Effets in vitro de la ribonucléase sur les cellules de la moelle osseuse et sur les cellules d'ascites du carcinome de Landschütz

v o L 26 (1957)

BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

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EFFETS I N VITRO DE LA RIBONUCL~ASE SUR LES CELLULES DE LA MOELLE OSSEUSE ET SUR LES CELLULES D'ASCITES DU CARCINOME DE LANDSCHOTZ A. PILERI, L. LEDOUX* ~T F. VANDERHAEGHE Laboratoire de Morphologie Animale, Universitd Libre de Bruxelles (Belgique)

INTRODUCTION De n o m b r e u x t r a v a u x ont montr6 que la ribonucl6ase (RNase) peut ~tre u n agent i n h i b i t e u r puissant de la croissance et de la division celhflaires 1-1°. Brachet a cep e n d a n t signal6 que t o u s l e s organismes trait6s par l ' e n z y m e ne lui sont pas 6galement sensiblesn . C'est pourquoi, il nous a p a r u int6ressant de comparer les effets de la RNase sur deux types de cellules diff6rentes qui, chez les Mammif~res, se caract6risent par une activit6 mitotique intense: les cellules d'ascites de la t u m e u r de Landschfitz et celles de la mo~lle osseuse. LEDOUX ET PILERIlz ont montr6 que la RNase p6n~tre dans ces deux types de cellules lorsqu'elles sont incub6es in vitro; nous examinerons ici les r6percussions de ce ph6nom~ne sur le m6tabolisme de l'acide ribonucl6ique (ARN) et des prot6ines. A cet effet, nous avons suivi l'incorporation de pr6curseurs radioactifs dans ces deux c o n s t i t u a n t s : l'ad6nine qui s'incorpore dans les purines de I ' A R N et l'acide orotique qui s'incorpore essentiellement dans les pyrimidines de cet acide nucl6ique; la ph6nylalanine a 6t6 utilis6e comme pr6curseur des prot6ines. Des exp6rienees pr61iminaires1~, faites au m o y e n de formiate sur les cellules d'ascites in vitro, a v a i e n t d6jk montr6 que le m6tabolisme des pyrimidines de I ' A R N est augment6 en pr6sence de la RNase, alors que celui des purines n ' e s t pas modifi6. Mais comme le formiate ne s'incorpore que tr~s faiblement dans les pyrimidines, nous avons cru utile de v6rifier ces r~sultats k l'aide d ' u n pr6curseur plus direct des pyrimidines: l'acide orotique. TECHNIQUES Les cellules ascitiques de la tumeur de Landschfitz proviennent de souris inocuMes depuis 8 jours. La suspension ascitique, Mg~rement dilu6e avec du NaC1 8. 5 °]00 sterile, est incub6e A 37 ° C (dans des tubes A essai agit6s par un mouvement rotatoire) en pr6sence de I /~c/rnl d'ad6nine-8-14C, d'acide orotique-2-14C ou de ph6nylalanine-3-14C. Les suspensions de cellules sont incub6es en l'absence ou en pr6sence de RNase P.E.V.Y.A., fraction A. La rno~lle osseuse est pr61ev6e darts les f6rnurs et les tibias de 4 jeunes rats et r6colt6e dans un hornog6n6iseur contenant le milieu d'incubation suivant: NaC1 8.5 °/00:15 rnl glucose (36 rng/rnl de tarnpon PO4-=M/io, pH 7.2) : 5 rnl. Les cellules sont raises en suspension et les gaines conjonctives sont 61irnin6es.Des experiences pr61irninaires nous ont montr6 que le lavage des cellules par du NaC1 8.50]00 est d~favorable leur m6tabolisrne nucl6ique: la vitesse d'incorporation des pr6curseurs diminue tout au cours de l'incubation. Les cellules sont incub6es en pr6sence de 1.2/~c/ml, o.75/zc/ml d'acide orotique * Charg6 de Recherches au Fonds National de la Recherche Scientifique. Bibliographie p. 516.

RNase

RNase

705 4- 6 0 135 4- 9 19 4- 3

55 ± 5 43 + 3 80 4- tO

60 rain

5.3 4- 0 . 9 0 . 8 4 4- 0 . 0 4 16. 3 ± 0 . 2

3 6 5 4- 80 192 + 21 53 4- 6

IO 4- 2 34 ± 3 34 ° ~: 5 0

~r2o mir~

1 1 5 o ~: t o o 3 1 o 4- 18 27 -4- 2

49 ± 3 54 ± 6 I I O 4- 8

9° m i ~

Moelle osseuse

4.5 ± 0.3 o . 7 5 4- 0 . 0 2 16.5 4- 0.5

2 5 8 4- 25 14o • 9 53 4- 8

i o :~: i 18 4- 2 1 8 o 4- 3 °

80 m i n

1.2o 4- 0 . 0 9 0 . 8 8 4- 0 . 0 5 o . 1 6 j : O.Ol 5 0 . 2 2 6 4- O.Ol 5 13. 3 ± 1. 5 2 0 . 0 4- 2 . 0

860 ± 90 181 4- 12 21 4- 3

33 ± 2 18 4- ~ 55 ± IO

35 rain

5 . 6 -E 0.2 o.41 4- 0 . 0 3 7.3 4- 0.3

2 2 o :c 17 i o o 4- 16 45 4- 5

17 4- 3 8 ± 2 4 7 4- 12

4 ° rain

1.31 4- o . 1 2 0.06 io.oo5 4 . 6 4- 0 . 8

5 6 5 4- 3 ° 79 ± 5 14 4- 2

2 7 4- 2 8 ± I 3 ° 4- 2

15 rain

i . o i 4- o . i o o.156 -- 0.09 15. 5 4- 2.o

1.26 4- o . 0 8 0 . 2 3 2 4- O.Ol 5 18. 4 4- 2.1

lO7O + 80 2 3 6 :c 2 0 22 ± 3

8o 5_ 5 56 4- 6 7 ° 4- 12

6o rain

4 . 7 ~: 0.3 0 . 7 2 4- 0 . 0 4 15. 5 ± 1. 5

2 9 8 4- 15 151 4- 9 51 4- 5

35 4- 3 25 4- 3 73 4- i o

80 rain

Conlr61e

Contrdle

1 5 3 o i 15o 2 7 5 4- 35 18 i 2

3° ± 4 18 4- I 60 - - IO

35 rain

5.5 ± 0.2 0 . 6 0 4- o . I o i i . o 4- 1. 3

I 7 6 ± 15 77 -~ 8 4~ J : 5

39 4- 4 7 4- 2 18 4- 8

4o rain

132o ± 15o 305 ± 31 23 q- 3

6 7 4- 4 67 ± 7 tOO 4- 9

9 ° rain

5.4 4- 0.3 0 . 8 6 4- 0 . 0 4 16.o ± 2 . 0

3 9 2 4- 12 2 0 4 ! 20 52 i 6

19 4- 2 33 ± 4 17o 4- i o

r2o rain

V a r i a t i o n a u c o u r s d u t e m p s d e s r a d i o a c t i v i t d s s p 6 c i f i q u e s d e la f r a c t i o n a c i d o s o l u b l e , d e ] ' A R N e t d e s p r o t 6 i n e s e t v a r i a t i o n d u p o u r c e n t a g e d ' i n c o r p o r a t i o n d a n s I ' A R N e t les p r o t 6 i n e s e n p r 6 s e n c e d e d i f f 6 r e n t s p r 6 c u r s e u r s r a d i o a c t i f s . A S = c o u p s / m i n / U . D . O 2 6 o m / ~ o u c o u p s / m i n / U , a c . a m i n d s ; A R N = c o u p s / m i n / U . D . O 2 6 o m / , ; I n c . = A R N / A . S . × IOO; P r o t . = c o u p s / m i n / U. a c . a m i n 4 s .

1.o8 ± 0 . 0 7 0 . 0 6 5 4- 0 . 0 0 5 6 . 0 4- o . i

555 4- 27 i o o :c 5 18 4- 2

Adenine-8-14C

Ph6nylalanine-3-1'tC

23 ± i 7"5 :~ 0 ' 5 32 4- 3

Ac. orotique-2-14C

z 5 rain

A.S. Prot. Inc.

Ph6nylalanine-3-14C

Prdcurseurs

A.S. ARN Inc.

A.S. ARN Inc.

Ad6nine-8-14C

Ac. orotique-2-14C

Prdcurseurs

I

de Landschiitz

TABLEAU Tumeur

wx

~~n ~

O

>

~0

©

0"1

> *o

-~

VOL. 26 (1957)

EFFETS in vitro BE LA RIBONUCLEASE

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ou 3 #c/ml de ph6nylalanine. Elles sont agit6es ~ 37 ° C, Les suspensions qui doivent 8tre trait6es par l'enzyme re~oivent 3 mg/ml de RNase P.E.V.Y.A. (fraction A). Des volumes de o. 5 ml de la suspension d'ascites sont pr61ev6s apr6s 4o, 8o ou 1,2o min &incubation; o.2 ml de la suspension des cellutes de la moelle osseuse sont pr61ev6es apr~s 15, 35 et 60 min. Les cellules sont s6par6es du milieu d'incubation par centrifugation et lav6es deux fois dans 4 ml de NaC1 8.50/00. On proc~de ensuite /~ l'extraction de la fraction acidosoluble, de I'ARN et des prot6ines selon la m6thode d6j~ ~ d6crite pr6c6demment aa. On d6termine alors la radioactivit6 sp6cifique globale de ces 3 extraits et on calcule le pourcentage d'incorporation de l'ad6nine et de l'acide orotique dans I'ARN et celui de la ph6nylalanine dans les prot6ines. Dans ce dernier cas, la radioactivit6 sp6cifique de la fraction acidosoluble a 6t6 d6termin6e en rapportant le nombre de coups/min/ml d'extrait /t la teneur de celui-ci en acides amin6s dos6s par la m6thode de LOWRY et al. 14. Dans des premi6res exp6riences in vitro1~ nous n'avons pas d6termin6 la radioactivit6 sp6cifique de la fraction acidosoluble et nous avons donc n~glig6 l'effet de la RNase sur les dimensions du pool des prdcurseurs intracellulaires. RESULTATS ET DISCUSSION

Les r 6 s u l t a t s que n o u s r a p p o r t o n s d a n s le T a b l e a u I m o n t r e n t que d a n s les t u m e u r s d'ascites, la R N a s e d o u b l e la v i t e s s e d ' i n c o r p o r a t i o n de l ' a c i d e o r o t i q u e d a n s I ' A R N , t a n d i s que celle de l ' a d 6 n i n e n ' e s t pas modifi6e. Ces r 6 s u l t a t s c o n f i r m e n t c e u x q u e nous a v o n s d~ik o b t e n u s in vivo a v e c les m ~ m e s pr6curseurs et in vitro a v e c le f o r m i a t e r a d i o a c t i f 13. D e m ~ m e , n o u s n ' o b s e r v o n s pas plus in vi#o qu'in vivo d'effet immddiat de la R N a s e sur le m 6 t a b o l i s m e des prot6ines. TABLEAU II VITESSE D'INCORPORATION DU PBI~CURSEUR ACIDO-SOLUBLE DANS LES PROT]~INES OU I ' A R N PRESENCE OU EN ABSENCE DE R ~ A S E Phdnylalanine-3-1*C contr61e

Tumeur de Landschfitz Moelle osseuse

RNase

6%/heure 18 % / h e u r e

Ad/nine-8J*C contr6Ie

RNase

9%/heure 8 %/heure

EN

Ac. orotique-2-1*C contr61e

RNase

112 % / h e u r e 2 2 o % / h e u r e 53 % / h e u r e

E n ce qui c o n c e r n e les cellules de la mo~lle osseuse, la R N a s e ne modifie ni le m ~ t a b o l i s m e des prot~ines, ni celui de I ' A R N . E l l e ne p r o v o q u e pas n o n plus l ' a u g m e n t a t i o n t r a n s i t o i r e d u r a p p o r t A R N / A D N q u e l ' o n o b s e r v e d a n s les cellules d ' a s c i t e s a6. C e t t e difference de c o m p o r t e m e n t des d e u x t y p e s de cellules p e u t ~tre mise aussi en ~ v i d e n c e p a r des o b s e r v a t i o n s c y t o c h i m i q u e s : alors que la b a s o p h i l i e des celhfles d ' a s c i t e s a u g m e n t e p e n d a n t les p r e m i e r e s m i n u t e s qui s u i v e n t la p ~ n ~ t r a t i o n de la R N a s e p o u r d i m i n u e r ensuite, celle des cellules de la mo~lle osseuse n ' e s t pas modifi~e p a r l ' e n z y m e . L ' i n t e r p r ~ t a t i o n de ces r ~ s u l t a t s d o l t t e n i r c o m p t e des faits s u i v a n t s : b i e n que la q u a n t i t ~ de R N a s e q u i p~n~tre d a n s les cellules d ' a s c i t e s e t de la mo~lle osseuse soit d u m ~ m e o r d r e de g r a n d e u r , la t e n e u r i n i t i a l e en e n z y m e a u g m e n t e de 2o k IOO fois d a n s le p r e m i e r cas, t a n d i s q u ' e l l e d o u b l e s e u l e m e n t d a n s le s e c o n d 12. D ' u n a u t r e c6t~, l ' e x a m e n du T a b l e a u I I r~v~le que les v i t e s s e s d ' i n c o r p o r a t i o n de l ' a d ~ n i n e et de l ' a c i d e o r o t i q u e different f o r t e m e n t d a n s les d e u x cas ~tudi~s ici. Sans p o u v o i r t i r e r de conclusion d~finitive de ces e x p 6 r i e n c e s in vitro, il semble, n ~ a n m o i n s , q u e les c a r a c t ~ r i s t i q u e s d u m ~ t a b o l i s m e cellulaire p u i s s e n t r e n d r e c o m p t e des effets obt e n u s et p e u t - ~ t r e e x p l i q u e r les diff6rences observ~es au cours de F a c t i o n de la R N a s e sur diff~rents t y p e s cellulaires. B i b l i o g r a p h i e p. 5~6.

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A. PILEI~I, L. LEDOUX, F. VANDERHAEGHE

VOL. 2 6

(I957)

E n c o n c l u s i o n , l ' 6 t u d e i n vitro d e s cellules d e la m o e l l e o s s e u s e n o u s m o n t r e q u e la R N a s e p e u t p 6 n 6 t r e r d a n s c e r t a i n e s cellules s a n s y m o d i f i e r s e n s i b l e m e n t le m 6 t a b o l i s m e d e I ' A R N , n i celui d e s p r o t 6 i n e s . L ' 6 t u d e parall~le d e s cellules d e l a t u m e u r d e L a n d s c h f i t z n o u s i n d i q u e , d ' a u t r e p a r t , q u ' a u c o u r s d e l a prerni~re p h a s e d e s o n a c t i o n , t o u t a u m o i n s , l a R N a s e acc61~re l ' i n c o r p o r a t i o n d e s b a s e s p y r i m i d i q u e s d a n s I ' A R N s a n s a l t 6 r e r le m 6 t a b o l i s m e d e s b a s e s p u r i q u e s n i celui d e s p r o t 6 i n e s .

R~SUM~ La pdndtration de la ribonucldase dans les cellules d'ascites de la tumeur de Landschfitz traitdes

in vitro s'accompagne d'une 616vation importante du m6tabolisme des bases pyrimidiques de I'ARN; le mdtabolisme des bases puriques de I'ARN et celui des protdines ne sont pas modifi6s par l'enzyme. Darts les cellules de la moelle osseuse, trait6es in vitro, la ribonucl6ase ne modifie pas le mdtabolisme de I'ARN ni celui des protdines. Les faits observds sont mis en relation d'une part a v e c l a variation de la teneur en ribonucldase des deux types de cellules et d'autre part, avec les propridtds de leur mdtabolisme nucl6inique. SUMMARY Penetration of ribonuclease into cells of Landschiitz ascites tumour, treated in vitro, is accompanied by an important elevation in the metabolism of the pyrimidine bases of RNA; the metabolism of the purine bases of RNA, and t h a t of proteins, is not modifed by this enzyme. Ribonuclease does not modify the metabolism of RNA or of proteins in the bone marrow cells, treated in vitro. The observed facts are brought into relation with the variation in ribonuclease content of the two types of cells, and, on the other hand, with the properties of their nucleinic metabolism. BIBLIOGRAPHIE 1 B. P. KAUFMANET N. K. DAS, Chromosoma, 7 (1955) 38. J. BRACHET, Nature, 174 (1954) 876. 3 j . BRACHET, Nature, 175 (1955) 851. 4 L. LEDOUX, J. LE CLERC ET F. VANDERHAEGHE,Nature, 174 (1954) 793. 5 j . BRACHET ET L. LEDOUX, Exptl. Cell Research, suppl. 3 (1955) 27. e L. LEDOUX, Nature, 175 (1955) 258. L. LEDOUX, Nature, 176 (1955) 36. 8 H. FIRKET, S. CH~VREMONT-COMHAIREET M. CH~VREMONT, Nature, 176 (1955) Io75. 9 C. CASTERMANET R. JEENER, Biochim. Biophys. Acta, 16 (1955) 433. 10 A. A. HADJIOLOV ET L. ZACHARIEVA,Naturwiss., 44 (1957) 45. 11 j . BRACI-IET, Pubbl. stag. gool., Napoli, 27 (1955) 146. as L. LEDOUX ETA. PILERI, Biochem. J., 66 (1957) 25 P. 13 L. LEDOUX ET F. VANDERHAEGHE, Biochim. Biophys. Acta, 24 (1957) 34 o14 O. K. LOWRY, N. J. ROSEBROUGH, L. FARR ET R. J. RANDALL,J. Biol. Chem., I93 (1951)265. 15 L. LEDOUX, E. BALTUS ET F. VANDERHAEGHE,Arch. intern, physiol., 64 (1956) 135. 16 L. LEDOUX, Biochim. Biophys. Acta, 20 (1956) 369. R e s u le 25 j u i n 1957