Eine einfache methode zur unterscheidung methicillin-resistenter von nur penicillinase-positiven sowie -negativen staphylokokken im agardiffusionstest

Zbl. Bah. Hyg., 1. Abt. Orig. A 248, 304-313 (1980) Aus dem Hygiene-Institut der Universitat Wien (Vorstand: Prof. Dr. H.Flamm)

Eine einfache Methode zur Unterscheidung Methicillin-resistenter von nur Penicillinase-positiven sowie -negativen Staphylokokken im Agardiffusionstest A Simple Method for Differentiating Methicillin-Resistant, PenicillinasePositive and -Negative Staphylococci by Agardiffusion Test ALEXANDER HIRSCHL, GEROLD STANEK und MANFRED ROTTER Mit 3 Abbildungen . Eingegangen am 19. Mai 1980

Abstracts Coagulase-positive staphylococci (41methicillin-resistant strains, 28 penicillinase-positive and 12 penicillinase-negative strains) were tested against most types of penicillines commercially available on the Austrian market using both broth-dilution test (incubated during 48 hours at 35°C) and agardiffusion tests (incubated during 24 hours at 30, 35 and 37°C) employing Mueller-Hinton-broth and -agar, respectively, in order to find out the most convenient way of detecting methicillin-resistant strains. Consecutively, the conclusions drawn from these experiments were verified for tests on Isosensitest-agar (Oxoid). It was demonstrated that methicillin-resistant strains could be detected easily with discs of methicillin and oxacillin at 30°C (Fig.1). At 35°C this was nearly as easily possible for methicillin but oxacillin discs had to be used at amounts of 1 fig instead of 5 fig. Excepting penicillin Gdiscs with all the other penicillines differing numbers of methicillin-resistant strains would have been missed at 37°C (Fig. 1,2). Only with discs containing 6 fig penicillin G methicillin-resistant strains were unequivocally identifiable in the agardiffusion test at all 3 incubation-temperatures (Fig. 3), the largest inhibition zone diameter being 12 mm. Penicillinase-positive but methicillin-sensitive strains always produced larger inhibition zones up to 30 mm. From these strains again penicillinase-negative strains were equally well distinguishable by much larger inhibition zones. So, the conclusion was drawn that on MuellerHinton agar one disc loaded with 6 fig of penicillin G allows proper distinction not only of methicillin-resistant and -sensitive but also of penicillinase-positive and -negative strains of staphylococci. On Isosensitest-agar this is true for an incubation-temperature of 35 but not 37°C (Tab. 1).

Zusammenfassung Merhicillin-resistente und Penicillinase-bildende Staphylokokken konnen im Agardiffusionstest ohne zusatzliche Tests erkannt werden. Aufgrund des Hemmhofes gegenuber

Unterscheidung Methicillin-resistenter Staphylokokken

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Penicillin G (6 p,g) lassen sich Methicillin-resistente von nur Penicillinase-positiven sowie Penicillinase-negativen Sraphylokokken leicht unterscheiden. Bei Testung auf MuellerHinton-Agar kann dabei die Inkubationstemperatur 35 oder 37°C betragen, wahrend auf Isosensirest-Agar eine Temperatur von 35°C nicht uberschritten werden darf. Zur Zeit sind bei Staphylokokken 3 Mechanismen der Penicillinresistenz bekannt, namlich Penicillinase-Bildung, Penicillin-Toleranz und Methicillin-Resistenz (= inharente Penicillinresistenz, Heteroresistenz, intrinsic resistance) (2,5,6, 7, 10, 12, 13). Die Erkennung dieser Resistenzmechanismen ist von grofer praktischer Bedeutung. Einerseits solIten namlich Penicillinase-ernpfindliche Penicilline nicht oder zumindest nicht allein zur Behandlung von Infektionen mit Penicillinase-bildenden Staphylokokken eingesetzt werden und andererseits ist bekannt, dag Methicillin-resistente Staphylokokken nicht nur gegeniiber Penicillinase-festen Penicillinen sondern auch gegeniiber praktisch allen Cephalosporinen resistent sind (7, 8, 11). Wiihrend die qualitative Erkennung der PenicillinaseBildung einfach ist (15), bereitet die Entdeckung der beiden anderen Resistenzmechanismen Schwierigkeiten. Penicillin-tolerante Staphylokokken, die sich durch niedrige minimale Hemmkonzentrationen aber 200-1000-fach hohere bakterizide Konzentrationen auszeichnen (13), werden im Rahmen der routinemalsigen Resistenzpriifung iibersehen. Dies gilt auch fiir Methicillin-resistente Stamme, Die phanotypische Auspragung dieser Resistenz hangt namlich von verschiedenen Faktoren ab, wie Bebriitungstemperatur, -dauer, Inokulumgrofse und Zusammensetzung des Nahrmediurns (1,2,4,6,7,8,9,12,14). In der Literatur fehlt es daher auch nicht an Vorschlagen fiir Priifmethoden zur Erkennung ebendieser Resistenz (1, 2, 4, 6, 7, 8, 12). Zumeist wird eine Resistenzpriifung bei 30°C oder zumindest die Bebriitung der zur Resistenzpriifung verwendeten Kulturen bei 35 ° anstatt 37°C empfohlen. Die letztgenannte Methode hat wenigstens den Vorteil, daf die gesamte Resistenzpriifung, also auch die gegen andere Substanzen bei dieser Temperatur durchgefiihrt werden kann. Trotzdem miissen Wirkstoffe wie Methicillin oder Oxacillin eigens zur Bestimmung der Heteroresistenz gepriift werden. Stets ist also die Prufrnethode zur Erkennung Methicillin-resisrenter Stamme mit einem zusatzlichen Aufwand an Arbeit und Material verbunden. In dieser Arbeit wurden nun mit den wichtigsten Penicillinen Diffusionstests bei 30°, 35 ° und 37°C im Vergleich zu Verdunnungstests auf dem zur Zeit im eigenen Laboratorium iiblichen Nahrboden (Mueller-Hinton) durchgefuhrt, um die okonomischste und beste Art zur Entdeckung Methicillin-resistenter Staphylokokken zu finden. In AnschluB an diese Untersuchungen wurde uberpriifl, ob die wichtigsten Ergebnisse auch fiir die Resistenzbestimmung bei Verwendung eines anderen Nahrmediums (IsosensitestAgar) gelten, Material und Methoden

Testkeime Bei den zur Untersuchung verwendeten Staphylokokken handelt es sich ausschlielslich urn Koagulase-bildende Stamme. Diese Stamme wurden aus dem Rourinc-Untersuchungsmaterial des Hygiene-Instituts der Universitat Wien im jahr 1979 hauptsachlich von hospitalisierten Patienten isoliert. 41 Methicillin-resisrente und 40 Merhicillin-empfindliche (28

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A.Hirschl, G.Stanek und M.Rotter

Penicillinase-positive und 12 Penicillinase-negative) Staphylokokkenstamme wurden nach folgenden Kriterien ausgewahlt: Es wurden nur Erstisolationen von einem Patienten wahrend eines einmaligen Krankenhausaufenthaltes untersucht, Ais Methicillin-resistent wurde ein Stamm beurteilt, dessen Wachstum auf festen Nahrrnedien durch ein Methicillin-Testplattchen (5/lg) bei Bebriitung wahrend 24 Std. bei 30 DC nicht gehemmt wurde. Die Bildung von Penicillinase wurde mit dem chromogenen Cephalosporin Nitrocephin (Glaxo) in der Plattenmethode gepriift.

Ndhrmedien Die Bouillonverdiinnungstests wurden in Mueller-Hinton (MH-)Bouillon, die Agardiffusionstests auf MH-Agar (Merck) durchgefiihrt. 1m weiteren wurden auch mehrere Varianten von MH-Agar (Merck, Oxoid, BBL; je zwei verschiedene Chargen) und Isosensitest-Agar (Oxoid) verwendet. Chemotherapeutika und Chemotherapeutikum-haltige Testpldttchen Chemotherapeutika wurden von den Herstellerfirmen als Reinsubstanz zur Verfiigung gestellt. Chemotherapeutikum-haltige Plattchen mit folgender Beladung wurden verwendet: Oxacillin 1 und 5/lg; Penicillin 6/lg; Ampicillin 10 /lg; Azlocillin, Mezlocillin 30 /lg; Ticarcillin 75 /lg; Carbenicillin 100 /lg.

Agardiffusionstest Agardiffusionstests wurden nach der von Ericsson u. Sherris (3) vorgeschlagenen Methodik durchgefuhrt, Die Platten wurden bei 30, 35 oder 37 DC 48 Std. lang inkubiert. Die Hemmzonen wurden nach 24 und 48 Std. ausgemessen. Bei der Verwendung der Hemmhofdurchmesser wurde jedes, d. h. auch hauchforrniges Wachstum als solches beurteilt. Bis zu 4 einzelne im Hemmhof befindliche Kolonien blieben aber unberiicksichtigt. Die Bebriitungstemperaturen wurden mit Hilfe eines 6-Kanal-Kompensationslinienschreibers mit elektrischer Kompensation der Umgebungstemperatur (Rikkadenki) iiber Eisen-Konstantan-Therrnofiihler kontrolliert.

Bouillon-Verdiinnungstest Der Bouillonverdiinnungstest wurde in Mikrotiter-Platten durchgefiihrt. Dazu wurden bei - 20 DC aufbewahrte Losungen der Wirkstoffe unmittelbar vor Versuchsbeginn aufgetaut und in einer logarithmischen Verdiinnungsreihe mit dem Faktor 2 in doppelt konzentrierter MH-Bouillon verdiinnt. Volumina von 0,025 ml der verschiedenen Verdiinnungen wurden mit 0,025 ml einer durch physiologische Kochsalzlosung 1: 1000 verdiinnten Bouillon-Kultur gemischt, so daf die Wirkstoffkonzentrationen 256 - 0,25 /lg/ml betrugen. Fur jeden zu priifcnden Stamm wurden auch Wachstumskontrollen angelegt. Nach 48stiindiger Bebriitung bei 35 DC wurde jene Konzentration als MHK angegeben, die das Wachstum des betreffenden Staphylokokkenstammes gerade vollstandig hemmte. Zur Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBK) wurden den unbewachsenen Napfchen der Mikrotiterplatten Volumina von 0,02 ml entnommen und in Columbiabouillon (Oxoid) eingebracht. Die Kulturen wurden 48 Std. bei 35 DC bebrutet.

Abb. 1. Minimale Hemmkonzentration (MHK) und Hemmhofdurchmesser (bei 30, 35 und 37 DC) von Oxacillin (Testplattchen 1 und 5/lg) und Methicillin bei Methicillin-resistenten (e), Methicillin-empfindlichen aber Penicillinase-positiven (A) und Penicillinase-negativen (0) Stammen von S. aureus. Fig. 1. Minimal inhibitory concentration (MIC) and inhibition zone size (at 30, 35 and 37°C) caused by Oxacillin (disc 1 and 5/lg) and Methicillin with Methicillin-resistant (e), -sensitive but penicillinase-positive (A), and penicillinase-negative (0) strains of S. aureus

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Unterscheidung Meth icillin-resisrenrer Sraphylokokken

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HEMMHOFDURCHMESSER II 'HIBITION ZONE SIZE Imml

Abb . 3. Mi nimale H emmkonzent ration (MH K) und H emmhofdurchmesser (bei 30, 35 und 37 °C) von Penicillin G bei Methicillin-resistent en (. ), Methicillin -empfindlichen aber Penicillinase-positiven (.&) und Penicillinase-negat iven (0) Stamme n von S. aureus. Fig. 3. Minim al inhibitory concentration (M IC) and inhibition zone size (at 30, 35 and 37 °C) caused by Penicillin G with Methi cillin-resistant (.) , -sensirive but pen icillinasepositive (.&), and penicillinase-negative (0) strains of S. aureus.

Abb . 2. Min imale H emmkonzentration (MH K) und H emmhofdur chmesser (bei 30, 35 und 37°C) von Car benicillin, Mezlocillin und Ti carcillin bei Methicillin-resistenten (. ), Methicillin-empfindlichen aber Penicillinase-positiven (.&) und Penicillinase-negativen (0 ) Stammen von S. aureus. Fig. 2. M inimal inhib itor y concentr ation (M IC) and inhibition zone size (at 30, 35 and 37 °C) caused by Carbenicillin, Mezlocillin and Tica rcillin with Methicillin-resist ant (.) -sensitive but penicillinase-positive (.&), and penicillinase-negati ve (0 ) strains of S.aureus.

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A.Hirschl, G.Stanek und M.Rotter

Ergebnisse Die Abbildungen 1-3 zeigen die Ergebnisse des Agardiffusionstests bei 30°,35 ° und 37°C, wobei die nach 24 Std. Bebriitung ausgemessenen Hemmzonen den nach 48 Std. abgelesenen MHK-Werten gegeniibergestellt wurden. In Abb. 1 sind die Ergebnisse fiir Methicillin und Oxacillin (Testplattchenbeladung 1 oder 5 flg) dargestellt. Die MHK-Werte der heteroresistenten Stamme gegeniiber Methicillin und Oxacillin waren wesentlich hoher als die Methicillin-empfindlicher Staphylokokken, Bei 30°C bildete keiner der Methicillin-resistenten Stamme Hemmhofe aus. Bei 35°C zeigten 2 Stamme gegeniiber Methicillin und 4 gegeniiber Oxacillin (5 flg) bereits mefsbare Hernmhofe, Bei 37°C werden bereits 13 Stamme von Methicillin, 5 und 29 von 1 bzw. 5 flg Oxacillin in ihrem Wachstum gehemmt. Dabei erreichen Methicillin-resistente Stamme Hemmhofe, die jenen der Methicillin-empfindlichen Staphylokokken ahnlich sind. Innerhalb der Methicillin-empfindlichen Keime unterscheiden sich Penicillinase-positive und -negative Stamme nur unwesentlich. Abb. 2 zeigt die Ergebnisse fiir Carbenicillin, Mezlocillin und Ticarcillin. Die Ergebnisse von Azlocillin sind mit jenen von Mezlocillin nahezu identisch, weshalb diese nicht eigens dargestellt wurden. Aufgrund der MHK-Werte lassen sich bei Carbenicillin und Ticarcillin Methicillin-resistente von -empfindlichen aber Penicillinase-positiven und diese wieder von Penicillinase-negativen Stammen gut unterscheiden. Bei Mezlocillin ist diese Unterscheidung aufgrund der MHK nicht immer moglich, da ein Teil der Methicillin-empfindlichen Starnme ebenfalls sehr hohe MHK-Werte aufweist. Auch gegeniiber diesen 3 Wirkstoffen zeigen die Hemmhofe der Methicillin-resistenten Stamme eine deutliche Abhangigkeit von der Inkubationstemperatur, so dag - Mezlocillin ausgenommen - Methicillinempfindliche und -resistente Starnme mit steigender Inkubationstemperatur irnmer schlechter auseinander gehalten werden konnen, Penicillinase-negative Stamrne hingegen fallen stets durch besonders grofse Hernmhofe (zumeist > 40 mm) auf. In Abb. 3 sind die Ergebnisse des Plattchen- und Dilutionstests fiir Penicillin G dargestellt. Die Priifung gegeniiber Ampicillin erbrachte praktisch das gleiche Ergebnis, weshalb dieses nicht eigens dargestellt wurde. Aufgrund der MHK konnen Methicillin-resistente von -empfindlichen (Penicillinase-positive wie -negative) Staphylokokken nicht unterschieden werden. Methicillin-empfindliche, aber Penicillinase-bildende Staphylokokken weisen z. T. namlich auch sehr hohe MHK-Werte auf. Es gibt aber auch sehr empfindliche Stamme in dieser Gruppe. Die Hemmhofe dieser Penicillinase-bildenden aber Methicillin-empfindlichen Stamrne sind jedoch iiber einen vergleichsweise kleineren Bereich verteilt, so dag durch den Agardiffussionstest stets eine gute Trennung zwischen dieser Population und den Methicillin-resistenten sowie den Penicillinase-negativen Stammen moglich ist. Die Hemrnhofe der Methicillin-resistenten Stamme sind namlich stets deutlich kleiner als die der nur Penicillinasebildenden Stamme - und das unabhangig von der Bebriitungstemperatur. Penicillinase-negative Stamme zeigen auch gegeniiber Penicillin G die weitaus grog ten Hemmhofe. Die Bestimmung der MBK von Penicillin G wurde nur bei Stammen mit einer MHK ::::; 2 flg/ml vorgenommen. Die MBK entsprach bei 7 von 12 Stammen der MHK, bei den iibrigen Stammen betrug die MBK das Doppelte der MHK. Tab. 1 zeigt die Ergebnisse des Agardiffusionstests bei 35°C und 37°C

Unterscheidung Methicillin-resistenter Sraphylokokken

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Tabelle 1. Hemmhofdurchmesser von Methicillin-resistenten (MR) und Methicillin-ernpfindlichen aber Penicillinase-bildenden (MS) Staphylokokken auf Mueller-Hinton- und Isosensirest-Agar bei 35 und 37 DC gegeniiber Penicillin G (6 flg) Table 1. Inhibition zone size (at 35 and 37 DC) caused by Penicillin G (6 flg) on MuellerHinton- and Isosensitest-agar with Methicillin-resistant (MR) and Methicillin-sensitive but penicillinase-positive (MS) strains of S. aureus Hemmhofdurchmesser (mm) Inhibition zone size (mm)

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24

MR = Methicillin-resistent MS = Merhicillin-sensibel, Pcnicillinase-positiv

mit Penicillin-haltigen Testplattchen auf MH- im Vergleich zu denen auf Isosensitest-Agar. Die fur MH-Agar angefiihrten Ergebnisse wurden auf dem Agar der Fa. Merck ermittelt. Vorversuche haben jedoch gezeigt, daf diese Ergebnisse auch fur MH-Nahrboden anderer Hersteller und Chargen gelten, Auf MH-Agar konnen Methicillin-resistente Starnme von den -empfindlichen aufgrund der Hernmzonendurchmesser eindeutig voneinander unterschieden werden. Die Durchmesser der Hemmhofe beider Gruppen von Stammen unterscheiden sich unabhangig von der Inkubationstemperatur urn mindestens 3 mm. Bei Verwendung von

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A.Hirschl, G.Stanek und M.Roner

Isosensitest-Agar ist dieser Unterschied sogar groger, allerdings nur nach Bebrutung bei 35°C. Eine Inkubation bei 37°C fuhrte hingegen zu Hemmzonen beider Gruppen, die sich in einem Bereich von 17-18 mm iiberlappen. Diskussion Eineeinfache und okonornische Methode zur Entdeckung Methicillin-resistenter Staphylokokken sollte die Auffindung dieser Stamme im Rahmen der routinemafsigen Resistenzpriifung d. h. im Agardiffusionstest und unter iiblichen Testbedingungen errnoglichen, Deshalb ist die von manchen Autoren (4,6,12) vorgeschlagene Inkubation bei 30°C keine praxisgerechte Losung, wenn damit auch Methicillinresistente Stamme leicht erkannt werden konnen. Diese Prufung mug namlich in einem eigenen Kulturversuch durchgefuhrt werden, da eine generelle Inkubation aller zur Resistenzpriifung bestimmten Kulturen bei 30°C, wegen falscher Testergebnisse bei anderen Chemotherapeutika z. B. Erythromycin (12), undurchfiihrbar ist. Die Erkennung der Methicillin-Resistenz sollte also bei einer Temperatur von 35-37 °C moglich sein. Die Hemmhofe der Methicillin-resistenten Stamme zeigen aber gerade in diesem Temperaturbereich bei vielen Wirkstoffen (Methicillin, Oxacillin, Ticarcillin, Carbenicillin) deutliche Schwankungen wodurch eine einheitliche Beurteilung der Hemmzonen im Sinne einer Zuteilung zu den Kriterien "empfindlich" oder "resistent" nicht moglich ist. Die Beurteilung wird weiters dadurch erschwert, dag mit zunehmender Temperatur die Hemmhofdurchmesser der empfindlichen und resistenten Stamme oft nahe beisammen liegen. Die Problematik der Festlegung eines Grenzwertes der Hemmhofdurchmesser lagt sich am Beispiel des Oxacillin (5 flg) gut zeigen. Wenn man namlich - nach DIN 58940 - 16 mm als Grenze zwischen "empfindlich" und "resistent" annimmt, wiirde man bei 35°C 10 0J0 bei 37°C jedoch bereits 70 0J0 der von uns gepruften Methicillin-resistenten Stamrne falsch empfindlich bewerten! Bei der Beurteilung des Oxacillin-Hemmhofes ist zusatzlich darauf zu achten, dag das Wachstum von heteroresistenten Zellen zumindest nach 24 Std. oft schlecht wahrnehmbar ist und daher leicht iibersehen werden kann. Dieses Faktum wirkt sich vor allem bei etwas zu geringem Inokulum nachteilig aus. Oxacillintestplattchen, die nur 1 flg dieses Wirkstoffes enthalten, sind zur Unterscheidung zwischen Methicillin-resistenten und -empfindlichen Stammen besser geeignet. Bei 37°C ist jedoch auch mit den niedrig beladenen Testplattchen diese Unterscheidung bei einigen Stammen unsicher. Die Hemmhofe anderer Wirkstoffe, wie z. B. Mezlocillin, vor allem aber Penicillin G werden durch die Inkubationstemperatur weniger beeinflulit, Mit Penicillin Gals Testsubstanz lagt sich aufgrund der Hemmhofgrofen stets zwischen Methicillin-resistenten, Methicillin-empfindlichen aber Penicillinase-positiven und Penicillinase-negativen Stammen unterscheiden. Vom Penicillin-Hemmhof lagt sich also auch ablesen, ob ein isolierter Staphylokokkenstamm Methicillinresistent oder nur Penicillinase-bildend ist. Die gesonderte Austestung von Penicillinasefesten und anderen Penicillinen sowie eigene Tests [iir die Erkennung der Penicillinase-Bildung sind somit nicht erforderlich. Da - wie gezeigt - dies bei Austestung auf Isosensitest-Agar aber nur bei 35°C funktioniert, folgen wir dem Vorschlag von Plorde u. Sherris (7) und empfehlen, alle im Agardiffusionstest angelegten Resistenzpriifungen bei 35°C durchzufiihren oder, wie in vielen Laboratorien heute iiblich, iiberhaupt diese Temperatur anstatt 37°C generell

Unterscheidung Methicillin-resistenter Staphylokokken

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zu verwenden. Da der Unterschied dieser beiden Temperaturen nur gering ist, der Testausfall aber stark beeinflufst wird, ist eine Temperaturkontrolle mit einem geeichten Thermometer unerlalslich. Literatur 1. Drew, W. L., A. L. Barry, R. O'Toole, and ]. C. Sherris: Reliability of the Kirby-Bauer disc diffusion method for detecting methicillin-resistant strains of staphylococcus aureus. Appl. Microbio!' 24 (1972) 240-247 2. Eickhoff, T. C.: Antibiotics and Nosocomial Infections. In: Benett,]. V. and P.S. Brachmann (ed.): Hospital Infections. Little, Brown and Company, Boston (1979) 3. Ericsson, H. M. and ]. C. Sherris: Antibiotic Sensitivity Testing. Acta path. microbio!' scand. Sect. B, Supp!. 217 (1971) 68-73 4. Hallander, H. 0., G. Laurell, and H. Dornbusch: Determination of methicillin resistance of Staphylococcus aureus. Scand. J. infect. Dis. 1 (1969) 169-174 5. Lacey, R. W.: Antibiotic Resistance Plasmids of Staphylococcus aureus and Their Clinical Importance. Bact. Rev. 39 (1975) 1-32 6. Parker, M. R. and ]. H. Hewitt: Methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Lancet 1 (1970) 800-804 7. Plorde, j.], and ]. C. Sherris: Staphylococcal resistance to antibiotics: origin, measurement and epidemiology. Ann. N. Y. Acad. Sci. 236 (1974) 413-434 8. Kayser, F. H.: Zur Resistenzpriifung der Staphylokokken gegen Penicillinase-feste Penicilline und Cephalosporine. Path. Microbio!' 30 (1967) 381-391 9. Kayser, F. H.: Der Einfluf des Nahrrnediums auf die Methicillinresistenz pathogener Staphylokokken. Z. med. Mikrobio!' Immuno!' 154 (1969) 287-299 10. Kayser, F.H., E.].Benner, R. Troy, and P.D.Hoeprich: Mode of Resistance against p-lactam Antibiotics in Staphylococci. Ann. N. Y. Acad. Sci. 182 (1971) 106-117 11. Kayser, F. H.: In vitro activity of Cephalosporin antibiotics against Grampositive bacteria. Postgrad. Med. J. Feb. Suppl. 1971, 14-20 12. Kayser, F.H. and T.M.Mak: Methicillin resistant staphylococci. Amer. J. med. Sci.264 (1972) 197-205 13. Sabath, L.D., N. Wheeler, M.Laverdiere, D.Blazevic, and B.]. Wilkinson: A new type of resistance of Staphylococcus aureus. Lancet 1 (1977) 443-447 14. Sutherland, R. and G.N.Rolinson: Characteristics of methicillin-resistant staphylococci. J. Bact. 87 (1964) 887-899 15. Sykes, R.B.: Methods for detecting p-lactamases. In: Reeves, D.S., I.Phillips, ].D. Williams, and R. Wise (ed.) : Laboratory Methods in Antimicrobial Chemotherapy. Churchill Livingstone, Edinburgh-London-New York (1978) Dr. Alexander Hirschi, Dr. Gerold Stanek und Univ.-Prof. Dr. Manfred Rotter, HygieneInstitut der Universitat Wien, Kinderspitalgasse 15, A-I095 Wien

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