Zur bestimmung der östrogene im urin nach der methode von Ittrich

CLINICA CHIMICA ACTA

544

ZUR BESTIMMUNG DER OSTR~GENE ~ptl URIN NACH DER METHODE VON ITTRICH

Unter

den chemischen

Methoden

zur Bestimmung

der iistrogene

im Urin hat

sich das Verfahren \-on BKOWN’ in der Modifikation van RROWN, BULBROOK UND (GREENWOOD2 als das zuverlassigste erwiescn. Einer allgemeinen Einfiihrung der Krown’schen

Methode

in das klinische

Laboratorium

steht

allerdings

der relativ

grosse -4rbeitsaufwand entgegen, der durch die Verteilung der Urinextrakte zwischen verschiedenen Lbsungsmitteln, die Methylierung der phenolischen Steroide, die Sgulenchromatographie Im Jahre der Bstrogenen

der M&y&her

sowie die a-stufige

Kober-Reaktion

1958 hat ITTRICH~ eine neue Methode zur chemischen Hormone im Urin angegcben, bei der fiir die quantitative

von &tron, iistradiol gebildete Farbkomplex

und &trio1 der nach einer modifizierten durch +Nitrophenol in Chloroform selektiv

die Farbliisung kann entweder kolorimetrisch oder fluorometrisch Durch die Spezifitgt der Farbreaktion sol1 die sonst notwendige Urinextrakte stark ergeben sich nach vorgeschlagene

(I) Direkte kolorimetrische folgenden

bedingt

ist.

Bestimmung Bestimmung

Kober-Reaktion extrahiert wird; gemessen werden. Vorreinigung dcr

vereinfacht bzw. gjlnzlich unterlassen werden kiinnen. Dadurch ITTRICX” folgende Anwendungsmiiglichkeiten fiir die van ihm

Methode : Durchfiihrung der bzw. fluorometrische

als Ittrich-Reaktion

Kober-Rcaktion mit Schwangerenurin Messung des estrahierten Farhkompleses

und (im

bezeichnet).

(z) Isolierung der iistrogenfraktion aus Schwangerenurin oder Zyklusurin, s%ulenchromatographische Trennung der drei ostrogene, Durchfiihrung der KobcrReaktion und kolorimetrische bzw. fluorometrische Jlessung des extrahierten Farbkomplexes (im folgenden als Ittrich-Xlethode bezeichnet). iiber unsere Bcobachtungen hinsichtlich der Reproduzierbarkeit Verfahren sol1 im folgendcn km-z bet-i&et werden.

der Ittrich’schen

METHODIK Athylgther, Petrolsther, Athanol und Chloroform wurden nach den Angaben van ITTRICH~ gereinigt. Hydrochinon, +Nitrophenol und Schwefels~ure hatten $.n. Reinheitsgrad und waren Prgparate der Fa. Merck, Darmstadt. Bei der Bestimmung der ijstrogene nach ITTRICH entsprachen alle methodischen Einzelheiten den von ITTRICH gemachten Angabenz. Die ijstrogenbestimmung nach BROWN wurde in der Modifikation \-on BROWN, BULBROOK UND GREENWOOD 3 durchgefiihrt. Die kolorimetrischen Messungen erfolgten mit einem Beckman-Spektralphotometer DU.

msTrmfr_mG

DER

CWIWGENE

Isf URIN

54.5

ERGEBNISSE

Ittvich-Reaktion

I.

wlit reinen Hovmonez

We aus Fig. I hervorgeht, ist der estrahierte estrogen-Farbkom~~les bei ~immertemperatur nicht bestgndig; seine Intensitat nimmt van der 30. his zur 60. min nach Extraktion um etwa IS’?;; ab. Es ist deshalb wichtig, die photometrische Uessung dcs extrahierten Farbkompleses nach einer genau festgelegten Zeit durchzufiihren. 20 min erwiesen sich als die giinstigste Zeitspanne zwischen ~nterscl~icllt~n der Schwefelsaurc mit Chloroform und photometrischer Messung des Farbkompleses. We Fig. I weiter zeigt, ist dcr bei dcr Kober-Reaktion nach ITTRICH primar ent-

0i 0

: 20

i

CA‘

‘0

ZEIT IN MIN BEENDIGUNG

60

83

NACH DER KOBER-

1clD

120

REAKTION

Fig. i. T’erhalten van 10 iiig &trio1 bei verscbiedenen .~~~sf~~hr~~~~ge~~ der Sober-Reaktion. His zur Messung wurden die FarbstoffI(isungen bei Zimmertemperatur im Hellen nnfbewahrt. .Ule Messungen wurden bei ,535.,j mf< in 1a-mm Kiivetten dwchgefiihrt.

a- --• o---o A-

-A

‘f\_.

-

,*

Kober-Reaktion nach ITTRICH mit anschliessender Chloroform-Extraktion des Farbkompleses. Kober-Reaktion nach ITTRICH ohne Extraktion. Kober-Reaktion nnch BROWN mit anschliessender Chloroform-Extraktion des Farbkomplexes (ohne vorherige Verdiinnung). Kober-Reaktion nach BROWN.

Fig. 1. Yerbalten van lopg iistriol bei cler Ittrich-Reaktion nacb Zusatz steigender Mengen ~‘0x1 IGnnerurin. Der r:rinleermert wurde abgezogen. Die Messungen crfolgten bci 50~1, 538.5 und 577 m,~. O---O Reaktion mit Trockenr~ckst~nden. a---@ Keaktion in Ltisung.

546

El. BREUER, J, GERTZ

stehende Farbkomplex in der w&srig-sauren Phase relativ stabil ; die Instabilit~t tritt erst mit der Extraktion auf und scheint bis zu einem gewissen Ausmass vom Reinheitsgrad des verwendeten Chloroforms, von der Saure-Konzentration, sowie von der G&se des Alkohol-Zusatzes abhangig zu sein. Es sei erwahnt, dass die bei der Brown’schen Modifikation der Kober-Reaktion gebildete Farbe offenbar nur bedingt extrahierbar ist ; der Intensitatsverlust betrug nach Extraktion mit $-Nitrophenol-Chloroform etwa 60;/, (Fig. I). Die Ursache dafiir durfte in der relativ hohen Endkonzentration der Schwefelsaure (43-49%) bei der Brown’schen Reaktion zu suchen sein; denn nach Verdiinnung der Farblosungen mit Wasser war der Farbstoff besser extrahierbar (vgL3, S. 3, 2. 13).

Die selektive Extrahierbarkeit des estrogen-Farbkomplexes veranlasste ITTRICH, die von ihm modifizierte Kober-Reaktion gerenurin anzuwenden. Dabei kiinnen zwei Verfahren benutzt

mit Chloroform direkt auf Schwanwerden. Im ersten

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/e-e,e \

l

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0

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o/O I

Fig. 3. Eichlmrve fiir &trio1 bei der IttrichReaktion unter verschiedenen Bedingungen. Die Urinleerwerte wurden abgezogen. Die Messungen erfolgten bei 500, 535.5 und 577 mp. A-A_ &trio1 ohne Urinzusatz. o-_-O &trio1 + Trockenriickstanrl van o.r m1 Grin. a---* &trio1 -4- 0.x ml t-i-in.

.I II

Fig. 4. Vcrhslten steigender Mengeu van Schwangerenurin bei der Ittrich-Reaktion. Die Messuw gen crfolgten bei 500, 538.5 und 577 my. O---o e--e

Reaktian mit Tmckenriickst%ndell. Reaktion in Liisung.

BESTIMMUNG

DER

~STR~GENE

547

1~ URIN

Falle wird die Ittrich-Real~tion mit dem ~~~~k~~~~~~kst~~~von 0.1 ml Urin ausgefi_ihrt. Im zweiten Falle wird nach Verdiinnen von 0.1 ml Urin auf 0.4 ml die IttrichReaktion in Liisung durchgefiihrt (vgl.*). l/evsuche mit Trockenriicksttinden Bei der Ausfiihrung der Ittrich-Reaktion mit Urin-Trockenrtickst2nden zeigte sich, dass die Extinktion von IOE(~ &trio1 nach Zusatz steigender Mengen M&innerm-in in crheblichem Masse abnahm (Fig. 2). Wghrend die korrigierte Extinktion fiir IO /Lg reines &trio1 (Trockenrtickstand) unter unseren Versuchsbedingungen 0,430 betrug, war sic nach Zusatz von 0.3 ml Mgnnerurin auf 0.045 abgesunken. Die bereits nach Zusatz von 0.1 ml LJrin ungentigende Wiederfindung spiegelt sich such in der Eichkurve wieder, die mit steigenden &trio&,Xengen und den Trockenriickstgnden gleichbleibender Urinrnengen aLlfgenommen wurde (Fig. 3). Die Eichkmve verlief linear, lag jedoch etwa 80% niedriger als diejenige fiir reines &triol. Wurde die Hormonmenge gleichzeitig erhiiht (steigende Mengen Schwangerenurin) und mit den Trockenriickst2nden die Farbreaktion ausgefiihrt, so ergab sich zwar eine Gerade, die aber wiederum zu tief lag (Fig. 4). Auf die Griinde der ungeniigenden Wiederfindung sol1 nicht n&es eingegangen werden. Die Versuche zeigen jedoch, dass die direkte Anwendung der Ittrich-Reaktion auf ~~~yi~1-TrockenYjickst~n~~ ftir quantitative Bestimmungen nicht mijglich ist. Verswhe

in L&wag

Wird die Ittrich-Reaktion in Liisung, d.h. mit verdiinntem Nativurin, durchgefiihrt, so sind die Ergebnisse befriedigender. Die Unterdr~ck~lng der Farbentwicklung durch die Urinpigmente ist, wie aus der entsprechenden Kurve der Fig. 2 hervorgeht, weniger stark als bei den Versuchen mit Trockenriickst5nden. Bei Zusatz von 0.1 ml Mgnnerurin war die Eichkurve fiir &trio1 im Bereich von 0.2-z.o/~g linear; die Wiederfindung betrug etwa 70% (Fig. 3). Einen interessanten Verlauf zeigte die Kurve, die mit steigenden Mengen Schwangerenurin (Fig. 4) erhalten wurde; der stijrende Einfuss der Urin~igmente wird besonders deutlich nach ~‘er~~,e~~d~~~~g von mehr als 0.25 ml Urin. Im Falle der direkten Anwendung der Ittrich-Reaktion auf Schwangerermrin ist die sogenannte “Wiederfindung” keine echte Wiederfindung, sondern tin Mass fiir die Unterdriickung der Farbreaktion durch Substanzen, die in den Ablauf der Kober-Reaktion &&-end eingreifeu. Sie schwankte naturgem%s von Urin zu Urin und TXBELLB ERG~~NIS

DER

I

WIEDERFINDUNGSVERSUCHE

DIREKTEN

ANWEliDUIiG

F~?R DER

&TRIO*

BEI

DER

ITTRICH-REAKTION

Die Zahlen in der Tabelle geben die Mittelwerte, die mittleren Ahweichungen (0) sonic in Klammern die .%nzahl der Versuche an.

0.1 ml Mknerurin 0.1

ml MBnnerurin

60 j: 10

(10)

‘55rt

4

(8)

0.1 ml M%nnerurin

73 +

5

(5)

0. i ml Schwangerenurin

78 i

fj

(4)

CEin.Chiin. Actn, 5 (1960)5.14-551

545

H. BREUER,

J. GERTZ

lag je nach Pigrnentgehalt der betreffenden Urine zwischen 600, und 90% fiir alle 3 iistrogene. Unter Heranziehung der \-on BORTH 5 angegebenen Definitionen fiir die Richtigkeit (accuracy), die Genauigkeit (precision) und die Empfindlichkeit (sensitivity) wurde die Zuverl~ssigkeit (realibility) der Ittrich-Reaktion bei der direkten Anwendung auf Schwangerenurin statistisch gepriift.

~~c~~~~/~~,~~. Das Ergcbnis der Zusatzvcrsuche ist in Tabelle 1 angegeben. Im Rerrich YOII 0.2 his 2.0 ,ug &trio1 betrug die ~~~ieder~ndung bti einem ~~~~~~~cru~-i~~ aus cinem (0.1 ml) Ooq;-73~~~. Fiir 0.S fig &trio1 belief sich die Wiedcrfindung Schwangerenurin (0.1 ml) auf 75’1;. Dcr tndogene Leerwert des MWwrurins war praktisch gleich Xull, wghrend dcr Lccrwert des Schwangerenurins 3.3 pg &trogenjo.r ml entsprach. Genuui~keit. Die Genauigkeit einer Ncthode kann durch wiedclrholte BestimI\-urdcn van 3 Personen an mungen an ~iwr Probe ermittelt werden. Insgesamt einer Schwangcrenurinprobc 31 Doppelbestimmungen durchgefiihrt, deren Ergebnis Std. = in Fig. j dargestellt ist. I>er Xttelwert (ausgedriickt in mg “ikt~id”j2~ Staudardabweichullg) betrug 3.4 + 0.48. Eine andere Methodc zur 13estimmung derwordcn. Dabei aird die Standardab(;cnauigkeit ist ~7011SNEF)ECOR~ angegcben weichung s nuu dem ~nterscl~ie~I Iz zwischen den beiden Wertcn einer ~oppelbestimmung bei t%xx griisseren ZfhI \-011 Yw%clwn bcrechnct :

wobci 12,dit: Zahl der I~ol~l~~lhestimmungen bcdeutet. Hei 30 Doppelbestimmungtn im Iionzcntrationsbereich \-on 2-4 mg “iistriol”/z4 Std. betrug s (ausgedriickt in mg ?jstriol’~j24 Std.) 0.44. Dcr Vertrauensbercich fiir einen Mittelwert JI errechnet sich aus drr Formel

wobei i die ‘~b~~~icllung und II die Zahl der ~esti~~lmungen bedeutet. fZei einrl Doppelb~~stinlInung im I+rcich van z-4 mg “&xiol”’ ,z4 Std. b&r&$ dcr Verstrauensbcreich (I-‘= 0.01)

Der maximalc

prozentuale

Fehler

einer Hestimmung

ergibt

sich nach der Formcl

die in ciner Doppelbestimmung noch mit Demnach betrHgt die Mengc “ijstriol”, eincr (ienauigkeit ~0x1 i Zjo& gemessen werden kann, 3.2 mgjy Std. In Fig. 6 sind die ~l-o~cnt~lal[,n Fehler van Doypelbfstimmungen im Bereich van OS-5.0 mg “&triol”/zq Std. angegeben. ~~~~~~~l~c~~e~~. Die qualitative Empfindlichkeit einer X&ode ist durch die geringste Menge grgeben, die van Null noch unterschieden nerden kann und wird definiert nls t.s/v’n. Im vorliegenden Fall betr5gt die Empfindlichktit i’iir die kolorimetrische Direktbestimmung der ijstrogetle im Schwangerenurin o.So :ng/zq Std. ; bci diesem Wert belguft sich der prozentuak masimale Fehlcr auf IOO~,,. 3. Ittrich-Methode

mit Schzi’angerellz~rin

Die van ITTI~ICH angegebene Vorschrift zur Isolierung der ijstrogenfraktion ist eine etwas vereinfachte ~b~~andlung des Brown’schcn Verfahrens. Jm Gegensatz zu der letztgenannten Methode wird auf den ~~erseifungssch~tt sowie auf die Nethylierung der &trogene verzichtet ; die ~hromatographie der freien &trogene erfolgt an der nluminiumosyd-S8ule. Die Bestimmung sol1 mit hBchstens IO ml Urin durchgefiihrt werden.

H. BREUER,J.GERTZ

550 Bei kolorimetrischer

Messung des Farbko~lple~es

kann die Ittrich-~~ethode

zur

getrennten Bestimmung der ijstrogene vom 2. Scl~~vangerschaftsmoilat an angewandt werden. Zu diesel- Zeit bettigt die Konzentration der Gesamtiistrogene etwa 2 ,ug/ro ml Urin. In Tabelle II sind die Ergebnisse van Wiederfindungsversuchen fiir ostron, ostradiol

und &trio1

im Bcreich

\:on 0.5-s

pg mit der Ittrich-Methode

GSTKIOLNACH

\vIEDERFJNUUNGF~~RG~TRADI~L-I~~,GSTR~P~UNU)

angegeben;

ZUSATZ~UHYDROLYSIERTE.UURIN

Die Steroide warden zu LOO ml Iirin (&Ietllode vim I3aowrv) bzw. 10 ml [7rin (Methode Van ITTRICH) zugesetzt. Die Zahlen in der Tahelle geben die Mittelwerte die mittleren Alweichnngcn (n) sowie in Klammern die .kznhl der Versuche an. Z24gessfste.~

Sleroid tktradiol-1 y/f

iistrrm

Ostriol

zum Vergleich erhalten

sind die ~~iederfindungen

wurden.

Die ~bereinstinlmLlng

angefiihrt,

die mit der Brown’schen

zwischen beiden

Die wghrend eines Zyklus ausgeschiedenen

Methoden

ijstrogen-Mengen

Nethode

ist befriediger~d.

im Urin schwanken

zwischen IO pg und IOO lug/24 Std.; demnach bet&$ in IO ml Grin die GesamtGstrogen-Menge 0.1-1.0 ,ug, die sich auf ijstradiol, ijstron und &trio1 im VerhHltnis van etwa I : z : z-4 verteilt. Da die untere Nachweisgrenze der kolorimetrischen Ittrich-Reaktion

bei 0.1 ,ug Estrogen

liegt, gibt die Ittrich-Methode

mit anschliessen-

der kolorirvletvischcr Messung des Farbkomplexes nur zur Zeit des Ovulationsgipfels brauchbaro Werte. Eine durchgchende Bestimmung der ostrogene wzhrend des ganzen Zyklus diirfte nur dann miiglich sein, wenn der estrahierte Farbstoff fluorometrisch

gemessen

wird.

Die van ITTRICH eingefiihrte Extraktion des &trogen-Farbkomplexes kann als wesentliche Verbesserung auf dem Gcbiet der Estrogen-Bestimmung angesehen werden. Dadurch wird die dir&e Anwendung der Kober-Reaktion auf Schwangerenurin maglich, wobei jedoch folgende Punkte besonders beachtet werden miissen: a. Der Urin sol1 auf 1500 bzw. 2000 ml verdiinnt werden. b. Die Reaktion darf mit hijchstens 0.1 ml Urin durchgefiihrt werden. Die Rcaktion muss in Liisung durchgefiihrt werden. C. Die Farbc dcs extrahierten Farbkomplexes muss wegen der InstabilitSt unter d. genau definiertcn Bedingungen abgelesen werden. Bei Einhaltung dieser I3eding~lngen kijnnen die Gesamt-ostrogene etwa vom

BE~TIM~V~JNG DER

&TR~GENE

134

URIN

551

3. Schwangerschaftsmonat an mit der Ittrich-Reaktion schnell und zuverl%ssig in jedem klinischen Laboratorium bestimmt wcrden. Bci der getrennten Bestimmung der ijstrogene im Schwangerenurin bietet die Ittrich-Methode gegeniiber der Brown’schen Methode den l’orteil des geringeren Ilatcrialverbrauchs und einer etwa aoqd-igen Zeiteinsparung. Bei der getrennten Bestimmung der ijstrogene im Zyklusurin sowie im Urin \-on Frauen in der Postmenopause und TTon Xnnern ist die Ittrich-hlethodc dcr Krown’schen Methode unterlegen, sofern der extrahierte &trogen-Farbstoff fioloriIME~V~SC~ gemessen werden ~011.\f’ird dagegen der Farbstoff fluorometrisch bestimmt, so diirfte die Ittrich-Methode such bri Urinen mit niedrigen &trogen-Konzentrationrn anwendbar scin. DANK Wir danken Herrn Dr. G. ITTRICH, Berlin, fiir die kritische Durchsicht dcr Arbeit und fiir wertvolle Hinweise. Die vorliegende Untersuchung wurdc zum Teil mit Mitteln aus einer Forschungsbeihilfe des Landes Nordrhein-Westfalen durchgefiihrt.

Die Anwendbarkeit der von ITTRICH angegebenen Verfahren zur Bestimmung der &trogene im Urin wurde unter verschiedenen Bedingungen gepriift. Bei der dir&ten Bestimmung der Gesamtiistrogene im Schwangerenurin kiinnen mit der Ittrich-Reaktion zuverl&sige Werte crhalten werden. Bei der Bestimmung der einzelnen ijstrogene im Schwangerenurin bietet die Ittrich-Methode-sofern der extrahicrte Farbstoff kolorimetrisch gemessen wird-den Vorteil des geringeren illaterialund Zeitaufwandes gegeniiber der Methode von BROWN. Bei Urinen geringerer Mgnnerurin) reicht infolge der ijstrogen-Konzentration (Zyklus, Postmenopause, gcringen Urinmenge die Empfindlichkeit der kolorimetrischen Messung nicht aus, sodass hier die fluorometrische Messmethodik verwendet werden muss.

ON THE DETERMINATION OF URINARY OESTROGENSBY ITTRICH’S lllETHOD The application of the method described by ITTRICH for the estimation of oestrogens in urine has been studied under various conditions. Satisfactory results were obtained when the Ittrich reaction was applied directly to pregnancy urine. The Ittrich method is not superior to the method of BROWN in estimating individual oestrogens present in low concentrations in the urine, when the extracted colour complex is measured calorimetrically. In such cases fluorimekic measurement is to be preferred.

1 J. B. 2 J. B.

LITERrlTI:R 60 (1955) 18j.

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Clia. Chim. A&,

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