Action du chlorure de sodium sur l'autolyse de la trypsine

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BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

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ACTION D U C H L O R U R E D E S O D I U M S U R L ' A U T O L Y S E DE LA TRYPSINE JEANNINE YON Laboratoire de Biologie physicochimique de la Facult~ des Sdences, Institut de Biologie physicochimique, Paris (France) (Re~u le i juin 1958)

SUMMARY

Action o/sodium chloride on ~rypsin autolysis Important concentrations of sodium chloride decrease the rate of trypsin autolysis. The kinetics of the reaction is considerably changed: from a second-order reaction without sodium chloride, the process becomes a first-order reaction in response to a molar concentration of sodium chloride. It the same time, the activation energy decreases. Kinetic and thermodynamic analyses led to the assumption that the diminution of trypsin autolysis in presence of salt is the result of a limitation of the denaturation process. Hence, the author earlier observations that sodium chloride protects the structure of native proteins, seems to be accurate.

INTRODUCTION

Aux teml~ratures inf~rieures k 5o °, la trypsine s'inactive selon deux processus qui d6pendent essentieUement du p H i. En milieu de pH inf~rieur ~ 2 ou sup~rieur k I2, la d~naturation est irreversible. Entre p H 2 et p H 9, la trypsine s'inactive en dormant d'abord une forme r~versiblement d~natur~e T', hydrolysable par la trypsine active T, selon le schema propos~ par KUNITZ ET NORTHROp1: k

T~T T+T

•

k 1\

~-TT

,

k8

, > T + Produits

(I) (2)

k, k', kl, k' 1 et ka, repr6sentent les constantes des vitesses dans le sens indiqu~ par les fl~ches. Dans les conditions de p H et de teml~rature favorables ~ l'autolyse, la r~action ob~it k une cin~tique du second ordrel, ~ que limite une inhibition par les produits de la r~action 3. Dans la mesure o/1 de la trypsine irr~versiblement d~natur~e pr~existe, il y a aussi hydrolyse de celle-ci par la trypsine native. S. GUINAND4 ~tudiant la molecule de trypsine au moyen de la lumi~re diffus~e, a remarqu~ qu'en milieu NaC1 1 M la vitesse de formation des produits d'autolyse est Bibliographie p. 85.

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j.

YON

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fortement diminure. D'autre part, nous avons montr6 clans un travail ant~rieu# que les chlorures alcalins retardent l'hydrolyse de la lactoglobuline native sans modifier la constante de Michaelis. Toute modification de l'autolyse de ]a trypsine en prrsence de NaC1 peut rrsulter indirectement d'une action sur l'rquilibre de drnaturation (I) ou plus directement, soit d'un changement dans l'association de T et T', soit d'une variation de la constante sprcifique ks. C'est pourquoi il nous a paru intrressant de drterminer quantitativement l'influence du chlorure de sodium I M sur l'allure de la cinrtique k pH 7.0 et aux temprratures comprises entre 2o° et 45 °. La trypsine irrrversiblement drnaturre ne se formant pas dans ces conditions, nous n'aurons pas k tenir compte de son hydrolyse. TECHNIgUES ~XPtRIMSNTAI.ES Preparation des solutions La trypsine utilis~e est la trypsine Worthington dialys~e eontre HC1 o.oi N jusqu'~ 61imination totale du sulfate de magnesium. On a g~n~ralement utilis~ les solutions d'enzyme Iratchement pr~par~es (depuis 6 jours maximum) et eonserv~es la glaci~re et dans quelques cas, pour contr61e, des solutions pr~par~es apr~s precipitation pr6alable par NaCI de la fraction d~natur6e. Au temps z~ro de l'exp~rienee, on introduit des quantit6s variables de la solution m~re de trypsine dans un volume d~termin~ d'un m~lange de phosphates disodique et monopotassique. Ces m~langes tampons sont tels que le pH final des solutions de trypsine ainsi pr6par~es est toujours 6.96 4- o.o3 et la force ionique o.I. La concentration des solutions de trypsine est obtenue k partir de la densit6 optique6 ~ 28o m~ .e' mg/ml_ 1.58).

Precipitation de la ]raaion d~natur~e par NaCl z M L'enzyme est d'abord purifi6 avant l'addition du tampon phosphate en ajoutant goutte ~ goutte avec agitation continuelle un 6gal volume de NaC1 2 M k la solution de trypsine k pH 2. On lalsse reposer une heure k la temp6rature de la piece et l'on centrifuge pendant une derni-heure k la vitesse de 12,ooo rev./min. On ajoute au surnageant un 6gal volume de tampon phosphate pH 7.20, t~----0.2 (phosphate disodique o.o555 M, phosphate monopotassique o.o445 M) qui eontient en plus NaC1 i M. Le pH des solutions ainsi pr6par6es est 6.63 4- o.o3. Mesure de l'autolyse L'autolyse de la trypsine a 6t6 mesur6e par dosage speetrophotom~trique des produits d'hydrolyse apparus en fonetion du temps et solubles clans l'acide triehlorac6tique 5 %. Les lectures sont faites h 28o mt~, au spectrophotom~tre de Jobin et Yvon. Nous avons 6galement utilis6 une autre m6thode qui eonsiste ~ mesurer l'activit6 r6siduelle de la trypsine, apr~s des temps d'autolyse variables; pour cela, au temps t, 1.o37 ml de la solution de trypsine est pr61ev6 et vers6 clans un tube eontenant o.35o ml d'une solution de HC1 o.I N, afin d'arr~ter l'autolyse (le pH final est environ 3). L'activit6 de ces diff6rents 6ehantillons de trypsine est donn6e par la vitesse initiale Bibliographie p. 85.

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CHLORURE

DE SODIUM ET AUTOLYSE DE TRYPSINE

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de protdolyse d ' u n e solution de/~-lactoglobuline n a t i v e de 3-35 m g / m l k p H 8.00 et 35 °, mesurde p a r la m d t h o d e p o t e n t i o m d t r i q u e 7. Nous avons dtabli le paralldlisme des r6sultats donnds p a r chacune de ces m 6 t h o d e s d a n s diff6rentes conditions, en absence et en prdsence de NaC1 I M (Tableau I). L a premiere mdthode, dosage d u s u r n a g e a n t apr~s p r d c i p i t a t i o n trichloracdtique, a dtd p r i n c i p a l e m e n t utilisde. R~SULTATS

A. Autolyse de la trypsine en absence de NaCl, d pH 6.96 Bien que la cindtique d ' a u t o l y s e de la t r y p s i n e ait dt6 l a r g e m e n t dtudi6e, il nous a sembld ndcessaire d ' e n r e p r e n d r e l ' a n a l y s e d a n s les conditions particuli~res de cette dtude. TABLEAU I MESURE DE L'AUTOLYSE DE LA TRYPSINE

Comparaison des rdsultats obtenus: I. En mesurant l'absorption ~ 28o mp des hydrolysats solubles dans l'acide trichloracdtique ~ 5 %. ~. En mesurant l'activitd protdolytique de la trypsine encore active; on l'exprime par la vitesse initiale de protdolyse par la trypsine non encore hydrolysde, re, ou par la trypsine partiellement hydrolysde, vz, d'une solution de 3-35 mg/ml de lactoglobuline native. t rain

x rag/rot

vz liaisons

P ~ e

p~p~diques rompu~ × xO 7

X/e

d'kydrolyss Vx/Ije

Autolyse de la trypsine en tampon phosphate pH 6.96; e = 500 pg/ml o io 3° 5°

o.o58 o.I61 o.213

25.0 22.o I6. 5 14.o

o.116 0.32 0.43

o.I2 0.34 0.44

Autolyse de la trypsine en prdsence de NaC1 i M; e = 44 ° pg/ml o IO 20 4°

o.o26 0.039 0.065

22. 4 eI.O 19.5 x8. 4

o.o65 0.09 o.15

o.o63 o. IO o.I7

Dggermination de l'ordm de la rgaaion. II a p p a r a i t , en premiere analyse, que la vitesse d ' a u t o l y s e crott n o t a b l e m e n t avec la c o n c e n t r a t i o n initiale de trypsine. Si la rdaction suit une cindtique d ' o r d r e 2 c o m m e cela a 6td g6n6ralement a d m i s L I , la relation: x

kn t ffi -• (e -- -

.)

(3)

doit ~tre vdrifide; d a n s c e t t e expression, e reprdsente la c o n c e n t r a t i o n t o t a l e & e n z y m e , x la q u a n t i t d de p r o d u i t s d ' h y d r o l y s e au t e m p s t, ( e - x) la q u a n t i t d de t r y p s i n e a c t i v e a u m~me t e m p s et kH la c o n s t a n t e d u second ordre. Nous avons effectud une s~rie d ' e x l ~ r i e n c e s ~t 32.2 ° et p H 6.96 p o u r plusieurs Bibliographie p. 85.

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J. Yos

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concentrations de trypsine variant de z o o pg/ml ~ 5.7 mg/ml (at* delk de cette concentration on est fimit6 par la solubilit6 de l'enzyme). L'analyse graphique des r4sultats montre que ]a r4action est bien du second ordre (Fig. I) pour les faibles concentrations de trypsine. Pour une concentration initiale de o.72o mg/ml, la r~action ~ partir d'un taux d'hydrolyse de 2I %, ne suit plus une simple cin4tique d'ordre 2, et s'en 6carte encore plus tbt pour les concentrations d'enzyme sup4rieures. A ce moment la r4action est probablement limit4e par les produits d'antolyse 3, ou par l'existence d'un produit de d4gradation poss4dant encore l'activit6 de l'enzymeS,t Darts la limite des concentrations oh la cin4tique d'antolyse de la trypsine est d'ordre 2, on peut d4terminer la constante kn d4finie par l'4quation (3) comme la pente de la droite repr4sent6e dans la Fig. i : kn = z7 ± 2 moles/1/sec b, 32.2 ° et pH 6.96.

l~quilibre entre la trypsine native et la trypsine d~natur~e. On admet g4n4ralement que l'4quilibre entre T et T' est imm6diat, c'est-k-dire qu'il se trouve r~alis~ h tout instant de la r4action 1 ; la r4action d'hydrolyse constitue le processus le plus lent. Par pr6cipitation par NaC1 x M k pH 2, on peut effectivement d4celer la pr4sence de trypsine r4versiblement d4natur6e x. Ainsi, il nous a ~t~ possible de v~rifier l'existence d'un 4quilibre entre l'enzyme natif et sa forme d6natur4e, au cours du processus d'autolyse (la r~action a ~t4 suivie pendant 30 minutes), et de calculer la constante correspondant k cet 4quilibre en admettant qu'k tout instant de la r4action la concentration de trypsine fibre est 4gale k e - x - (T'), c'est-~-dire que la quantit~ de "IT' est tr6s petite. Cette hypoth6se sera justifi4e au cours de la discussion. On obtient: K = (T')/(T) = o.I 4 h 3o.z ° et p H 6.96 ( T a b l e a u II).

81 7! o 0.200 mg/ml

---, 4

x 0,300 • 0.400 a 0.500

.

• 0.372 • 0.720

.

o

40.3*C

•

35.2 "C

•

*

~ 5

10

I

I

15

20

t

"

2oc I•

I =.

25

m~nutes Fig. x. Autolyse de la trypsine en absence de N a C I ~ p H 6.96 et 32.z°; r4action d'ordre 2 (e : concentration %otale de trypsine, x : concentration de trypsine hydrolys4e, exprim4e en mgInll.

Bibliographic p. 85.

1

1111

5

10

15

20 25 minutes

Fig. 2. A c t i o n de a t e m p 4 r a t u r e s u r l ' a u t o l y s e de l a t r y p s i n e e n a b s e n c e de NaC1 ~ p H 6.96 (e = o,38 m g / m l ; e = o.76 mg/rnl). D r o i t e e n poi nt i l l ~ : v o i r Fig. I.

voL

31

(I959)

CHLORURE DE SODIUM ET AUTOLYSE DE TRYPSINE TABLEAU

79

II

EXISTENCED'UN~QUILIBREENTRETRYPSINENATIVEETTRYPSINED]~NATUP~E (A 3 o, I o e t p H 6.96) t

x

e -- x

(T9

e -- x -- ( T 9

K=(T')/(T)

rng/ml

mg/ml solubles d a ~ TCA

mg/ml

0

0

5 Io

O.314 o.46o

15

0.586

20 25

0.673 0.766

1.90 1.59 1.44 1.31 1.22 1.13

rain

30

0'845

1.O5

insolubles darts NaCl ,r M dpH2

mg/ml

0.20

1.4o 1.25 1.14 1.o8 I.O 0.93

o.19 o.I7 o.I45 O.135 o.125

o.I 4 o.15 o.15

o.13 O. 13

O.14

Action de la temperature. D~termination de l'~nergie d'activation exp~rimentate. Les rdsultats d'une sdrie d'exp~riences faites h plusieurs temp6ratures (3o.1°; 32.2°; 35°; 4o.3 °) sont group6es sur la Fig. 2. Pour chaque temperature, les hydrolyses ont 6t6 effectudes en prdsence d'au moins deux concentrations d'enzyme. Darts l'intervalle de temp6ratures consid~rd, la cin6tique d'autolyse de la trypsine est toujours d'ordre 2, pour les concentrations d'enzyme inf~rieures h I mg]ml. La pente des droites donne k chaque temp6rature, la valeur de la constante du second ordre (Fig. 2). La variation de cette constante avec la teml~rature permet d'obtenir l'6nergie d'activation exl~rimentale/z qui correspond au phdnom~ne global. La pente de la droite log kH en fonction de I/T (Fig. 3) donne: /~ = 64.0oo ± 2000 calories

En accord avec KUNITZ ET NORTHROP 1 n o u s retrouvons, pour le processus global, une valeur de ~ tr~s sup6rieure k l'~nergie d'activation d'une r6action

log kr

log kI

~

x 2

m

'~'.

0.IC

1

0.05

l 3.1

3.2

0~~~'I~ ~~" 3.3

t / T . 10~

Fig. 3- A c t i o n de ]a t e m p 6 r a t u r e s u r l ' a u t o l y s e de la t r y p s i n e - R e p r d s e n t a t i o n d'ARRH~NIUS. E n a b s e n c e de NaC1, droite e n t r a i t plein; e n prdsence de 1NaC1, droite e n pointill6. Bibliographic

D280

p. 85.

10

20

30

40

minutes

Fig. 4. I n f l u e n c e de NaCl s u r I ' a u t o l y s e de la t r y p s i n e ~ p H 6.96 et 30.1 °.

80

J.

v o L 81 (r959)

Yo~

d'hydrolyse enzymatique, ce qui implique n6cessairement une d6naturation pr6c6dant l'attaque enzymatiquO °. L'influence des ions H + sur le processus d'autolyse semble moins important que l'effet de temp6rature. GoRIHI ET FELIXz trouvent ku 6gal k 9o/mole/1/sec k pH 8 et 36°; nous trouvons par interpolation de nos r6sultats (Fig. 3) que kH est 6gal k 48[mole/1/sec ~ 36 ° et pH 7 en accord avec la valeur indiqu6e par KUHITZET NORTHROP (ku = 9/mole/1/sec a pH 7 et 30 ). La constante du second ordre est ~ peme doubl6e lorsqu'on passe de pH 7 k pH 8.

B. Autolyse de la trypsine en presence de NaCl I M D~termination de l'ordre de la r~aaion. En pr6sence de NaC1 I M, on observe une diminution appr6ciable de la vitesse d'autolyse de la trypsine et la solubilit6 de cet enzyme se trouve consid6rablement augment6e, comme GUINAND l'a d6jk observ6 ant6rieurement 4 (Fig. 4). Nous avons cherch6 k d6terminer l'ordre de la r6action dans ces conditions. Les r6sultats exp6rimentaux montrent que la cin6tique d'autolyse n'est plus d'ordre 2 mais d'ordre I. On v6rifie en effet la relation: ktt

= 2. 3 log e/(e - - u)

(4)

kl ~tant la constante du premier ordre. Les r6sultats de plusieurs s~ries d'exp~riences s'0dignent effectivement sur une m~me droite (Fig. 5); la relation du premier ordre se trouve encore v~rifi~e pour des concentrations de trypsine importantes (9.7 mg/ml) et des taux d'hydrolyse de pros de 5o %. On a: kr = (7.5 ~ o.5) I°-5 S~C-1 ~I. p H 6,6o et 320 2

l~quilibre entre trypsine aaive st trypsine d~natur~e. Nous devons noter que, au cours de toute d'hydrolyse en pr6sence de NaC1 i M, nous n'avons jamais vu appalog 0.2 +

x

g/ml LO

0.2

0

m~/ml

I /

i l g.10

,,

• 4.85

.

• 9.70

.

0.5

OJ /

~,~

/,,

50

,

~00

°7.

150 mlnutes

Fig. 5. Autolyse de la t r y p s i n e e n pr(mence de NaC! z M ~ 3z.2 ° - R6action du p r e m i e r order.

Bibliographic p. 85.

0

6

12 18 minutes

-

F i 8. 6. R 6 v e r s i b i l i t 6 de F a c t i o n de NaCI

sur

l'autolyse de I s trypsine. • R ~ c t i o n en absence de NaCI; × R6action apr~s t r a i t e m e n t p r ~ l a b l e p a r NaCI I M et ~limination du sel pax dialyse.

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CHLORURE DE SODIUM ET AUTOLYSE DE TRYPSINE

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rattre de pr~cipit~, m~me si l'on acidifie jusqu'~ p H 2 selon la technique de KUNITZ r~T NORTHROP1; ce qul semble montrer qu'~t aucun moment de la r~action il n'y a accumulation de T'. R~versibilit~ de l'action de NaCl. Une solution de trypsine trait~e par NaC1 I M selon la technique pr~c~demment d~crite a ~t~ dialys~e exhaustivement contre HC1 o.or M ~ 4 °. Nous avons v~rifi~ au moyen d'un interf~rom~tre que la concentration de NaC1, apr~s dialyse, ~tait inf~rieure k Io -4 M. Aux erreurs exp~rimentales pros, la trypsine ainsi trait~e s'autolyse avec la m~me vitesse que l'enzyme qui n'a pas ~t~ trait~ par NaC1 (Fig. 6). L'action de NaC1 est donc r~versible.

Influence de la temperature, t~nergie d'activation exp~rimentale en presence de NaCl z M. L'effet de ls temp6rature sur la ein6tique d'autolyse de la trypsine en pr6sence de NaC1 1 M est iUustr~ par la Fig. 7. Dans l'intervalle de temperatures oh la r~aetion a et6 6tudi6e, la ein6tique reste d'ordre I. De la variation de la constante de premier ordre en fonetion de la temp6rature (Fig. 3), on d6duit: pN=ct = 37.000 4- IOOO calories.

La presence de NaC] i M entra~ne done non seulement un ehangement dans l'ordre de la r~action d'autolyse de la trypsine, mais aussi une diminution appreciable de l'~nergie d'aetivation exl~rimentale.

l,ogA OA

0.3

0.2

*

5

10

=

20 25 minutes Fig. 7. I n f l u e n c e de l a t e m l ~ r a t u r e s u r l ' a u t o l y s e d e 1~ t r y p s i n e ell (e = 3.5 m g / m l ; e = 7.0 m g / m l ) .

|

~5

prSsence de NaCI z M.

DISCUSSION

Les r6sultats obtenus s,appliquent ~ une r~action globale qui comporte une d6naturation suivie d'une hydrolyse enzymatique, ce qui rend l'interpr~tation diflicile. Bibliograpkie p. 85.

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A. Autolyse de la trypsine en absenae de NaCl L'application de la loi g6n6rale des r6actions enzymatiques au processus d'aut olyse de la trypsine, conduit k 6crire: v = k, (TT'). Soit Km la constante de dissociation de TT'. Si l'on adopte avec KVNITZ ~T NORTnROI'1 l'hypoth~se d'un 6quilibre de d6naturation toujours r6alis6, ce qui s'est trouv6 confirm6 par les exp6riences d6crites dans ce travail, on a en outre une constante d'6quilibre K = (T')/(T). L'6quation des vitesses peut done s'6crire: K Dans les conditions les plus g6n6rales, la concentration de (T) libre est ~ tout instant e - - x - - 2CTT') - - (T'). On a donc: [2 K(T) ] K (T) = e - - x - - (T) t---R-~ + ~

(6)

Nous pouvons envisager plusieurs cas selon les valeurs relatives de (T), K et Kra. Premier cas: 2 K(T)/Kra ~ I; cette condition est r6alis6e si la valeur de la constante d'association de l'enzyme pour son substrat est faible par rapport k la concentration de substrat pr6sente. Dans ce cas la vitesse s'exprime finalement par la relation d'ordre 2: k, K v -- Km (K + I) 2 (e -- x)~

(7)

Deuxi~me cas: 2 K(T)/Km ~ I, ce qui signifie que l'affinit6 de l'enzyme pour son substrat est grande; l'expression finale de la vitesse est de la forme: k8 2

v = - - (e - - x);

(8)

la cin6tique est du premier ordre, de plus, cUe est ind6pendante de K et de Kin. I1 existe un troisikme cas interm6diaire lorsque K(T) est de rordre de grandeur de Kra. Dans ces conditions l'expression finale de la vitesse prend une forme complexe difficilement analysable, mais qui ne rend plus compte de la cin6tique du second ordre trouv6e exp6rimentalement. Puisque nous avons trouv6 une cin6tique du deuxi~me ordre, seule r6quation (7) pout s'appliquer ~ la cin6tique 6tudi6e. Elle s'applique tant que la r6action n'est pas limit6e par la pr6sence des produits d'hydrolyse ou m6me par des interactions d'ordre 61ectrostatique susceptibles de se produire pour les fortes concentrations de prot6ines s, xl. L'expression (7) correspond k l'6quation (I), elle permet d'expliciter k partir des constantes k,, K, Kin, la constante du second ordre k u que nous avons d6termin6e exp6rimentalement :

kH

k, K K~ (K + ,)2

(9)

L'6nergie d'activation, /~, mesur6e exp6rimentalement d'apr~s les variations de Bibliographic p. 85.

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CHLORURE DE SODIUM ET AUTOLYSE DE TRYPSINE

83

la constante du second ordre, est donc fonction de la variation de ces diff&entes constantes avee la temp6rature. En d&ivant l'6quation (9) par rapport k l'inverse de la temp6rature absolue, on est conduit ~ la relation: # = AH:# --AHm + AH (* - - K )

K+I

(Io)

L'6nergie d'activation exp6rimentale d6pend donc ~ la fois de l'6nergie d'activation du complexe interm6diaire AH ~, de la chaleur de formation de ce complexe dHm (qui est pratiquement nuJle dans un grand nombre de r6actions de prot6olyses) et de la chaleur de d6naturation AH.

B. Autolyse de la trypsine en presence de NaCl z M En pr6sence de NaCI I M, la r6action d'autolyse est d'ordre I; l'effet de la concentration saline se traduit ~ la lois par une diminution de la vitesse d'hydrolyse, un changement dans l'ordre de la r6action et par une diminution de l'6nergie d'activation exp&imentale. Si l'action de NaC1 s'exer~ait au stade de la r6action d'hydrolyse eJle-m~me sans modifier l'6quilibre de d6naturation, le fait que la cin&ique est d'ordre I impliquerait que Km est devenu petit devant la concentration de substrat (deuxi~me cas). La vitesse de la r6action s'exprimerait alors par la relation (8) ; on pourrait penser que l'affinit6 de l'enzyme pour son substrat s'accroR lorsqu'augmente la force ionique du milieu par suite d'une diminution de certaines r6pulsions ~lectrostatiques entre les groupes charg6s de l'enzyme et du substrat. Dans ce cas d'apr~s la relation (8), la constante du premier ordre kl n'est autre que la moiti~ de la constante sp~cifique de d6composition du complexe interm~diaire k,, et l'~nergie d'activation exp~rimentale iZl~aCl devient : I~acl = AH~Nacl

-

-

RT

(II)

Or la valeur de 36,400 calories parait beaucoup trop forte pour correspondre l'enthalpie d'activation d'un processus enzymatique simple. De plus, on ne peut admettre le fair que l'6quilibre de d6naturation se trouve r6alis6 k chaque instant en milieu NaC1 I M; en effet, k cette concentration saline, la pr&ence de trypsine d6natur6e ne peut plus ~tre d6cel6e exp6rimentalement au cours de l'autolyse. I1 semble donc que l'hypoth~se d'une action directe de NaC1 au stade du processus d'autolyse, ne peut ~tre retenue. I1 reste l'hypoth~se d'une action indirecte du chlorure de sodium sur le processus de d6naturation. Si la vitesse de d6naturation devient le processus le plus lent, c'est-k-dire si v ~ k(T), la r6action est aussi d'ordre I. Ceci exige k ~ ks. L'6quilibre de d6naturation n'est plus satisfait dans les conditions d'hydrolyse et la quantit6 de T' pr6sente k chaque instant est tr~s faible; on a donc: v = k (e-

x)

(x2)

La constante du premier ordre k1 d6termin6e exp&imentalement serait identique la constante k. Cette hypoth~se perlnet d'expliquer ]e changement de ]'ordre de la r6action en Bibliogmpkie p. 85.

84

J. YoN

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pr6sence de NaC1; elle permet en outre, de rendre compte de l'~nergie d'activation exp~rimentale ~ a c l pour la d~naturation de la trypsine. Le passage ~ l'~tat activ~ correspondrait k une variation d'enthalpie de 36,40o calories et une variation d'entropie de 46 u.e. k 42% Ces valeurs sont de l'ordre de grandeur des donn~es thermodynamiques trouv~es pour la d~naturation de quelques enzymes prot~olytiques TM. En conclusion, le chlorure de sodium aux fortes concentrations, en m~me temps qu'il diminue la vitesse d'autolyse de la trypsine, modifie profond~ment l'ailure de la cin~tique. Une action comparable a aussi ~t~ observ~e lorsque la trypsine est ac~tyl~es. Maigr~ la complexit~ du probl~,me, le changement de l'ordre de la r~action et la diminution de l'~nergie d'activation exp~rimentale peuvent s'interpr~ter selon un schema simple. La d~naturation de la trypsine qui precede son autolyse est consid~rablement ralentie par la presence de chlorure de sodium et devient le processus limitant. Quelques haisons faibles sont probablement renforc~es, assurant ainsi une plus grande stabilit~ ~ ]a structure native de l'enzyme. Ce travail confirme donc l'interpr~tation de r~sultats ant~rieurs obtenus d a n s l e cas de l'hydrolyse trypsique de la ~-lactoglobuline native et d~natur~e par la chaleur oh nous avions conclu k un effet protecteur des chlorures alcalins sur les prot~ines natives ~. L'existence d'un ~quilibre entre les Iormes monom~re et dim~re de la trypsine (ce dim~re ~tant different du complexe"lT'), mis en ~vidence en absence et en presence de NaC1 z M, au moyen de la lumi~re diffus~e et confirm~ par ultracentrifugation analytique~, 1~, ne semble pas intervenir sensiblement dans la cin6tique d'autolyse. I1 ressort des 6tudes faites en pr6sence de calcium que la forme monom~re est active; mais rien de permet de pr6sumer qu'elle soit la seule forme active ~,~, ~. REMERCIEMENTS

Ce travail a 6t6 fait au laboratoire du Professeur R ~ WURMSER, que je remercie bien vivement pour l'int6r6t constant qu'il y a apport6 et pour toutes ses suggestions et critiques. Je remercie 6galement Mile S. GUINAND et Mr. J. TONNELATpour les nombreux ~changes de vues qui ont eu lieu au cours de ce travail. Pour routes les discussions que nous avons cues au Laboratoire Carlsberg, je remercie Dr. T. WlSWANATHA, Dr. I. LIENER et tout particuli~rement Dr. GORDOS JOHANSEN dont les critiques m'ont aid6e A la r6daction de ce travail. R~SUM~ La vitesse d'autolyse de la trypsine diminue sous l'effet des fortes concentrations de chlorure de sodium. La cin6tique de la r6action se trouve profondfment modifi6e; d'ordre z en l'absence de chlorure de sodium, elle devient du Ier ordre en pr6sence de NaCI I M, en mgme temps que s'abaisse l'6nergie d'activation exp6rimentale. L'analyse cin6tique et thermodynamique permet de pr6sumer que le sel diminue l'autolyse de la trypsine en limitant le processus de d6naturation. On peut donc admettre que le chlorure de sodium exerce un effet protecteur sur la structure native des prot6ines, comme nous l'avions d~jk observ6. ReJerences p. 8~.

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CHLORURE DE SODIUM ET AUTOLYSE DE TRYPSINE

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ULTRAVIOLET SPECTRAL CHANGES R E L A T E D TO T H E ENZYMIC ACTIVITY OF CHYMOTRYPSIN C. H. C H E R V E N K A

Palo Alto Medical Research Foundation, Palo Alto, Cali/. (U.S.A .) (Received April 22nd, 1958)

SUMMARY

Certain changes in the u.v. absorption spectra of chymotrypsinogen and chymotrypsin have been studied in terms of structure and enzymic activity. The spectral changes during the activation of chymotrypsinogen to chymotrypsin have been found to involve predominantly the absorption of tyrosine residues, and are related to structural changes in only a limited part of the molecule. A spectral change has been found to accompany the autolysis of chymotrypsin; this change is identical to that which occurs during urea treatment of either chymotrypsinogen or chymotrypsin. In both cases the difference spectra result from a wavelength shift in the absorption of tryptophane and probably all of the chromophoric amino acid residues. A simple method for estimating the extent of autolysis or denaturation in solutions of proteins has been suggested.

INTRODUCTION

Although the chemical changes occurring during the tryptic activation of chymotrypsinogen to 8-chymotrypsin have been shown to be comparatively simple 1, the appearance of enzymic activity is paralleled by important configurational changes s. Because of the relationship between the light absorption of the chromophoric amino Re/erences p. 95.