Eine methode zur darstellung der gestalt von chromosomen-oberflächen im lichtmikroskop

Cotyrighf Q 1973 by Academic Press, Inc. A/l rigim of reproduction in any form resewed

Experimental Cell Research 80 (1973) 27-30

EINE

METHODE

ZUR DARSTELLUNG

CHROMOSOMEN-0BERFLh;CHEN I. H. PAWLOWITZKF

DER GESTALT

VON

IM LICHTMIKROSKOP und G. PFEFFERKORN2

Institut fiir Humangenetik und Institut fiir Medizinische Physik der Westftilischen Wilhelm+Universitiit Miinster, 44 Miinster, BRD

SUMMARY

Visualization of chromosomal surface architecture using a new tight-microscopical method A new method is described, by which the surface architecture of chromosomes can be visualized using light microscope. The principles of the method include 1. the coating of chromosomes with a thin layer of evaporated gold to increase light reflection; 2. the use of oblique and asymmetrical illumination which creates shadows across the surface of chromosomes such that elevations appear bright and deprEssion dark. The chromosomes thus give a three-dimensional appearance. This method can be used to demonstrate correlations between the Giemsa banding pattern and the surface architecture of chromosomes: each Giemsa positive area clearly corresponds to an elevation of the chromosomal surface. ZUSAMMENFASSUNG Es wird eine neue Methode beschrieben, die es gestattet, das Oberflachenrelief von Chromosomen im Lichtmikroskop darzustellen. Das Prinzip der Methode beruht auf zwei Faktoren: 1. Die Untersuchung erfolgt im Auflicht-Mikroskop, die Chromosomenpraparate werden jedoch zuvor mit einer diinnen Metallschicht iiberzogen, urn eine gute Lichtreflexion zu gewlhrleisten. 2. Die Beleuchtung erfolgt asymmetrisch schrlg von oben, urn Licht-Schatten-Effekte auf der Chromosomen-Oberfllche zu erzeugen: Erhebungen sind hell, Vertiefungen dunkel, die Chromosomen erscheinen somit plastisch. Bisherige Beobachtungen mit Hilfe dieser Methode zeigen deutliche Beziehungen zwischen Giemsafarbung und der Oberflachenmorphologie von Chromosomen: jede Giemsabande entspricht einer Erhebung des Oberflachenreliefs.

Seit Einfiihrung der Banderungstechniken wurde das Interesse an der dreidimensionalen Morphologie von Chromosomen neu belebt. Die raumliche Chromosomengestalt war bisher nur mit elektronenmikroskopischen, 1 Addresse: Institut fur Humangenetik, 44 Miinster, Vesaliusweg 12/14, BRD. 2 Addresse: Institut fur Medizinische Physik, 44 Mtinster, HtifferstraRe, BRD.

also aufwendigen Methoden darzustellen, namlich durch Transmissions-ElektronenMikroskopie von Oberflachenabdriicken [2] und durch Raster-Elektronenmikroskopie [l, 3, 41. Im folgenden wird ein lichtoptisches, wenig aufwendiges Verfahren beschrieben, das es ermiiglicht, die dreidimensionale Gestalt der Chromosomen abzubilden. Exptl Cell Res 80 (1973)

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& G. Pfefferkorn

Ob

Ob

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Abb. 1. Strahlengang im Auflicht (a) bei zentrischer Beleuchtung; (b) bei asymmetrischer, ,,schriger” Beleuchtung: Durch Verlagerung der Aperturblende (Ao) innerhalb der Blendenebene kreuzt der Strahlengang die optische Achse in Hiihe der Leuchtfeldblende (Lo), durchsetzt das Objektiv (Ob) und fsllt ,,schrsg“ von oben auf die Prlparatoberfllche (Pv). Durch diese ,,schrlge“, asymmetrische Beleuchtung entstehen Licht-SchattenEffekte auf dem OberflBchenrelief, die Chromosomen erscheinen plastisch (s. Abb. 26).

METHODEN Das Prinzip der Methode beruht auf zwei Faktoren: (1) Die Untersuchung erfolgt im Auflicht-Mikroskop, die Chromosomenprsparate werden jedoch zuvor mit einer diinnen Metallschicht tiberzogen, urn eine ausreichende Lichtreflexion zu gewlhrleisten. (2) Die Beleuchtung erfolgt nicht wie iiblich zentrisch vertikal, vielmehr asymmetrisch, schrLg von oben; diese MaRnahme dient dazu, Licht-Schatten-Effekte auf dem Chromosomen-Oberfllchenrelief zu erzeugen; Erhebungen sind hell, Vertiefungen infolge Schattenwurf dunker, die Chromosomen erscheinen somit plastisch.

Das Verfahren im einzelnen Chromosomenprtiparate aus Blutlymphozyten wurden bis einschlieI3lich der Lufttrocknung in iiblicher Weise hergestellt. Das anschliefiende Fgrbeverfahren ist beliebig; bei den in Abb. 2 dargestellten Prlparaten folgte der Lufttrocknung eine kurzfristige Trypsin-Behandlung und Giemsaftirbung (0.1 % Trypsin, (Difco 1:250) in pH 6,8 Phosphat-Puffer, Behandlungsdauer 15 Sek.; Giemsa (Fa Merck) 1 :50 in pH 6,8 Phosphat-Puffer, FPrbungsdauer 20 Min). Exptf Cell Res 80 (1973)

Urn die ungeniigende Eigenreflexion der Chromosomen und der Interphase-Zellkerne zu steigern, wird eine diinne Schicht aus metallischem Gold im Hochvakuum auf die Prlparate aufgedampft (Bedampfungsanlage: Fa Edwards, Vacuum coater 306, Vakuurn 8 x 1O-5 torr, Kegelbedampfung: Dicke der Aufdampfschicht ca 200 A). Eine Goldaufdampfschicht dieser Dicke steigert die Lichtreflexion geniigend fiir eine Untersuchung im auffallenden Licht; diese Goldschicht ist jedoch noch ausreichend transparent, urn die Auswertung such im durchfallenden Licht praktisch nicht zu beeintriichtigen. Dieser Umstand erlaubt vergleichende Untersuchungen etwa zwischen de,n Bandenmuster eines Chromosoms und seinem Oberfl$chenrelief und zwar ohne Mikroskopwechsel, lediglich durch Umschaltung von Durch- zur Auflichtbeleuchtung. Dazu muB das Mikroskop entsprechend ausgestattet sein, d. h. neben der iiblichen Durchlichtbeleuchtung die folgende spezielle Einrichtung zur ,,schrHgen“ Auflichtbeleuchtung haben. Die ,,schrlge“ Beleuchtung im Auflicht IlRt sich erzielen, indem man die Aperturblende aus ihrer zentrierten Lage zur optischen Achse peripher verlagert, jedoch in der Aperturblendenebene beliflt. Der Strahlengang kreuzt dann die optische Achse in HGhe der Leuchtfeldblende, durchsetzt das Objektiv und fallt ,,schrlg“ von oben, d. h. unter Winkelbil-

Barstehg

der Gestalt von Chromosomenoberfliichcn

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Abb, 2. Metaphasenplatte nach Giemsaftirbung und Goldbeschichtung (Objektiv: PI A po x 160/1.40 Leitz), (u) im Durchlicht; (b) im Auflicht. Die Durchlichtaufnahme erfolgte durch die Golda lufdampfschicht hindurch. Ein Vergleich heider Aufnahmen zeigt deutliche 3eziehungen zwischen der Gie msafkrbung und dcr MorphoIogie der Chromosomen-Oberfltiche; Jede Giemsabande in (a) entspricht einer Erhe:bung in (b), Gleiches gilt fiir F&bung und Oberfl~chenmorphologie des Interphasezellkerns. MI Cell Res 80 (1973)

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& G. Pfefferkorn

dung zur optischen Achse, auf die Praparatoberflache (Abb. 1). Der Winkel und die Richtung des einfallenden Lichtes lassen sich unabhlngig voneinander variieren und gezielt dem jeweiligen Praparat anpassen, z. B. der Lage eines darzustellenden Chromosoms. Dies erfolgt durch eine entsprechende Verlagerung der Aperturblende. (Ein entsprechender Auflichtilluminator ist fur diese Untersuchungen, passend zu den Mikroskopen Ortholux oder Orthoplan, konstruiert worden: OPAK-Illuminator/Leitz mit Einrichtung fur schrage Beleuchtung.)

ERijRTERUNG Die beschriebene Methode erlaubt eine plastische Darstellung von Chromosomen, von Interphase-Zellkernen und von anderen biologischen Objekten im Auflichtmikroskop. Auch nichtbiologische Objekte mit geringer etwa Kalkspatoberflachen Eigenreflexion ua., lassen sich auf diese Weise im Lichtmikroskop darstellen [5]. Ihre Vorteile gegeniiber den elektronenmikroskopischen Verfahren liegen insbesondere im vergleichsweise geringen instrumentellen und zeitlichen Aufwand bei schwacherer, fiir viele Fragestellungen jedoch ausreichender Auflosung. Mit der Methode ist eine gute Abbildungsqualitat zu erzielen, es lassen sich kleinere Details erkennen, als bei Verwendung von durchfallendem Licht. Dies liegt zunachst an der asymmetrischen Beleuchtung, die durch Licht-Schatten-Effekte die Kontraste steigert. Ferner gestattet die spiegelnde Oberfllche des aufgedampften Goldes den Einsatz von Objektiven mit hoher Eigenvergrol3erung ( x 160/N.A. 1.40, &-Immersion).

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Diese Oberflachendarstellung liefert zusatzliche Information i.iber die Morphologie von Chromosomen. So zeigen bisherige Beobachtungen deutliche Beziehungen zwischen der Giemsafarbung und der OberflHchenChromosomen: jede von morphologie Giemsabande entspricht einer Erhebung des Oberflachenreliefs. Analoge Verhtiltnisse gelten fi.ir die Oberflachenmorphologie von Interphasezellkernen (Abb. 2). Vorlaufige Beobachtungen lassen vermuten, dab die verschiedenen Verfahren der Chromosomenpraparation wie, z. B. Trypsinbehandlung, Alkali-Denaturierung u. a., die raumliche Morphologie der Chromosomen charakteristisch verandern. Der Deutschen Forschungsgemeinschaft wird fiir die Untersttitzung gedankt.

LITERATUR 1. Christenhusz, R, Biichner, T & Pfeiffer, R A, Nature 216 (1967) 379. 2. Evans, H J & Sumner, A T, Chromosome architecture: morphological and molecular aspects of longitudinal differentiation. Jerusalem chromosome conference, September (1972). 3. Pawlowitzki, I H & Blaschke, R, J microsc 93 (1971) 119. 4. Pawlowitzki, I H, Blaschke, R & Christenhusz, R, Naturwiss 55 (1968) 63. 5. Pfefferkorn, G, Pawlowitzki, I H, Michaeli, G, Blaschke, R & Bode, M, Beitr elektronenmikroskop Direktabb Oberfl 2 (1969) 199.

Received January 23, 1973