Eigenschaften eines Monosaccharidtransportsystems bei Maiswurzeln

Biochem. Physiol. Pflanzen (BPP), Bd. 166, S. 313-325 (1974) Humboldt-Universitat zu Berlin, Sektion Biologie, Bereich Pflanzenphysiologie

Eigenschaften eines Monosaccharidtransportsystems bei Maiswurzeln I. Spezifitat Von P. SAMMLER und R. EHwALD Mit 8 Abbildungen

Properties of a Monosaccharide Transport System in Maize Root Tips. I. Specificity Key Term Index: sugar transport, glucose, 2-deoxyglucose, rhizodermis, transport kinetic and inhibition; Zea mays.

Summary Root tips isolated from maize seedlings absorp glucose and 2-deoxyglucose (2-deG) with the same rate, provided the concentration of sugars in the medium is low (10- 6 -10-3 molefl). Uptake of both sugars shows a constant rate over a prolonged period (several hours), though in the case of 2-deG uptake 2-deG-phosphate is accumulated. In the low concentration range the uptake of glucose and 2-deG is ratelimited by membrane transport at the rhizodermis, a process describable by the MICHAELIS-MEN'TEN-equation. The specificity of the transport system was investigated by detecting the competitive inhibition exerted by several sugars on 2-deG-uptake. D-glucose, 3-o-methylglucose, 2-deG, D-galactose and D-mannose are substrates with high affinities (Krvalues 10-4-10-3 molefl). Also D-fructose, L-sorbose and pentoses are taken up by this system. Uranyl nitrate was found to be a potent inhibitor of monosaccharide uptake.

Einleitung Der Transport von Zuckern durch die Zellmembran ist bei einer Vielzahl von heterotrophen Objekten - Bakterien, Pilzen und tierischen Zellen - eingehend untersucht worden (KoTYK und JANACEK 1970; NIKOLSKI und TROSCHIN 1973). Wahrend seit langem Arbeiten iiber die Verwertbarkeit applizierter Kohlenhydrate fur pflanzliche Organ- und Gewebekulturen durchgefiihrt werden (Literaturzusammenstellung bei GoRING und GERLACH 1966), liegen noch wenige Ergebnisse iiber die Natur des Zuckertransportes durch die pflanzliche Zellmembran vor. Durch Speichergewebe von Daucus carota (REINHOLD und EHSHAR 1968), Hypokotylsegmente von Cucurbita pepo (HANcocK 1970) und Chlorella vulgaris (KoMOR und TANNER 1971) werden nicht metabolisierbare Hexosen gegen den Konzentrationsgradienten akkumuliert. In mehreren Arbeiten haben KoMOR und TANNER die kinetischen Eigenschaften des induzierbaren Hexose-Transportsystems bei Chlorella vulgaris beschrieben (TANNER 1969; TANNER u. a. 1970; KOMOR und TANNER 1971).

314

P. SAMMLER und R. EHWALD

Bei vielzelligen pflanzlichen Objekten wird die kinetische Analyse der Zuckeraufnahme durch die Diffusion im ,Freien Raum" kompliziert. Die bei der Ionen- und Zuckeraufnahme durch pflanzliche Gewebe allgemein feststellbare ,Doppelisotherme" dar£ daher nicht als Ausdruck zweier unterschiedlicher Transportsysteme auf zelluHirer Ebene gedeutet werden (EHWALD u. a. 1973a). In diesem Zusammenhang konnten wir jedoch zeigen, da13 die Absorption von Monosacchariden durch Maiswurzeln im wesentlichen an der Rhizodermis erfolgt, wenn die Zuckerkonzentration im Medium niedrig ist (10-6 -10-3 Moljl). In dieser Arbeit werden Ergbnisse tiber die Spezifitat eines Monosaccharidtransport systems an der Rhizodermis von Maiswurzeln dargestellt. Material und Methoden Anzucht und Praparation des Versuchsmaterials erfolgten wre bei EHWALD u. a. (1973 a) beschrieben. Zur Anzucht steriler Keimlinge wurden ausgesuchte Karyopsen von Zca mays griindlich mit warmer Seifenlosung gewaschen, gespiilt und in einer Sterilisationsapparatur 30 min in 25%iger H 2 0 2 -Losung sterilisiert. Nach mehrfachem Spiilen mit Aqua dest wurden die Karyopsen in der Impfkamm.er auf das sterile Keimbett iibertragen, das zuvor im Autoklaven bei 1 atm wahrend 1 Std. keimfrei gemacht wurde. Die Keimung erfolgte in feuchtem Quarzsand. Die Sterilitat der Keimwurzeln wurde im Plattentest mit Hilfe von Nahragar gepriift. Aufnahme von 2-deG in Anwesenheit anderer Monosaccharide 3 mm lange, isolierte Wurzelspitzen (200 mg) wurden nach der Vorinkubation (30 min) zu 4 ml Medium in ein Erlenmeyerkolbchen gegeben, das 2-deG und verschiedene Hemmzucker in einer Konzentration von 10-5 10-3 Molfl enthielt. Die Proben wurden bei 25 oc mit ausreichend hoher Schiittelfrequenz geschiittelt. Nach 1 Std. wurde das Gewebe von der Inkubations!Osung getrennt und auf einer Nutsche 3mal kurz mit Aqua dest gewaschen. Die Extraktion des Gewebes erfolgte in einer Reibschale mit 2 x 2 ml 4%iger Trichloressigsaure unter Zugabe einer Spatelspitze Quarzsand. N ach dem Zentrifugieren (5 min bei 1000 g) wurde im Uberstand der Gehalt an lOslichen 2-deG-haltigen Verbindungen bestimmt. Die Bestimmung von 2-deG-P erfolgte in Anlehnung an AuausTIN und HoFMANN (1963). Dazu wurden nach der Extraktion des Gewebes 2 ml des Uberstandes zur Fallung der Zuckerphosphate mit Ba(OH)2 und ZnS01 eingesetzt. Der Niederschlag wurde 3mal mit 3 ml destilliertem Wasser gewaschen und anschlieBend das Sediment mit 2 x 3 ml 4%iger Trichloressigsaure extrahiert. Im erhaltenen Uberstand wurde der Gehalt an 2-deG-P bestimmt. Aufnahme von D-Glukose, D-Fruktose und L-Sorbose Die Aufnahmeraten wurden aus der Abnahme der Zuckerkonzentration im Medium wahrend eines definierten Inkubationszeitraumes ermittelt. Die Methode ist im Detail bei EHWALD u. a. (1973 a) beschrieben. Aufnahme von 14 C-Glukose und 14 C-Ribose 50 mg isolierter Wurzelspitzen wurden in Losungen mit markierter Glukose oder Ribose 30 min bzw. 60 min lang inkubiert, danach durch 3maliges Absaugen mit Aqua dest auf einem Papierfilter gewaschen. Das Gewebe wurde in eiue Szintillationskiivette zu 4 ml Methanol gegeben und iiber Nacht bei Raumtemperatur geschiittelt. Danach wurden 8 ml Szintillationsfliissigkeit (4 g PPO und 0,1 g POPOP/l Toluol) hinzugegeben und die Im:pulsrate mit dem Fliissigkeitsszintillations-Spektrometer Tri-Carb der Firma Packard gemessen. Die Berechnung der Aufnahmeraten erfolgte mit Hilfe interner Standards.

Eigenschaften eines Monosaccharidtransportsystems bei Maiswurzeln

315

Chemikalien: 2:Desoxy-D-glukose, Reanal, Budapest; (D+ )-Glucose f. d. Bakt, E. Merck AG, Darmstadt; P-D-Glucose C. P., Mann Research Laboratories, N.Y.; Fruktose DAB 7, D( + )Galactose reinst, D-Mannose reinst, D-Xylose z. A., L-Arabinose z. A., D-Glucosamin, VEB Berlin Chemie, Berlin; L-Sorbose und Trehalose, Chemapol, Prag; D-Ribose und Melibiose, Schuchard, Miinchen; D-Fucose, Serva Heidelberg; 3-0-Methyl-D-glucose, Calbiochem, Los Angeles; L-Glucose, Sigma, St. Louis; D-Arabinose f. d. Bakt., Ferak, Berlin; D-Ribose-1-014, 5-10 mCifmmol, Radiochemical center, Amersham 140 (U)-D-Glucose, UVVVR, Prag.

Ergebnisse

1. Aufnahme von 2-Desoxyglukose bei steril und nicht steril angezogenem Versuchsmaterial Die Aufnahme von 2-Desoxyglukose (2-deG) durch isolierte Maiswurzelspitzen zeigt keine signifikanten Unterschiede nach den verschiedenen Anzuchtbedingungen (Tabelle 1). Da die Aufnahmeraten von Glukose und 2-deG im niedrigen Konzentrationsbereich gleich hoch sind (vgl. dazu Abb. 3), konnen wir annehmen, da13 die erhaltenen Werte ftir die Glukoseaufnahme durch Maiswurzeln, tatsachlich die Absorption durch die Rhizodermiszellen wiedergeben und der Beitrag von Mikroorganismen an der Monosaccharidaufnahme unter unseren Versuchsbedingungen vernachlassigbar ist. Tabelle 1

Aufnahme von 2-Desoxyglukose (2-deG) durch isolierte Wurzelspitzen von Zea mays bei steril und nicht steril angezogenen Versuchsmaterial. Mittlere Konzentration von 2-deG im Medium 6,5 x 10-5 M, lnkubation: aerob 90 min bei 25 °0. FG = Frischgewicht

Anzucht a) steril in feuchtem Quarzsand b) uusteril auf feuchtem Filterpapier c) unsteril in feuchtem Quarzsand

2-deG-Aufnahme .uMolfg FG · h

n

0,832

±

0,082

5

0,804

±

0,028

5

0,873

±

0,057

10

2. Bedeutung der Schnittflache fur die Monosaccharidaufnahme Aus Tabelle 2 geht hervor, da13 die Schnittflachen isolierter Wurzelspitzen von Zea mays keine erhohte Aufnahme von 14 C-Glukose oder von 2-deG aus dem Au13enmedium bewirken. 3. Zeitlicher Verlauf und Konzentrationsabhangigkeit der Monosaccharida ufnahme Glukose, Fruktose und 2-deG werden durch isolierte Wurzelspitzen wahrend des untersuchten Zeitraumes von 3-5 Std. mit konstanter Rate aufgenommen (Abb. 1). Die Aufnahme von 2-deG verlauft linear, obwohl sich im Gewebe 2-deG-P anhauft

316

P. SAMMLER und R. EHWALD

Tabelle 2 Einflu/3 der Schnittfliiche auf die Aufnahme von 14 C-Glukose und 2-deG. 2 d alte 2-3 em lange isolierte Keimwurzeln wurden 4 h in Aqua dest. vorgeschiittelt. Danach wurden von der HiiJfte des Materials 3 mm lange apikale Wurzelspitzensegmente isoliert. Bei Variante a) wurden 20 Wurzelspitzen (3 mm) direkt in die Zuckerlosung inkubiert, bei b) wurden 20 Keimwurzeln (2-3 em) mit der Spitze ca. 5 mm tief in die Zuckerlosung eingetaucht. Die Proben wurden gut beliiftet und bei 25 oc gehalten. Nach 1 h wurden die Wurzeln entnommen, gut abgespiilt und in heiden Fallen die Radioaktivitat bzw. der Gehalt an loslichen 2-deG-haltigen Verbindungen in den apikalen 3 mm Iangen Wurzelspitzensegmenten bestimmt. FG = Frischgewicht 14

16

Imp/min

p,Mol/g FG

2-deG

p,Molfg FG

a) 1 mM

30900

2,5

1mM 1mM

2,74 2,80

b) 1 mM

31552

2,53

1mM 1mM

3,02 3,44

C-Glu

v(_..uMolfgFG)

v (,.u.Mol/gFql

8

12

6

4

2

60

120

180

240

300

t [min]

0

Abb. 1

60

120

180

240

t [ mi~

Abb. 2

Abb. 1. Zeitlicher Verlauf der Aufnahme von Glukose, Fruktose und 2-Desoxyglukose (2-deG) durch isolierte W urzelspitzen von Zea mays.

0 10-3 M Glukose; D 10-3 M Fruktose;

!:::,

2 x 10-4M 2-deG.

Abb. 2. Zeitlicher Verlauf der Aufnahme von 2-deG (e) und Akkumulation von 2-deG-P (D) in Maiswurzelspitzen

Konzentration an 2-deG im Medium: 10-3 lVL

Eigenschaften eines Monosaccharidtransportsystems oei Maiswurzeln

317

vf,uMol/gFG·h] 3

2

S [Moll!] ·10-l.

0 ~~-----r--------~------~--------~~ 0,1

0,5

1,0

1,5

2,0

Abb. 3. Isotherme der 2-deG-Aufnahme im niedrigen Konzentrationsbereich (5 x 10-6 his 2 x 10-4 M). Die Aufnahmeraten wurden aus der Abnahme der 2-deG-Konzentration im Medium (obere Kurve) bzw. nach einer einstiindigen Aufnahmeperiode und anschlieBender Extraktion des Gewebes (untere Kurve) ermittelt. Die Kreise (0) geben die Aufnahmerate fiir Glukose an.

(Abb. 2). Im niedrigen Konzentrationsbereich weisen Glukose und 2-deG gleich hohe Aufnahmegeschwindigkeiten auf. Die Isothermen der Aufnahme von 2-deG und Glukose zeigen einen hyperbolischen Verlauf (Abb. 3). 4. Konkurrenz der Monosaccharide beim Aufnahmeproze13 Die Aufnahme von 2-deG wird durch eine Reihe von Monosacchariden, darunter 3-0-Methylglukose und Galaktose kompetitiv gehemmt (Abb. 4). Das weistdarauf hin, da13 die Aufnahme dieser Zucker tiber ein gemeinsames Transportsystem erfolgt. In Tabelle 3 sind K 1-Werte verschiedener Monosaccharide bei der Hemmung der Aufnahme von 2-deG sowie die Halbsattigungskonstanten (KM-Werte) der Aufnahme von Glukose und 2-deG dargestellt. Die hochsten Affinitaten zum gemeinsamen Transportsystem besitzen Glukose, 3-0-Methylglukose und 2-deG; eine etwas niedrigere Affinitat besitzt Galaktose und noch geringere Affinitat weisen Mannose und Fruktose auf. Ein Substrat mit sehr niedriger Affinitat ist L-Sorbose. Aus dem EADIE-plot la13t sich ein K1-Wert von 0,036 Moljl berechnen (Abb. 5). Die Priifung einer Reihe weiterer Zucker und Zuckerderivate hinsichtlich ihrer Fahigkeit, die Aufnahme von 2-deG zu hemmen, ergab, da13 von den zusatzlich untersuchten Verbindungen nur D-Glukosamin einen dentlichen Hemmeffekt zeigt (Tabelle 4). Keinen Einflu13 auf die Aufnahme von 2-deG durch isolierte Maiswurzelspitzen haben Disaccharide wie Melibiose und Maltose. Bei anderen Disacchariden (z. B. Cellobiose und Trehalose) wird auf Grund der durch extrazellulare Hydrolyse des Disaccharids frei gewordenen Glukose die Aufnahmerate

318

P.

SAMMLER

und R.

EHWALD

0

A 5

4

10 9

8 7

6 ~

<.:>

5 B

LL

"' 0 :::E

~

4 3

/

5

4

.

3

~>

2

3

4

20

Abb. 4. Hemmung der Aufnahme von 2-deG durch andere Monosaccharide. Darstellung nach LINEWEAVER-BURK. Konzentration der hemmenden Zucker: & 2 x 10-4 M; • 10-3M; Kontrolle. A = Glukose, B = Galaktose, C = Mannose, D = 3-0-Methylglukose, E = Fruktose.

e

etwas erniedrigt. Aus diesem Grunde konnte auch der EinfluB von Saccharose und Glukose-6-P auf den Monosaccharidtransport mit der hier angewandten Methode nicht untersucht werden. Wahrscheinlich besitzen D-Xylose und andere Pentosen eine geringe Affinitat zu dem hier untersuchten Transportsystem, da Glukose und andere Hexosen die Aufnahme von Pentosen durch Maiswurzeln stark hemmen (GRANT und BEEVERS 1964). Wir fanden, daB selbst Fruktose, ein Zucker mit relativ niedriger Affinitat zum Transportsystem, die Riboseaufnahme stark erniedrigt (Tabelle 5). Das Monosaccharidtransportsystem bei Maiswurzeln besitzt im Unterschied zum Glukosetransportsystem bei Hefen (EHWALD u. a. 1973b) eine gleich hohe Affinitat

319

Eigenschaften eines Monosaccharidtransportsystems bei Maiswurzeln Tabelle 3

K -Werte verschiedener Monosaccharide bei der Hemmung der 2-deG-Aufnahme und Kr,r W erte fur D-Glukose und 2- Desoxy-D-Glukose

1,4 x10-4 M 2,4x10 M

3-0- Methyl- D-glukose D-Glukose 2- Desoxy-D-glukose D-Galaktose D-Mannose D-Fruktose L-Sorbose 1 )

1-2x10-4 M 2-3x10- 4 M

3,3 x10- 4 M 6,7 X 10-4 M 31,6 X 10-4 M 360,0 X 10- 4 M

1) Hemmung der Aufnahme von D-Glukose

v LuMol/gFG·h] I,

3

2

• 0

0

10 Abb. 5. Hemmung der Aufnahm.e von

20

14 C-Glukose

30

v/s [ml/gFG·h]

durch Sorbose in der Darstellung nach

EADIE

und

HOFSTEE.

Q,

e

Kontrolle; D., .A 5 X 10-2 M Sorbose.

ftir die IX- und P-Anomeren von D-Glukose. Es ist kein Unterschied in der Hemmung der Aufnahme von 2-deG durch IX- und /1-Glukose festzustellen (Tabelle 6). Die Hemmung der Aufnahme von 2-deG durch verschiedene Monosaccharide bei hohen Substratkonzentrationen (10-100 mMolfl) liiBt hinsichtlich ihrer Spezifitat keine Unterschiede zu den Resultaten erkennen, die im niedrigen Konzentrationsbereich erhalten wurden (Abb. 6).

320 Tabelle 4

P.

SAMMLER

und R.

EHWALD

Einflu[J verschiedener Zucker und Zuckerderivate auf die 2-deG-Aufnahme Konzentration an 2-deG: 2 x 10-4 M; Konzentrationen der hemmenden Zucker 10-3 M; Inkubation aerob; Temp. 25 oc

2-deG-Aufnahme (,uMol/g FG · h)

D-Xylose L-Arabinose D-Arabinose*) D-Ribose*) L-Glukose D-Frucose D-Glukosamin Galakturonsaure *) Temp. 28

Tabelle 5

in Anwesenheit des des hemmenden Zuckers

1,30 ± 1,30 ± 2,02 ± 2,02 ± 1,37 ± 1,47 ± 1,47 ± 1,47 ±

1,19 ± 1,32 ± 1,95 ± 2,12 ± 1,41 ± 1,46 ± 1,10 ± 1,45 ±

0,10 0,10 0,14 0,14 0,07 0,12 0,12 0,12

0,06 0,04 0,02 0,04 0,10 0,03 0,04 0,07

oc

Hemmung der Aufnahme von 14 C-Rib

in der Kontrolle

14 C-Ribose

durch Fruktose

Imp/min

(mM)

FruktoseKonzeutration (mM)

1 1 1 1

0 1 10 100

2646± 1859 ± 1018 ± 662±

70 135 89 96

Ribose-Aufnahme ,uMolfg FG · h

n

0,599 ± 0,422 ± 0,232 ± 0,152 ±

4 4 4 4

0,018 0,031 0,021 0,021

Tabelle 6 Einflu[J von ex- und {J-D-Glukose auf die Aufnahme von 2-deG bei isolierten Wurzelspitzen von Zea mays. Inkubation aerob: 10 min, Temp.: 24,5 oc 2-deG-Aufnahme t-tMol/g FG

% d.

10

0,92 0,64 0,63

100 69 68

10

0,96 0,66 0,69

100 69 72

10

1,17 0,63 0,52

100 54 44

Konzentrationen 2-deG (mM)

cx-Glo (mM)

10 10 10

10

10 10 10

10

10 10 10

10

{J-Glo (mM)

Kontrolle

Eigenschaften eines Monosaccharidtransportsystems bei Maiswurzeln

i. 100

3-0-Methylglukose

D-Glukose

D-Galaktose

321

D-Mannose

80 60 40 20

Konzentration des Hemmzuckers

D 10

IZJ 20

§

lS.'S'J

50

100 mM

Abb. 6. Hemmung der Aufnahme von 2-deG durch andere Monosaccharide im hohen Konzentrationsbereich. Konzentration an 2-deG: 10-2 M. Aufnahme der Kontrolle

= 100%. Inkubationsdauer 1 h bei

25 °C.

5. Hemmung der Monosaccharidaufnahme durch Uranyl-Ionen Uranylionen fungieren nach RoTHSTEIN (1962) und CIRILLO und WILKINS (1964) als nicht penetrierende Transportinhibitoren, die bereits in niedrigen Konzentrationen zu einer Hemmung des Zuckerinfluxes und Zuckereffluxes ftihren. Die Aufnahme von Glukose (Abb. 7) und anderen Monosacchariden (Abb. 8) wird durch U0 2(N0 3) 2 im sauren pH-Bereich (pH< 5) stark gehemmt. v [pMol/gFG]

35 1

30

2

25 3 20

15 10

4 5

5 0 0

60

120

t [min]

Abb. 7. Einflu[J von Uranylionen auf die Glukoseaufnahme. Konzentration an Glukose: 5,5 x 10-3 M. 1 = Kontrolle; 2 = 8 x 10-5 ; 3 = 2 x 10-4 ; 4 = 4 x 10-4 ; 5 = 8 X 10-4 M U0 2(N0 3 ) 2 •

322

P. SAMMLER und R. EHw ALD

v (pMol/gFG·h]

Abb. 8. Hem mung der Aufnahme von Glukose (1), 2-deG (2), Fruktose (3) und Sorbose ( 4) durch 4 X 10-4 M U02 (N0 3 ) 2 • Konzentration der Zucker im Medium: 0,011 M Glukose, Fruktose und Sorbose, 0,005 M 2-deG. pH-Wert des Mediums 4,5; Inkubationsdauer 1 h; Temperatur 25 °C. Die Zahlen iiber den Siiulen geben die Aufnahme in % gegeniiber der Kontrolle an.

Diskussion

Als geschwindigkeitsbestimmende Schritte bei der Aufnahme von Hexosen durch pflanzliche Gewebe konnen in Betracht gezogen werden:

1. Die Diffusion in den ,Freien Raum", 2. der Transport durch das Plasmalemma, 3. die Phosphorylierung der Zucker, 4. der Phosphorylierung nachfolgende Reaktionen und 5. der symplasmatische Transport. Obwohl die Diffusion der Zucker in den Freien Raum nicht zum ProzeB der Aufnahme in die Zelle gerechnet wird, kommt sie als limitierender Schritt in Betracht, wenn die Zuckerkonzentration im Medium hoch ist. Im Bereich niedriger Konzentrationen (< 10-3 Mol/1 ) konnen wir jedoch die Diffusion des Substrates in den Freien Raum als geschwindigkeitsbestimmenden Faktor vernachlassigen (EnwALD u. a. 1973a). Die Aufnahme von Glukose und 2-Desoxyglukose verlauft bei isolierten Wurzelspitzen von Zea mays linear mit der Zeit (Abb. 1) und ihre Konzentrationsabhangigkeit weist die Form einer Sattigungskurve auf (Abb. 3), die sich mit Hilfe der MICHAELIS-MENTENGleichung beschreiben laBt (Abb. 4 und Abb. 5). Glukose und 2-deG besitzen ahnliche KM- und Kr-Werte von 1-3 x 10-4 Molfl. Beide Zucker werden im metabolischen Kompartiment zu den entsprechenden Zucker-6-phosphaten verestert. Der weitere Stoffwechsel unterscheidet sich jedoch dadurch, daB 2-deG-6-P nicht in die Glykolyse

Eigenschaften eines Monosaccharidtransportsystems bei Maiswurzeln

323

oder den Pentosephosphatweg einbezogen wird und sich in der Zelle anreichert (Abb. 2). Der lineare Verlauf der Aufnahme von 2-deG tiber mehrere Std. bei gleichzeitiger Anhiiufung von 2-deG-P in der Zelle und die Aquivalenz der Aufnahmeraten von 2-deG und Glukose bei niedrigen Konzentrationen schlieBen aus, daB unter den vorliegenden Versuchsbedingungen der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Hexokinase-Reaktion nachfolgt. Da nicht metabolisierbare Hexosen wie 3-0-Methylglukose (REINHOLD und ESHHAR 1968; KOMOR und TANNER 1971) und L-Sorbose (BoWEN 1972; EHWALD und SAMMLER 1975) sowie auch Galaktose die Aufnahme von 2-deG bzw. von Glukose kompetitiv hemmen (Abb. 4 und Abb. 5), ist es unwahrscheinlich, daB die Konkurrenz der Zucker bei der Aufnahme in die Zelle mit der Hexokinase-Reaktion zusammenhangt. Alle von uns erhaltenen Resultate sind mit der Annahme einer limitierenden Rolle des Membrantransportes bei der Monosaccharidaufnahme durch isolierte Maiswurzelspitzen vereinbar (Tabelle 7). Tabelle 7 Analyse der Glukoseaufnahme durch isolierte W urzelspitzen von Zea mays in bezug auf geschwindigkeitsbestimmende Reaktionen FR = freier Raum Befund

Transport in den FR

Membrantransport

Phosphorylierung

1 2-deG-Aufnahme = Glukose-Aufnahme

+

+

+

2 Anhitufung von 2-deG-P bei konst. Aufnahmerate

+

+

+

Kompetitive Hemmung d. Aufnahme von 2-deG u. Glukose, durch 3-0-MethylGlukose, Galaktose, Sorbose

Reaktionen nach d. Phosphorylie rung

l J

+

4 Aufnahme von 2-deG und Glukose ~ Diffusion in den FR -

+ +

+

+

+) Befund ist vereinbar -) Befund ist nicht vereinbar mit einer geschwindigkeitsbestimmenden Funktion des Teilschrittes bei der Glukoseaufnahme

Es ist moglich, daB der symplasmatische Transport der Zucker aus den absorbierenden Zellen der Gewebsoberfliiche zu anderen Zellschichten Bedeutung flir die Aufnahmeraten besitzt. Dafiir sprechen die geringen Aufnahmeraten von 3-0-Methylglukose im Vergleich zu Glukose bei Karottenspeichergewebe (REINHOLD und EsHHAR 1968) und bei Hypokotylsegmenten verschiedener dikotyler Pflanzenarten (HANCOCK 1970). Urn die Substratspezifitat eines Zuckertransportsystems zu charakterisieren, werden haufig die Kr Werte einer Reihe von Zuckern bestimmt. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daB die Transportraten nur eines einzigen Substrates gemessen

324

P. SAMMLER und R. EHWALD

werden miissen. Die Abhangigkeit der Affinitat eines Monasoccharids erlaubt, Riickschliisse tiber die Struktur des substratbindenden Zentrums am Transportsystem zu ziehen (LEFEVRE 1961). Es lassen sich folgende Aussagen tiber den Zusammenhang zwischen den Liganden an einzelnen C-Atomen des Pyranose-Ringes und der Affinitat zum Transportsystem bei Maiswurzelspitzen machen: C1 : Eine glykosidische Bindung fiihrt zum volligen Affinitatsverlust. Die Stellung der OH-Gruppe (aquatorial o. axial) ist nicht wichtig, da die Glukoseaufnahme nicht anomerenspezifisch ist. C2 : Die OH-Gruppe kann fehlen, ohne daB die Affinitat beeinflu.Bt wird (2-deG); ist sie vorhanden, wird die aquatoriale Stellung bevorzugt (D-Glukose > D-Mannose). Eine Substitution durch die NH 2-Gruppe verringert die Affinitat. C3 : Eine Methylierung der OH-Gruppe in aquotorialer Stellung verringert die Affinitat nicht (3-0-Methylglukose). C4 : Die aquatoriale Stellung der OH-Gruppe ist leicht bevorzugt (D-Glukose > DGalaktose). C5 : Die CH 20H-Gruppe hat Bedeutung fur die Affinitat (Pentosen 6-Desoxy-D-galaktose und Galakturonsaure besitzen sehr geringe Affinitaten). Hexo-Aldosen, die vorwiegend in der Pyranose-Ring-Form vorliegen und in der C1-Konformation nach REEVES (1950) stabil sind, (z. B. D-Glukose, D-Galaktose und D-Mannose ), stellen somit giinstige Transportstrukturen dar. L-Glukose, die in der 1C-Konformation vorliegt, besitzt keine oder nur eine sehr geringe Affinitat. Das Monosaccharidtransportsystem bei Maiswurzeln zeigt eine ahnlich breite Spezifitat wie die entsprechenden Transportsysteme bei Erythrozyten (LEFEVRE 1961), Backerhefe (KoTYK 1967; CIRILLO 1968), Chlorella (TANNER u. a. 1970; KoMOR und TANNER 1971) und bei anderen Eukaryoten (STEIN 1967). Es weist in seiner Spezifitat viele Gemeinsamkeiten mit bisher bei Geweben hoherer Pflanzen untersuchten Zuckertransportsystemen (REINHOLD und EsHHAR 1968; HANCOCK 1970; BowEN 1972; MARETZKI und THOM 1972) auf. Zusammenfassung Isolierte Maiswurzelspitzen absorbieren Glukose und 2-Desoxyglukose mit gleicher Geschwindigkeit, wenn die Konzentration der Zucker im Medium niedrig ist ( < 10-3 Molfl). Die Raten der Aufnahme beider Zucker bleiben im Verlaufe mehrerer Stunden konstant, obwohl sich im Gewebe 2-Desoxyglukosephosphat anhiiuft. Geschwindigkeitsbestimmend ist im Bereich niedriger Substratkonzentrationen der Membrantransport an der Rhizodermis, der sich mit Hilfe der MICHAELISMENTEN-Gleichung beschreiben liiBt. Die Spezifitiit des Transportsystems wnrde charakterisiert, indem die kompetitive Hemmung der Aufnahme von 2-Desoxyglukose durch andere Monosaccharide untersucht wurde. Substrate mit hoher Affinitat zum Transportsystem sind: D-Glukose, 3-0-Methylglukose, 2-Desoxyglukose, DGalaktose und D-Mannose (K1 -Werte: 10-4 -10-3 Mol/1). Aber auch D-Fruktose, L-Sorbose und Pentosen werden durch das gleiche System transportiert. Das Transportsystem ist empfindlich g egeniiber Uranylionen. Herm Prof. Dr. sc. H. GoRING, der diese Arbeit groBziigig unterstiitzte und durch wertvolle Anregungen fiirderte, gilt der besondere Dank der Autoren.

Eigenschaften eines Monosaccharidtransportsystems bei Maiswurzeln

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Bioehem. Physiol. Pflanzen, Bd. 166