti~~r~st~, IC Iavagi) tat un~’ 0pCration pri:alablc ct nkxwkx! dans tous Its cas. Pour lc rcstc, Its modalitk d’application dcs rtactions caractfristiqucs sont tcs mCmrs CIW cclles dr I’c’kctrophorPsc simple. II faut sculemcnt signaler (lu’on nc doit pas s’attcndw ii dcs rkultats syst~maticlucm~nt p~aralli~lcs cntrcs la rnCk-w rCaction appliilmk in l’&~ctroptioriw simplr cbt A I’analysi~ immuo~lc~ctrophorCticluc d’un constitnant. Et ctbci. par la fait ~IW la txktion immunochimiquc ptwt produirc des changemiwts dans la structurr dcs parties &gissantcs : antigimc-anticorps, soit blocagc dcs groupcbmcnts fonctionrwls ou IibCration dcs groupcments masq~k; soit cmtraincmclnt dw constituants fondamcntaus - lipidrs par cxctnpk provocluant dc nouvclks dispositions :l la surface dcs complescs spCcifiqws. tl'iln;~l~3;c.
Kous avons prC&demment fait rcmarcluer lluc la comparaison des donnks obtenues par 1’6lcctrophorbe ct par d’autrrs mCthodes, s’av&r souvent difficile. Maintenant, nous allons montrer cpc lorsclu’il s’agit de rclier les rlsultats fournis par les m&hodes d’analysc Plectrophor6tique cn gClosr, non seulcment nous nc nous heurtons pas & cette difficult6, mais now cn tirons dcs conclusions nouvelles. Bibliograph it* p. 23
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Un exemple assez demonstratif est celui de la cCruloplasmine *. RCcemment nous en avons fait avec M. GRABAR, sa separation Clectrophoretique et immunoelectrophoretique en &lose, suivie de techniques directes de caracterisation g&kales et spbcitiques. Ces demieres basees sur la detection du cuivre lie &cette proteine et sur l’estimation de son activite enzymatique. Dans le Tableau I sont Gunis les renseignements donnes par les difkentes techniques employees et correspondants respectivement au serum humain normal et a une preparation de cCmloplasmine isolee et purifiee du s&urn par des methodes de precipitation fractionrke. TABLEAU RENSEIGNEMENTS
FOURNIS
PARLES -~
DIFFdRRNTES
Echantillon &did
S&aralion t’lectrophor&iqzleJ
Coloration ge’n&de des pvot&neP
Serum Humain Normal
Electrophor&se simple en gelose
Six fractions de mobilite: Q, alb., ui, az, B et y
Immunoelectrophorbse
Ceruloplasmine
I TECHNIQUES
DE CARACTkRISATION
.-
Coloration spkcifique du cl&we lid am pvott%zeslo -.~_ Reaction du cuivre dans la zone de la serumalbumine et dans celle des a,-globulines
Estimation de l’actioitP de la cevuloplaswineii ActivitC enzymatique dans la zone des a,-globulines
16x8 lignes de precipitation correspondants aux differentes constitutions antigeniques du serum
Une seule ligne de precipitation correspondante a la zone des a2 globulines donne une reaction du cuivre positive
Activite enzymatique decelable dans une ligne de precipitation de la zone des a,-globulines
Electrophor&se simple en g&lose
Une fraction (quantitativement la plus importante) de mobilit czi. Une sous fraction de mobilite a2
Reaction du cuivrc positive dans les deux fractions ; plus intense dans celle de mobilite al
Activite enzymatique dans les 2 fractions mais beaucoup plus intense dans celle de mobilite up
ImmunoBlectrophor&e
Une ligne de precipitation de mobilite a, qui donne une reaction croisee avec une ze ligne de mobilite a1 Unc troisieme ligne de mobilit
Les deux lignes qui donnent une reaction croisee conticnnent du cuivre. La ligne de mobilite a, donne une reaction plus forte que celle de mobilite a2
Activite enzymatique dans les deux lignes cuivre-positives, mais l’intensite est inverse & la proportion de cuivre decele
w%
On peut coordonner les resultats exprimes sCparCmmentdans le Tableau I et les interpreter de la facon suivante : (a) En ce qui conceme le serum humain, la ckuloplasmine montre en &lose, une mobilit az. Elle a CMcar-act&i&e par la detection du cuivre lie a cette proteine et par son activite enzymatique. Le complexe de la cCruloplasmine avec son anticorps spectique ne modifie pas les groupements fonctionnels responsables de ses propriCk%enzyma* La c&uloplasmine est une proteine serique isolee du serum par HOLMBERG 11s l’ont caracterisee comme une up-globuline, contenant du cuivre et possedant enzymatiques (Acta Chem. Stand., 5 (1951) 921). Bibliographic p. 03
ET LAURELL.
des propritWs
11 scmblc clone assw Cvidcnt (pw dcs conclusions tc~llrs qut* wllcs cxprimks cidessus, nc peuvcnt Ctrc tirCcs (1uc d’un rasscInhlrmc~nt rationncl clits donn&s Clcctrophor6tiilues, immunocliimii~ucs clt chimiqws obtrnucs il partir il’unv cspdrknccr commune la sfiparation ~lectrol)horPticliIr vn gClosc d’un mCl:ingc tlib constitwnts p&k?‘p5. Xous pouvons signakhr, finalcmrnt, quc: 11~sri.actions dv c;lr;tct~risation dc type “spdcifique” rcprfkmtcnt le moycn le plus siir rt lc plus commode : prcmiiwmcnt, dais le cas de 1’6lectrophorOw simplr, de prkiser quantitatiucmcwt un constituant mincur d’un cnscmble (lc cas prkiti: dc la c~ruloplasmin~~) ; ct clrusi~mcmcnt, dc caractCriscr une lignc dc pricipitation dans l’immunot!lectrophor~s~~. parmi tl’autrc~s wrrcspondank A la m6mv zone d(* mohilitd c:lectrophor~ticlur.
A dctailccl study of ~.lcctropllorctic scparatiou of proteins in agar jelly, and the tlc\cloJb mcnt of a method for this separation wcrc described in I qqq by (;OKDON and his collaborators. J3ut it is to the work of (;RARAK and his followers that noteworthy progress is due, as also the, general adoption of this method. The combined use of clcctrophoresis with agar aud the immuuologic and chemical reactions of charactcrixation provides, in one experiment, a threr-fold criterion for analysis of any one constituent: electrophoretic mobility. immunochemical specificity. chemical composition. The principle of gcncral or specific charactrrization trchniques of thr constituents of biologic fluids. according to Axtrophorosis with agar or immunoclcctrophoretic analysis, forms the subject of this paper. The advantages and disadvantages of this method, in compakson to other fields of migration in zcnw electrophoresis (paper, starch, etc.), are also considcrecl as well as possibilities of application to rcscarch, fuudamcntal or applied, in protein aualpsis. fSibliogrrcphir’
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BIBLIOG1IAI-‘HIE I A. H. GORDON, B.KEIL, muns., 1.5 (IgjO) I. %
3 4 5 6 7 S 9 IO II
K. %BESTA,
0. KNESSL
AND F.~oKM,
Cdl.
Czechoslov. Chem.
P. GRABAR ET C. A. WILLIAMS Jr.,Biochim. Biophys. Acta, IO (1953) 193. P. GRABAR ET C. A. WILLIAMS Jr.,Biochim. Riophys. Acta, 17 (19.55) 67. J. URIEL ET J. J, SCHEIDEGGEK, Bull. WC. chink biol., 37 (1955) 165. J. URIEL, H. GOTZ ET P. GRABAR, 4nrr. inst.Paslew, go (1956) 4'7. A. RUSSARD ET D. PERRIN, J. Lab. Clia. Xed., 46 (1955) 689. J. J. SCHEIDEGGER. Intern. .-1rch. .4lleugy, 7 (195.5) 103. Ii.J. WIEME ET M. KABAEY, Satuvwiss...# (1957) II2. K. 1:.GIRI, .~Utl0'wis.S., .f3(1956) 202. J. URIEL ET P. GRABAR, J. me’d. Suisse. IJ ([957) 401. .I. URIEL, Udl. sot. chim. bid. (iL paraitrr).
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Mais, malgre 1’interCt et le vaste domaine des applications de cette methode de recherche, l’experience
a montre que les donnees Clectrophoretiques,
suflisantes comme seules criteres pour Ctablir l’identite
sont tres in-
dune proteine ou l’homoge-
n&t6 dune preparation. D’autre part, l’accord des resultats fournis par l’electrophorese et par d’autres methodes, s’avere souvent difficile et parfois inutile ou vain. Pour cela, l’idee de GRARAR ET WILLIAMS de combiner dans la mCme experience une separation Clectrophoretique dun melange des constituants avec des reactions immunochimiques represente un incontestable progres. C’est aussi un premier pasvers une coordination rationelle de methodes ayant des principes tres differents et faisant appel a des proprietes distinctes dun mCme constituant. Notre propre travail dans ce domaine s’est orient6 vers le developpement techniques de caractCrisation des constituants
des liquides biologiques
des
apres leur
analyse immunoClectrophorCtique, afin de pouvoir realiser dans la mCme sCrie d’experiences la triple caracterisation dun constituant, par sa mobilit electrophoretique, son immunospCcifitC et sa structure ou sa nature chimique. Parallelement,
ces techni-
ques ont CtC appliquees a des constituants soumis seulement a une separation Clectrophoretique en gelose. L’exposC que je vais vous faire, traite des principes gCnCraux d’utilisation de ces procedes de caracterisation chimique et des modalites d’application selon les conditions particulieres de travail et selon les structures ou les fonctions qu’on veut mettre en evidence dans les differents composants en etude. Quelques unes de ces techniques ont CtC deja rCalisCes avec sucds dans l’electrophorese sur papier, mais nous avons l’avantage d’avoir affaire a un support de migration, la gelose, qui se p&e particulierement bien a ce genre de travail. A notre avis, elle presente des possibilites d’application beaucoup plus nombreuses que la plupart des supports utilises jusqu’a present en Clectrophorese de zone. I. L’RLECTROPHORRSEET L’IMMUNOJ?LECTROPHOR$SE L’emploi
de la gelose comme support de migration date du debut du siecle, mais
* Attach6 de Recherches au Centre National de la Recherche Scientifique. Bibliographic p. a~
~‘1%ii’c*st (~u’t~i It~.p) 111it’ (A ‘i
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La suite des operations, une fois la migration Clectrophoretique terminee, est representee dans le Fig. I. La partie droite du schema comporte les operations desti&es a une etude par immunoelectrophorese. La partie gauche, celle pour la realisation d’une analyse Clectrophoretique simple. Nous Ctudierons brievement la signification et les modalites d’utilisation de ces differentes Ctapes operatoires. En ce qui conceme l’electrophorese simple: (a) La fixation a pour but d’immobiliser sur place les differents constituants SCpares lors de leur migration Clectrophoretique. On peut utiliser une grande variCtC de
Reactions de Coroctcrisation
El&tmphorLse
Immune-ilectrophorisc
simple
Fig. I.
fixateurs dans des solvants aqueux ou organiques. Dans chaque cas, le choix dun fixateur doit Ctre en rapport avec la nature des composants qu’on veut precipiter. et, de plus, ne pas gener les operations ultkrieures. (b) La dessication permet de reduire la couche de gelose (initialement de 4 a 5 mm d’epaisseur) a une mince feuille transparente qu’on peut decoller de la plaque de verre qui lui servait de support; et, parvenir ainsi a la realisation des mesures photometriques et a sa conservation pratiquement indefinie. On effectue la dessication en appliquant une feuille de papier filtre sur la gelose et en mettant les plaques soit a 1’Ctuve h 37 “C soit exposees a un courant d’air. Dans le cas de l’analyse immunoelectrophoretique, la fixation n’est pas n&essake, puisque les complexes specifiques antigene-anticorps qu’on d&Ye par cette methode sont des precipites insolubles; mais il faut laver les plaques pendant trois jours dans le KaClo.15 X, reouvellC une ou deux fois par jour, afin de se debarrasser de l’exces d’antigenes
et d’anticorps
qui n’ont pas reagis.
II. LES RRACTIOSS DE CARACTRRISATION Les conditions
prealables
ques apres Clectrophorese histochimiques, permettre
c’est a dire les produits
une localisation
ou facilement
decelables
exemple. Bibliographic
a l’utilisation
p. -13
des techniques
de caracterisations
chimi-
de zone, sont les memes que celles exigees pour les travaux des reactions
precise des structures par une autre propriM
doivent
&tre insolubles,
atin de
ou des fonctions CtudiCes, et color&, physico-chimique,
radioactivite
par
I)ans Ic cad clc I’~lrctrol~llori~si~ simple (‘11galosh, 1st comma: il tbst montrc: plans 1~’ Fig. r, lcs r&ctions dr carartCrisation pwwnt c’trc appliilnCi5 in tlifickwts stxl~3 ilt. l’ensemble dcs procc%l&s opCratoirc5 1111~’ coniportcc ccttr m~thotli~ I.(* choir du moment lt! plus appropri6 cast i:\idimmiwt conditionnd par la nature nii%ic~ (I(%12 rCnction. Ainsi : (a) Quand les structuws ou lcs fonctions llu’on visiit mcttrr cn AGl~wc~ sont susceptiblcs fl’Ctw alti~rck par lo tiisatcur ou par l’action dc I’osvgiw~ atmosphc~riqw lors de la dcssication. la caract&-isation doit Ctro r&disCc ilnnic:cli:ttc~lnt,l~t :tprCs la migration ~lc!ctrol)tior~ticllli~. ].a plupart cles rAwtions dc caracti~risation tl’cnz~mc5 seront done cffectuk ii cc stadr. (‘cs (lw nous a\~ns fait tlans 1~s cas suivants : dittection dcs groupcmcwts snlfhydriles drs protCinl~s natiws : c%udc tl~ I’acti\*itC cnzymatiquc dc la c~rnloplasmint, : cl+rtion du cuivri~ IiC:aus pr~Gini3 II’. (1,) Quancl lcs risiln~5 signal& dans 1~ lx1ragraph~~ (a) nc’ sont pas +ants pour la caracttirisation, ou iluand ci4lc-ci n’cbst pas rCxlisabli~ (9 miliiw ai~ii~wx, la lisation iIt la dessication des placlu~s sont clw elk-ations prCal;~blcs. 12s tcchniilucs appliiluks ilans ~(5 conditions sont cn gcGii:r;tl plus rapid~~s ilt mains 0nCrcuws. Conimc~ cwmplcs5, nous citcrons : la coloration gt!ncktlc dtas protc%ws (Amidos~tlw;lrz ou lkw tk bromophcnol) cht dcs lipidcs ct IipoprotCinw (soudan noir, oil red 0) ; la caractckisation dlas glycoprot&ws ot tlths act:talptlosphatidl,s; la caractCrisation tic>I’nrtivitC lxwsydasiiliic dcs h6moglobincs; dCtcction du cuivrc lit’! aus protkws. (c) TXS rktions dr wract&isntion pcuvcnt Ctrcl cffcctu&s cmtrc lcs stadrs de fixation ct de dcssication, clnancl wtttb dc~rniiw c,st lc scwl danger ;I craindrc et quand, d’autrr part, la fixation pwt Otrc utik dans nn but dc prkipitation s6lectiw dc c(‘rtains constituants ou d’inhihition rllb ccrtains autws cliii pourrairnt cwtrcr cw corn+ tition avrc cclui cn tituch~. En cc qui conccrnc~ l’immuno~lrctrt~l~ti~~r~st~, IC Iavagi) tat un~’ 0pCration pri:alablc ct nkxwkx! dans tous Its cas. Pour lc rcstc, Its modalitk d’application dcs rtactions caractfristiqucs sont tcs mCmrs CIW cclles dr I’c’kctrophorPsc simple. II faut sculemcnt signaler (lu’on nc doit pas s’attcndw ii dcs rkultats syst~maticlucm~nt p~aralli~lcs cntrcs la rnCk-w rCaction appliilmk in l’&~ctroptioriw simplr cbt A I’analysi~ immuo~lc~ctrophorCticluc d’un constitnant. Et ctbci. par la fait ~IW la txktion immunochimiquc ptwt produirc des changemiwts dans la structurr dcs parties &gissantcs : antigimc-anticorps, soit blocagc dcs groupcbmcnts fonctionrwls ou IibCration dcs groupcments masq~k; soit cmtraincmclnt dw constituants fondamcntaus - lipidrs par cxctnpk provocluant dc nouvclks dispositions :l la surface dcs complescs spCcifiqws. tl'iln;~l~3;c.
Kous avons prC&demment fait rcmarcluer lluc la comparaison des donnks obtenues par 1’6lcctrophorbe ct par d’autrrs mCthodes, s’av&r souvent difficile. Maintenant, nous allons montrer cpc lorsclu’il s’agit de rclier les rlsultats fournis par les m&hodes d’analysc Plectrophor6tique cn gClosr, non seulcment nous nc nous heurtons pas & cette difficult6, mais now cn tirons dcs conclusions nouvelles. Bibliograph it* p. 23
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Un exemple assez demonstratif est celui de la cCruloplasmine *. RCcemment nous en avons fait avec M. GRABAR, sa separation Clectrophoretique et immunoelectrophoretique en &lose, suivie de techniques directes de caracterisation g&kales et spbcitiques. Ces demieres basees sur la detection du cuivre lie &cette proteine et sur l’estimation de son activite enzymatique. Dans le Tableau I sont Gunis les renseignements donnes par les difkentes techniques employees et correspondants respectivement au serum humain normal et a une preparation de cCmloplasmine isolee et purifiee du s&urn par des methodes de precipitation fractionrke. TABLEAU RENSEIGNEMENTS
FOURNIS
PARLES -~
DIFFdRRNTES
Echantillon &did
S&aralion t’lectrophor&iqzleJ
Coloration ge’n&de des pvot&neP
Serum Humain Normal
Electrophor&se simple en gelose
Six fractions de mobilite: Q, alb., ui, az, B et y
Immunoelectrophorbse
Ceruloplasmine
I TECHNIQUES
DE CARACTkRISATION
.-
Coloration spkcifique du cl&we lid am pvott%zeslo -.~_ Reaction du cuivre dans la zone de la serumalbumine et dans celle des a,-globulines
Estimation de l’actioitP de la cevuloplaswineii ActivitC enzymatique dans la zone des a,-globulines
16x8 lignes de precipitation correspondants aux differentes constitutions antigeniques du serum
Une seule ligne de precipitation correspondante a la zone des a2 globulines donne une reaction du cuivre positive
Activite enzymatique decelable dans une ligne de precipitation de la zone des a,-globulines
Electrophor&se simple en g&lose
Une fraction (quantitativement la plus importante) de mobilit czi. Une sous fraction de mobilite a2
Reaction du cuivrc positive dans les deux fractions ; plus intense dans celle de mobilite al
Activite enzymatique dans les 2 fractions mais beaucoup plus intense dans celle de mobilite up
ImmunoBlectrophor&e
Une ligne de precipitation de mobilite a, qui donne une reaction croisee avec une ze ligne de mobilite a1 Unc troisieme ligne de mobilit
Les deux lignes qui donnent une reaction croisee conticnnent du cuivre. La ligne de mobilite a, donne une reaction plus forte que celle de mobilite a2
Activite enzymatique dans les deux lignes cuivre-positives, mais l’intensite est inverse & la proportion de cuivre decele
w%
On peut coordonner les resultats exprimes sCparCmmentdans le Tableau I et les interpreter de la facon suivante : (a) En ce qui conceme le serum humain, la ckuloplasmine montre en &lose, une mobilit az. Elle a CMcar-act&i&e par la detection du cuivre lie a cette proteine et par son activite enzymatique. Le complexe de la cCruloplasmine avec son anticorps spectique ne modifie pas les groupements fonctionnels responsables de ses propriCk%enzyma* La c&uloplasmine est une proteine serique isolee du serum par HOLMBERG 11s l’ont caracterisee comme une up-globuline, contenant du cuivre et possedant enzymatiques (Acta Chem. Stand., 5 (1951) 921). Bibliographic p. 03
ET LAURELL.
des propritWs
11 scmblc clone assw Cvidcnt (pw dcs conclusions tc~llrs qut* wllcs cxprimks cidessus, nc peuvcnt Ctrc tirCcs (1uc d’un rasscInhlrmc~nt rationncl clits donn&s Clcctrophor6tiilues, immunocliimii~ucs clt chimiqws obtrnucs il partir il’unv cspdrknccr commune la sfiparation ~lectrol)horPticliIr vn gClosc d’un mCl:ingc tlib constitwnts p&k?‘p5. Xous pouvons signakhr, finalcmrnt, quc: 11~sri.actions dv c;lr;tct~risation dc type “spdcifique” rcprfkmtcnt le moycn le plus siir rt lc plus commode : prcmiiwmcnt, dais le cas de 1’6lectrophorOw simplr, de prkiser quantitatiucmcwt un constituant mincur d’un cnscmble (lc cas prkiti: dc la c~ruloplasmin~~) ; ct clrusi~mcmcnt, dc caractCriscr une lignc dc pricipitation dans l’immunot!lectrophor~s~~. parmi tl’autrc~s wrrcspondank A la m6mv zone d(* mohilitd c:lectrophor~ticlur.
A dctailccl study of ~.lcctropllorctic scparatiou of proteins in agar jelly, and the tlc\cloJb mcnt of a method for this separation wcrc described in I qqq by (;OKDON and his collaborators. J3ut it is to the work of (;RARAK and his followers that noteworthy progress is due, as also the, general adoption of this method. The combined use of clcctrophoresis with agar aud the immuuologic and chemical reactions of charactcrixation provides, in one experiment, a threr-fold criterion for analysis of any one constituent: electrophoretic mobility. immunochemical specificity. chemical composition. The principle of gcncral or specific charactrrization trchniques of thr constituents of biologic fluids. according to Axtrophorosis with agar or immunoclcctrophoretic analysis, forms the subject of this paper. The advantages and disadvantages of this method, in compakson to other fields of migration in zcnw electrophoresis (paper, starch, etc.), are also considcrecl as well as possibilities of application to rcscarch, fuudamcntal or applied, in protein aualpsis. fSibliogrrcphir’
p. 2.~
voL. 3 (1958)
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BIBLIOG1IAI-‘HIE I A. H. GORDON, B.KEIL, muns., 1.5 (IgjO) I. %
3 4 5 6 7 S 9 IO II
K. %BESTA,
0. KNESSL
AND F.~oKM,
Cdl.
Czechoslov. Chem.
P. GRABAR ET C. A. WILLIAMS Jr.,Biochim. Biophys. Acta, IO (1953) 193. P. GRABAR ET C. A. WILLIAMS Jr.,Biochim. Riophys. Acta, 17 (19.55) 67. J. URIEL ET J. J, SCHEIDEGGEK, Bull. WC. chink biol., 37 (1955) 165. J. URIEL, H. GOTZ ET P. GRABAR, 4nrr. inst.Paslew, go (1956) 4'7. A. RUSSARD ET D. PERRIN, J. Lab. Clia. Xed., 46 (1955) 689. J. J. SCHEIDEGGER. Intern. .-1rch. .4lleugy, 7 (195.5) 103. Ii.J. WIEME ET M. KABAEY, Satuvwiss...# (1957) II2. K. 1:.GIRI, .~Utl0'wis.S., .f3(1956) 202. J. URIEL ET P. GRABAR, J. me’d. Suisse. IJ ([957) 401. .I. URIEL, Udl. sot. chim. bid. (iL paraitrr).
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