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Effets radiorestaurateurs de l'ATP associe a l'ion Mg2+, vis-a-vis d'embryons de riz soumis au rayonnement gamma du Co60
Environraenlal and Evt~erimenlal Botar!~, Vol. 23, No. 2, pp. 103 Io I 1 l, 1983
0098-g472/g3 $3.00 -t- 0.00 (~) 1983. Pergamon Press Ltd.
Printed in Great Britain
EFFETS R A D I O R E S T A U R A T E U R S DE L'ATP ASSOCIE A L'ION Mg 2+, VIS-A-VIS D ' E M B R Y O N S DE RIZ S O U M I S A U R A Y O N N E M E N T G A M M A D U Co 6° R. J O N A R D , S. M A N S O U R , R. MARIE* et M. RIEDEL
Laboratoire d'Histophysiologie et Radiobiologie V~g6tales, Universit~ des Sciences et Techniques du Languedoc, 34 060 Montpellier Cedex, France (Received 21 May 1982; in revisedform 23 September 1982; in final form 13 October 1982) JONARD R., MANSOURS., MARIE R. and RIEDEL M. Radiorestoration effects 0fATP associated with Mg 2 + ions on rice embryos exposed to gamma rays (6°Co). ENVIRONMENTALANDEXPERIMENTALBOTANY 23~ 103--111, 1983.--Mg 2+ ions and ATP used separately have little radiorestoration effect on in vitro isolated rice embryos. However, the association of ATP and Mg 2+ induces, at the embryo stage, most efficient action recorded during the numerous restoration experiments that were carried out. This radiorestoration effect is permanent. When the seedlings produced from these experiments are planted out in rice fields, a significant increase in the production of fertile panicules and in seed yields is recorded.
INTRODUCTION LA MUTAGEN~SE exp6rimentale est utilis6e ~t M o n t p e l l i e r depuis de nombreuses ann6es, afin d ' o b t e n i r un g r a n d n o m b r e de mutants, chez les diverses vari6t6s de Riz cultiv6es en C a m a r g u e . Afin d ' a u g m e n t e r le n o m b r e de m u t a n t s survivants, aux radio-expositions g a m m a sont associ6s des agents restaurateurs qui favorisent la r 6 p a r a t i o n des ruptures chromosomiques radioinduites. U n e p a r t i e au m o i n s d e c e s r6unions p o u r r a i t m~me p r o v o q u e r des r 6 a r r a n g e m e n t s fournissant alors de n o u v e a u x types de m u t a n t s viables, Nous analyserons ici les actions d ' a g e n t s rest a u r a t e u r s sur les effets physiologiques: germination, d 6 v e l o p p e m e n t de la p l a n t e jusqu'/t la m a t u r a t i o n des grains en l a b o r a t o i r e et en champs,
P a r m i les substances susceptibles de r6parer le d o m m a g e radioinduit, les acides nucl6iques et les compos6s nucl60tidiques se sont montr6s des agents r a d i o r e s t a u r a t e u r s efficaces vis-~t-vis des tissus a n i m a u x , tS'6'tT) Dans le cas des tissus v6g~taux, les acides nucl6iques t2'7'9) mais 6galement, les nucl60tides t1°'1 x) et en particulier les cytokinines ts't2'x4'21) ont manifest6 des activit6s restauratrices marqu6es. En ce qui concerne les nucl60tides ~ 3 groupements phosphoryl6s, tels que l'ad6nosinet r i p h o s p h a t e ou A T P , BEATTY et BEATTY(3) a v a i e n t soulign6 un effet m a r q u 6 sur la diminution du n o m b r e des a b e r r a t i o n s c h r o m o somiques, au niveau des cellules d ' a n t h b r e s de Tradescantia. I1 convient de noter ici les r6sultats enregistr6s au cours d'exp6riences pr61iminaires: l ' e m b r y o n pr6sente une radiosensibilit6 plus m a r q u 6 e
*Laboratoire du Riz et des mutations, Centre de Recherches Agronomiques INRA-ENSAM, 34 060 Montpellier Cedex, France. 103
104
R. JONARD, S. MANSOUR, R. MARIE et M. RIEDEL
lorsqu'il est isol6 sur un milieu nutritiffavorable ~t sa germination it partir du caryopse irradi6, que lorsqu'il demeure au sein de ce caryopse. En effet, les doses qui entrainent la mort de 75% des plantules sont respectivement de 250 grays dans le premier cas, et de 400 grays dans le second. De plus, l'embyron soumis directement /t l'irradiation apr6s son isolement est 16g6rement moins radiosensible que l'embryon extrait du caryopse irradi6, aux doses 61ev6es de 200/l 250 grays, JONARD et al., en 1978 "3) notaient que I'ATP et la guanine-triphosphate ou GTP 6taient capables d'am61iorer la prolif6ration des tissus de Topinambour. BENJAMINremarquait 6galement en 1979~4) que les semences de Riz 6taient capables de fournir une quantit6 importante de plantules survivantes, lorsqu'apr6s une radioexposition /~ des doses 61ev6es de rayons y (400 grays), elles 6taient trait6es par immersion dans une solution d ' A T P ~i 10-4M. A la suite d'observations r6centes de KATZ et al. ~15) qui signalent la formation d'un complexe actif ATP Mg 2+, nousavonsdoncessay6, afind'augmenter le nombre de plantules viables, les effets restaurateurs de I'ATP seul ou associ6/~ l'ion Mg z +, par application directe sur les embryons isol6s ~ partir de caryopses de Riz soumis au rayonnement y. MATERIAL ET METHODES
L'utilisation des embryons isol6s dans des conditions rigoureuses d'asepsie permet une action rapide des substances restauratrices directement au niveau des cellules qui formeront la future plante,
La culture des embryons Nous avons utilis6 comme mat6riel v6g6tal, les semences de Riz, it grains courts de la vari6t6 pure Cigalon, cr6ee en 1950 par R. MARm ~ partir d'un croisement entre Balilla 1.1 g6niteur femelle et Allorio 4.6 g6niteur mgtle, L'embryon est isol6 intact ~ partir de caryopses sains de m6mes dimensions; °) toutes les manipulations sont r6alis6es dans des conditions aseptiques: ainsi les embryons sont st6rilis6s par trempage dans une solution d'hypochlorite de
calcium ~ 150 g 1- x pendant 30 mn, puis rinc6s plusieurs fois ~t l'eau st6rile. Les embryons sont ensemenc6s dans des tubes h6molyse, sur 2 ml d'une solution nutritive st6rilis6e au pr6alable off ils vont germer it 28°C, sous un 6clairement de 1600 lx, pendant 12 h sur 24. Les plantules ayant alors atteint un stade de robustesse satisfaisant, sont ensuite, soit transf6r6es en serre, dans des bacs (25 x 25 x 100 cm) surunm61ange terrede Camargue (1/3)terreau "Humosoil" (2/3) et aliment6es par bassinage, soit repiqu6es directement en rizi6re exp6rimentale.
La radio-exposition Les radio-expositions ont 6t6 effectu6es au Centre d'Etudes Nucleaires de Cadarache sur les caryopses entiers, ~ l'aide d'un irradiateur du typegamma-cellrenfermantunesourceradioactive de Cobalt 60, sous un d6bit moyen de 11 grays par minute, en atmosph6re ambiante, ~ 22°C. Les doses 6tablies apr6s des essais pr61iminaires de radiosensibilit6, s'6chelonnaient de 100 ~ 300 grays. Les caryopses avaient un taux d'humidit6 contr616de 12,5% au moment desirradiations. Les radiorestaurations Les embryons irradi6s au sein des caryopses sont diss6qu6s apr6s leur radioexposition et ensemenc6s apr6s st6rilisation, dans des conditions rigoureuses d'asepsie, sur la solution min6rale de Miller, glucos6e (1%) et g61os6e (0,5%) renfermant ou non l'agent restaurateur, Des embryons issus de caryopses non irradi6s serviront de t6moins. L'ad6nosine 5'-triphosphate (ATP) sous sa forme de sel dipotassique (Sigma) a 6t6 ufilis6e aux concentrations de 0,05-0,1-0,125~),200 et 0,500 g/1 associ6e ou non ~ un exc~s de magn6sium dans le milieu (magn6sium sulfate RP prolabo), ajout6 aux m6mes concentrations, d6finies apr6s des essais pr61iminaires. Ces substances sont incorpor~es en r6partition aseptique aux milieux pr6alablement autoclav6s, apr6s ultrafiltration sur filtres millipores de 0,22 #m. LYvaluationdesr~sultats Q uarante-huit embryons sont utilis6s pour chaque condition exp6rimentale.
EFFETS RADIORESTAURATEURS DE L'ATP ASSOCIE A L'ION Mg 2+ Les mesures sont 6valu6es en laboratoire sur les plantules gtg6es de 20jours selon les crit~res 6tablis par Mt~JREB et GREIG: ~2°) la somme des longueurs des plantules et le pourcentage de plantules survivantes. Le repiquage des plantules en rizi~re, nous a ensuite permis d'analyser les apparitions de pr6cocit6s de d6veloppement, au tallage, A la floraison o u / t la maturation, les restaurations de fertilit6 et la valeur des rendements en grains A la r6colte. Des analyses statistiques (test F de Fisher ou test de Duncan) nous ont permis d'6valuer la validit6 de nos r6sultats, les exp6rimentations 6tant r6alis6es en suivant la m6thode des blocs, RESULTATS Expgriences r~alis~es au laboratoire
La dose entrainant la mort de 75% des plantules issues d'embryons isol6s des caryopses irradi6s est de 250 grays. Contrairement & ce que nous avons observ~ pour les caryopses entiers, ~x4) I ' A T P seul ne manifeste q u ' u n e 16g~re activit6 restauratrice pour les doses inf6rieures /t 250 grays, lorsqu'il est appliqu6 sur les embryons isol6s partir de caryopses irradi~s. Par contre, I ' A T P - M g z + se montre l'agent radiorestaurateur le plus efficace parmi tous ceux que nous avons essay6. En effet, les diagrammes des Figs. 1 3 r6sumant les r~sultats obtenus montrent que m~me pour cette dose de 250 grays, l'apport d ' A T P M g 2+ am61iore en laboratoire, non seulement le d6veloppement des plantules, mais 6galement le n o m b r e des plantules survivantes, Les meilleurs r6sultats sont obtenus avec les concentrations de 0,2 g/1 pour les 2 substances: A T P et M g 1+ (Fig. 3). Essais en serre
Pour la r6colte 1979, les plantules obtenues trop tardivement pour pouvoir esp6rer une maturation satisfaisante en rizi~re de Camargue, ont 6t6 6lev6es en serre climatis6e, Les r6sultats obtenus au cours de ces essais sont r6unis dans les Tableaux 1 et 2. Leur examen permet de constater les faites suivants: dans le cas des plantes issues d'embryons isol6s des caryopses non irradi6s, I ' A T P + M g z+ ne manifeste aucun effet significatif, sur la vigueur des plantes exprim6e par le
105
nombre de talles produites, sur la taille moyenne de la tige et le n o m b r e de panicules fertiles. Pour des doses fortes de rayons ~ (200 A 225 grays), I ' A T P + M g 2+ am61iore par contre toutes les valeurs analys6es. Et ce qui est important A signaler, le traitement restaurateur provoque une pr6cocit6 tr+s marqu6e, chez les plantes issues des embryons pr61ev6s sur les caryopses irradi6s. Essais en rizidre
En ce qui concerne la r6colte 1980, l'essai plus pr6coce a permis un repiquage des plantules en rizi~re exp6rimentale. Les r6sultats observ6s sont r6unis dans le Tableau 3. Son examen permet de constater que le traitement par I ' A T P + M g 2 +, augmente de mani+re significative, A la fois la production des panicules fertiles (contenant un grain au moins) et la quantit6 de grains produits, chez les plantes issues d'embryons sains mais ~galement chez celles provenant d'embryons isol6s des caryopses irradi6s, m6me lorsque les doses de rayonnement 7 sont 61ev6es (225-250 grays). L'effet radiorestaurateur se manifeste donc 6galement au niveau de la r6colte finale des grains en rizi6re. DISCUSSIONS ET CONCLUSIONS
En ce qui concerne les radiorestaurations: I ' A T P seule, contrairement aux observations de BEr~JAMXN ~4) sur semences enti~res de Riz, n'a q u ' u n faible effet radiorestaurateur, (voir Figs. 1 et 2). De m~me le glucose et le glucose phosphate que nous avons essay6s au cours de ces essais, ne manifestent qu'un faible effet radiorestaurateur.(1 s) L ' A T P n'agirait donc pas uniquement en sa qualit6 de mol6cule riche en 6nergie. ~3) Par contre dans le cas d'embryons isol6s in vitro, l'association A T P + M g z + (voir Figs. I, 2 et 3) manifeste une tr+s forte activit6 radiorestauratrice, plus marqu6e que toutes celles que nous avions enregistr6es au cours de nos recherches ant6rieures en utilisant diverses substances, telles que les cytokinines, les acides nucl6iques ou les auxines. Os) Employ6 seul, l'ion M g z+ a un 16ger effet
Retard ou avance observable Am61ioration en pr6sence d u c o m p l e x e radiorestaurateur R e t a r d ou a v a n c e observable Am61ioration en pr6senee d u c o m p l e x e radiorestaurateur R e t a r d ou a v a n c e observable Am61ioration en pr6sence d u complexe radiorestaurateur --
3
-- 3
_6
-- 6
0
--
--
0
--
0
--
+ 8
--
--
4- 7
2
4- 6
6
- 6
0
4- 7
150 G r a y s C u l t u r e s s u r milieu Avec A T P de base + Mg 2+
--
4- 20
--
4- I 1
--
4- 18
L4
4- 6
11
0
18 -- 7 = L1
4- 7
200 G r a y s C u l t u r e s s u r milieu Avec A T P de base + Mg 2+
Le signe 4- i n d i q u e u n r e t a r d d a n s l ' a p p a r i t i o n d u crit~re analys6. Le signe -- i n d i q u e u n e a v a n c e d a n s l ' a p p a r i t i o n d u crit~re analys6. Le milieu de base est celui de Miller. Les chiffres soulign6s i n d i q u e n t en j o u r s les gains de pr6cocit6 a p p o r t 6 s p a r le t r a i t e m e n t r e s t a u r a t e u r .
Floraison
Epaison
A p p a r i t i o n de la premiere talle
0 G r a y s (t~moins) C u l t u r e s sur milieu Avec A T P de base + Mg 2+
4- 37
--
+ 28
4- 33
23
+ 14
18
+ 10
33 -- 24 = 9
4- 24
225 G r a y s C u l t u r e s s u r milieu Avec A T P de base + Mg 2+
Precocites exprim6es e n j o u r s chez les p l a n t e s issues d ' e m b r y o n s irradi~s
Tableau 1. Les effets radiorestaurateurs de I ' A T P + M g 2 + sur les phdnom~nes de prdcocitd: ?z rapparition de la l~re talle, ~ l'dpiaison, gt la floraison
t2
>
"~
O
;~
.~ ~"
A B C
A en (cm) B C
A B C
A en (cm) B C
A B C
Nombre de talles par pied r6colt~
Longueur moyenne de la tige
Nombre total de panicules par plante
Longueur moyenne de la panicule
Nombre de panicules fertiles p a r plante
1,82 100 100
14 100 100
3,14 100 100
80,0 I00 I00
3,05 100 100
92 100 100
1,67 93 93
13,5 96 96
3,08 98 98
81,5 102 102
2,92 96 96
100 109 109
M avec A T P + M g 2+
0,95 71 100
16 114 100
2,30 73 100
69,5 87 100
3,00 98 100
83 90 100
1,13 71 100
15 107 94
2,70 86 117
74,0 93 106
3,04 100 101
96 104 115
sur milieu M avec de base A T P + M g 2+ (M)
Irradi6s & 150 grays
225 grays
0,28 27 100
13,5 96 100
1,78 57 100
67,5 84 100
1,33 44 I00
75 82 100
0,91 54 200
14 I00 104
2,91 93 163
76,0 95 113
3,14 103 236
92 100 122
0,23 18 100
13,5 96 I00
2,15 68 100
65,0 81 100
1,62 53 100
54 59 100
0, 70 50 272
13 93 96
2,40 76 112
73,0 89 109
3,00 98 185
83 90 154
sur milieu M avec sur milieu M avec de base A T P + M g 2+ de base A T P + M g 2+ (M) (M)
200 grays
A: valeurs enregistr6es. B: en % p a r r a p p o r t au t6moin n o n irradi~ et n o n trait6 p a r I ' A T P + M g 2+. C: en % par r a p p o r t au t6moin respectif irradi6 & la marne dose, mais non trait6 p a r I ' A T P + M g 2+.
A B C
Pourcentage de survivants
Criteres analyses
isol6s sur milieu de base (M)
N o n irradi6s
Plantules issues d ' e m b r y o n s
Tableau 2. Effects de I ' A T P + M g 2 + sur le dgveloppement en serre de plantules issues d'embryons de riz isolgs in vitro
+
o
r~ >
> c~ O
c~
100
13090
77
622
ou
139
18168
91
722
100
4309
47,4
789*
178
7654
75,4
426
avec A T P 200 grays et Milieu de M avec A T P M g 2+ base et M g z+
100
3355
44,5
706
206
6715
61
711
0
0
0
--
5276
59
659
225 grays 250 grays Milieu de M avec A T P Milieu de M avec A T P base et M g 2+ base et M g 2+
Production en rizi~re des plantes issues d ' e m b r y o n s Irradids aux doses de
* Cette a u g m e n t a t i o n souvent enregistr6e chez les plantes soumises aux radio-expositions g a m m a , est u n accroissement des panicules st6riles. Les valeurs soulign~es i n d i q u e n t des augmentations statistiquement significatives de la production en panicules fertiles ou en grains (au seuil de probabilit~ 0,05).
% de grains produits
Nombre de grains produits
% de panicules fertiles
Nombre total de panicules
puis isol6s sur milieu de base (M)
N o n irradi~s
Tableau 3. Essais en riziOre: Les am6liorations des rendements par rapport d ' A T P + M g 2 +, observables apr~s le repiquage en riziOre, des plantules issues des embryons trait~s in vitro
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EFFETS RADIORESTAURATEURS
DE L ' A T P A S S O C I E A L ' I O N Mg 2+
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Doses,
225
250
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Fzo. 1. Histogrammes indiquant le d~veloppement des plantules (exprim6es par la somme des longueurs en cm) issues d'embryons t~moins (O) ou irradifis, isol6s soit sur un milieu de base: solution de Miller (en blanc) soit sur le milieu de Miller, additionn6 d ' A T P (0,2 g/l) (surface en pointillfis), ou d ' A T P (0,2 g/l) et d'ions Mg 2+ (0,2 g/l) (surface en h&chures). 48 Embryons sont utilisfis pour ehaque condition expfirimentale. S (ppdms pour la probabilitfi de 99%) = 20 cm.
r a d i o r e s t a u r a t e u r vis-&-vis des e m b r y o n s de riz isol6s in vitro, selon MOUTIA; (xg) or, o n sait q u e d a n s l ' a l b u m e n des caryopses d e R i z , la c o u c h e & aleurone renferme une quantit6 importante d ' i o n s M g 2+ q ui, p a r contre, ne sont pas localis6s au n i v e a u de l ' e m b r y o n . (~)
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15o Doses,
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Si le c o m p l e x e a c t i f p e u t se recr6er d a n s le c a r y o p s e e n t i e r en pr6sence d ' A T P - e x o g 6 n e , au n i v e a u de l ' e m b r y o n p a r contre, il f a u d r a app o r t e r a v e c la m o l 6 c u l e d ' A T P , l ' i o n M g 2+ a b s e n t des tissus e m b r y o n n a i r e s . P o u r e x p l i q u e r les effets r e s t a u r a t e u r s d e ce
FIG. 2. Variations en fonction des t6moins, des pourcentages de plantules survivantes, issues d'embryons ensemenc~s in vitro apr6s leur radioexposition &diverses doses de rayonnement 7 du Co 6°, sur diverses solutions nutritives. milieu de Miller (M): Courbe en pointill6s. M avec A T P (0,2 g/l): Courbe en tir6s M avec A T P (0,2 g/l) et M g 2+ (0,2 g/l): Courbe avec 6toile noires. La p p d m S correspond & S = 15% (au seuil de probabilit6 0,01 ). A partir de 100 grays, seul le m61ange A T P + M g 2+ manifeste sur la survie un effet radiorestaurateur significatif.
110
R. JONARD, S. MANSOUR, R. M A R I E et M. RIEDEL
I00--
75
~
1
5 ~
0
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Gy
"~ ~ '~ ~ ' ~
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200Gy "~'225 Gy
250Gy
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I
I
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I
I
0.05
O. I0
O. 125
0.20
0.25
0.50
C ATP et rng2+,
rng/!.
FIG. 3. Effets radiorestaurateurs de diverses concentrations en ATP + Mg 2 + sur le d6veloppement des embryons irradi6s. Les valeurs indiqu6es expriment les sommes des longueurs des plantules (Z L exprim6es en % par rapport aux t6moins correspondants non irradi6s, et issues d'embryons isol6s apr~s les radioexpositions ~, sur des milieux diff6rents.) Toutes les diff6rences sup6rieures ~t 10% pour Z L sont significatives. Pour les doses 61ev6es de 225 ~ 250 gy en particulier, toutes les concentrations en A T P + M g 2+ sont significativement efficaces.
complexe A T P + M g 2+, il faut signaler son r61e dans les m6canismes de r~parations au niveau des syntheses nucl~iques. En effet, scion LINDAHL et EDELMAN,(16} la r 6 p a r a t i o n des cassures chromosomiques fait intervenir une ligase ATP-t- M g z + d6pendante.
plantes viables exploitables p o u r l ' o b t e n t i o n de m u t a n t s ~ventuels.
M a i s ce complexe A T P + M g 2+ p e u t 6galement induire une a u g m e n t a t i o n de l'activit6 ad6nylatecyclase selon KATZ et al. (is) Et cette activation de I ' A M P cyclis6 est i m p o r t a n t e , puisque ce nucl6otide avec le G M P est lui-m6me un facteur actif de r a d i o r e s t a u r a t i o n , c o m m e nous l'avons contr61~ au cours de nos e x p 6 n• m e n t a u o• n s (18) sur le Riz en confirmation d'observations ant6rieures.(13) I1 est int6ressant de souligner que les effets
1. BAYONOVE J. (1978) Les sernences d'un Riz de
restaurateurs du complexe A T P + M g 2 + se m a i n tiennent lorsque les plantules sont ensuite repiqu6es en serre ou en rizi~re ( T a b l e a u x 1, 2 et 3), p e r m e t t a n t ainsi d ' o b t e n i r une m a t u r a t i o n plus pr6coce et une am61ioration des rendements, chez les irradi6s; ce qui a u g m e n t e la p r o p o r t i o n de
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0098-g472/g3 $3.00 -t- 0.00 (~) 1983. Pergamon Press Ltd.
Printed in Great Britain
EFFETS R A D I O R E S T A U R A T E U R S DE L'ATP ASSOCIE A L'ION Mg 2+, VIS-A-VIS D ' E M B R Y O N S DE RIZ S O U M I S A U R A Y O N N E M E N T G A M M A D U Co 6° R. J O N A R D , S. M A N S O U R , R. MARIE* et M. RIEDEL
Laboratoire d'Histophysiologie et Radiobiologie V~g6tales, Universit~ des Sciences et Techniques du Languedoc, 34 060 Montpellier Cedex, France (Received 21 May 1982; in revisedform 23 September 1982; in final form 13 October 1982) JONARD R., MANSOURS., MARIE R. and RIEDEL M. Radiorestoration effects 0fATP associated with Mg 2 + ions on rice embryos exposed to gamma rays (6°Co). ENVIRONMENTALANDEXPERIMENTALBOTANY 23~ 103--111, 1983.--Mg 2+ ions and ATP used separately have little radiorestoration effect on in vitro isolated rice embryos. However, the association of ATP and Mg 2+ induces, at the embryo stage, most efficient action recorded during the numerous restoration experiments that were carried out. This radiorestoration effect is permanent. When the seedlings produced from these experiments are planted out in rice fields, a significant increase in the production of fertile panicules and in seed yields is recorded.
INTRODUCTION LA MUTAGEN~SE exp6rimentale est utilis6e ~t M o n t p e l l i e r depuis de nombreuses ann6es, afin d ' o b t e n i r un g r a n d n o m b r e de mutants, chez les diverses vari6t6s de Riz cultiv6es en C a m a r g u e . Afin d ' a u g m e n t e r le n o m b r e de m u t a n t s survivants, aux radio-expositions g a m m a sont associ6s des agents restaurateurs qui favorisent la r 6 p a r a t i o n des ruptures chromosomiques radioinduites. U n e p a r t i e au m o i n s d e c e s r6unions p o u r r a i t m~me p r o v o q u e r des r 6 a r r a n g e m e n t s fournissant alors de n o u v e a u x types de m u t a n t s viables, Nous analyserons ici les actions d ' a g e n t s rest a u r a t e u r s sur les effets physiologiques: germination, d 6 v e l o p p e m e n t de la p l a n t e jusqu'/t la m a t u r a t i o n des grains en l a b o r a t o i r e et en champs,
P a r m i les substances susceptibles de r6parer le d o m m a g e radioinduit, les acides nucl6iques et les compos6s nucl60tidiques se sont montr6s des agents r a d i o r e s t a u r a t e u r s efficaces vis-~t-vis des tissus a n i m a u x , tS'6'tT) Dans le cas des tissus v6g~taux, les acides nucl6iques t2'7'9) mais 6galement, les nucl60tides t1°'1 x) et en particulier les cytokinines ts't2'x4'21) ont manifest6 des activit6s restauratrices marqu6es. En ce qui concerne les nucl60tides ~ 3 groupements phosphoryl6s, tels que l'ad6nosinet r i p h o s p h a t e ou A T P , BEATTY et BEATTY(3) a v a i e n t soulign6 un effet m a r q u 6 sur la diminution du n o m b r e des a b e r r a t i o n s c h r o m o somiques, au niveau des cellules d ' a n t h b r e s de Tradescantia. I1 convient de noter ici les r6sultats enregistr6s au cours d'exp6riences pr61iminaires: l ' e m b r y o n pr6sente une radiosensibilit6 plus m a r q u 6 e
*Laboratoire du Riz et des mutations, Centre de Recherches Agronomiques INRA-ENSAM, 34 060 Montpellier Cedex, France. 103
104
R. JONARD, S. MANSOUR, R. MARIE et M. RIEDEL
lorsqu'il est isol6 sur un milieu nutritiffavorable ~t sa germination it partir du caryopse irradi6, que lorsqu'il demeure au sein de ce caryopse. En effet, les doses qui entrainent la mort de 75% des plantules sont respectivement de 250 grays dans le premier cas, et de 400 grays dans le second. De plus, l'embyron soumis directement /t l'irradiation apr6s son isolement est 16g6rement moins radiosensible que l'embryon extrait du caryopse irradi6, aux doses 61ev6es de 200/l 250 grays, JONARD et al., en 1978 "3) notaient que I'ATP et la guanine-triphosphate ou GTP 6taient capables d'am61iorer la prolif6ration des tissus de Topinambour. BENJAMINremarquait 6galement en 1979~4) que les semences de Riz 6taient capables de fournir une quantit6 importante de plantules survivantes, lorsqu'apr6s une radioexposition /~ des doses 61ev6es de rayons y (400 grays), elles 6taient trait6es par immersion dans une solution d ' A T P ~i 10-4M. A la suite d'observations r6centes de KATZ et al. ~15) qui signalent la formation d'un complexe actif ATP Mg 2+, nousavonsdoncessay6, afind'augmenter le nombre de plantules viables, les effets restaurateurs de I'ATP seul ou associ6/~ l'ion Mg z +, par application directe sur les embryons isol6s ~ partir de caryopses de Riz soumis au rayonnement y. MATERIAL ET METHODES
L'utilisation des embryons isol6s dans des conditions rigoureuses d'asepsie permet une action rapide des substances restauratrices directement au niveau des cellules qui formeront la future plante,
La culture des embryons Nous avons utilis6 comme mat6riel v6g6tal, les semences de Riz, it grains courts de la vari6t6 pure Cigalon, cr6ee en 1950 par R. MARm ~ partir d'un croisement entre Balilla 1.1 g6niteur femelle et Allorio 4.6 g6niteur mgtle, L'embryon est isol6 intact ~ partir de caryopses sains de m6mes dimensions; °) toutes les manipulations sont r6alis6es dans des conditions aseptiques: ainsi les embryons sont st6rilis6s par trempage dans une solution d'hypochlorite de
calcium ~ 150 g 1- x pendant 30 mn, puis rinc6s plusieurs fois ~t l'eau st6rile. Les embryons sont ensemenc6s dans des tubes h6molyse, sur 2 ml d'une solution nutritive st6rilis6e au pr6alable off ils vont germer it 28°C, sous un 6clairement de 1600 lx, pendant 12 h sur 24. Les plantules ayant alors atteint un stade de robustesse satisfaisant, sont ensuite, soit transf6r6es en serre, dans des bacs (25 x 25 x 100 cm) surunm61ange terrede Camargue (1/3)terreau "Humosoil" (2/3) et aliment6es par bassinage, soit repiqu6es directement en rizi6re exp6rimentale.
La radio-exposition Les radio-expositions ont 6t6 effectu6es au Centre d'Etudes Nucleaires de Cadarache sur les caryopses entiers, ~ l'aide d'un irradiateur du typegamma-cellrenfermantunesourceradioactive de Cobalt 60, sous un d6bit moyen de 11 grays par minute, en atmosph6re ambiante, ~ 22°C. Les doses 6tablies apr6s des essais pr61iminaires de radiosensibilit6, s'6chelonnaient de 100 ~ 300 grays. Les caryopses avaient un taux d'humidit6 contr616de 12,5% au moment desirradiations. Les radiorestaurations Les embryons irradi6s au sein des caryopses sont diss6qu6s apr6s leur radioexposition et ensemenc6s apr6s st6rilisation, dans des conditions rigoureuses d'asepsie, sur la solution min6rale de Miller, glucos6e (1%) et g61os6e (0,5%) renfermant ou non l'agent restaurateur, Des embryons issus de caryopses non irradi6s serviront de t6moins. L'ad6nosine 5'-triphosphate (ATP) sous sa forme de sel dipotassique (Sigma) a 6t6 ufilis6e aux concentrations de 0,05-0,1-0,125~),200 et 0,500 g/1 associ6e ou non ~ un exc~s de magn6sium dans le milieu (magn6sium sulfate RP prolabo), ajout6 aux m6mes concentrations, d6finies apr6s des essais pr61iminaires. Ces substances sont incorpor~es en r6partition aseptique aux milieux pr6alablement autoclav6s, apr6s ultrafiltration sur filtres millipores de 0,22 #m. LYvaluationdesr~sultats Q uarante-huit embryons sont utilis6s pour chaque condition exp6rimentale.
EFFETS RADIORESTAURATEURS DE L'ATP ASSOCIE A L'ION Mg 2+ Les mesures sont 6valu6es en laboratoire sur les plantules gtg6es de 20jours selon les crit~res 6tablis par Mt~JREB et GREIG: ~2°) la somme des longueurs des plantules et le pourcentage de plantules survivantes. Le repiquage des plantules en rizi~re, nous a ensuite permis d'analyser les apparitions de pr6cocit6s de d6veloppement, au tallage, A la floraison o u / t la maturation, les restaurations de fertilit6 et la valeur des rendements en grains A la r6colte. Des analyses statistiques (test F de Fisher ou test de Duncan) nous ont permis d'6valuer la validit6 de nos r6sultats, les exp6rimentations 6tant r6alis6es en suivant la m6thode des blocs, RESULTATS Expgriences r~alis~es au laboratoire
La dose entrainant la mort de 75% des plantules issues d'embryons isol6s des caryopses irradi6s est de 250 grays. Contrairement & ce que nous avons observ~ pour les caryopses entiers, ~x4) I ' A T P seul ne manifeste q u ' u n e 16g~re activit6 restauratrice pour les doses inf6rieures /t 250 grays, lorsqu'il est appliqu6 sur les embryons isol6s partir de caryopses irradi~s. Par contre, I ' A T P - M g z + se montre l'agent radiorestaurateur le plus efficace parmi tous ceux que nous avons essay6. En effet, les diagrammes des Figs. 1 3 r6sumant les r~sultats obtenus montrent que m~me pour cette dose de 250 grays, l'apport d ' A T P M g 2+ am61iore en laboratoire, non seulement le d6veloppement des plantules, mais 6galement le n o m b r e des plantules survivantes, Les meilleurs r6sultats sont obtenus avec les concentrations de 0,2 g/1 pour les 2 substances: A T P et M g 1+ (Fig. 3). Essais en serre
Pour la r6colte 1979, les plantules obtenues trop tardivement pour pouvoir esp6rer une maturation satisfaisante en rizi~re de Camargue, ont 6t6 6lev6es en serre climatis6e, Les r6sultats obtenus au cours de ces essais sont r6unis dans les Tableaux 1 et 2. Leur examen permet de constater les faites suivants: dans le cas des plantes issues d'embryons isol6s des caryopses non irradi6s, I ' A T P + M g z+ ne manifeste aucun effet significatif, sur la vigueur des plantes exprim6e par le
105
nombre de talles produites, sur la taille moyenne de la tige et le n o m b r e de panicules fertiles. Pour des doses fortes de rayons ~ (200 A 225 grays), I ' A T P + M g 2+ am61iore par contre toutes les valeurs analys6es. Et ce qui est important A signaler, le traitement restaurateur provoque une pr6cocit6 tr+s marqu6e, chez les plantes issues des embryons pr61ev6s sur les caryopses irradi6s. Essais en rizidre
En ce qui concerne la r6colte 1980, l'essai plus pr6coce a permis un repiquage des plantules en rizi~re exp6rimentale. Les r6sultats observ6s sont r6unis dans le Tableau 3. Son examen permet de constater que le traitement par I ' A T P + M g 2 +, augmente de mani+re significative, A la fois la production des panicules fertiles (contenant un grain au moins) et la quantit6 de grains produits, chez les plantes issues d'embryons sains mais ~galement chez celles provenant d'embryons isol6s des caryopses irradi6s, m6me lorsque les doses de rayonnement 7 sont 61ev6es (225-250 grays). L'effet radiorestaurateur se manifeste donc 6galement au niveau de la r6colte finale des grains en rizi6re. DISCUSSIONS ET CONCLUSIONS
En ce qui concerne les radiorestaurations: I ' A T P seule, contrairement aux observations de BEr~JAMXN ~4) sur semences enti~res de Riz, n'a q u ' u n faible effet radiorestaurateur, (voir Figs. 1 et 2). De m~me le glucose et le glucose phosphate que nous avons essay6s au cours de ces essais, ne manifestent qu'un faible effet radiorestaurateur.(1 s) L ' A T P n'agirait donc pas uniquement en sa qualit6 de mol6cule riche en 6nergie. ~3) Par contre dans le cas d'embryons isol6s in vitro, l'association A T P + M g z + (voir Figs. I, 2 et 3) manifeste une tr+s forte activit6 radiorestauratrice, plus marqu6e que toutes celles que nous avions enregistr6es au cours de nos recherches ant6rieures en utilisant diverses substances, telles que les cytokinines, les acides nucl6iques ou les auxines. Os) Employ6 seul, l'ion M g z+ a un 16ger effet
Retard ou avance observable Am61ioration en pr6sence d u c o m p l e x e radiorestaurateur R e t a r d ou a v a n c e observable Am61ioration en pr6senee d u c o m p l e x e radiorestaurateur R e t a r d ou a v a n c e observable Am61ioration en pr6sence d u complexe radiorestaurateur --
3
-- 3
_6
-- 6
0
--
--
0
--
0
--
+ 8
--
--
4- 7
2
4- 6
6
- 6
0
4- 7
150 G r a y s C u l t u r e s s u r milieu Avec A T P de base + Mg 2+
--
4- 20
--
4- I 1
--
4- 18
L4
4- 6
11
0
18 -- 7 = L1
4- 7
200 G r a y s C u l t u r e s s u r milieu Avec A T P de base + Mg 2+
Le signe 4- i n d i q u e u n r e t a r d d a n s l ' a p p a r i t i o n d u crit~re analys6. Le signe -- i n d i q u e u n e a v a n c e d a n s l ' a p p a r i t i o n d u crit~re analys6. Le milieu de base est celui de Miller. Les chiffres soulign6s i n d i q u e n t en j o u r s les gains de pr6cocit6 a p p o r t 6 s p a r le t r a i t e m e n t r e s t a u r a t e u r .
Floraison
Epaison
A p p a r i t i o n de la premiere talle
0 G r a y s (t~moins) C u l t u r e s sur milieu Avec A T P de base + Mg 2+
4- 37
--
+ 28
4- 33
23
+ 14
18
+ 10
33 -- 24 = 9
4- 24
225 G r a y s C u l t u r e s s u r milieu Avec A T P de base + Mg 2+
Precocites exprim6es e n j o u r s chez les p l a n t e s issues d ' e m b r y o n s irradi~s
Tableau 1. Les effets radiorestaurateurs de I ' A T P + M g 2 + sur les phdnom~nes de prdcocitd: ?z rapparition de la l~re talle, ~ l'dpiaison, gt la floraison
t2
>
"~
O
;~
.~ ~"
A B C
A en (cm) B C
A B C
A en (cm) B C
A B C
Nombre de talles par pied r6colt~
Longueur moyenne de la tige
Nombre total de panicules par plante
Longueur moyenne de la panicule
Nombre de panicules fertiles p a r plante
1,82 100 100
14 100 100
3,14 100 100
80,0 I00 I00
3,05 100 100
92 100 100
1,67 93 93
13,5 96 96
3,08 98 98
81,5 102 102
2,92 96 96
100 109 109
M avec A T P + M g 2+
0,95 71 100
16 114 100
2,30 73 100
69,5 87 100
3,00 98 100
83 90 100
1,13 71 100
15 107 94
2,70 86 117
74,0 93 106
3,04 100 101
96 104 115
sur milieu M avec de base A T P + M g 2+ (M)
Irradi6s & 150 grays
225 grays
0,28 27 100
13,5 96 100
1,78 57 100
67,5 84 100
1,33 44 I00
75 82 100
0,91 54 200
14 I00 104
2,91 93 163
76,0 95 113
3,14 103 236
92 100 122
0,23 18 100
13,5 96 I00
2,15 68 100
65,0 81 100
1,62 53 100
54 59 100
0, 70 50 272
13 93 96
2,40 76 112
73,0 89 109
3,00 98 185
83 90 154
sur milieu M avec sur milieu M avec de base A T P + M g 2+ de base A T P + M g 2+ (M) (M)
200 grays
A: valeurs enregistr6es. B: en % p a r r a p p o r t au t6moin n o n irradi~ et n o n trait6 p a r I ' A T P + M g 2+. C: en % par r a p p o r t au t6moin respectif irradi6 & la marne dose, mais non trait6 p a r I ' A T P + M g 2+.
A B C
Pourcentage de survivants
Criteres analyses
isol6s sur milieu de base (M)
N o n irradi6s
Plantules issues d ' e m b r y o n s
Tableau 2. Effects de I ' A T P + M g 2 + sur le dgveloppement en serre de plantules issues d'embryons de riz isolgs in vitro
+
o
r~ >
> c~ O
c~
100
13090
77
622
ou
139
18168
91
722
100
4309
47,4
789*
178
7654
75,4
426
avec A T P 200 grays et Milieu de M avec A T P M g 2+ base et M g z+
100
3355
44,5
706
206
6715
61
711
0
0
0
--
5276
59
659
225 grays 250 grays Milieu de M avec A T P Milieu de M avec A T P base et M g 2+ base et M g 2+
Production en rizi~re des plantes issues d ' e m b r y o n s Irradids aux doses de
* Cette a u g m e n t a t i o n souvent enregistr6e chez les plantes soumises aux radio-expositions g a m m a , est u n accroissement des panicules st6riles. Les valeurs soulign~es i n d i q u e n t des augmentations statistiquement significatives de la production en panicules fertiles ou en grains (au seuil de probabilit~ 0,05).
% de grains produits
Nombre de grains produits
% de panicules fertiles
Nombre total de panicules
puis isol6s sur milieu de base (M)
N o n irradi~s
Tableau 3. Essais en riziOre: Les am6liorations des rendements par rapport d ' A T P + M g 2 +, observables apr~s le repiquage en riziOre, des plantules issues des embryons trait~s in vitro
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EFFETS RADIORESTAURATEURS
DE L ' A T P A S S O C I E A L ' I O N Mg 2+
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IIII111~2~ 200
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Doses,
225
250
Gray
Fzo. 1. Histogrammes indiquant le d~veloppement des plantules (exprim6es par la somme des longueurs en cm) issues d'embryons t~moins (O) ou irradifis, isol6s soit sur un milieu de base: solution de Miller (en blanc) soit sur le milieu de Miller, additionn6 d ' A T P (0,2 g/l) (surface en pointillfis), ou d ' A T P (0,2 g/l) et d'ions Mg 2+ (0,2 g/l) (surface en h&chures). 48 Embryons sont utilisfis pour ehaque condition expfirimentale. S (ppdms pour la probabilitfi de 99%) = 20 cm.
r a d i o r e s t a u r a t e u r vis-&-vis des e m b r y o n s de riz isol6s in vitro, selon MOUTIA; (xg) or, o n sait q u e d a n s l ' a l b u m e n des caryopses d e R i z , la c o u c h e & aleurone renferme une quantit6 importante d ' i o n s M g 2+ q ui, p a r contre, ne sont pas localis6s au n i v e a u de l ' e m b r y o n . (~)
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15o Doses,
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20o 225 25o Groy
Si le c o m p l e x e a c t i f p e u t se recr6er d a n s le c a r y o p s e e n t i e r en pr6sence d ' A T P - e x o g 6 n e , au n i v e a u de l ' e m b r y o n p a r contre, il f a u d r a app o r t e r a v e c la m o l 6 c u l e d ' A T P , l ' i o n M g 2+ a b s e n t des tissus e m b r y o n n a i r e s . P o u r e x p l i q u e r les effets r e s t a u r a t e u r s d e ce
FIG. 2. Variations en fonction des t6moins, des pourcentages de plantules survivantes, issues d'embryons ensemenc~s in vitro apr6s leur radioexposition &diverses doses de rayonnement 7 du Co 6°, sur diverses solutions nutritives. milieu de Miller (M): Courbe en pointill6s. M avec A T P (0,2 g/l): Courbe en tir6s M avec A T P (0,2 g/l) et M g 2+ (0,2 g/l): Courbe avec 6toile noires. La p p d m S correspond & S = 15% (au seuil de probabilit6 0,01 ). A partir de 100 grays, seul le m61ange A T P + M g 2+ manifeste sur la survie un effet radiorestaurateur significatif.
110
R. JONARD, S. MANSOUR, R. M A R I E et M. RIEDEL
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I
I
I
I
0.05
O. I0
O. 125
0.20
0.25
0.50
C ATP et rng2+,
rng/!.
FIG. 3. Effets radiorestaurateurs de diverses concentrations en ATP + Mg 2 + sur le d6veloppement des embryons irradi6s. Les valeurs indiqu6es expriment les sommes des longueurs des plantules (Z L exprim6es en % par rapport aux t6moins correspondants non irradi6s, et issues d'embryons isol6s apr~s les radioexpositions ~, sur des milieux diff6rents.) Toutes les diff6rences sup6rieures ~t 10% pour Z L sont significatives. Pour les doses 61ev6es de 225 ~ 250 gy en particulier, toutes les concentrations en A T P + M g 2+ sont significativement efficaces.
complexe A T P + M g 2+, il faut signaler son r61e dans les m6canismes de r~parations au niveau des syntheses nucl~iques. En effet, scion LINDAHL et EDELMAN,(16} la r 6 p a r a t i o n des cassures chromosomiques fait intervenir une ligase ATP-t- M g z + d6pendante.
plantes viables exploitables p o u r l ' o b t e n t i o n de m u t a n t s ~ventuels.
M a i s ce complexe A T P + M g 2+ p e u t 6galement induire une a u g m e n t a t i o n de l'activit6 ad6nylatecyclase selon KATZ et al. (is) Et cette activation de I ' A M P cyclis6 est i m p o r t a n t e , puisque ce nucl6otide avec le G M P est lui-m6me un facteur actif de r a d i o r e s t a u r a t i o n , c o m m e nous l'avons contr61~ au cours de nos e x p 6 n• m e n t a u o• n s (18) sur le Riz en confirmation d'observations ant6rieures.(13) I1 est int6ressant de souligner que les effets
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