Ein Beitrag zur physiologischen Charakterisierung von drei Chlorophyll b-freien Mutanten von Hordeum vulgare1)

Biochem. Physiol. Pflanzen 173, 146-159 (1978)

Ein Beitrag zur physiologischen Charakterisierung von drei Chlorophyll b-freien Mutanten von Hordeum vulgare 1 ) HERTA SAGROMSKY

Zentralinstitut fiir Genetik und Kulturpflanzenforschung Gatersleben

Contribution to the Physiological Characterisation of Three Chlorophyll b-Iess Mutants from Hordeum vulgare Key Term Index: carotenoids, chlorophyll, chlorophyll b mutants, Hill reaction; Hordeum vulgare.

Summary Three chlorophyll b-Iess mutants from Hordeum vulgare were cultivated with their parent-form, the variety Donaria, under light intensities of 2000, 3000 and 22000 lux corresponding to 33, 50 and 362 microeinstein m-2s-1 , respectively. Pigment content of the plants and Hill activities of chloroplasts isolated from them were determined: 1. When grown under 22000 lux the chlorophyll a content in the mutants reached only 61-65 % of that in Donaria, under 2000 lux 71-78%. 2. The neoxlmthin content of the mutants amounted to 18 % and the lutein zeaxanthin content to about 40 % of the values for Donaria. 3. The chloroplasts of the mutants were more sensitive to SDS than those from Donaria. 4. At high light intensities, chloroplasts from the mutants yielded on a chlorophyll a basis higher Hill activities with ferricyanide and dichlorophenolindophenol as oxidants than chloroplasts from Donaria. Light saturation of the Hill activities was not achieved for the chloroplasts of the mutants under the experimental conditions tested. 5. Hill activities with ferricyanide as oxidant were on a chlorophyll a basis considerably lower for chloroplasts from plants grown under 2000 lux than for those from plants grown under 22000 lux. 6. During ontogeny of the leaves the plastids of the mutants reached their full capacity for Hill activity later than those of Donaria. 1. Hill activities with 1,5-diphenylcarbazone as reagent were catalyzed about equally on a chlorophyll a basis by plastids from the mutants and Donaria.

+

Einleitung

Bei der Untersuchung von Wachstums- und Entwicklungsvorgangen sowie von physiologischen Reaktionen haben sich Mutanten als geeignete Versuchsobjekte erwiesen. Mit ihnen gelang es zum Beispiel, Biosyntheseschritte von wichtigen PflanzeninhaItsstoIfen aufzuklaren oder auch verschiedene Reaktionsablaufe in der Pflanze zu analysieren. Der Umgang mit diesen Objekten gebietet jedoch gewisse Vorsicht. Mutanten brauchen nicht nur in von uns leicht wahrnehmbaren Eigenschaften abgeandert zu sein, sondern konnen auch Abwandlungen haben, die phanotypisch nicht in Erscheinung treten. Storungen von Funktionen der Normalpflanze sind daher nicht ohne weiteres durch die sichtbaren Veranderungen bedingt, sondern konnen auch 1) Herrn Prof. Dr. A.

RIETH

gewidmet.

Charakterisierung von chlorophyll b-freien Gerstenmutanten

147

durch nicht leicht erfaJ3bare Abwandlungen vom Wildtypus hervorgerufen sein. Wenn sich aber andererseits Mutanten bei gewissen Aktivitaten genau so wie Normalpflanzen verhalten, dann ist wohl der SchluB berechtigt, daB das bei den Mutanten fehlenden Merkmal fur diese betreffende Reaktion nicht benotigt wird. Zur Beurteilung der physiologischen Bedeutung von Chlorophyll b standen uns Mutanten mit abweichendem Chlorophyll b-Gehalt zur Verfugung, vor aHem auch solche, bei denen Chlorophyll b nicht nachweisbar war. In fruheren Untersuchungen (SAGROMSKY 1974) war gezeigt worden, daB die 3 Chlorophyll b-freien Mutanten 2800, 2807 und 3613 von Hordeum vulgare cv. Donaria etwas geringeres Wachstum und verminderte Samenproduktion als die Elternform hatten, reduzierte Pigmentierung aufwiesen, schwach herabgesetzten CO2- Umsatz pro Chlorophyll a zeigten, aber sehr starke Hillaktivitaten mit Ferricyanid pro Chlorophyll a erkennen IieBen. Die Kulturen fUr diese Untersuchungen waren in NahrlOsungen in einem Gewachshaus angezogen worden. Zwar wurden zum Vergleich der Mutanten mit der Stammform nur Pflanzen verwendet, die zu der gleichen Zeit unter denselben Licht- und Temperaturbedingungen gewachsen waren, doch da die Pigmentierung und das Photosyntheseverhalten bei Normalpflanzen in starkem MaBe von Licht und Temperatur wahrend ihrer Ankultur abhangig und im Gewachshaus diese Faktoren nicht konstant sind, sind diese Werte nur relativ zu nehmen. Sie sind bestimmt durch das Vorleben der Pflanzen. Mutanten werden in der Regel durch AuBenfaktoren in noch starkerem MaBe als Normalpflanzen beeinfluBt. Sie konnen durch die Vorkultur anders gepragt werden als die Elternform. Daher sollte in den folgenden Untersuchungen an Kulturen, die in kontrollierten reproduzierbaren Klimabedingungen gewachsen waren, die Variabilitat von Pigmentierung und Hill-Aktivitaten der 3 Mutanten im Vergleich zur Elternform bestimmt und weitere Eigenschaften dieser Formen erfaBt werden. Material und Methoden Material

Die 3 Mutanten 2500, 2807, 3613 sowie die Stammform "Donaria" von Hordeum vulgare L. stammten aus dem Mutantensortiment von H. Stubbe. Sie kamen, wenn nicht spezielle Angaben im Text zu finden sind, in Nahrlosung nach van der Crone mit einem Zusatz von Hoaglandscher AZ-Losung (RUGE 1947) zur Kultur, entweder im Hydroponikverfahren mit entkalkten, in de stilliertern Wasser gewaschenen 3-5 mm dicken Kieselsteinen oder auf gewaschenen Biolastonnadeln und zwar in einem halbklimatisierten Raum bei 18 ± 1 DC oder 25 ± 1 DC bei 2000 oder 3000 Lux (12 HQR 400 Watt Lampen) im 16: 8 Licht-Dunkel-Rhythmus oder in einer Klimakammer (Controlled Environments, Kanada) bei einem Tag-Nachtwechsel von 16: 8 Stunden (Lichtintensitat 22000 Lux bzw. 362 Mikroeinstein m-2 s-t, Tagestemperatur 24 DC und Nachttemperatur 16 DC). Pigmentbestimmungen

Zur Analyse wurde 1 g Frischgewicht, bestehend aus etwa 5 cm langen Blattstiicken aus der Mitte der Blatter, genommen, die Blattstiicke mit einer Schere zerkleinert, dann mit einem Zusatz von MgCO s, gegliihtem Quarzsand und Methanol extrahiert und mit Hilfe von NaCl und Aqua dest. in Athylather iibergeschiittelt. Aus dem Absorptionsspektrum im Rot einer abgemessenen Portion der Athylatherlosung werden die Chlorophyll a- und Chlorophyll b-Gehalte nach CO:M:AR und ZSCHEILE (1942) berechnet. Die 3 Mutanten hatten sich in friiheren Untersuchungen (1974) als 10'

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H. SAGROMSKY

frei von meBbaren Mengen an Chlorophyll b erwiesen, daher war bei ihnen aus der Atherfraktion nur die Chlorophyll a-Menge zu ermitteln. Zur Bestimmung der Carotinoide wurde eine abgemessene Menge der Atherliisung im Vakuum unter Stickstoff eingeengt, dabei entwassert (SAGROMSKY 1973) und die Pigmenttrennung diinnschichtchromatographisch in Kieselgel-Kieselgur-Platten (HAGER und BERTENRATH 1962 und 1966) durchgefiihrt. Die Pigmentanalysen wurden mit 5-7 Wiederholungen vorgenommen. Bestimmung der Hill-Aktivitiiten Die Messung der Hillaktivitaten geschah wie in fruheren Versuchen (SAGROMSKY 1974). Das Chloroplastenisolierungsmedium enthielt 0,4 mol Saccharose, 0,05 mol "Tris" Puffer, 0,01 mol KH2 P04 und hatte einen pH-Wert von 7,4. Das verwendete Reaktionsgemisch (3 ccm) hatte im allgemeinen 6-13 ",g Chlorophyll a, 40 ",mol Tris-Puffer, 70 ",mol NaCl, 10 ",mol MgCl2 und 1,0 ",mol Ferricyanid. Statt Ferricyanid wurdewahlweise 0,1 mmoI2,6-Dichlorphenol-Indophenol (DICIP) oder 1 mmol1,5-Di-phenylcarbazon genommen. Bei den Versuchen mit Diphenylcarbazon war die Chloroplastensuspensionetwas dunner gewahlt worden, so daB das Reaktionsgemisch 4-5 ",g Chlorophyll a besaB. Die Versuche mit Ferricyanid hattenin der Vergleichskuvette keine Chloroplasten, sondern nur Reaktionsliisung mit Ferricyanid. Bei den Versuchen mit 2,6-Dichlorphenol-Indophenol und 1,5-Diphenylcarbazon hatten Reaktions- und Vergleichkuvette Chloroplasten und nur das ReaktionsgefaB den Farbstoff. - Die absoluten Werte fiir die reduzierten Mengen von KsFe(CH)o beziehungsweise von 2,6-Dichlorphenol-Indophenol oder 1,5-Diphenylcarbazon wurden aus den Veranderungen der Absorptionen bei 418 nm beziehungsweise der der Absorptionsmaxima bei 602 nm oder bei 487 nm und entsprechenden Eichkurven errechnet. - Der Chlorophyllgehalt der MeBproben wurde nach Versetzen von 10 ccm Chloroplastenliisung mit Methanol und Uberschiittlung der Farbstoffe mit Hilfe von NaCl in Diathylather aus der Absorption im Rot der Atherliisung bestimmt (COMAR und ZSCHEILE 1942). Die Versuche mit 1,5 Diephenylcarbazon wurden im Rotlicht durchgefiihrt, RG 5 von VEB Schott & Gen., lena.

Ergebnisse und Diskussion

Die Mutanten 2800, 2807 und 3613 waren in den Jahren 1947 und 1949 aus der von mit X-Strahlen behandelten Samen von Hordeum vulgare L. der Sorte "Donaria" ausgelesen worden. Sie waren unabhangig voneinander entstanden. Durch diaHele Kreuzungen konnten MACHOLD et al. (1977) zeigen, daB aHe 3 wie. auch die Chlorophyll b-freie Gerstenmutante von HIGHKIN (HIGHKIN und FRENKEL 1962) im selben Kerngen mutiert waren. Die 3 aHelen Formen unterschieden sich in ihren Wachstums- und Entwicklungseigenschaften, uber die schon berichtet wurde (SAGROMSKY 1974). Daruber hinaus erwies sich die Mutante 3613 als besonders gut keimfahig, die Mutante 2800 reagierte empfindlicher als die ubrigen Formen auf Licht- und Temperaturveranderungen wahrend der Anzucht und die Mutante 2807 hatte stets die hochsten Hillaktivitaten. ~-Generation

Pigmentgehalte der Mutanten und der Stammform Der Pigmentgehalt von Pflanzen wird durch die Klimabedingungen wahrend der Wachstumszeit beeinfluBt, vor aHem durch die Lichtverhaltnisse vom Standort (EGLE 1960). Licht steuert wahrend der Anzucht der Pflanzen die PigmentbiIdungsraten und bestimmt damit in gewissen Grenzen den Pigmentgehalt und die Farbstoffzusammensetzung in den Plastiden (SAGROMSKY 1973). Andererseits kann aber auch Licht bereits vorhandene Farbstoffe zerstoren, so daB die Pflanzen zwar die Fahigkeit haben, nor-

Charakterisierung von chlorophyll b-freien Gerstenmutanten

149

male Pigmentmengen zu synthetisieren, aber diese nicht halten ktinnen. Das geschieht meistens, wenn die betreffenden Pflanzen starken Stoffwechselsttirungen unterliegen. Dann laufen meistens Photosynthesereaktionen nicht normal ab und die von den Plastidenfarbstoffen absorbierte Lichtenergie wird zu photooxydativen Substanzzersttirungen verwendet, die Pigmentabbau und auch Degeneration von Plastiden (meistens Vakuolisierung) zur Folge haben ktinnen (SAGROMSKY 1956). Bei Mutanten sind solche Erscheinungen besonders haufig zu finden. Sie ktinnen sich dann nur im Schwachlicht griin entwickeln.

Tabelle 1. Pigmentgehalt in mg/g Frischgewicht der Elternform "Donaria" und der Mutanten 3613, 2807 und 28 14tagige Kultur bei 18°C und 2000 Lux (16: 8 h Licht/Dunkel) in NahrHisung nach van der Crone + AZ-Liisu , (Hoagland) auf Biolastonnadeln Chlorophyll a Donaria 3613 2807 2800

1,05 0,58 0,57 0,52

± 0,03 ± 0,02 ± 0,01 ± 0,01

Chlorophyll b 0,37

± 0,002

,B-Carotin 0,050 0,032 0,026 0,032

± 0,001 ± 0,001 ± 0,002 ± 0,002

Lutein + Zeaxanthin 0,095 0,042 0,038 0,039

± 0,003 ± 0,002 ± 0,001 ± 0,002

Violaxanthin 0,028 0,014 0,012 0,012

± 0,003 ± 0,001 ± 0,001 ± 0,002

Neoxanthin 0,032 0,006 0,006 0,006

± 0,002 ± 0,001 ± 0,001 ± 0,002

Tabelle 2. Pigmentgehalt in mg/g Trockengewicht der Elternform "Donaria" und der Mutanten 3613, .. 2807 und 2800. 14tatige Kultur bei 18°C und 2000 Lux (16: 8 h Licht/Dunkel) in Nahrliisung nach von der Crone + AZ-Liisung (Hoagland) auf Biolastonnadeln

Donaria 3613 2807 2800

Chlorophyll a

Chlorophyll b

,B-Carotin

Lutein + Zeaxanthin

Violaxanthin

Neoxanthin

10,37 7,98 8,11 7,33

3,73

0,50 0,44 0,37 0,44

0,94 0,59 0,53 0,55

0,28 0,19 0,18 0,17

0,34 0,09 0,08 0,08

Tabelle 3. Pigmentgehalt in mg/g Frischgewicht der Elternform "Donaria" und der Mutanten 3613, 2807 und 280 14tatige Kultur bei 24°C: 16 °C im 16 :8stiindigen Licht-Dunkel-Wechsel (LicHtintensitat 22000 Lux oder 36 Mikroeinstein m-2s-1) in Nahrliisung nach van der Crone mit llMachem N-Gehalt und Hoaglandscher AZ-L sung auf Biolastonnadeln . Chlorophyll a Donaria 3613 2807 2800

1,42 0,80 0,75 0,73

± 0,03 ± 0,02 ± 0,01 ± 0,02

Chlorophyll b 0,51

± 0,03

,B-Carotin 0,060 0,046 0,043 0,043

± 0,003 ± 0,002 ± 0,002 ± 0,002

Lutein + Zeaxanthin 0,084 0,051 0,041 0,042

± 0,003 ± 0,003 ± 0,002 ± 0,003

Violaxanthin 0,028 0,018 0,017 0,020

± 0,002 ± 0,002 ± 0,001 ± 0,003

Neoxanthin 0,029 0,007 0,006 0,007

± 0,002 ± 0,001 ± 0,002 ± 0,001

H.

150

SAGROMSKY

Um den EinfluJ3 der Lichtintensitat wahrend der Ankultur auf die Pigmentierung der 3 Chlorophyll b-freien Mutanten und der Elternform "Donaria" zu priifen, wurden Pflanzen davon bei 2000 und bei 22000 Lux (33 und 362 Mikroeinstein m-2 S-I) kultiviert und von ihren Blattern Pigmentanalysen durchgefiihrt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Tabellen 1-4 zusammengestellt. Tabelle 1 enthalt die gefundenen Blattpigmentmengen in mg pro g Frischgewicht von Pflanzen, die bei 2000 Lux und 18°C gewachsen waren. In Tabelle 2 sind diese Werte auf die Trockengewichtseinheit bezogen. Die Pigmentgehalte der Blatter, die sich bei 22000 Lux entwickelt hatten, sind, bezogen auf g Frischgewicht, in Tabelle 3, bezogen auf g Trockengewicht, in Tabelle 4 zu finden. Aus diesen Werten geht hervor, daB bei beiden Tabelle 4. Pigmentgehalt in mglg Trockengewicht der Elternform "Donaria" und der Mutanten 3613, 2807 und 2800. 14tii.tige Kultur bei 24°C: 16 °C im 16: 8stiindigen Licht-Dunkel-Wechsel (Lichtintensitii.t 22000 Lux oder 362 Mikroeinstein m-2s-1 ) in Nii.hrliisung nach van der Crone mit FMachem N-Gehalt und Hoaglandscher AZ-Liisung auf Biolastonnadeln

Donaria

Chlorophyll a

Chlorophyll b

p-Carotin

Lutein + Zeaxanthin

Violaxanthin

Neoxanthin

10,67

3,89

0,45

0,65

0,21

0,22

3613

6,96

0,40

0,44

0,16

0,07

2807

6,55

0,38

0,36

0,15

0,06

2800

6,64

0,39

0,39

0,19

0,06

Lichtintensitaten die Mutanten stark reduzierte Chlorophyll a-Mengen besitzen. Das wird besonders deutlich, wenn das Frischgewicht als BezugsgroBe gewahlt wird. Dann enthalten die Mutanten nur 56% bis 50% des Chlorophyll a der Elternform. Bei den hohen Lichtintensitaten (22000 Lux) ist weiterhin bei den Mutanten die Pigmentreduktion starker ausgepragt als bei Schwachlicht. Das laBt sich besonders gut aus den Analysenwerten erkennen, bei denen der Pigmentgehalt auf das Trockengewicht bezogen wurde. Die Mutanten haben zum Beispiel nach Kultur bei 22000 Lux nur 65% bis 61 % der Chlorophyllmengen von Normalpflanzen unter gleichen Wachstumsbedingungen. Dagegen betragt der Chlorophyll a-Gehalt bei Mutanten, die sich bei 2000 Lux entwickelt haben, 78 % bis 71 % des Chlorophyll a der Elternform. Bei allen Kulturbedingungen war der Neoxanthingehalt der Mutantenblatter im Vergleich zu dem der Eltern~orm als stark vermindert gefunden worden. Es war bis au~ ein Viertel und mehr der Menge der Ausgangsform reduziert. Auch der Luteinund der ZeaxanthinanteiI war bei den Mutanten stark herabgesetzt, geringfiigiger derjenige von p-Carotin und Violaxanthin. 1m Gegensatz zum Chlorophyll a-Gehalt war die Minderung des Neoxanthins im Vergleieh zur Stammform bei Kultur imSchwachlicht starker ausgepragt als nach Wachstum im Starklicht. Das ist dadurch erklarbar, daB normal griine Pflanzen, wenn sie bei niederen Lichtintensitaten angezogen werden, eine starke ErhOhung der Neoxanthinbiosynthese erfahren, die Mutanten je-

151

Charakterisierung von chlorophyll b-freien Gerstenmutanten

Tabelle 5. Pigmentgehalt in mg/g Frischgewicht der Elternform "Donaria" und der Mutanten 3613, 2807 und 2800. 14tatige Kultur bei 25°C 2000 Lux (16: 8 h Licht/Dunkel) in Nahrlosung nach van der Crone + Hoaglandsche AZ-Losung auf Biolastonnadeln

Donaria 3613 2807 2800

Chlorophyll a

Chlorophyll b

± 0,03 0,55 ± 0,02 0,54 ± 0,02 0,54 ± 0,02

0,38

1,09

± 0,03

{J-Carotin

Lutein + Zeaxanthin

Violaxanthin

Neoxanthin

± 0,002 0,034 ± 0,001 0,033 ± 0,001 0,032 ± 0,002

± 0,004 0,041 ± 0,002 0,044 ± 0,003 0,045 ± 0,002

± 0,002 0,012 ± 0,001 0,014 ± 0,002 0,012 ± 0,002

± 0,003 0,005 ± 0,001 0,004 ± 0,001 0,004 ± 0,001

0,056

0,111

0,027

0,034

doch keine derartige Steigerung haben, so daJ3 der Unterschied im Neoxanthingehalt zwischen Mutanten und Normalpflanzen im SchwachIicht noch vergroJ3ert wird (SAGROMSKY 1973). Eine ErhOhung der Temperatur von 18°C auf 25 °C wahrend der Anzucht der Pflanzen im SchwachIicht steigerte die Herabsetzung des Chlorophyll a-Gehalts, desjenigen von Neoxanthin und von Lutein + Zeaxanthin geringfugig (Tabelle 5). Bei den 3 Mutanten 2800, 2807 und 3613 von Hordeum vUlgare cv. "Donaria" war bei allen bisher gewahlten Kulturbedingungen das Chlorophyll a als starker reduziert gefunden worden als bei der Chlorophyll b-freien Gerstenmutante von HIGHKIN (BOARDMAN und HIGliKIN 1966). Diese hatte nach Wachstum in einem temperaturreguIierten Gewachshaus (21°C: 16°C im 8: 16 h Rhythmus) im TagesIicht mit kiinstlichem Zusatzlicht (Photoperiode 16 h) den in Tabelle 6 aufgezeichneten Chlorophyllgehalt. Seine Mutante enthalt danach 94 % des Chlorophyll a der Ausgangsform, wahrend bei unseren Mutanten der Chlorophyll a-Gehalt bis auf 61 %reduziert ist. Die Angaben zu den verschiedenen Mutanten lassen sich jedoch nicht ohne weiteres vergleichen, da die Kulturbedingungen nicht dieselben waren. Tabelle 6. Chlorophyllgehalt (in mg/g Trockengewicht) der Chlorophyll b-freien Mutante von Hordeum vulgare und der Chlorophyll b-armen Mutante von Pisum sativum sowie der dazugehOrigen Stammformen (nach HIGH KIN und Mitarb.) . Chlorophyll a Chlorophyll b Chlorophyll a Hordeum vulgare

Normalform Mutante Pigmentgehalt der Mutantein ~o der Normalform

8,5 7,9 94

2,8

11,3 7,9 70

Pisum sativum

Normalform Mutante Pigmentgehalt der Mutante in % der Normalform

8,9 5,67 64

3,1 0,38 12

12,0 6,05 50

+b

152

H.

SAGROMSKY

Eine ahnliche Chlorophyllherabsetzung(in m.g pro gTrockengewicht) wie bei unseren Mutanten fanden HIG;HKIN et al. (1969) bei einer Mutante von Pisum sativum (Tabelle 6). Die Plastidenfeinstruktur in Blattern dieser Mutante, vor aHem ihre Granabildung, war stark gestort. Bei unseren 3 Mutanten dagegen konnte bei annahernd gleicher Pigmentherabsetzung gute Granabildung beobachtet werden (SAGROMSKY und DOBEL 1974). Damit wird gezeigt, daB Chlorophyll b nicht in Verbindung mit der Fahigkeit zur Granabildung gebracht werden kann. Mit VELEMINSKY und ROBBELEN (1966) entgegen der Auffassung von KNOT;H et al. (1976) sind wir der Meinung, daB nicht Chlorophyll b, sondern die GesamtchlorophyHmenge in Zusammenhang mit der Stabilitat des Photosyntheseapparates steht. Unsere 3 Mutanten haben zwar ein normales Thylakoidmembransystem mit gut ausgebildeten Grana, dennoch sind sie gegeniiber exogenen Einfliissen empfindlicher als die Normalform. Wenn zum Beispiel Chloroplastensuspensionen im normal en Extraktionsmedium mit Natriumdodecylsulfat (0,48 % SDS) versetzt wurden, dann trat eine Bindungslockerung der Chlorophyllmolekiile von der Mentbran ein und die Pigmente wurden langsam abgebaut. Zunachst wurde Phaophytinbildung beobachtet und bei noch langerer SDS-Einwirkung traten weitere Pigmentzerstorungen auf. Dabei erwiesen sich die 3 Mutanten als amalliger als ihre Elternform Donaria. Abb. 1 zeigt, daB bei der Mutante 2807 nach 30 min langem EinfluB von 0,4 % SDS das Chlorophyll wesentlich starker umgebildet ist als das der Normalform unter den gleichen Bedin-

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Dona ria

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2807

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500

600

700

nm

Abb. 1. Starkere Empfindlichkeit gegenuber 0,48 % SDS bei OhloropZastensuspensionen der Normalform aZs bei solchen der Mutante 2807. Ausgezogene Linie, Absorption von Chloroplastensuspensionen ohne SDS-Einwirkung, gestrichelte, nach 30 ,min langer SDS-Behandlung.

Charakterisierung von chlorophyll b-freien Gerstenmutanten

153

gungen. Schwachere Konzentrationen von SDS wirkten ahnlich, nur benotigten sie langere Zeiten, um zu demselben Zerstorungsgrad zu kommen. H ill-Aktivitiiten

Bei der Chlor,ophyll b-freien Gerstenmutante von HIG;HKIN sowie bei unseren 3 Mutanten 2800, 2807 und 3613, war bei Polyacrylamid-Gel-Elektrophoreseuntersuchungen der Chlorophyll-Protein-Komplex II nicht auffindbar(THoRNBER and HIGHKIN 1974; MACH OLD et al. 1977). Eine starkere Auflosung der Membran-Polypeptide mittels 11 % Polyacrylamid-Gel und 5 M Harnstoff lieJ3 erkennen, daJ3 bei allen Chlorophyll b-freien Mutanten eine Hauptpolypeptidbande (MG um 24 K Dalton), die gew.ohnlich in dem Chlorophyll-Protein-Komplex II assoziiert ist, drastisch reduziert und nur die schwachere Polypeptidbande des Chlorophyll-Protein-Komplexes II bei diesen Formen deutlich erkennbar war. Trotz des stark verringerten Chlorophyll-Protein-Komplexes II konnten bei der Mutante von HIGHKIN sowie bei den 3 Formen 2800, 2807 und 3613 starke Hill-Aktivitaten(SAGRoMSKY 1974) gemessen werden. Die Reduktion von Ferricyanid, bezogen auf mg Chlorophyll a, war bei den 3 Mutanten bei hOheren Lichtintensitaten wesentlich starker als bei der Normalform Donaria und erreichte bei den verwendeten Lichtintensitaten noch keine Lichtsattigung, wahrend die Normalform schon bei relativ schwachen Lichtintensitaten Lichtsattigung zeigte. Ein ahnliches Ergebnis konnte beobachtet werden, wenn als Reagenz 2,6-Dichlorophenol-Indophenol (DCIP) genommen wurde (Abb. 2), Zwar tritt bei DCIP die Lichtsattigung bei hOheren Lichtintensitaten als mit Ferricyanid ein, doch auch hier wurde bei den Mutanten Lichtsattigung innerhalb des benutzten Lichtintensitatsbereiches nicht erreicht und bei starkeren Lichtintensitaten lag die Aktivitat der Mutantenchloroplasten wesentlich iiber der von Chloroplast en der Ausgangsform. Bei Schwachlicht dagegen war die Reduktionskraft der Donaria-Chloroplasten der der Mutantenplastiden iiberlegen. SMILLIE

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5

10 10 4 Lux Abb. 2. Abhiingigkeit der Hill-Aktivitiit mit DOIP pro Ohlorophyll a von der gebotenen Lichtintensitiit. Die Mutanten 2800, 2807 und 3613 erreichen spater Lichtsattigung als die Ausgangsform Donaria.

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H.

SAGROMSKY

et al. (1977) berichteten von Gerstenmutanten, deren Hill-Aktivitaten mit DCIP wesentlich erhOht wurden, wenn dem Photo system II Elektronen. durch Diphenylcarbazid von au13en zugegeben wurden, auch waren diese Hill-Reaktionen unempfindlich gegeniiber DCMU [3-(3,4-Dichlorphenyl)-1,1-dimethyl-Harnstoff]. - Durch Zugabe von 1,5-Diphenylcarbazid (0,5 mmol oder 1 mmol) konnte die Hill-Aktivitat mit Ferricyanid und auch mit DCIP als Reagenz von den Chloroplasten der Mutanten 2800, 2807 und 3613 nicht erhOht werden. Auch wurde die Hill-Reaktion mit beiden Reagentien bei den Mutanten-Chloroplasten durch DCMU (10 ,."mol) vollkommen gehemmt. Das zeigt, da13 das wasserspaltende System bei diesen Formen gut ausgebildet ist und da13 die Photoreduktionen mit beiden Farbstoffen bei Chloroplasten der Mutanten normal ablaufen. Die Photosystem I-Aktivitat von Chloroplasten der Normalform und der 3 Mutanten wurde mit 1,5-Diphenylcarbazon (1 mmol) nach VERNON und SHAW (1972) gemessen. Abb. 3 zeigt, da13 sich die Mutante 2807 ahnlich wie die Normalform verhiilt. Die Aktivitat ihrer Chloroplasten liegt etwas hOher als die der Plastiden von Donaria, wohl weil die Plastiden der Mutante starkere Photosystem II-Reaktion als die der Form Donaria haben, so da13 bei ihnen das Photosystem I weniger durch Photosystem II begrenzt wird. Von Photosynthesemessungen her ist bekannt, da13 die Lichtverhiiltnisse am Stand~ ort die Photosynthesekapazitat der Pflanzen stark beeinflussen konnen. Die Kohlensaureassimilation der Blatter von Schattenpflanzen erreicht zwar relativ friih ihren Lichtsattigungswert, doch ihre Photosyntheserate bleibt stets unterhalb derjenigen von Blattem der gleichen Art aus Sonnengebieten (Literatur bei SIMONIS 1960). Ein Vergleich der Chloroplastenaktivitaten aus Sonnen- und Schattenbla ttem wurde von 600r-------------------------------------~

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5

Abb. 3. Abhiingigkeit der Hill-Aktivitiit mit 1,5-Diphenylcarbazon pro Chlorophyll a von der gebotenen Lichtintensitiit. Die Mutante 2807 verhiilt sich ahnlich wie die Elternform Donaria.

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Charakterisierung von chlorophyll b-freien Gerstenmutanten

BOARDMAN et al. (1974) durchgefiihrt. Die Hill-Aktivitat mit DCIP von Chloroplasten aus Blattern von Atriplex patula, die im Schwachlicht gewachsen waren, lag wesentlich niedriger als diejenigen von Chloroplasten aus Blattern mittlerer Lichtintensitaten und diese wiederum erheblich unterhalb der Aktivitaten von Chloroplasten aus Sonnenblattern. Wie bei den Photosyntheseraten von Blattern aus verschiedenen Lichtkhmata erreichten auch die Hill-Aktivitaten von Chloroplasten aus Schattenblattern ihren Lichtsattigungswert bei viel niedereren Lichtintensitaten als solche aus Sonnenblattern. Es schien daher wichtig zu priifen, in welchem Ausma6 die Hill-Aktivitaten der Mutantenchloroplasten durch die Lichtverhaltnisse am Standort beeinUu6t werden. Dazu wurden Hill-Reaktionsbestimmungen mit Chloroplasten von Blattern der Mutanten und von solchen der Elternform durchgefiihrt, die unter genau kontrollierten Be-

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Abb.4. EinflufJ der Lichtintensitat wahrend der Vorkultur aUf die Hill-Aktivitat mit Ferricyanid pro Chlorophyll a. Bei hiiheren Lichtintensitaten gewachsenes Material zeigt griiJ3ere Hillaktivitaten. 1. Plastiden aus Material, das bei 2000 Lux, 2. Plastiden aus Material, welches bei 22000 Lux gewachsen war.

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dingungen, bei 2000 und bei 22000 Lux, gewachsen waren. In Abb. 4 sind die Hillaktivitaten mit Ferricyanid von Chloroplasten der Mutante 2807 und von solchen der Form Donaria dieser Kulturserie bei verschiedenen Lichtintensitaten eingezeichnet. Wie bei den Versuchen von BOARDMAN et al. hatten Chloroplasten, die sich bei schwacheren Lichtintensitaten entwickelt hatten, stets niedrigere Hill-Reaktionswerte als diejenigen cler gleichen Form aus dem hellen Licht. Donaria-Chloroplasten, die sich bei 2000 Lux gebildet hatten, erreichten friiher den Lichtsattigungswert der Hill-Aktivitat als solche, die im Raum mit 22000 Lux gewachsen waren. Bei den Mutanten dagegen konnte in keinem Fall bei den gewahlten Lichtintensitaten Lichtsattigung gemessen werden. Die anderen Mutanten verhielten sich ahnlich wie die Form 2807. Obwohl Schwachlicht eine Zunahme von Chlorophyllmolekiilen bewirkt und damit die Photosyntheseeinheiten vergroBert, reicht die Zahl der lichtsammelnden Antennenmolekiile nicht aus, um bei den verwendeten Lichtintensitaten eine Lichtsattigung der HillReaktion zu erzielen. Bei Normalpflanzen llnterliegt die Photosynthesefahigkeit von Blattern, aber auch die Reduktionskraft ihrer Chloroplasten, im Laufe der Ontogenese gewissen Schwankungen. SESTAK et al. (1977) zeigten das fUr Chloroplasten aus Bohnenblattern.

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Abb. 5. EinflufJ des Blat/alters auf die Hill-Aktivitiit mit Ferricyanid pro Chlorophyll a bei verschiedenen Lichtintensitiiten. Bei der Mutante 2807 stammen die Plastiden aus 2 und 17 Tage alten Blattern, bei der Form Donaria aus 2 und 16 Tage alten.

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Charakterisierung von chlorophyll b-freien Gerstenmutanten

Eine Dbersicht uber die Literatur zu dieser Problematik gibt SESTAK (1977). Nachdem wir gefunden hatten, da13 Chloroplasten aus 2 Tage alten Blattern von Donaria hohere Hillaktivitaten mit Ferricyanid zeigten als solche aus 16tatigen, wahrend umgekehrt die Reduktionskapazitat von 2 Tage alten Chloroplasten der Mutante 2807 niedriger lag als diejenige von Chloroplasten aus 17 Tage alten Blattern (Abb. 5), schien es wichtig, die Hill-Aktivitat von Plastiden der Mutante im Vergleich zu den der Elternform Donaria im Laufe der Ontogenese zu untersuchen. Da Grasblatter von der Basis her wachsen, ist es schwierig, Gewebestiicke etwa gleichen Alters zu gewinnen. Es wurden daher bei den jungen Blattentwicklungsstadien nur relativ kurze Blattstreifen fur die Herstellung von Chloroplastensuspensionen benutzt. Dennoch war es bei diesem Material nicht moglich, Plastiden gleichen Alters zu erhalten, sondern es konnten nur Chloroplasten eines gewisssen Altersbereiches isoliert werden, so da13 ihr Durchschnittsalter genommen wurde. Da sich in der Entwicklung die Chloroplasten in ihrer Leistungsfahigkeit sehr schnell andern, sind die Werte mit Chloroplasten jungerer Blattstucke gro13eren Schwankungen unterworfen als solche von alteren. In Abb. 6 ist die Reaktionsfahigkeit bei 80000 Lux von Chloroplast en aus verschieden alten Blattstucken zusammengestellt. Daraus ist zu erkennen, da13 Chloroplasten aua jungen Geweben der Form Donaria relativ hohe Hill-Aktivitaten haben. Bei alternden Blatteilen wird fUr langere Zeit ein gewisses Aktivitatsniveau gehalten, das erst in hOherem Blattalter absinkt. 1m Gegensatz zur Normalform erlangen die Chloroplasten der Mutante erst bei alteren Blattern ihrevolle Reduktionskraft. Die Hill-Aktivitat von Chloroplasten der Mutanten steigt mit dem Altern der Blatter relativ langsam an und bleibt dann fur eine gewisse Zeit lang gleich hoch, um darauf wieder abzufallen. Die Entwicklung der Mutantenchloroplasten unterscheidet sich demnach etwas von der bei der Elternform.

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Die vorliegenden Untersuchungen haben gezeigt, in welchem Umfang Pigmentierung und Aktivitat von ChloropJasten der 3 Chlorophyll b-freien Mutanten 2800, 2807 und 3613 von Hordeum vulgare der Sorte Donaria im Vergleich zur Normalform variieren konnen. Mit dem Verlust von Chlorophyll b ist bei diesen Formen immer eine Senkung des Chlorophyll a-Gehaltes, eine starke Reduzierung von Neoxanthin und, wenn auch in geringerem MaI3e, eine Herabsetzung von Lutein + Zeaxanthin verbunden. Im allgemeinen werden Aureaformen im Schwachlicht fast normal griin (SAGROMSKY 1956). Bei diesen Mutanten war jedoch die Chlorophyllvermehrung im Schwachlicht nicht so stark, daI3 sie den Pigmentmangel aufheben konnte. Kulturen, die bei 2000 Lux gezogen waren, hatten nur 70-80% des Chlorophyll a der Normalpflanzen. - Obwohl durch die Pigmentherabsetzung bei den Mutanten das Photosystem II in starkem MaI3e betroffen ist, konnte bei den Chloroplasten aus den Mutanten bei starkeren Lichtintensitaten eine viel hOhere Hill-Aktivitat mit Ferricyanid und mit DCIP bezogen auf Chlorophyll a als bei solchen der Normalpflanze Donaria gemessen werden. Das hat vermutlich seine Ursache darin, daI3 bei der Chlorophyllreduktion nicht die Anzahl der Chlorophylleinheiten, sondern die GroI3e der Chlorophylleinheiten verandert ist, so daI3 die Zahl der Reaktionszentren annahernd die gleiche bleibt und sich nur die Zahl der Antennenmolekiile verringert. Die starke Verkleinerung der Chlorophylleinheiten hat ferner zur Folge, daI3 bei den Mutanten die Lichtsattigung der Hill-Reaktion bei sehr viel hOheren Lichtintensitaten eintritt als bei der Stammform Donaria (Abb. 2, 4 und 5). Sie war auch nicht bei Chloroplasten' aus Schwachlichtkulturen bei den verwendeten Lichtenergiemengen zu beobachten, obwohl bei Kulturen aus niederen Lichtintensitaten die Chlorophylleinheiten im allgemeinen gro.I3er sind als bei solchen aus hellem Licht. Daher zeigen auch Chloroplasten aus Schwachlichtpflanzen niedrigere HiU-Aktivitaten als solche von Blattern heller Standorte. Die starke Pigmentreduktion bei den Mutanten hat weiterhin eine gro.l3ere Empfindlichkeit dieser Pflanzen im Vergleich zu Normalformen gegeniiber exogenen Einfliissen zur Folge. Frau U. DAN NEIL danke ich fiir die Mithilfe bei den Versuchen.

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Anschrift der Verfasserin: HERTA SAGROMSKY, Zentralinstitut fUr Genetik und Kulturpflanzen· forschung, Gatersleben, 4325 Gatersleben, ab Oktober 1978: Kieler Str. 587 C, D - 235 Neumiinster.