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Incorporation In vitro de glycine-1-14C dans les cellules individuelles de la moelle osseuse
Experimental
CeU Research,
INCORPORATION CELLULES
6, 69-75
IN
VITRO
DE
INDIVIDUELLES A. FICQ,
Laboratoire
69
(1954)
F.
DE GAVOSTO
de Morphologic
GLYCINE-1J4C
animale, Rep
LA
et M. Univcrsite’
le 27
Avril,
MOELLE
DANS
LES
OSSEUSE
ERRERA Libre
de Bruxelles,
Belgique
1953
LA technique autoradiographique basee sur l’observation des traces individuelles Cmises par un element radioactif (2) offre sur la methode classique, oti l’activite se mesure par le noircissement, plusieurs avantages apprtkiables: elle permet, en effet, de localiser avec precision l’element en question, pour autant que l’emulsion sensible soit en contact intime avec la preparade mesurer la valeur relative des phirnomenes par le tion histologique, comptage des particules Cmises, et enfin d’eviter certaines confusions dues h des artefacts: la precipitation parasite des grains d’Ag par des substances reductrices pouvant exister dans les tissus ou la pigmentation naturelle de certaines preparations, par exemple. 11 nous a paru utile de mettre au point une technique bake sur ce principe et de l’appliquer a un materiel biologique bien connu et relativement facile a utiliser: c’est le cas de la moelle osseuse (5). Altmann et crl. ont dCmontrE l’existence d’une incorporation de glycocolle, marque au l*C, dans les cellules de la moelle osseuse (1). Boyd et aZ. (3) ont donne la preuve autoradiographique de ce phenomitne, en etudiant le noircissement de l’dmulsion par les cellules individuelles. La mCme technique a Cte appliquee par Morse (8) en utilisant cette fois du ST.
MATBRIEL
ET
MBTHODES
Dans la presente experience, des fragments de moelle osseuse sont preleves dans les OS longs d’un rat. Les cellules sont disperskes dans du Ringer citrate dkpourvu de Ca++, a l’aide d’un homogCnCiseur en verre du type Potter. La suspension cellulaire est filtree sur de la gaze, centrifugee pendant 5 minutes SI2.500 t/m et remise en suspension dans la m&me solution. L’incubation a lieu a 37”, en prksence de glucose M isotonique et de tampon au phosphate - a pH 7.5. La suspension contient environ, 30
par mm3, carboxyle 47 - 533705
1C6 cellules et 150 y de glycocolle, sont marques.
dont
60 “/b des atomes
Experimental
de carbone
Cell Research
du
6
A. Ficq, F. Gavosto et M. Errera Aprks incubation, la suspension cst diluCe de man&e ti obtenir une dispersion cellulaire satisfaisante sur des lames prkalablement gClatinCes; les frottis sont ensuite fix& B l’alcool mkthylique. 11s sont rccouverts d’knulsion Ilford G 5 u in gel form H diluCe au tiers par de l’eau bidistillke, fondue Sl 45” puis rcfroidic aux environs de 35”: B cette temperature, le dommagc causC aux cellules est minime et l’on pcut kviter l’emploi d’un film protectcur (formvar, plcxiglas) qui diminuc la rksolution. 1,‘Cpaisseur dc l’kmulsion sbche est estimke ti 40 p environ aprks fixation. Nous avons pro&d6 au dCveloppcmcnt photograpbique aprks des expositions dc G ct de 12 beures; l’incubation &ant effect&c dans mi milieu fortcmrnt radioactif, une durCe brkve d’exposition est suffisante pour clue l’obscrvation soit ais& ct qu’ les Clectrons du background puissrnt Ctre nCgligCs. Aprks lc dCveloppement au rCvClatcur Kodak X, fixation dans une solution d’hyposulfite de Na 1/3 saturke et lavagc soigncux 5 l’eau courante, les prkparations sont colorkes suivant la tcchniquc habituelle de May Griinwald-Giemsa. Dans les cas oil lc temps de coloration n’a pas CtC trop prolong@ (4 minutes dans le hleu de mCthylbnc, . eosme 1/3, suivi de 15 minutes dans 1’azurCosine diluC dans l’cau au 1/20e), l’identification des cellules cst parfaitcmrnt possible malgrC la couche dc gklatinr ct la longuc incubation in vitro.
RkSULTATS
EXPl?RIMENTAUX
L’expPrieiwe dCcrite dans le prPsent travail a port6 sur l’esaincn d’environ 800 cellules de chaquc lame apribs resprctivement 6 et 12 heures d’esposition (le temps dtant compt6 Si partir du moment oil 1’6mulsion est s&he). Les rkultats sent rassemblk dans le tableau 1 et dans le graphique 1. Quelques microphotographies permettent de jugcr de 1’Ptat dcs ccllulcs (Figs. 1, 2, 3). On constate, tout d’abord, que le pourcentage des cellules marquees est deux fois plus considErable dans le frottis exposd pendant 12 heures que dans celui expose pendant 6 hem-es seulement. on assiste Zi une diminution En cc qui concerne la &rie granulocytairc, considPrable de la radioactivitk des cellulcs au cows de leur maturation. Pour donner uric id@e de la radioactivit6 spkifique de chaque crllulr, leur diamCtre a 6th mesurc: il varie de 10,2 IJ- pour les cellules les plus actives B 7,:) I* pour les mains activcs, ce qui correspond h une variation de volume de l’ordre de 3 ii 1 (cfr tableau I). Si on ramPne les activitks par cellule h une valeur corrigde pour le volume individucl de chaque cellule, on obtient une itvaluation approsimatire de (( l’activitk spkifique 1). On suppose, dans ce cas, que lcs ccllulcs conservent sur le frottis une forme sphkrique, ce qui correspond h la correction maxima. La valeur ainsi obtenue n’est dvidemment qu’une valeur approchEe, puisqu’il n’est pas tenu compte de la densit ties cellules. Une mitthode ha&e sur une mesure interfPromPtrique Experimenlnl
Cell Kesenrch
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Incorporation
in vitro de glycine-l-l% I
TABLEAU
I
Exposition
I’
557
71
6 h.
Exposition
3
2
12 h.
6
(6) ~, (12) I’romydocylrs
510
.
12
6 1 50
98
3~ (21P /
200
360
7 (22)
116
228
63
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295
87 17
73 70
310 1 95
-49 30
30 54
114 175
MlJPl0CfJte.S
neutrophiles cosinophiles
86 2
52
236 3.53
185 49
66 18
209 3 10
212 60
24 12
125
~ 67
1
158
50
36 37
152 103
119 21
125 20
60 65
16-t 55
)
i
A~l&m7yCloc~yfes ncutrophiles cosinof)hiics Leitcocyles ncutrophiles cosinophilcs
~
A-
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Er{ylhroblastes basophiles polychrom. orthochrom. Httmalies
1
. . . . . . . . .(
8
3
180
4
(i, 18 (21)
37
56
I
t
reticulocytes
3
.
.
. I
Prolymphocytes . Lymphocytes . . Histiocytes jeunes . Plasmocytes . . Jlegararvocvtes
I
Total3I
3 88
-
2.2 1
8
1 11
12.5
170 2 2 1
891
135
22”
1
785
115 26
362
/
36
/
traces par cellule ~~ x100. vol. rellule * I.es chiffres entre parentheses proviennent de cellules comptees isolement. Les autres etii determinCes au hasard comme on le fait dans le cas des myelogrammes habituels. 3 Dans le total ne sont pas comptes les chiffres entre parentheses. 1 eActivitC
specifiquer:
Experimental
Cell Research
ont
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A. Ficq, F. Gavosto et M. Err-era
3
Fig. 1. Trois leucocytes polynuclCaires; le plus petit est un neutrophile, deux autres sont des Cosinophiles. Fig. 2. Un normoblaste orthochromatique. Fig. 3. Un mykloblaste.
les
des constituants cellulaires (4) serait certainement plus exacte. Notons quc cette correction due aux variations dc volume cellulairc modifie assez fortement l’allure gbn&ralc du ph:“omi~nc obscrvP, commc on peut s’en rendre comptc en comparant les graphiqucs I A et II. A,joutons clue l’on n’a pas pris en considdration l’ahsorption dcs Plectrons au win des cellules ellcsplus consid&rahle que lc diamirtre m8mes. Cette absorption cst d’autant cellulaire est plus grand: unc telle correction, dans lc cas qui nous prEoccupc, aurait plut6t tendance j augmenter la radioactivit& spkifiquc des cellules lcs plus volumincuses. Experimental
Cell Reseccrch 6
Incorporation
in vitro de glycine-1-W
73
2w
0
C
. IOC
i. \ \
.
0
Fig.
Fig. I. Radioactivite des divers types de cellules de la moelle osseuse au tours de leur maturation. Ordonnees: nomhre de traces par cellule x 10% x 0, apres 12 heures d’exposition; 80, apres 6 heures d’exposition (resultats x 2). Fig. II. C
8
L
I.
‘Oc -
\t/ 0
/“\es
e*oshoyhi
x *
A
sp 0
100 -
Fig.
II.
Les phenomenes observes sont fort semblables dans le cas des cellules de la serie lymphocytaire et dans celui des globules rouges. Dans la lignee rouge, les erythroblastes presentent une incorporation encore assez importante, tandis que les erythrocytes arrives a maturite n’ont qu’une activite negligeable qui peut probablement &tre attribuee aux reticulocytes. Ces constatations concordent bien avec les resultats des travaux de Altman (l), Shemin, London et Rittenberg (7, 9) et Chantrenne et Koritz (6) Ctablissant que la synthese de l’hemoglobine n’est plus possible dans les 5 - 633705
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A. Ficq, F. Gavosfo ef M. Errera
Crythrocytes non nucles alors qu’elle l’est encore dans les reticulocytes les cellules plus jeunes. Cette synthese debute au stade proerythroblaste a lieu au tours de toute la maturation (10).
et et
DISCUSSION
Nos resultats sont, dans une certaine mesure, cornparables a ceux de Morse, obtenus au moyen de 32P* , toutefois, dans le cas present, on observe une activite non negligeable des leucocytes mQrs. Dans le travail de Morse, il n’y a d’activite leucocytaire que si l’animal a 6th inject6 21 heures avant la preparation des frottis. Mais la technique de noircissement utilisee par cet auteur, qui n’etait pas suivie d’un comptage des grains ou d’une etude photometrique, est t&s loin d’$tre quantitative. Les constituants marques dans les cellules au tours de l’incorporation de la glycine-1-W sont vraisemblablement des proteines ou des groupesp rosthetiques qui leur sont associes (acides nucleiques, cytochromes, heme). Un fractionnement cytochimique devrait permettre de preciser ce point (5). D’autre part, l’utilisation de precurseurs marques, plus specihques de certains groupements, devrait fournir des renseignements plus precis encore. Des experiences analogues a l’aide d’acide orotique marque (precurseur des pyrimidines) sont en tours et elles donneront vraisemblablement d’utiles renseignements sur la synthiise des acides nucleiques. De m&me, l’utilisation d’inhibiteurs competitifs marques pourrait peut-&tre permettre egalement une localisation cytochimique d’un enzyme don& a condition que ces inhibiteurs soient suffisamment specihques. Nous n’avons pas tent& dans le present travail, de localiser le point d’origine de chaque trace. De telles observations sont certainement possibles a l’aide de la technique utilisee. Notons toutefois que les erythroblastes ont montre un certain nombre de traces issues du noyau, d’autres du cytoplasme. Dans le cas des myeloblastes, des traces ayant leur origine dans le nucleole ont et6 observees avec certitude, dans un nombre non negligeable de cas. Cependant, il serait certainement preferable d’operer sur des coupes suffisamment minces au lieu de frottis, afin d’eviter toute incertitude du fait des constituants cellulaires situ& au dessus ou en dessous de l’organite qui parait emettre l’electron. Le choix de cellules de taille plus grande que celles de la moelle osseuse facilitera beaucoup ce travail de localisation. Des experiences sur des amibes et des cellules embryonnaires sont d’ailleurs actuellement effect&es par l’un de nous (A. F.). Nous pensons que la technique que nous avons mise au point se revelera Experimenfal
Cell Research
6
Incorporation
in vifro de glycine-1-l*C
75
d’une trbs grande utilite car elle permettra de mesurer avec une assez bonne precision l’activite specifique des divers types de cellules; elle completera ainsi utilement toute etude du metabolisme d’un tissu complexe au moyen d’isotopes. Precisons enfin, que la methode utilisee est susceptible en principe de donner des resultats en valeur absolue: connaissant le nombre de traces, la duree d’exposition et la periode de l’isotope, il est possible de calculer, par cellule, le nombre de molecules incorporees; mais, comme nous l’avons fait remarquer, les corrections dont il faut tenir compte devront faire l’objet d’une etude minutieuse.
Une technique autoradiographique basee sur l’observation des traces individuelles Cmises par un element radioactif au sein d’une cellule a 6th mise au point en ce qui concerne les cellules de la moelle osseuse. Les resultats obtenus au moyen de glycine-l-C,, ont montre une incorporation particulierement intense au sein des cellules jeunes; l’incorporation diminue progressivement au tours de la maturation, pour devenir presque nulle dans le cas des hematies. Les leucocytes polynucleaires et les lymphocytes mQrs sont le siege d’une incorporation non negligeable. Toute notre gratitude va au Professeur G. Occhialini qui nous a guides dans l’application de la technique autoradiographique. BIBLIOGRAPHIE 1. ALTMAN,
K. I., CASARETT, G. W., Chem., 176, 319 (1948).
2. BOYD,
G. A.,
CASARETT,
G. W.,
MASTERS, ALTMAN,
R. E., NOONAN, K.
I.,
NOONAN,
T. R., et SALOMON, T. R.,
et SALOMON,
K.,
J. BioI.
K.,
Science,
108, 529 (1948). 3. BOYD,
G. A., CASARETT, G. W., et WILLIAMS, A. I., Stain TechnoZ., 25, 17 (1950). H. G., et WILKINS, M. H. F., Nature, 169, 541 (1952). intern. Biochimie. Masson. M., Symposium SUP l’Ht!matologie du 2e Congris
4.
DAVIES, 5. ERRERA,
Paris
(19521. 6. KoR&, 7. LONDON, 8. MORSE, 9. SHEMIN, 10. THORELL,
S.; et CHANTRENNE, I. M., SHEMIN, D.,
H., Biochim. et Biophys. Acta (sous presse) (1953). et RITTENBERG, D., J. Biot. Chem., 173, 797 (1948). W. I., Amer. J. med. Sci., 220, 522 (1950). D., Cold Spring Harbor Symposia Quant. Biol., 13, 185 (1948). B., Acta med. Stand. suppl. (1947).
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LA technique autoradiographique basee sur l’observation des traces individuelles Cmises par un element radioactif (2) offre sur la methode classique, oti l’activite se mesure par le noircissement, plusieurs avantages apprtkiables: elle permet, en effet, de localiser avec precision l’element en question, pour autant que l’emulsion sensible soit en contact intime avec la preparade mesurer la valeur relative des phirnomenes par le tion histologique, comptage des particules Cmises, et enfin d’eviter certaines confusions dues h des artefacts: la precipitation parasite des grains d’Ag par des substances reductrices pouvant exister dans les tissus ou la pigmentation naturelle de certaines preparations, par exemple. 11 nous a paru utile de mettre au point une technique bake sur ce principe et de l’appliquer a un materiel biologique bien connu et relativement facile a utiliser: c’est le cas de la moelle osseuse (5). Altmann et crl. ont dCmontrE l’existence d’une incorporation de glycocolle, marque au l*C, dans les cellules de la moelle osseuse (1). Boyd et aZ. (3) ont donne la preuve autoradiographique de ce phenomitne, en etudiant le noircissement de l’dmulsion par les cellules individuelles. La mCme technique a Cte appliquee par Morse (8) en utilisant cette fois du ST.
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MBTHODES
Dans la presente experience, des fragments de moelle osseuse sont preleves dans les OS longs d’un rat. Les cellules sont disperskes dans du Ringer citrate dkpourvu de Ca++, a l’aide d’un homogCnCiseur en verre du type Potter. La suspension cellulaire est filtree sur de la gaze, centrifugee pendant 5 minutes SI2.500 t/m et remise en suspension dans la m&me solution. L’incubation a lieu a 37”, en prksence de glucose M isotonique et de tampon au phosphate - a pH 7.5. La suspension contient environ, 30
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RkSULTATS
EXPl?RIMENTAUX
L’expPrieiwe dCcrite dans le prPsent travail a port6 sur l’esaincn d’environ 800 cellules de chaquc lame apribs resprctivement 6 et 12 heures d’esposition (le temps dtant compt6 Si partir du moment oil 1’6mulsion est s&he). Les rkultats sent rassemblk dans le tableau 1 et dans le graphique 1. Quelques microphotographies permettent de jugcr de 1’Ptat dcs ccllulcs (Figs. 1, 2, 3). On constate, tout d’abord, que le pourcentage des cellules marquees est deux fois plus considErable dans le frottis exposd pendant 12 heures que dans celui expose pendant 6 hem-es seulement. on assiste Zi une diminution En cc qui concerne la &rie granulocytairc, considPrable de la radioactivitk des cellulcs au cows de leur maturation. Pour donner uric id@e de la radioactivit6 spkifique de chaque crllulr, leur diamCtre a 6th mesurc: il varie de 10,2 IJ- pour les cellules les plus actives B 7,:) I* pour les mains activcs, ce qui correspond h une variation de volume de l’ordre de 3 ii 1 (cfr tableau I). Si on ramPne les activitks par cellule h une valeur corrigde pour le volume individucl de chaque cellule, on obtient une itvaluation approsimatire de (( l’activitk spkifique 1). On suppose, dans ce cas, que lcs ccllulcs conservent sur le frottis une forme sphkrique, ce qui correspond h la correction maxima. La valeur ainsi obtenue n’est dvidemment qu’une valeur approchEe, puisqu’il n’est pas tenu compte de la densit ties cellules. Une mitthode ha&e sur une mesure interfPromPtrique Experimenlnl
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(6) ~, (12) I’romydocylrs
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traces par cellule ~~ x100. vol. rellule * I.es chiffres entre parentheses proviennent de cellules comptees isolement. Les autres etii determinCes au hasard comme on le fait dans le cas des myelogrammes habituels. 3 Dans le total ne sont pas comptes les chiffres entre parentheses. 1 eActivitC
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Fig. 1. Trois leucocytes polynuclCaires; le plus petit est un neutrophile, deux autres sont des Cosinophiles. Fig. 2. Un normoblaste orthochromatique. Fig. 3. Un mykloblaste.
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des constituants cellulaires (4) serait certainement plus exacte. Notons quc cette correction due aux variations dc volume cellulairc modifie assez fortement l’allure gbn&ralc du ph:“omi~nc obscrvP, commc on peut s’en rendre comptc en comparant les graphiqucs I A et II. A,joutons clue l’on n’a pas pris en considdration l’ahsorption dcs Plectrons au win des cellules ellcsplus consid&rahle que lc diamirtre m8mes. Cette absorption cst d’autant cellulaire est plus grand: unc telle correction, dans lc cas qui nous prEoccupc, aurait plut6t tendance j augmenter la radioactivit& spkifiquc des cellules lcs plus volumincuses. Experimental
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Fig. I. Radioactivite des divers types de cellules de la moelle osseuse au tours de leur maturation. Ordonnees: nomhre de traces par cellule x 10% x 0, apres 12 heures d’exposition; 80, apres 6 heures d’exposition (resultats x 2). Fig. II. C
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Les phenomenes observes sont fort semblables dans le cas des cellules de la serie lymphocytaire et dans celui des globules rouges. Dans la lignee rouge, les erythroblastes presentent une incorporation encore assez importante, tandis que les erythrocytes arrives a maturite n’ont qu’une activite negligeable qui peut probablement &tre attribuee aux reticulocytes. Ces constatations concordent bien avec les resultats des travaux de Altman (l), Shemin, London et Rittenberg (7, 9) et Chantrenne et Koritz (6) Ctablissant que la synthese de l’hemoglobine n’est plus possible dans les 5 - 633705
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Crythrocytes non nucles alors qu’elle l’est encore dans les reticulocytes les cellules plus jeunes. Cette synthese debute au stade proerythroblaste a lieu au tours de toute la maturation (10).
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DISCUSSION
Nos resultats sont, dans une certaine mesure, cornparables a ceux de Morse, obtenus au moyen de 32P* , toutefois, dans le cas present, on observe une activite non negligeable des leucocytes mQrs. Dans le travail de Morse, il n’y a d’activite leucocytaire que si l’animal a 6th inject6 21 heures avant la preparation des frottis. Mais la technique de noircissement utilisee par cet auteur, qui n’etait pas suivie d’un comptage des grains ou d’une etude photometrique, est t&s loin d’$tre quantitative. Les constituants marques dans les cellules au tours de l’incorporation de la glycine-1-W sont vraisemblablement des proteines ou des groupesp rosthetiques qui leur sont associes (acides nucleiques, cytochromes, heme). Un fractionnement cytochimique devrait permettre de preciser ce point (5). D’autre part, l’utilisation de precurseurs marques, plus specihques de certains groupements, devrait fournir des renseignements plus precis encore. Des experiences analogues a l’aide d’acide orotique marque (precurseur des pyrimidines) sont en tours et elles donneront vraisemblablement d’utiles renseignements sur la synthiise des acides nucleiques. De m&me, l’utilisation d’inhibiteurs competitifs marques pourrait peut-&tre permettre egalement une localisation cytochimique d’un enzyme don& a condition que ces inhibiteurs soient suffisamment specihques. Nous n’avons pas tent& dans le present travail, de localiser le point d’origine de chaque trace. De telles observations sont certainement possibles a l’aide de la technique utilisee. Notons toutefois que les erythroblastes ont montre un certain nombre de traces issues du noyau, d’autres du cytoplasme. Dans le cas des myeloblastes, des traces ayant leur origine dans le nucleole ont et6 observees avec certitude, dans un nombre non negligeable de cas. Cependant, il serait certainement preferable d’operer sur des coupes suffisamment minces au lieu de frottis, afin d’eviter toute incertitude du fait des constituants cellulaires situ& au dessus ou en dessous de l’organite qui parait emettre l’electron. Le choix de cellules de taille plus grande que celles de la moelle osseuse facilitera beaucoup ce travail de localisation. Des experiences sur des amibes et des cellules embryonnaires sont d’ailleurs actuellement effect&es par l’un de nous (A. F.). Nous pensons que la technique que nous avons mise au point se revelera Experimenfal
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d’une trbs grande utilite car elle permettra de mesurer avec une assez bonne precision l’activite specifique des divers types de cellules; elle completera ainsi utilement toute etude du metabolisme d’un tissu complexe au moyen d’isotopes. Precisons enfin, que la methode utilisee est susceptible en principe de donner des resultats en valeur absolue: connaissant le nombre de traces, la duree d’exposition et la periode de l’isotope, il est possible de calculer, par cellule, le nombre de molecules incorporees; mais, comme nous l’avons fait remarquer, les corrections dont il faut tenir compte devront faire l’objet d’une etude minutieuse.
Une technique autoradiographique basee sur l’observation des traces individuelles Cmises par un element radioactif au sein d’une cellule a 6th mise au point en ce qui concerne les cellules de la moelle osseuse. Les resultats obtenus au moyen de glycine-l-C,, ont montre une incorporation particulierement intense au sein des cellules jeunes; l’incorporation diminue progressivement au tours de la maturation, pour devenir presque nulle dans le cas des hematies. Les leucocytes polynucleaires et les lymphocytes mQrs sont le siege d’une incorporation non negligeable. Toute notre gratitude va au Professeur G. Occhialini qui nous a guides dans l’application de la technique autoradiographique. BIBLIOGRAPHIE 1. ALTMAN,
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