Eine semiquantitative Methode zur Bestimmung der alkalischen Phosphataseaktivität in der menschlichen Arterienwand

Acta histochern. 76, 105-112 (1985)

Aus der II. Medizinischen Universitatsklinik (Vorstand: Prof. Dr. G. GEYER) und der 1. Anatornischen Lehrkanzel (Vorstand: Prof. Dr. W. FIRBAS) der Un iversi taf Wien, Osterreich

Eine semiquantitative Methode zur Bestimmung der alkalischen Phosphataseaktivitat in der menschlichen Arterienwand A method of semi-quantification for determining the alcaline phosphatase activity in human vascular tissue Von EVA STROBL-JAGER, WILHELM FIRBAS und HELMUT SINZINGER (Eingegangen am 19. Januar 1984)

Summary A new method of semi-quantification of the alcaline phosphatase enzyme activity in human vascular tissue is described. An index is derived from the number of alealine positive cells and the different levels of intensity of the staining reaction. In the autopsy and surgical material of male and female subjects aged between 40 and 60 a, we evaluated the alcaline phosphatase enzyme reaction of normal and atherosclerotic arteries after various incubation intervals. Tissue samples were obtained from aorta, common carotid artery, renal artery, splenic and anterior tibial artery, and Sparks prosthetic graft.

Zusammenfassung Eine neue Methode der semi-quantitativen Auswertung der Enzymaktivitat der alkalischen Phosphatase in der menschlichen Gefafswand wird beschrieben, wobei die Anzahl und die verschiedenen Intensitatsstufen der alkalische.Phosphatase-positiven Zellen mittels eines Index erfaJ3t werden. Wir bestimmten die Alkalische.Phosphatase-Aktivitiit in makroskopisch unauffalligen und atherosklerotischen Arterien nach verschiedenen Inkubationsintervallen. Dabei wurden Gewebsproben aus Aorta, A. carotis communis, A. renalis, A. lienalis und A. tibialis anterior sowie aus Sparks-Prothesen entnommen. Die GefaJ3e stammten aus dem Operationsbzw, Autopsiematerial von marmlichen und weiblichen Individuen zwischen dem 40. und 60. Lebensjahr.

Schliisseluxirter : alkalische Phosphatase GefaBveranderungen - Sparks-Prothese. Key words: alcaline phosphatase Sparks-prothesis.

Arterienwand -

arterial wall -

atherosklerotische

atherosclerotic lesions -

Einleitung Die histochemische Reaktion der alkalischen Phosphatase wurde unabhangig voneinander von GOMORI (1939) und TAKAMATSU (1939) entwickelt, die eine positive Reaktion nur in der Adventitia mittelgroBer Arterien beschrieben. Bisher wurden in der Literatur verschiedene, z. T. widerspriichliche Angaben tiber die genaue Lokalisation der Alkalischen-Phosphatase.Aktivitat gemacht, die je nach der GroBe des GefaBes unterschiedlich sein solI. Die meisten Autoren beschrieben eine an Zellen oder fibrose Elemente gebundene Aktivitat im Endothel und in der Adventitia,

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E. STROBL·JXGI<;R, \V. FIRBAS und H. SINZINGER

nicht jedoch in der Media. Folgende morphologische Substrate wurden bisher als Trager der positiven Enzymreaktion genannt: 1. Endothelzellen (ROMANUL und BANNISTER 1962), wobei hier Unterschiede nach Lokalisation und Topographie der verschiedenen GefaBabschnitte beschrieben werden. 2. Fibrose Elemente (SCHLIEF et al. 1954; VIZOW 1972, Collagen und Fibrohlasten (FELL et al. 1943 ; GOULD 1960; JELLINEK et al. 1976). 3. Makrophagen (LOJDA 1965). 4. Histiocyten, Mastzellen und Pericyten (GARDNER 1963; LIERSE 1963). 5. Glatte Muskelzellen (HADJIISKY et al. 1975).

Eine pathologische Alkalische-Phosphatase-Aktivitat wurde bisher beschrieben bei : a) degenerativen GefaBveranderungen, wie Atherosklerose (LEVONEN et al. 1960), b) bei Hypertonie (KERENYI et al. 1976; MOHACSY 1977). Bei der Neubildung von faserigen Bindegewebselementen bzw. des Granulations. gewebes (FELL et al, 1943 ; SCHLIEF et al. 1954; ADAMS 1967; VIZIOLI et al. 1972) wurde ebenfalls eine positive Enzymreaktion beschrieben. Weiters ist die Bestimmung der alkalischen Phosphatase von Wichtigkeit fiir die Beurteilung der Reife eines bindegewebigen GefaBersatzes, wie z. B. einer Sparks-Prothese (SINZINGER et al. 1975a, b). Die pathophysiologische Bedeutung und Interpretation dieser Aktivitat, ist jedoch sowohl beim Menschen als auch beim Versuchstier bis heute weitgehend unge. klart (ADAMS 1976 ; LOJDA und REINIS 1964 ; VELICAN 1974 ; HADJIISKY et al. 1975; u. v, a.). Bis jetzt liegen in der Literatur ausschliefllich qualitative Beurteilungen bzw. Beschrankung auf Angaben tiber eine hohe oder niedrige Aktivitat der alkalischen Phosphatase vor. Quantitative Angaben existieren nur vom Homogenat (KIRK et al. 1950, 1964). Ziel unserer Untersuchung war es daher, das Vorkommen einer positiven Enzymreaktion an verschiedenen Lokalisationen menschlicher GefaBe mittels einer semi. quantitativen Methode zu untersuchen. Mit der Quantifizierung der Adventitia. aktivitat und der Erstellung von Normalwerten fiir verschieden groBe Arterien konnte ein .Ausgangspunkt fiir eine quantitative Aussage zur Diagnostik gewonnen werden.

Material und Methoden Die untersuchten Arterien stammten von mannlichen und weiblichen Individuen zwischen dern 40 . und 60. Lebensjahr aus d em Operationsmaterial d el' 1. Chirurgisehen Universitiitsklinik (fiir die Uberlassung danken wir Prof. Dr. FRANZ PIZA und Prof. Dr. OTTO WAGNER) und dom Obduktionsmaterial del' Rudolfstiftung (fiir die Uberlassung danken wir Prim. Dr. ERNST ZAN. DANELL n. Gewebsproben von makroskopiseh unauffalligen Gefiil3en al s auch Gewebsstiieke mit sichtb ur en atherosklerotisehen Veriinderungen wurden aus Aorta , A . ea rot is communis, A.renalis, A . lienalis und A . tibialis anterior (unmittelbar distal des Ursprungs) entnommen. \Veiters wurde d ie Alkalische-Phosphatase-Aktivitat in den von SPAHKS (1965) erstmals besehriebenen auto -allo . plastisehen Arterienprothesen ermittelt . (Sparks-Prothes en be stehen aus einem Teflongitter zur Implantation als Gefiil3er satz bei Patienten mit peripher er Ver sehlul3krankheit, wobei ers t nach Bildung eines Granulationsgewebes del' An schluLl an den arteriellen Kreislauf in einer 2. chirurgisch en Sitzung durehgefiihrt wird.) Di e Untersuchung de s GefiiLlmaterials erfolgt e in del' von GOIlIORI (1939) angegebenen Met horlo. Di e Gefiil3e wur-den im Cryostat geschnit.ten und in kaltem Aeeton 3 min f'ixiert., An schliel3 end

Alkalische Phosphataseaktivitat in der menschlichen Arterienwand

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wurden die Schnitte in 50 ml einer walsrigon, Na-Veronal (9,2 :c;: pH :c;: 9,3) gepufferten Losung von 19,6 mmoljl Natrium-p-Glycerophosphat und 68 mmoljl CaCI 2 • 2 H 2 0 , der 0,25 ml einer MgCI 2 Losung (491,9 mmoljl) zugesetzt worden waren, zwischen 30 min und 2 h bei 37°C inkubiert. SchlieJ3lich wurden die Schnitte mit einer Losung von CaCl 2 (180 mmol/l) 1 bis 2 min, dann mit einer Cobalt.chlor-idloaung (154 mmoljl) fur 5 min behandelt und mit Aqua bidestillata 4mal gespult. Eine Ammoniumsulf'idlcsung (146,8 mmoljl) wurde nach 3 bis 5 min in flieJ3endem Wasser abgespult : darauf folgten Kernfarbung mit Harnalaun und Lufttrocknung. AnschlieJ3end erfolgte die Auszahlung der alkalische-Phosphatase-positiven Zellen. Urn aus den Auszahlungen einen von der Untersuchungsanzahl unabhangigen Parameter zu gewinnen, wurde analog der alkalischen Leukocytenphosphatase in der Hamatologie nach KAPLOW (zit. naeh ~[ERKER und HEILMEYER 1960) ein Index berechnet. Zur Beurteilung wurden 100 positive Areale ausgezahlt., Die Positivi tat der Reaktion wurde nach der Farbungsintensitat in 4 Stufen (0 bis 3) eingeteilt (Aktivitatsstufen): Stufe Stufe Stufe Stufe

0: 1: 2: :J:

keine Aktivitat, keine Anfarbung ; geringe Akt.iv itat., geringe Anfarbung ; mdjJige Akt.iv itat , mittelbraun; starke Aktivitat , dunkelbraun. Die jeweiligen ausgezahlten Zellen wurden mit der ihnen zugeordneten Akt.ivit.atsst.ufe multipliziert; aus der Erfassung von 100 Zellen ergaben sich daher Index- Werte von 0 bis 300. Dieser Index wurde fur die Gesamtadventitia in Aorta, A. renalis, A. lienalis, A. carotis cornmunis und A. tibialis anterior nach einem Inkubationsintervall von 15 und 45 min erhoben und der Mitt elwert aus jeweils 10 Schnitten von sowohl makroskopisch unauffalligen GefaJ3en als auch von Arterien mit sichtbaren atherosklerotischen Veranderungen angegeben. In der A. femoralis wurde die Adventitia durch Vierteln des Durchmessers mittels des Okularrasters in 4 Teile untertcilt, die von innen nach auJ3en mit A bis D bezeiehnet wurden. Der Aktivitatsindex der alkalisehen Phosphatase wurde - zur besseren methodischen Vergleichbarkeit nach 10, 15, 30, 45, 60 und 120 min Inkubationszeit getrennt - fur die 4 Adventitiaabschnitte gemessen und der Mittelwert von je 10 Schnitten bei 6 Individuen angegeben. AuJ3erdem wurde die Alkalische.Phosphatase.Aktivitat im Granulationsgewebe von 6 reifen und 5 unreifen Sparks-Prothesen ermittelt (als "reif" wurden dabei nach klinisch-chirurgischen Kriterien makroskopisch gut eingewachsene Prothesen bezeichnet; als "unreif" jene, die fur einen AnschluJ3 an das GefaJ3system nicht geeignet erschienen).

Ergebnisse Bei der Quantifizierung der positiven Areale in der Adventitia (Tabelle 1) fallt eine unterschiedliche Akt.ivitat, in den verschiedenen Gefal3en auf, wobei sich auch nach Unterteilung in Arterien des elastischen (Aorta, A. carotis communis), des hybriden (A. Iienalis) und des muskularen Typs (A. renalis, A. femoralis, A. tibialis anterior) nach den verschiedenen Inkubationsintervallen keine einheitlichen Ergebnisse erkennen lassen. Atherosklerobisch veranderte GefaBe zeigen eine signifikant vermehrte Alkalische.Phosphatase.Aktivitat gegeniiber makroskopisch unveranderten Gefal3en gleicher Entnahmelokalisation. Unterteilt man die Adventitia der A. femoralis in 4 Abschnitte, so wird vom inneren zum aul3eren Viertel eine deutliche Zunahme des Aktivitatsindex beobachtet (Tabelle 2). Diese Resultate sind bei allen Inkubationszeiten einheitlich. Bei den Sparks-Prothesen ist die Alkalische-Phosphatase-Aktivitat in den reifen Prothesen hoher als in den unreifen; dieser Unterschied erreicht bei einem Inkubationsintervall von 45 min ein Signifikanzniveau von p < 0,01 (Tabelle 3).

Diskussion Uber die Lokalisation der Alkalischen-Phosphatase-Aktivitdt in der GefdjJwand sind die Angaben in der Literatur nicht einheitlich. Nach ROMANUL et al. (1962), LOJDA (1965), LOJDA et al. (1964)

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E. STROBL-JAGER, W. FmBAS und H. SINZINGER

Tabelle 1. Alkalische Phosphatase (Adventitia). Aktivitiitsindex (5< ± SEM) Arterie

n

Aorta A. carotis communis A. renalis A.lienalis A. tibialis anterior A. femoralis

4 4 10 8 4 8

nicht atherosklerotisch atherosklerotisch 15 min

45 min

18 ± 3 6±2 26 ± 6 43 ± 6 51 ± 7 32 ± 4

105 21 53 102 99 73

± ± ± ± ± ±

17 4 3 15 13 10

15 min

45 min

37 13 50 68 89 67

166 35 89 135 157 98

± ± ± ± ± ±

5 2 6 8 6 5

p[15min] p[45min]

< < < < < <

± 5 ± 5 ± 9 ± 21 ± 24 ± 15

0.1 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

< < < <

0.01 0.01 0.01 n. s. 0.05 n. s.

Tabelle 2. Aktivitiitsindex der alkalischen Phosphatase in 4 verschiedenen Adventitia-Abschnitten der A. femoralis (5< ± SEM; n = 6) Adventitia-Abschnitt

Inkubationszeit [min]

A

B

C

10 15 30 45 60 120

0 0 0 29 ± 6 12 ± 5 20 ± 4

0 7 ± 3 14 ± 5 44 ± 9 15 ± 4 52 ± 6

3± 9± 21 ± 36 ± 83 ± 79 ±

D

2 3 3 7 20 9

0 13 ± 4 75 ± 9 89 ± 8 77 ± 11 133 ± 18

A innerstes, ... D iiuJ3erstes Viertel

Tabelle 3. Sparks-Prothese. Aktivitiitsindex der alkalischen Phosphatase (5< ± SEM)

reife Prothese unreife Prothese

*p <

n

15 min

45 min

6 5

9 ±4 3±2

67 21

± 8* ±6

0.01

und SOTONYI et al, (1954) soll die positive Alkalische-Phosphatase-Reaktion an die Endothelzelle gebunden sein. Andere Autoren beschreiben eine positive Enzymreaktion in Fibroblasten (GOULD 1960; JELLINEK et al. 1976), in Makrophagen (LOJDA et al. 1964), glatten Muskelzellen (HADJIISKY et al, 1975) sowie in Histiocyten, Mastzellen und Pericyten (GARDNER 1965; LIERSE 1963). Weiters soll die alkalische Phosphatase an das Auftreten f'ibroser Proteine (SCHLIEF et al. 1954), gebunden sein. Nach SOTONYI et al. (1965) und HUTTNER et al. (1965) liegt die Enzymreaktion nicht in den Vasa vasorum, sondern in einem Lymphspaltensystem oder an der aktiven Oberfliiche von Gewebsfasern. Gegen eine Aktivitiit in den Vasa vasorum spricht, daB nach Identifikation mittels Tuscheinjektion in den Vasa vasorum keine Enzymreaktion lokalisiert werden konnte, gegen Lymphgefiil3e hingegen experimentelle Untersuchungen nach Erweiterung, die ebenfalls negativ waren (HUTTNER et al. 1976). Uber die Lokalisation in der Endothelzelle existieren verschiedenste Ansichten. Nach FISCHER und GLICK (1947) sowie MIZUTANI und BARNETT (1965) ist die alkalische Phosphatase im Kern lokalisiert; nach SPIER und MARTIN (1956) ist die Enzymaktivitiit sowohl im Zellkern als auch im Cytoplasma lokalisiert. NEWMAN et al. (1950) sprechen von einer "primiir cytoplasmatischen Reaktion", wiihrend PEARSE (1960) zuletzt die Kernreaktion als Artefakt bezeichnete. Nach CLARK (1961) und REALE (1962) ist die Aktivitiit an Membranen gebunden.

Alkalische Phosphataseaktivitat in der menschlichen Arterienwand

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Die Enzymreaktion ist an den Endothelien verschieden grofter Arterien verschiedener Lokalisation unterschiedlich und scheint mit der Zunahme der Gro/3e des Gefa/3es allmahlich (SOTONY! et al, 1965) abzunehmen. Die zu diesem Punkt einander sehr stark widersprechendon Ansichten in der Literatur zeigen, da/3 die iiberwiegende Anzahl der Autoren die terrninale Strombahn als Lokalisation der Enzymakt.ivit.at. beobachten konnte. KASAl (1964) beobachtet an Aortenendothelien in vitro eine negative Reaktion. Gelegentlich findet sich aber auch an grofleren GefalJen eine positive Endothelzelle, wenn auch die Anzahl sehr gering ist. LEVONEN et a!. (1960) beschrieben als einzige eine regelmafsige positive Enzymreaktion in den Endothelien der groJ3en Arterien. Relative Einigkeit herrscht tiber eine positive Reaktion in den Vasa vasorum. GOMORI (1939) beobachtet diese als einziger nur in der Adventitia mittlerer Arterien. Die Aktivitat ist im venosen Kapillarschenkel niedriger als im arteriellen (KLINGMULLER 1957). Neben nur vereinzelter Aktivitat in der - vor allern aulJeren - Media, liegt der Schwerpunkt der Aktivitatsverteilung in der Adventitia (GOMORI 1939; LOJDA 1964; LIERSE 1963; FAED et al. 1964; GARDNER und LAING 1965; ADAMS 1967; VELICAN 1974, U. v. a.). Hier ist interessant, daJ3 die Aktivitat nicht gleichmaflig verteilt ist. Erstmals berichteten JANOSSA et al, (1965) und KOLONICS et a!. (1975) aus der Arbeitsgruppe urn JELLINEK uber eine hohere Akbivit.at in der aulJeren Adventitia. In den von uns quantitativ untersuchten Gefa/3en (A. femoralis, Tabelle 2) laJ3t sich dieser Befund bei allen Inkubationsintervallen verifizieren, d. h. die Aktivitat steigt vorn inneren b.s zum aulJeren Viertel kontinuierlich an, wobei sich die Indexwerte in manehen Gruppen zur nachsten sogar vervielfachen. WOOSMANN et al, (1972) beschreiben eine Anderung (Reparativzone) der Akt.ivit.at bei Hyper. tonie vorwiegend im aulseren Drittel, gehen aber auf die quantitative Verteilung nicht naher ein. In experimentellen Studien konnte gezeigt werden (Tabelle 1), dalJ mit zunehmender Aus. priigung degenerativer Gefii.lJverii.nderungen wie Hypertonie (BOURNE 1953) oder klinisch manifester Atherosklerose (PATERSON et al. 1957; MALINOW et al. 1959, u. v. a.] die Enzymaktivitiit ansteigt , wahrend diese sonst einem altersabluinqiqen. Altersabfali unterliegt (KAHN und SLOCUM 1967a, b). Eine positive Enzymaktivitii.t konnte im Sinne eines cellularen Umbaues der GefiiJ3wand interpretiert worden (WOOSMANN et al, 1972). GIRARD et al. (1974) beobachteten in Hamangiomen eine positive Ensyrnaktivitat. SCHLIEF et al. (1954) konnten an Homogenaten von Arterien zeigen, da/3 die Enzyrnakt.ivit.at an Orten [ibriiser Veriinderungen stark gesteigert war; ein Befund, der generell bei Formation f'ibroser Proteine gefunden werden kann (ZEMPLENY'I 1968; JOHNSON und McMINN 1958; bzw. in noch wachsenden Geweben, z , B. in Carcinomen [ZEMPLENYI 1968]), oder als ein fruhes Zeichen eines Umbaues, bevor noch morphologische Voranderungen fa/3bar sind (MOON 1959). FELL and DANIELl (1963) sowie GOULD (1960) beschrieben eine Korrelation der Enzymaktivitiit zur Fa.serbildung, MARCHANT (1944) und ROBERTSON (1950) lehnen dies ab; CHVAPIL et a!. (1958) lassen diese Frage offen. Bedeutung hat auch die beginnende Vascularisation (VIZIOLI et al , 1972; PATERSON 1957), ebenso wie auch die Beziehung der Enzyrnakt.ivite.t zum Alter des Granulat.ionsgewebes bekannt ist (RAEKALLIO und MAKINEN 1969; VIZIOLI et al. 1972; ADAMS 1967). Daraus ergibt sich auch der interessante Befund des Reifegrades einer Sparks-Prothese (SINZINGER et a!. 1975; Tabelle 3), der an der Enzymaktivitat bewertet werden kann. Verschiedene Studien ergaben erhebliche Specieeunterschiede (JOHNsoN und McMINN 1958; WINKELMANN et al, 1961; SOTONY'I et al. 1965) sowie deutliche U nterschiede nach experimentellen Noxen, die jedoch bis jetzt keinen Beitrag zur Klarung der Bedeutung des Enzyms leisten konnten. Zahlreiche Untersuchungen mit Homogenaten (MANDEL et a!. 1959; CAFIERO 1954; ROSSOTO 1956; OKA und ANGRIST 1967; KAHN und SLOCUM 1967; ANTONINI und WEBER 1951) haben ebenfalls zu nur unbefriedigenden Resultaten gefuhrt, Moglicherweise liegt die Bedeutung der Alkalischen.Phosphatase-Aktivitat im Stoffwechsel der Zelle selbst, Nach SEIFERT (1970) nimmt die alkalisehe Phosphatase eine wichtige Stellung im Kohlehydratstoffwechsel ein und kormte so eine ernahrendo Funktion fur die Hautkapillaren oder eine Transportfunktion haben (DANIELLI et a!. 1954; MOOG 1962). Dagegen spricht, dalJ die Aktivitat in Gefii.J3en mit intensivem Stoffaustausch bzw. in bestimmten Organen nicht erhoht ist, bzw. gelegentlich sogar niedriger ist (SEIFERT 1970). Unter Urnstanden hat auch die Pinocytoaeaktivitat (MIZUTANI und BARNETT 1965) eine enge Beziehung zur Aktivitat der alkalischen Phosphatase. Dafur wurden auch die Befunde von KAHN und SLOCUM (1967) sprechen, die einen

no

E. STROBL-JAGJ;
Anstieg des Enzyms parallel mit der ATPase in der Hiihnchenaorta nach atherogener Diat fanden. Von der ATPase ist die Bedeutung fur die Bereitstellung der Transportenergie zur Pinocytose bekannt (ADAMS 1967; HOFF und GRAF 1966). BOTS (1976) fand hingegen in Endothelzellen von rasch proliferierenden Hirntumorgefaflen im Vergleich zu normalen Endothelzellen eine geringere AP-Aktivitat zugleich mit einer erhohten A'I'Paso-Akt.ivitat., was gegen einen engeren Zusammenhang beider Enzyme spricht.

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Alkalische Phosphataseaktivitat in der menschlichen Artenenwand

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