Etude des macromolécules et des particules biologiques par ultracentrifugation en gradient de perchlorate de sodium

>. 4. --- E x t r a c t i o n

des RNA.

L'op6ration s e fait h temp6rature ambiante. La solution c o n t e n a n t les BNP est amen6e h 0,5 p. cent en sodium dod6cyl sulfate (SDS) et trait6e par u n volume 6gal de ph6nol satur6 d'eau. Les RNA de la phase aqueuse sont pr6cipit6s par deux volumes d'6thanol p e n d a n t au m o i n s 2 heures h - - 20°C. 5. - - T r a i t e m e n t d e s R N P p a r le g l u t a r a l d ~ h y d e .

P o u r emp6cher la dissociation des RNP dans le p e r c h l o r a t e de s o d i u m ou le chlorure de c6sium, nous les avons <> p a r le glutarald6hyde selon u n e v a r i a n t e de la m6thode propos6e par Baltimore et H u a n g [12]. Le glutarald6hyde est neutralis6 p a r a d d i t i o n de NaHCO:~ et sa concent r a t i o n r a m e n 6 e h 30 p. cent dans l'eau. On ajoute h la solution de macromol6cules 6tudi6es 1/10 de son volmne de glutarald6hyde 30 p. cent, et on le laisse agir 5 rain h 0°C. Le g r a d i e n t de p e r c h l o r a t e de sodium est pr6form6. Juste avant l'exp6rience, il est surmont6 d ' u n coussin de saccharose 20 p. cent m a i n t e n u h 0°C. Ce coussin est destin6 h emp6cher la diffusion et l ' o x y d a t i o n du glutarald6hyde clans le perchlorate, qui m a s q u e r a i e n t le haut du gradient si la diffusion n'6tait pas emp6ch6e. Ce p h 6 n o m 6 n e existe aussi avec le GsC1 bien qu'h u n degr6 moindre. La solution c o n t e n a n t les particules trait6es au glutarald6hyde est d6pos6e sous forme d ' u n e couche m i n c e en haut du tube. La c e n t r i f u g a t i o n est ensuite conduite de fa~on h ce que les diff6rentes zones a r r i v e n t '~ leur 6quilibre respectif. Le temps de c e n t r i f u g a t i o n p o u r o b t e n i r l'6quilibre a 6t6 d6duit des calculs th6oriques [5] et v6rifi6 exp6rim e n t a l e m e n t . D ' u n e m a n i 6 r e g6n6rale, la c e n t r i fugation h l'6quilibre est men6e dans u n rotor SW4I c o n t e n a n t u n gradient 3,0-70 p. cent en perchlorate et centrifug6e 35 heures h 32 000 r p m et 22oC. 6. - - C e n t r i [ u y a t i o n d e s p a r t i c u l e s r i b o s o m a l e s non fix~es.

Une solution de particules ribosomales est d6pos6e au sommet d ' u n gradient de p e r c h l o r a t e de sodium. La c e n l r i f u g a t i o n de zone est c o n d u i t e comme d6crit dans la 16gende des figures. C ertaines zones a r r i v e n t h leur 6quilibre de densit6, d ' a u t r e n o n (voir texte). L e s gradients sont perfor6s p a r le bas et leur a b s o r b a n c e est mesur6e h 254 n m en c o n t i n u dans u n e cellule LKB de 0,5 ml. Les fractions recueillies sont ensuite ana-

Ultracentrifugation

l y s 6 e s p o u r l e u r a b s o r p t i o n "~ 260 n m et l e u r r a d i o a c t i v i t 6 . L a c o m p a r a i s o n e n t r e les f r a c t i o n s est ainsi parfaite. 7. - -

Produits emplog~s.

Le g l u t a r a l d 6 h y d e ~ 50 p. c e n t d a n s l ' e a u est un produit Fluka. -

1025

en g r a d i e n t de p e r c h l o r a t e .

-

--L'uridine t r i t i 6 e et l a l e u c i n e t r i t i 6 e p r o viennent du Commissariat h l'Energie Atomique (CEA). --- L e p e r c h l o r a t e d e s o d i u m p u r est u n p r o d u i t d e B r i t i s h D r u g H o u s s e (B.D.H.).

RESULTATS. 1. - - Propridtd, s p h y s i q u e s des s o l u t i o n s de perc h l o r a t e de s o d i u m .

C o m m e le c h l o r u r e de c 6 s i u m est le sel u n i v e r s e l l e m e n t u t i l i s 6 d a n s les O u d e s b a s 6 e s s u r les diff6rences de masse volumique, nous avons comp a r 6 les p r o p r i 6 t 6 s p h y s i q u e s d e s s o l u t i o n s d e p e r c h l o r a t e d e s o d i u m et d e c h l o r u r e d e c d s i u m . L e s s o l u t i o n s d e p e r c h l o r a t e d e s o d i u m et d e chlorure de c6sium ont en commun certaines prop r i d t 6 s . Les m a s s e s v o l u m i q u e s m a x i m a l e s o b t e -

N o u s a v o n s n o t 6 q u e les d e n s i t 6 s d e c e s s o l u tions ne sont pas proporfionnelles h leur concentration. Les coefficients d'extinction molaire 260 n m s o n t t r 6 s f a i b l e s m 6 m e p o u r les s o l u t i o n s s a t u r 6 e s ( i n f 6 r i e u r e h 0,0,2 u n i t 6 d e d e n s i t 6 o p t i q u e p o u r les s o l u t i o n s r 6 a l i s 6 e s a v e c le p e r c h l o r a t e d e s o d i u m ) a l o r s q u ' i l s s o n t lr6s 61evds si o n utilise e e r t a i n s sels c o m m e l ' i o d u r e d e p o t a s s i u m o u l ' i o d u r e de s o d i u m [3!. E n r e v a n c h e , les s o l u t i o n s d e c h l o r u r e d e c 6 s i u m et d e p e r c h l o r a t e d e s o d i u m d i f f 6 r e n t c o n s i d 6 r a b l e m e n t p a r l e u r v i s c o s i t 6 . A l o r s q u e les s o l u t i o n s de chlorure de c6sium ont une viscosit6 inf6rieure 'h la c e n t i p o i s e [13], c e l l e d e s s o l u t i o n s d e p e r c h l o r a t e d e s o d i u m a t t e i n t c i n q c e n t i p o i s e s (fig. 2).

!

~m~f

o/

/o

0,8

07

ojO/° ,

0.6 0

/

O f,

,

•

' 0,5

.

.

,

'

' 1

1

(...tlpoil.)-,

I1D

FIG. 2. Representation en coordonn~es inverses de variations de la viscosit~ en fonetion de la densild pour les solutions aqueuses de NaClO~ 5 22°C. -

/ /

t37 /,

/

/ 1,3 5

/"

Fro. 1 . - Variations de la densitd en [onetion de Findice de rd[raction pour les solutions aqueuses de NaClO~ h 22°C.

L'indiee de r~fraetion (nD) est mesur~ pour la raie D du sodium avee u n r~fraetom6tre Abbe de Carl Zeiss (Oberkoehem). La masse v o l u m i q u e est mesurfie avee u n pyenom6tre de I ml apr6s, s t a b i l i s a t i o n de la t e m p e r a t u r e . Le p o i n t ex'tr~me repr~sente les valeurs obtenues h s a t u r a t i o n .

n u e s s o n t t r 6 s 61ev6es : 1,9 g.cm-Z p o u r le c h l o r u r e d e c 6 s i u m [13] et 1,7 g.clu-3 p o u r le p e r c h l o r a t e d e s o d i u m (fig. 1) ; ce n ' e s t p a s le c a s p o u r les solutions de tartrate de potassium pour lesquelles la m a s s e v o l u m i q u e est i n f 6 r i e u r e h 1,4 g.cm-3 I l l . BIOCHIMIE, 19'72, 54, n ° 8.

-

La viseosit~ est mesur~e p a r ~eoulement h t r a v e r s u n capillaire p r 6 a l a b l e m e n t dtalonn6 pour les diff~rents intervalles de viseosit~ avee des solutions de sucrose de viseosit~ eonnue [13]. 5 ml d ' u n e solution de p e r e h l o r a t e de sodium s'6eoulent h t r a v e r s u n eapillaire de 25 m m de long. Le temps d'~eoulement est mesur6 et la viseosit~ est ealeul~e d'aprbs la loi de Poiseui]le.

Cette p r o p r i 6 t 6 p h y s i q u e e n t r a i n e u n c e r t a i n n o m bre de cons6quences quand on utilise ces solutions pour la centrifugation en gradient : la diffusion d e s m o l 6 c u l e s d i s s o u t e s est t r 6 s f a i b l e ; la s6dim e n t a t i o n p r o p r e d u sel p e n d a n t la c e n t r i f u g a t i o n est a u s s i d i m i n u 6 e , d e s o r t e q u e l a v a l e u r d o n n 6 e all g r a d i e n t d e d e n s i t 6 se c o n s e r v e d u r a n t n o s exp6riences, quelle que soit la force centrifuge a p p l i q u 6 e a l o r s q u e , darts les m 6 m e s c o n d i t i o n s , les solutions des chlorure de c6sium tendent rapidement vers leur 6quilibre thermodynamique. Le perchlorate de sodium permet doric de travailler a v e c d i f f 6 r e n t e s v a l e u r s d u g r a d i e n t d e d e n s i t 6 et d ' a v o i r la r 6 s o l u t i o n d 6 s i r 6 e s a n s t e n i r c o m p t e d e la v i t e s s e d e r o t a t i o n .

1026

Jean-Pierre Liautard

I I . . - - COMPORTEMEINT DES P A R T I C U L E S RIBOSOMALES

(NO~ WaA~S) DANS LE P E R C H L O R A T E DE SODIUM,

La centrifugation de zone en gradient lin6aire d e p e r c h l o r a t e d e s o d i u m (3,0 p. c e n t , 70 p. c e n t e n p o i d s ) d e l a (~ f r a c t i o n r i b o s o m a l e t o t a l e >) p e n d a n t n D DO

CPM

/"

1,38 I i

I [

sooo

/ I /I

1,34 0,2[

~'~

5

10

15

~

1000

20 FRACTIONS

Fz6. 3. - - Sddimentation de la << fraction ribosomale totale >> en gradient de NaClO~. Les cellules sont incub6es 2 h e u r e s avec 5 ~ C i / m l de Leucine [3HI. La ~ f r a c t i o n r i b o s o m a l e totale >> est dissoutc d a n s du t a m p o n de suspension. 10,0 ~I de cette solution c o n t e n a n t 0,.5 mg de RNP sont d~pos6s au s o m m e t d ' u n g r a d i e n t pr6form6 de perchlora~e de sodium comme n o u s l ' a v o n s d6crit d a n s le c h a p i t r e << Mat6riels et M6thodes ~. La c e n t r i f u g a t i o n est r6alis6e d a n s u n rotor S%V41 h 320.0.0 r p m p e n d a n t 21 h. La t e m p 6 r a t u r e de c e n t r i f u g a t i o n esg de 22°C. Des f r a c t i o n s de 10 gouttes sont recueillies p o u r l'analyse. a b s o r b a n c e h 260 n m (DO). ...... • ....... • radioacfivit6 de l a Leucine [3HI. A...... A ...... A indice de r6fraction (n,).

et Kurt K6hler.

t i o n r6v616e p a r le f r a c t i o n n e m e n t e n c o n t i n u e s t c e r t a i n e m e n t d u e a u fait, q u e P 3 est c o n s t i t u 6 e d e m o l 6 c u l e s p r 6 c i p i t 6 e s et q u e c ' e s t l a t u r b i d i t 6 q u i est m e s u r 6 e . L ' 6 t u d e t h 6 o r i q u e c i - d e s s o u s c o n f i r m e q u e P 3 est c o n s t i t u 6 e d e p r o t 6 i n e s p r 6 c i p i t 6 e s . L e s r i b o s o m e s d e s e u c a r y o t e s se c o m p o r t e n t d o n c d a n s les s o l u t i o n s d e p e r c h l o r a t e d e s o d i u m c o m m e d a n s c e l l e s d e c h l o r u r e de c 6 s i u m . N o u s a v o n s a l o r s 6 t u d i 6 le c o m p o r t e m e n t d e q u e l q u e s macromol6cules et particules h partir des calculs t h 6 o r i q u e s [5]. N o u s a v o n s c o m p a r 6 les c o u r b e s o b t e n u e s a v e c n o s r 6 s u l t a t s e x p 6 r i m e n t a u x (fig. 4). Ces r 6 s u l t a t s p e r m e t t e n t d ' i d e n t i f i e r s a n s a m b i g u i t 6 s les d i f f 6 r e n t e s z o n e s . L e s z o n e s P1 et P 2 s o n t c o n s t i t u 6 e s r e s p e c t i v e m e n t d e s R N A 28 S e t 18 S, l a b a n d e P 3 est c o n s t i t u 6 e d e p r o t 6 i n e s p r e c i p i t 6 e s ( n o u s a v o n s t r o u v 6 8 f r a c t i o n s e n gel d e polyacrylamide) tandis que la zone P 4 contient d e s p r o t 6 i n e s s o l u b l e s et d u R N A 5 S. La centrifugation en gradient de perchlorate de s o d i u m p e u t O r e u t i l i s 6 e p o u r l ' a n a l y s e et l a p r 6 p a r a t i o n d e s R N A c a r elle n e n 6 c e s s i t e q u ' u n m i n i mum de manipulations. S i g n a l o n s q u e le DrNA d e E. colt est 6 g a l e m e n t s o l u b l e d a n s le p e r c h l o r a t e d e s o d i u m off sa m a s s e

A

tic

DE

B

,,=, 4o :E 3O

•

20

21 h h 32 (~0O r p m et h 22°C, s 6 p a r e 4 z o n e s (fig. 3); a priori la centrifugation n'est pas h l'6quilibre, U n e a n a l y s e p h y s i c o - c h i m i q u e et u n e 6 t u d e t h 6 o r i q u e o n t 6t6 f a i t e s p o u r i d e n t i f i e r ces z o n e s . L e r a p p o r t DO260/DO2s0 m o n t r e q u e les z o n e s P1 et P 2 s o n t c o n s t i t u 6 e s e s s e n t i e l l e m e n t d ' a c i d e s n u c l 6 i q u e s et les z o n e s P 3 e t P 4 d e p r o t 6 i n e s . L e s z o n e s P1 et P2, d i a l y s 6 e s p u t s c e n t r i f u g 6 e s e n g r a d i e n 5 p. c e n t - 2,0 p. c e n t d e s a c c h a r o s e , o n t respectivement des coefficients de s6dimentation 28 S et 18 S, c o m m e d e s R N A r i b o s o m a u x . U n traitement p r 6 a l a b l e p a r le p h 6 n o l n ' a p p o r t e aucune modification du trac6 obtenu. La r6partit i o n d e s p r o t 6 i n e s (~fig. 3) m o n t r e q u e P 3 et P 4 sont essentiellement constitu6es de prot6ines, alors q u e P1 et P 2 e n s o n t d 6 p o u r v u e s . De m 6 m e u n m a r q u a g e p r 6 a l a b l e h [3H] u r i d i n e r6v61e q u e les z o n e s P1 et P 2 s o n t t r ~ s f o r t e m e n t m a r q u 6 e s t a n d i s q u e P 4 est 1 6 g 6 r e m e n t m a r q u 6 e , a u c u n e r a d i o a c t i vit6 n ' a p p a r a i t s o n s P3. L ' i m p o r t a n c e d e l ' a b s o r p BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 8.

7 menisque

9

I'1

13

CEI~TIMETRES fond

FIG. 4. - - Etude thdorique et comparaison avec les valeurs expdrimentales. Les eourbes t h 6 o r i q u e s son,t r6alis6es h p a r t i r des calculs d6velopp6s p a r Morin [5] pour les conditions suivantes : - - r o t o r S~W 41 (eentrifugeuse Spinco L~). gradient de p e r e h l o r a t e 30 p. c e n t - 70 p. cent en poids. vitesse de c e n t r i f u g a t i o n 32 00,0 rpm. t e m p 6 r a t u r e 22°C. Une eourbe ,th6orique a 6t6 trae6e dans eheeun des cas s u i v a n t s : C : Prot6ines 1,00,0 S o ---- 1,35 g em-3 B : Prot~ines 7 S ? = 1,35 g cm-3 A : Prot~ines 4 S f = 1,35 g cm-3 D : ribosomes F : rRNA 28 S ? = 1,65 g cm-3 E : rRNA 18 S ? = 1,65g cm-3 Les points e x p 6 r i m e n t a u x r e p r 6 s e n t e n t les diff~rentes zones s6par~es p a r c e n t r i f u g a t i o n comme indiqu~ h ta figure 3. --0-O--PI--A --z~ P ' 2 - - U - - - [] - - P 3 - - e - - - P 4 - -

- -

- -

Ultracentrifugation

volumique obtenue par centrifugation isopycnique (~ ---- 1,48 g cm-3) est t r ~ s i n f 6 r i e u r e h c e l l e t r o u v6e d a n s le c h l o r u r e d e c 6 s i u m .

ni.

--

RESULTA.TS TRAITEES

OBTENUS AU

AXrEC

LES

1027

en gradient de perchlorate.

PARTICULES

GLUTARALDEHYDE.

aussi, pour avoir une base de comparaison, le c h l o r u r e d e c d s i u m .

dans

Le perchlorate de sodium donne des r6sultats c o m p a r a b l e s h c e u x t r o u v 6 s d a n s le c h l o r u r e d e c 6 s i u m ( t a b l e a u I). Des r 6 s u l t a t s , o n d 6 d u i t ]a formule empirique suivante : 1,65 - -

1. - - Masse v o l u m i q u e cytoplasmiques.

de q n e l q u e s

particules

P u i s q u e les r i b o s o m e s d e s e u c a r y o t e s se d i s s o c i e n t e n R N A et p r o t 6 i n e s d a n s le p e r c h l o r a t e d e

n o DO

pourcentage

de prot6ines

--

0,003 (ou ~ est l a m a s s e v o l u m i q u e , e n g . c m -a d a n s le p e r c h l o r a t e d e s o d i u m ) . B i e n q u e les d i f f d r e n c e s d e m a s s e v o l u m i q u e e n t r e R N A et p r o t 6 i n e s s o i e n t

CPM

~

[

1,50

CPM

no DO 1'521,50

1500

1,3 o,3

1:0,2

1:

V

I000

~

;00

o

\ i I tl

s

10

20 FRACTIONS

l's

2'0 FRACTIONS

FtG. 5. - - Sddimentation & l'dquilibre de la fraction ribosomale <> en gradient de NaClO~. Action du d~soxycholate de sodium. Les cellules sont ineubdes 40 m n avec u r i d i n e [3HI h 10 p.Ci/ml. La ¢ f r a c t i o n ribosomale totale >> c o n t e n a n t routes les particules cytoplasmi.ques plus petites que les mitoc h o n d r i e s et a y a ~ t u n coefficient de s d d i m e n t a t i o n superieur h 40, S est dissoute d a n s du t a m p o ~ de suspension. La solution ainsi o b t e n u e est divisde en 2 parties 6gales. Une partie (contenant e n v i r o n 0,25 mg de RNP) est traitde au glutaralddhyde, puis ddposde sur . . . u n g r a d i e n t de p e r c h l o r a t e de sodium et est . ensulte centrlfugee <> comme nous l ' a v o n s d6crit darts le ehapi'tre << Mat6riels et Mdthodes >>. Les rdsultats de l ' a n a l y s e du g r a d i e n t sont reprdsentdes figure 5 A. La d e u x i 6 m e p a r t i e est a d d i t i o n n d e de ddsoxycholate de s o d i u m (sous a g i t a t i o n const a n t e et h 0°C). La c o n c e n t r a t i o n finale de ddsoxycholate est de 2 p. cent. La solution, ainsi obtenue est fix6e et centrifugde darts les m~mes conditions que prdcddemment. L ' a n a l y s e du g r a d i e n t est r a p p o r t d e darts la figure 5 B. Ls ehiffres au-dessus des courbes r e p r d s e n t e n t la masse volulnique en g cm-3. ........ A ........ indiee de r6fraetion (n,). a b s o r b a n c e h 260 n m (DO). • ..... • ...... • radioactfvi.td de l ' u r i d i n e [3HI.

s o d i u m , c o m m e ils le f o n t d a n s le c h l o r u r e d e c6sium, nous avons 6tudi6 des particules ribosom a l e s ¢ fix6es >> p a r le g l u t a r a l d 6 h y d e . N o u s a v o n s m e s u r 6 e x p d r i m e n t a l e m e n t les d e n s i t d s d e s p a r t i eules ribosomales par centrifugation de zone h l ' d q u i l i b r e d a n s le p e r e h l o r a t e d e s o d i u m m a i s BIOCHIMIE, 1972, 54, n" 8.

moins grandes en perchlorate de sodium qu'en chlorure de cdsium, cela n'est pas un inconven i e n t . E n effet, l a v i s c o s i t 6 i m p o r t a n t e a p e r m i s d e crder un gradient pr6form6 de valeur faible. La d i f f u s i o n d e s m a c r o m o l 6 c u l e s est f a i b l e h c a u s e d e la v i s e o s i t d d u m i l i e u , o n o b t i e n t u n p i c d e d e n -

J e a n - P i e r r e L i a u t a r d et K u r t K 6 h l e r .

1028

sit6 o p t i q u e trbs fin. I1 en r6sulte une r6solution effective m e i l l e n r e que celle obtenue avec le c h l o r u r e de c6sium.

2. - - Nature des mol~cules associ~.es au RNA ~t marquage rapide. Les r6sultats pr6c6dents nons ont encourag6s tester les possibilit6s du p e r c h l o r a t e de s o d i m n dans l'6tude de la p a r t i c u l e c o n t e n a n t le RNA m a r q u a g e r a p i d e , que certains auteurs appellent ¢ i n f o r m o s o m e >> [6, 8]. La c e n t r i f u g a t i o n h l ' 6 q u i l i b r e de la f r a c t i o n r i b o s o m a l e totale, apr~s un m a r q u a g e r a p i d e montre un trac6 de r a d i o a c t i v i t 6 ne r e c o u v r a n t pas celui de l ' a b s o r b a n c e (fig. 5). Ce r6sultat est conf o r m e aux e x p 6 r i e n e e s de n o m b r e u x auteurs [6,

7, 8, 9, 143. TABLEAU I.

Masse votumique eompar~e dans CsCI et NaCLO~, et quelques particules cgtoplasmiques. M~sse volumique en g. cm-a POOFCeIItage de dans CsC1 dans NaC10~ prot6ines Ribosomes . . . . . Particules 60 S.. Partieules 45 S.. Polysomes . . . . . Prot~ines . . . . . . .

1,546 1,58 1,49 1,55 1.30

1,500 1,515 1,47 1,50 1,35

51 45 60 51 100

La masse volumique des diff6rentes particnles est mesur6e par centrifugation. Des couches minces des particules, prdalablement purifi6es par centrifugation en gradient de saccharose, sont dSpos6es sur des gradients pr6form6s de CsCl ou de NaG10~ et sont ensuite centrifug6es de faqon h ce que les oarticules atteignent leur 6quitibre de densitd (Mat6riels et Mdthodes). Le gradient est ensuite fractionn6 et chaque fraction est analys6e pour sa densit6 ?pHque et son indice de r6fraction. Les masses volumlques pr~sent6es dans le tableau sont le r6sultat d'au moins 3 mesnres. L e pourcentage de prot$ines est calcul~ h partir des masses volumiqnes dans le CsC], avec ]a formule empirique donn6e par Spirin [6] : 1,85- p p. cent de prot. -(0 e n g . cm-3) 0,006 Celte p a r t i c u l e c o n t i e n t du RNA, c o m m e le m e t en 6vidence le m a r q u a g e p a r l ' u r i d i n e [3HI, mais sa masse v o l u m i q u e est faible (0 = 1,449 g/cm3) p a r r a p p o r t h celle du r i b o s o m e ou de ses sousunit6s (tableau I). Cette faible v a l e u r de la masse v o l u m i q u e serait due solon c e r t a i n s auteurs h une association u n i q u e m e n t avec des prot6ines [6, 7, 8, 14], ou, selon les autres, h une association polyr i b o s o m e s - lipides [9, 10J. Nous avons alors trait6 la <> p a r un d6tergent ionique, le d6soxycho-

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late de sodium, h la c o n c e n t r a t i o n finale de 2 p. cent. A cette c o n c e n t r a t i o n , le d 6 s o x y c h o l a t e solubilise los lipides. On o b s e r v e alors un glissem e n t du trac6 de r a d i o a c t i v i t 6 , mais los deux trac6s ne se r e c o u v r e n t toujours pas (fig. 6). Le m a x i m u m du trac6 de r a d i o a c t i v i t 6 c o r r e s p o n d h la masse v o l u m i q u e de r i b o s o m e s n o n trait6s, et le m a x i m u m du trac6 de densit6 o p t i q u e c o r r e s p o n d h u n e masse v o l u m i q u e plus 61ev6e que celle du r i b o s o m e non trait6. Cos r6sultats s e m b l e n t ~tre diff6rents de ceux de K e m p f et al. [9]. On peut en d6duire que la p a r t i c u l e c o n t a n t le RNA h m a r q u a g e - r a p i d e n'est pas u n e association de lipides avec les ribosomes. CONCLUSION. 1. - - Le p r 6 s e n t t r a v a i l m o n t r e qu'il est possible de r e m p l a c e r a v a n t a g e u s e m e n t le c h l o r u r e de c6sium (CsC1) p a r le p e r c h l o r a t e de s o d i u m ( N a C 1 0 ) p o u r los e x p 6 r i e n c e s de c e n t r i f u g a t i o n en g r a d i e n t de densit6. E n effet, les acides nucl6iques (DNA et BNA) sont solubles darts los solutions de p e r c h l o r a t e . Cos solutions atteignent des masses v o l u m i q u e s i m p o r t a n t e s (o := 1,7 g c m -~) ce qui p e r m e t d'6tud i e t les acides nucl6iques et les RNP cytoplasm i q u e s p a r leur diff6rence de densit6. Le p e r c h l o rate de s o d i u m n'est pas un o x y d a n t aussi fort que le chlorate de sodium. E n p a r t i c u l i e r il nc semble pas m o d i f i e r c h i m i q u e m e n t les acides nucl6iques. En effet F r e i f e l d e r [18] p u r i f i e les DNA de certains virus p a r c e n t r i f u g a t i o n d i r e c t e du v i r u s h t r a v e r s un coussin de p e r c h l o r a t e de s o d i u m 5 M. Le DNA ainsi obtenu a gard6 toutes ses propri6t6s biologiques. Le p e r c h l o r a t e de s o d i u m poss6de l ' a v a n t a g e sur CsC1 d'6tre d ' u n p r i x de r e v i e n t b e a u c o u p plus has et de d o n n e r des solutions de viscosit6 plus importantes. Cette d e r n i b r e propri6t6 pr6sente un double int6r6t ; d ' u n e p a r t elle p e r m e t d ' u t i l i s e r des gradients pr6form6s de p e r c h l o r a t e de s o d i u m qui restent stables au cours de la c e n t r i f u g a t i o n (on peut ainsi p a r des calculs de s i m u l a t i o n ¢ optimiser>> lcs c o n d i t i o n s exp6rimentales), d ' a u t r e p a r t la r6solution de la m 6 t h o d e est augment6e p u i s q u e la diffusion des p a r t i c u l e s 6tudi6es est diminu6e. 2.P o u r i l l u s t r e r ces r6sultals, nous avons 6tudi6 le RNA ~ m a r q u a g e r a p i d e qui a p p a r a i t dans le c y t o p l a s m e des cellules HeLa apr6s 40 min de m a r q u a g e . Nous avons mis en 6 v i d e n c e une p a r t i c l e c o n t e n a n t le R ~ A m a r q u 6 - r a p i d e m e n t ayant une masse v o l m n i q u e de ~ = 1,44 g era-3. Le calcul du p o u r c e n t a g e de prot6ines c o r r e s p o n d a n t

Ultracentrifugation en gradient de perchlorate. /~ la densit& d e c e t t e p a r t i c u l e est d e 70 p. c e n t . L e r i b o s o m e d e d e n s i t ~ 1,5,0 p o s s ~ d e p a r c o n t r e 51 p. c e n t d e p r o t ~ i n e s ( t a b l e a u I). O n n e p e u t d o n c s u p p o s e r q u e la p a r t i c u l e m a r q u 6 e r a p i d e ment soit due h l'association de ribosomes avec une autre RNP car celle-ci devrait comporter une tr~s g r a n d e q u a n t i t 6 d e p r o t ~ i n e s . D e m ~ m e l ' a s s o e i a t i o n d e p o l y s o m e s a v e c les l i p i d e s est e x c l u e p a r le f a i t q u e les t r a c ~ s d e r a d i o a c t i v i t 6 et d e densit~ optique sont encore disso:i~s apr~s solub i l i s a t i o n d e s l i p i d e s p a r le d 6 s o x y c h o l a t e d e sodium. L e s r ~ s u l t a t s o b t e n u s s ' e x p l i q u e n t si l ' o n s u p p o s e l ' e x i s t e n c e d a n s <> d ' u n e p a r t i c u l e l i b r e c o n t e n a n t d u R N A h m a r q u a g e r a p i d e . P o u r les c e l l u l e s H e L a , S p o h r et al. [8~ o n t m o n t r ~ q u e l a m a j o r i t 6 d e R N A i n c o r porant l'uridine triti~e en pr6sence d'actinomye i n e D se t r o u v a i t i n c l u e d a n s d e s p a r t i c u l e s l i b r e s d a n s le c y t o p l a s m e . D a n s ces p a r t i c u l e s le r a p p o r t p r o t ~ i n e s / R N A est d e 70 p. c e n t . N o u s p e n s o n t q u e c ' e s t c e t t e m ~ m e p a r t i c u l e q u i est m a r q u e e r a p i d e m e n t . E l l e est p l u s s e n s i b l e h F a c t i o n d u d 6 s o x y c h o l a t e d e s o d i u m q u e les r i b o s o m e s . E n effet elle p e r d 20 p. c e n t d e ses p r o t 6 i n e s , a l o r s q u e les r i b o s o m e s n ' e n p e r d e n t q u e 6 p. c e n t . Cette p a r t i c u l e p r 6 s e n t e u n e s e n s i b i l i t 6 a u d6soxycholate comparable /~ c e l l e d ~ c r i t e p a r O l s n e s [16, 17], l i b ~ r 6 e d e s p o l y s o m e s p a r I ' E D T A . ll s e m b l e d o n c q u e u n e p r o t 6 i n e ( a u m o i n s ) , v r a i s e m b l a b l e m e n t h y d r o p h o b e , est s o l u b i l i s ~ e p a r le d~soxycholate de sodium. Pour la particule lib6r 6 e d e s r i b o s o m e s p a r I ' E D T A , O ] s n e s [17] m e t e n 6 v i d e n c e q u ' u n e s e u l e p r o t 6 i n e est l i b 6 r 6 e . Les r6sultats que nous avons obtenus avec cette p a r t i c ! d e s o n t b i e n e n a c c o r d a v e c la d e s c r i p t i o n d e S p i r i n [6] d e l ' i n f o r m o s o m e . E n effet, p o u r e x p l i q n e r le f a i t q u ' e l l e a i t u n e d e n s i t 6 c o n s t a n t e , quelle que soit la longueur du messager, on admet q u e les p r o t 6 i n e s s o n t li6es a u m R N A d e f a c o n fi f o r m e r d e s u n i t 6 s d ' a s s o c i a t i o n . Ces u n i t 6 s p r 6 s e n t e n t u n r a p p o r t R N A / p r o t 6 i n e s c o n s t a n t et elles se r 6 p 6 t e n t s u r t o u t e l a l o n g u e u r d u m e s s a g e r . Le n o m b r e d e p r o t 6 i n e s d o i t d o n c 6tre f a i b l e c a r les diff6rents mRNA ne pr6sentent pas une grande v a r i a t i o n d e faille. Si o n s o l u b i l i s e s p 6 c i f i q u e m e n t o n e e s p ~ c e d e p r o t ~ i n e s , le r a p p o r t R N A / p r o t 6 i n e s est affect~ d e f a c o n i m p o r t a n t e . Ce mod61e n o u s p e r m e t d ' e x p l i q u e r l a f o r t e a u g m e n t a t i o n de d e n sit6 de la p a r t i c u l e m a r q u e e - r a p i d e m e n t (aussi appel~e informosome) apr~s l'action du d6soxycholate de sodium. C'est ce m6me ph~nom~ne que O l s n e s ~171 a m i s e n 6 v i d e n c e p a r d ' a u t r e s v o i e s ; il m o n t r e q u e s e u l e m e n t u n e p r o t 6 i n e , r e l f i c h ~ e p a r

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a c t i o n d u d ~ s o x y c h o l a t e , p e u t ~tre i d e n t i f i ~ e a u x prot~ines associ~es au RNA h marquage-rapide, a l o r s q u ' u n n o m b r e p l u s ~lev~ p r o v i e n n e n t d u r i b o s o m e . Ces e x p e r i e n c e s s o n t d o n c e n f a v e u r d e l'existence d'une particule de nature informationnelle.

RemereiemenLs. Ce t r a v a i l a ~t~ support~ p a r la Ligue N a t i o n a l e contre le Cancer et la Deutsche F o r c h u n g s g e m e i n s c h a f t . Nous r e m e r c i o n s Madame N. B e r n a r d et Madame R. Dietz p o u r leur patienLe a t t e n t i o n port~e h la culture des cellu~es HeLa, a i n s i que Madame le P r o f e s s e u r H. Colson-Guastala et Monsieur P. J e a n t e u r p o u r leurs pr~cieuses suggestions au cours de la r~daction du manuscrit. R~suM~. P a r une ~tude de l ' u l t r a c e n t r i f u g a t i o n en g r a d i e n t de densit~ nous d ~ m o n t r o n s qu'fl est possible de reinplacer le chlorure de c~sium (CsC1) p a r le p e r e h l o r a t e de sodium (NaC104). Le p e r c h l o r a t e de sodium est tr~s solub:le d a n s l ' e a u et les solutions ob.tenues ont les caract6ristiques s u i v a n t e s : u n e tr~s faible absorption h 260 nm, une m a s s e v o l u m i q u e i m p o r t a n t e (p : 1,7 g/cm3 h satura'tion), et u n e viscosit~ i m p o r t a n t e ( j u s q u ' h 5 centipoises). En outre les acides n u cl4iques sont tr~s solub]es d a n s ces so]uti:ons. Ces propri~t6s a p p o r t e n t des aspects n o u v e a u x p o u r la r~alisation de gradients de d e n s i t C Nous avons donc r~alis6 l'~tude de certaines macromol4cules et p a r t i cules des cellules HeLa p a r c e n t r i f u g a t i o n en g r a d i e n t de perchlorate de sodium. Comme les particules r i b o s o m a l e s sont dissoci~es en RNA et prot~ines (c'est aussi le cas dans CsCl) ces gradients ne peuvent ~tre utilis~s que p o u r la s~paration et la caract~risation des RNA, comme on utilise les gradients de saccharose. Les particules <> p a r le g l u t a r a l d 6 h y d e sont s~par~es selon leur r a p p o r t RNA/prot6ines. La r~sol u t i o n obtenue par c e n t r i f u g a t i o n isopycnique est mei.1leure que celle obtenue avec CsC]. P o u r i l l u s t r e r cet avantage, nous avons ~tudi6 la particuIe c o n t e n a n t le RNA h m a r q u a g e rapide, et nous m o n t r o n s que la faible densit6 de cette particule n'est pas due h des lipides. ZUSAMMENFASSI;NG.

Wit" zeigen hier, dab fiir D i c h t e g r a d i e n t e n z e n t r i f u gation CsC1-L6sungen d u r c h NaC104-L5sungen ersetzt werden k6nnen. NaCIO4 is t sehr gut nvasserl6sHeh ; die L6sungen h a b e n eine R eihe gfinstiger p h y s i k a l i scher Eigenscha~ten : Eine sehr geringe Absorption im Bereieh bet 260 n m erlaubt eine einfaehe B e s t i m m u n g der Nukleins~iuren. Die h o h e LSsliehkeit erlaub,t L6sungen m i t sehr h o h e r Dichte (1,7 g/cma bet S~ittigung) u n d h o h e r Viscosit~it (bis 5 eentipoises) anzusetzen. Nukleins~iuren sind in allen NaC104-L6snngen sehr gut 15slich. Diese Eigenschaften ergeben neue m e t b o d i s e h e Pcrspektiven fiir die Dichtegradien.tenzentrifugation. W i r h a b e n a u f diese Weise R i b o n u c l e o p r o t e i n p a r t i k e l u n d Nukleins~iuren aus HeLa-Zellen u n t e r s u e h t .

Jean-Pierre

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Liautard

Ribosomen zerfallen in h o c h k o n z e n t r i e r t e n Perchlora:t-L6snngen ~ihnlich vcie in CsGI-LSsnngen. Doch k a n n der Gradient wie die Zuckergradienten zur T r e n n u n g und Ch~/rakterisierung der verschiedenen RNA dienen. Mit Glutaraldehyd fixierte Partikel w e r d e n auf Grund fhrer Dichte b~w, ihres RNA-Proteingehaltes getrennt. Die Aufl6sung in einem NaUIO~-Dichtegradienten ist h e s s e r als im CsGl-Gradienten. W i r b e n u t zen d a h e r die NaC10,-Dichtegradienten, u m Partikel mit p u l s m a r k i e r t e r RNA a u f z u t r e n n e n u n d weisen nach, da6 ihre niedrige D ichte nicht durch Lipide bedingt ist. BIBLIOGRAPHIE. 1. Spirin, A. S., Belitsina, N. V. • Lerman, M. C. (1965) J. Mol. biol., 14, 611. 2. Reboud, A. M. ,~ P e t e r m a n , M. (1969) Organizational Biosynthesis, Academic Press, 477. 3. Anet, R. ~ S.trayer, D. R. (1'9~69) Biochem. Biophys. Res. Comm., 37, 52. 4. McCrea, Epstein, R. S. ~ Barry, W. H. (1971) Nature, 189, 2~0.

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