Dosage fluorimétrique de la trypsine

CLINICA CHIMICA ACTA

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DOSAGE

FLUORIMfiTRIQUE MARC

DE LA TRYPSINE

ROTH

Labovatoire Central, Hcfpital Cantonal, Gent& (Suisse) * (Requ le ~7 aoht, 1962)

SUMMARY FLUORIMETRIC

ASSAY

OF TRYPSIN

A fluorimetric assay of trypsin is presented. Trypsin is incubated at pH 7.8 in presence of the synthetic substrate, Na-benzoyl-arginine-p-naphthylamide. The fluorescence of the fi-naphthylamine formed by the enzymic reaction is measured directly in the incubation mixture. The method is easy, rapid and two hundred fold more sensitive than any other reported method. It is possible to determine as little as 5 ng/ml of trypsin in the incubation mixture. The method permits kinetic measurements and is also applicable to the assay of trypsin in pancreatic juice.

Depuis que l’on sait que certains

derives synthetiques

de l’arginine

sont de bons

substrats de la trypsine, des methodes spectrophotometriques ont et& proposees qui permettent de doser la trypsine par mesure d’un des produits de reaction liberes sous l’action de l’enzyme. C’est ainsi que la benzoyl-arginine-$-nitranilide libhe de la $nitraniline qui peut &tre mesuree directement au spectrophotom&rel. De facon analogue, la benzoyl-arginine-/I-naphtylamide (BANA), qui a et6 d&rite par RIEUEL ET WUNSCH comme un substrat specifique de la trypsine, libere de la @-naphtylamine qui peut etre ensuite diazotee et copulee, donnant naissance a un colorant azo’ique mesurable au spectrophotometre2p 3. La @-naphtylamine possede une autre propriete, qui est d’etre fluorescente. Or, nous avons pu constater que la BANA, elle, n’est pas fluorescente. Ces faits nous ont permis de mettre au point la methode de dosage fluorimetrique de la trypsine d&rite ci-apres. Elle se distingue par sa simplicite et offre l’avantage d’etre au moins ZOO fois plus sensible que les methodes spectrophotometriques connues jusqu’ici. R&a&ifs Tampon Tris PH 7.8, 0.05 M. 6.057 g de Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane + 30 ml de HCl N; completer a un litre avec de l’eau bidistillee. (.a) Solution stock de /I-naphtylamine 8. IOO ,ug/ml dans du methanol puriss. Stable une semaine dans un flacon brun a + 4O.

(I)

____*

Directeur:

Dr. M. C. SANZ

DOSAGE FLUORIMETRIQUE DE LA TRYPSINE

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(3) Solution standard

d I ,ug/ml de P-nafihtylamine. Diluer IOO fois la solution stock No. z avec le tampon Tris pH 7.8 No. I. + (4) Tampon Tvis-CaCl, (PH 7.8). 6.057 g de Tris-(hydroxymCthyl)-aminomethane 3.68 g de CaCl, - 2H,O + 30 ml de HCI N; completer a un litre avec de I’eau bidistillee. de Na-benzoyl-D, L-arginine(5) Solutiou de BANA (PH 7.8). IO mg de chlorhydrate P-naphtylamide (Fluka, Buchs SC, Suisse) sont dissous dans 2 ml de methanol; completer a IOO ml avec le tampon Tris-CaCl, (No. 4). Pour les dosages de trypsine entre j et 250 ng/ml*, utiliser une solution preparee le jour meme. Pour les dosages au-dessus de 250 ng/ml, on peut employer une solution conservite jusqu’a 7 jours a + 4O. A ppareils Les dosages de trypsine ont CtC effect& avec un spectrophotometre Beckman DU muni d’un photomultiplicateur et des accessoires pour les mesures de fluorescence (No. 29So). Le filtre d’entree (Corning 5860) a son maximum de transmission a 360 nm ; il elimine les rayonnements ayant une longueur d’onde superieure a 390 nm. Le filtre secondaire (Corning 3389) laisse passer toutes les ondes plus longues que 400 nm. Le diaphragme month: sur le boitier de la lampe a une ouverture de IO mm de diametre. Les spectres d’activation et de fluorescence de la p-naphtylamine ont ete obtenus a l’aide d’un spectrofluorimetre Zeiss (PM(! II + ZFM 4) a deux monochromateurs muni d’une lampe a Xenon comme source lumineuse. Fluovescelzce de la P-xaphtylamine

Alors qu’elle est non fluorescente au-dessous de pH 4, la /3-naphtylamine presente une vive fluorescence bleue en milieu neutre et alcalin. La fluorescence de la @-naphtylamine est aisement mesurable au pH 7.8, qui est le pH optimum de la trypsine. La Fig. I montre les spectres d’activation et de fluorescence d’une solution de pnaphtylamine a pH 7.8. Le maximum d’activation se situe a 338 nm, le maximum de fluorescence a 410 nm. 11 est possible de mesurer la fluorescence de la @-naphtylamine de facon satisfaisante avec le spectrophotometre Beckman DU muni d’un photomultiplicateur et de ses accessoires de fluorescence. La courbe d’ktalonnage de la Fig. 2 montre que la concentration est proportionnelle a l’intensitk de fluorescence entre IO et 2,000 ng/ml. Dosage de In tvyjkte

Dosage de 0.25 a 20 pg/ml de trypsine (dans la solution finale). Dans ce domaine de concentrations, il est possible d’effectuer un dosage rapide par mesure cinetique en tours d’incubation. Techkpe: Dans un bain-marie a 37”, placer une Cprouvette contenant 3 ml de solution de BANA (No. 5) et une Cprouvette contenant la solution de trypsine a doser (solution neutre ou dans HCI 0.001 N). Apres 5 min, mettre I ml de solution de trypsine dans I’eprouvette contenant le BANA, agiter, verser le melange dans une

(I)

m&e)

* Kous utilisons les abrhiations = mp et nM (nanomole)

d’unith = rc+M.

suivantes:

ng (nanogramme)

Clic Chim.

= IO-~ pug,nm (nano-

Acta,

8

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?&ROTH

cuvette de I x I cm et mesurer L’intensitC de la fluorescence toutes les minutes pendant 5 min. Les lectures sont faites par rapport B un standard a I ,ug/ml (5.6 nM/ml) de /I-naphtylamine (No. 3). Nous effectuons nos mesures sans thermostatisation du compartiment a cuvettes. La source lumineuse (lampe de tungstene) est allumee deux heures avant les lectures.

Fig. Tris

I. pH

Spectres d’excitation et de fluorescence de la @-naphtylamine (I pg/ml dans du tampon 7.8). l Spectre d’excitation (fluorescence mesurbe & 410 nm). 0 Spectre de fluorescence (excitation B 338 nm).

Fig. 2. Courbe d’gtalonnage

de la ,&naphtylamine

en solution-tampon

Tris PH 7.5.

Dc cettc fac;on, le compartiment & cuvettes atteint sa temperature d’equilibre (env. pendant les j premieres minutes, la solution a mesurer n’a pas le temps de se refroidir sensiblement et la vitesse de In reaction enzymatique reste constante. La courbe d’etalonnage (Fig, 3) montre que la concentration de trypsine est proportionnelle B l’augmentation d’intensite de fluorescence entre 0.25 et 14 &ml de trypsine dans la solution finale. On a avantage a diluer les solutions B doser contenant plus de 20 pgjml. 31" pour une temperature ambiante de zj”);

fz] Dosage rapide de la trypsine dans le sue pancreatique. Mettre 4 ml de solution de BANA (No. 5) dans une Cprouvette et faisser 5 min ou plus au bain-marie 8.37”. AU

DOSAGE FL~O~I~~T~IQWE DE LA TRYPSINE

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moyen dune pipette de SANZ en polyethyl&ne: ajouter 20 ,uI de sue pancreatique. Melanger, verser dans une cuvette et continuer comme ci-dessus. Si Son a un sue pancr~atique pauvre en trypsine, if faudra en ajouter davantage (roo~l), Des r&&tats obtenus avec cette methode seront pub&% sCparCment. (3) Dosage de la trypsine en concentrations inferieures a I,U g/ml dans la solution

Fig. 3. Courbe d’etalonnage de la trypsine entre 0.25 et 20 pg/ml. En ordonntie: augmentation de fluorescence par minute (l’intensite de fluorescence est exprimee en concentration de B-naphtylamine correspondante). L’activite de I g de trypsine (Boehringer, No. conk. 6172412) en solution a IO &g/ml, rapportQ B Ia @-naphtylamine lib&r&e, est de 64 ,nuM/min.

Mettre une eprouvette contenant 3 ml de solution de BANA (No. 5) au bainmarie B 37’. Laisser 5 min ou plus. Ajouter I ml de solution de trypsine Q doser (solution neutre ou dans HCl 0.001 N) et melanger. Laisser incuber z h & 37” et mesurer la fluorescence aprb exactement z h. Proceder de mCme avec un blanc ne contenant pas de trypsine. La courbe d’~talonnage (Fig. 4j montre qu’il est possible Ctant de de doser des concentrations minimes de trypsine, la limite de sensibilite

finale.

l’ordre de 5 ng/ml

clans la solution

finale.

100

ng/ml

150

200

250

trypsine

Fig. 4. Courbe d’etalonnage de Ia trypsine entre 5 et 250 ng/ml. En ordonnee: augmentation de fluorescence (exprimee en concentration de ~-nap~tylam~ne correspondante) en deux heures ?A 37”. L’activite de I & de trypsine (Boehringer, No. contr. 6172412) rapportbe a Ia /kraphtyIamine lib&&e, est de 62 @Pl/min. Cfin. Chinr. Acta, 8 (1963) 574-573

M. ROTH

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CONCLUSIONS Dans les techniques de dosage fluorimetrique de la trypsine d&rites ci-dessus, la mesure de fluorescence se fait directement sur le melange d’incubation. 11 est ainsi possible d’effectuer des mesures cinetiques pendant que le processus enzymatique se deroule. L’activiti: dun melange contenant I pg/ml de trypsine ou davantage est mesuree en moins de j min. Avec une incubation de 2 heures, il est possible de doser jusqu’a 5 ng/ml de trypsine dans l’incubat. La methode est done au moins 200 fois plus sensible que toutes les techniques d&rites jusqu’ici. REMERCIEMENTS Nous tenons a remercier Mlle Ursula Loos de sa prbcieuse collaboration, ainsi que Xl. le Prof. Denys MONNIER,qui a bien voulu mettre a notre disposition un spectrofluorimetre Zeiss.

Une methode de dosage fluorimetrique de la trypsine est d&rite. La solution & doser est incubee a PIT 7.8 en presence dun substrat synthetique, la Na-benzoylarginine-fi-naphtylamide. On mesure directement sur le melange d’incubation la fluorescence de la ,3naphtylamine qui se forme sous l’action de l’enzyme. La methode est simple, rapide et deux cents fois plus sensible que toutes les methodes d&rites jusqu’ici. 11 est possible de doser 5 ng/ml de trypsine dans la solution finale. La methode se p&e a des etudes cinetiques et est, en outre, applicable au dosage de la trypsine dans le sue pancreatique. BIBLIOGRAPHIE 1 B. F. ERLANGER, N. KOKOWSKY ETW. COHEN, drch.Biochem.Biophys.,95 z A. RIEDEL ET E. WONSCH, 2. Physiol. Chem., 3x6(1959) 61. 3 H. SCHGN,B.R~SSLERETN.HENNING,Z.P~~S~OZ. Chem.,327(1962) M. C. SANZ, Chimia

(Aarau),

(1961) 271. 166.

13 (1959) 192.

(‘lift. Chim. Acta, 8 (1963) 574-578