Ergebnisse mit den IgM-FTA-Abs- und IgM-TPHA-Testen bei der Untersuchung von seropositiven Luetikerseren

Zbl. Bakt. Hyg., 1. Abt. Orig. A 254, 521-527 (1983)

Institut fiir Klinische Mikrobiologie und Infektionshygiene der Universitat Erlangen-Nurnberg (Vorstand: Prof. Dr. W.Knapp)

Ergebnisse mit den IgM-FTA-Abs- und IgM-TPHA-Testen bei der Untersuchung von seropositiven Luetikerseren Detection of Specific IgM Antibodies with the IgM-FTA-Abs- and IgM-TPHA-Test in Seropositive Sera of Syphilis Patients VOLKER BRADE und HORST ULRICH BEUSCHER

Mit 2 Abbildungen . Eingegangen am 24. Dezember 1982

Abstract The IgM fraction was separated by gel filtration chromatography from patient sera which were positive in the FTA-abs-test as well as in the TPHA-test. After absorption the isolated IgM fraction was tested for specific IgM antibodies against Treponema pallidum in the IgM-FTA-abs- and also in the IgM-TPHA-test. The following results were obtained: 1. Both IgM tests often showed positive reactions even with negative results in the cardiolipin complement fixation assay (CFA) (Tables 1 and 2). 2. In most positive cases specific IgM was detectable with both IgM tests in the same sample (Table 3). 3. The CFA titers were low « 1: 20) in the majority of cases which did not have detectable IgM (Tables 1 and 3). 4. The CFA titers were prevailingly high (> 1: 20) where the IgM tests gave positive results (Table 1 and 3). Clinical symptoms of active syphilis were only reported for cases with high CFA titer and positive IgM tests in the same sample. Therefore only these latter results of diagnostic tests can be clearly interpreted to indicate a requirement for specific therapy against syphilis.

Zusammenfassung Patientenseren mit positiven TPHA- und FTA-Abs-Testen wurden zum Nachweis von spezifischen IgM-Antikorpern gegen Treponema pallidum durch Gelfiltration aufgetrennt. Die IgM-haltigen Fraktionen wurden ankonzentriert und nach Absorption sowohl im IgM-FTA-Abs- als auch im IgM-TPHA-Test auf die Anwesenheit von spezifischen Antikorpern gepriift. Folgende Befunde wurden erhoben: 1. Beide IgM-Teste waren haufig positiv, auch bei negativem Ausfall der Cardiolipin-KBR. 2. Der Nachweis von spezifischem IgM zeigte in der Mehrzahl der Falle in beiden Testen i.ibereinstimmende Ergebnisse. 3. Die KBR-Titer waren iiberwiegend niedrig « 1: 20) bei negativen IgM-Testen. 4. Die KBRTiter waren iiberwiegend hoch (> 1:20) bei gleichzeitig positiven IgM-Testen. Klinische 35 Zbl. Bakt. Hyg.,

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Symprom e einer aktiven Lues wurden nur fiir Faile mit hohem KBR-Titer und gIeichzeitig posit iven IgM-Testen mirgereilr, Lab or diagn ostisch scheinen daher nur positi ve Reaktionsausfa lle in den IgM-Testen bei gleichzeitig hohem KBR-T iter (> 1 :20) m it Sicherheit au f eine Behandlungsbediirftigk eit h inzuw eisen .

Einleitung Die Anwesenheit von spezifischen Antikorpcrn der IgM-Klasse wurde fiir aile Stadien einer klinisch symptomatischen Lues des Erwachsenen und des Neugeborenen beschrieben (1, 2, 6). Der Nachweis der IgM-Antikorper wird als Ausdruck einer noch floriden Infektion gedc utet (2, 6, 7, 8). In Einkl ang mit dieser Interpretation steht die Beobachtung, daB nach Durchfiihrung einer Therap ie die spezifischen IgM-Antikorper innerh alb cines langeren Zeitraumes von 3 Mon aten bis 2 jahren verschwinden (2,5,7,8 ). Fiir Klinik und Labor steht seit Einfuhrung des IgM-Nachweises in die luesserologische Diagno stik die Frage im Vord ergrund, welche Aussage dem Nachweis Treponema pallidum spezifischer Anrikorper der IgM-Klasse bei klinisch unauffalliger seropositiver Lues vor allem fiir die Therapieplanung zukommt, zumal bei vie/en Patienten keine sichere Behandlungsan amne se erhoben werden kann. In unseren Untersuchungen erweiterten wir den bisher routinernaliig mit dem IgM-FTA-Abs-Test (T) erbrachten luesspezifischen IgM- N achweis durch den IgM-TPHA-Test (T). Gestellt waren die Fragen, ob unsere Unter suchungsergebn isse dem einsendenden Arzt die gewiinschte Entscheidun gshilfe fur die Behandlungsplanung geben konnen und mit welcher Haufi gkeir bei beiden Testen auch bei klinisch unauffalliger Lues ein eindeutig po sitives Ergebnis zu erwarten isr,

Material und Methoden Lues-Grunddiagnostik Erhitzte Patientenseren (30 M in . 56 °C) wurden mit dem T PH A-T, dem FTA-Abs.-T und der Cardiol ipin-KBR untersucht. Fiir den qualirativen TPHA-T wurden die Praparate der Fa. MAST (MAST Diagnostika , H amburg) eingesetzt. Die im TPHA-T einge setzren sensib ilisierten Er ythrozyten waren fr ei vo n nachweisbarem Kaninchen-lgG , da sie m it Anti-Kani nche n-IgG (M edac) keine Agglutinationsreaktion zeigten, Mit dem Fluoro-Kit der Fa. Clinical Sciences Inc., welcher iiber MAST Diagnostika bezogen wurde, wurden aile Untersuchungen im FTA-Abs-T durchgcfiihrt. In dies em Kit werden Treponema-beschichtete Objektrrager (Clin-Slides) mitgeliefert. Auf den Trepon emen liefsen sieh mit Fluo reszein-markierten Anti-Kaninchen-IgG Antikorpern (Fa. M edae, Hamburg) keine Antikorper dieser Immunglobulinklasse naehweisen. Abweiehend von den Angaben des Herstellers wurden aile Patientenseren mit dem Sorbent fiir 30 Min. bci 37 °C absorbiert (3). Die Cardiolipin-KBR wurde im M ikr olitersystem angesetzt. Das Cardi olipin und das positive Kontroll serum wurden von der Fa. Behr ing (Marburg) bezogen .

Abtrennun g der spezifischenlglvi-Ant ik iirper Die Abtrennung der IgM -Antikorper vo n den Antikorpern der a nder en Immunglobulinkl assen erfolgte dureh Gclfiltration . Erhitztes Patientenserum (0,6 rnl) wurde auf eine Saule (1.5 x 60.0 em) aufgetragen, welche mit Ultrogcl AeA 34 (LKB Instrument GmbH,

Nac hwe is von spezi fischem IgM in Luetikerseren

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10 20 30

~40 c o

'iii ., 50

~ c

60

.
i=

70

80

90 14

16

18

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34

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Fraktionen Abb. 1. Beispiel fiir die Auf trenn ung einer Serum probe (0.6 rnl) auf einer Sau le (1.5 x 60.0 em) mit Ultrogel AcA 34. Abszisse : In den Rohr chen gesammelte Fraktionen vo n 2.5 ml. Ordi nate: T ransmission der aufge tre nnten Seru mfrakt ion en. In dem crsten Absorptionsgipfel (Frak tion 15- 18) befinden sich die IgM -Ant ikor per.

Mii nchen ) gefiillt wa r. D as Aquili brieren und Eluie ren der Saule erfo lgre mit Veronalpuffer. Das Eluat wurde in Pro ben von 2.5 ml gesa mmel t. Abb. 1 zeigt ein Beispiel der hierb ei erzielte n Auftrennung. Bei diesem Vorge hen werden die IgM -Anti korper des Serums urn einen Faktor von ca. 12 ver diin nt. IgM- FT A-A bs-Test

Jeweils 3 bis 4 IgM-halt ige Fraktionen wurden in Koll od iumh iilsen (Sartorius, Ccrtingen) auf das Ausgangsvol umen von 0.6 ml anko nzentriert. Mit der radialen Immun diffusion auf Tri-Partigen-lgG-l'l atten (Behringwerk, Marbu rg) wa ren IgG-Antikorper im IgM -Konzentrat nicht nachweisba r. Fiir d ie fluoreszenzserologische Unt ersuc hung des IgM- Konzentrates wu rde d ieses zunachst durch Inkubation (30 Min. bei 37 °C) mit dem gleichen Volumen Sorbent (MAST Diagnostika) absorbiert . Von diesem IgM -Konzent rat wurd en weitere Verdiinnungen (1: 6, 1: 18, 1:54) mit Veronalpuffer hergestellt. Die besch ichtetcn Objekttrager (Clin-Slides, MAST Diag nostika) wurden mit den vier Verdiinn ungen (1:2 bis 1:54) des IgM-K onzent rats und einem posi tiven Kontrollpr aparat beladen. Aile Inkubation s- und W aschvorgange fo lgten dem vom H erst eller fiir den FTA-Abs-T angegebene n Verfahren. Das ,u-Kett en spezifische, fluo reszeinmarkierre Antiserum wurde von der Fa. Medac bezogen. D ie Betr achtung der Prap arate erfolgre mit einem Zeiss -Fluoreszenzmikroskop mit einem Au flicht ko nden sor IV FL. IgM- TPI-lA- Te st (lgM-Konzent rat )

D as IgM -Kon zentrat wurde fiir diesen Tes t mit dem Absorptionsmedium (MAST Diagnos tika) 1:2,1 :4, 1:8 und 1: 16 verdiinnt und anschliefsend 30 Mi n. bei 37 °C ink ubiert. Der IgM -T PHA-T wurde mit 25,u l des ab sorbierten IgM -Konzent rat es un d mit 75,u1 sensibilisierren bzw. nichtsensibil isierten Erythro zyten angesetzt. Ein positives Ergebnis zeigt A bb . 2 in der unteren H alft e.

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IgM- TP HA -T est (IgM -Frak tio nen )

N ach Serurnauftrennung wu rden ail e protein hal tigen Fra kt ionen ohn e vo rherige Ankonz entrati on auf die Anwesenheit vo n spezifischen An tikorpern untersucht. Bei di esem Test wurden 25 p i der nichtab sorbiert en Fra ktio n und 75 It! sensibilisie rte Ery rhrozyten bzw. n ichtsensibilisiert e Kont rolizellen eingcsetzt. Ein positi ves Aggluti na tion sergebnis im IgG-Bcr eich (Fraktion 30 bis 36) und im IgM-Bereich (Frak tio n 19 bis 23) zeig t Abb. 2 (obere H alf te).

Abb. 2. Beispiel fiir einen posit iven TPHA-T nach Serumauftrennung mit den Fra ktionen des IgM- und IgG-Bereichs und mit dem IgM-Konzentrat. Ob ere Halfte : Inku bation von 75 pi sensibil isicrt en (5E) bzw. nicht sensibilisicrten (NE) Eryrhrozyren mi t 25 It! Fra ktion. H am agglu tinat ion im IgM- (Fra ktio n 19- 23) und IgG-Bereich (Fraktion 30-36). Untere Halfre : Inkubat ion vo n 75 p i 5E bzw. NE mit 25 pi absorb icrte m IgM-Kon zent rat (Konz) in 4 Verdiin nun gen.

Ergebni sse Eine Gesamtzahl von 82 Patientenseren, welche in den TPHA- und FTA-AbsTesten positiv waren, wurde mit der KBR, dem IgM-FTA-Abs-T und IgM-TPHA-T untersucht. Davon waren 29 Seren in der Cardiolipin-KBR positiv (Tab. 1). Spezifische Anrik orper der IgM-Kl asse wurden in 36 Fallen bci der gleichen Patientengruppe gefunden, doch waren nur bei 16 Seren KBR und IgM-FTA-Abs-T gleichzeitig positiv (Ta b. 1). Daraus ergibt sich der labord iagnostische Befund, daB der IgM-FTA-Abs-T in 20 Fallen positiv wa r bei einem negativen Reakt ionsausfall der KBR mit dem gleichen Patient enserum. Ein negatives Ergebnis in der KBR schliefst daher nicht die Anwesenheit von spezifischen IgM-Antikorpern aus. Eine Aufschliisselung der KBR-T iter erga b, da B bei Patienten mit rcaktivern IgM-FTA-Abs-T in der Regel auch hohe KBR-Titer gefunden wurden, wahrend bei nicht nachwe is"

N achweis von spez ifischem IgM in Luet ikerseren

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Tabelle 1. Reaktion sau sfall e vo n KBR und IgM -FTA-Abs-T T este

Positi ve Reaktionsausfallc bei 82 Luet ikerseren *

KBR-T itcr

KBR

29

Stre uu ng von 1: 5 bis 1: 1280

IgM- FT A-Abs-T

36 (44 % )

KBR + IgM- FTA- Abs-T

16 (19,5%)

KBR allei n

13

IgM-FTA -Abs-T allei n

20

X l : 140,6 ''' ' , max. ",,,. 1: 1280 68,8 % :> 1 :20

X 1 : 9,6 ':" ', max. *<-<-1 : 20 77% < 1: 20

* Pati entenseren mit positi vem TPHA-T und FT A-Abs-T

,:." X = Mittelwert

","> max. = hochster KBR-T it er in der Gruppe Ta belle 2. Rcaktionsausfalle von KBR, IgM -FTA-Abs-T und IgM- TPHA-T Positiv e Reaktions ausfalle bei 36 Lucti kerseren ':. KBR 16

IgM -FT A-Ab s-T 12

IgM-TPHA-T 17

* Pat ientenseren mit po siti vem TPHA-T un d FTA-Abs-T

barem IgM ganz iiber wiegend sehr niedrige KBR-Tite r vorl agen (T ab. 1). Ein hoher KBR-Titer (> 1 :20) !afSt somit ein mit grofser Wahrscheinlichkeit positives Ergebnis im IgM-FTA-Abs-T erwarten. Gleichzeitig zeigtcn unsere serologischen Befunde , daIS der mit dem IgM-Konzentr at durchgefuhrre IgM-TPHA-T haufiger po sitiv war (Ta b. 2) als der IgM-FTAAbs-T. Der IgM-TPHA-T wurde nur dann als po sitiv bewertet, wenn die sensibilisicrten Eryrhrozy ten ab der nied rigsten Verdiinnung (1 :2) durch das ab sorbierte IgM-K onzentrat agglutiniert wurden bei negativem Ausfall des Kontrollansatzes (Abb. 2, untere Halfte). Anal og dem in Abb. 2 dargestellten Schema wurden sowohl die Fra ktionen als auch das IgM-K onzentrat im TPHA-T unt ersuchr. Nur die mit dem IgM-Konzentrat erzielte n Resulrat e gingen in die Ausw ertung ein , Die weitere Aufschliisselung des in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisses zeigt, daIS die zusatzliche Anwendung des IgM-TPHA-T die Ausbeute an IgM-positiven Pati ent enseren deutlich erhoht (T ab. 3). Diese Beobachtung gilt vor aHem fiir die Falle mit negativem Ergebnis in der KBR. Hier ergab sowohl die Anwendung des IgM-TPHA-T allein (Testkombination Nr. VII) od er in Kombination mit dem IgM- FTA-Ab s-T (Nr. IV) eine hohere Zahl positiver Ergebnisse als der IgM -FTA -Abs-T allein (Nr. VI). Bei gleichzeitig positiver KBR fiihrte der IgM-TPHA-T (Nr. III) etwas haufiger zu einern IgM-N achweis als der IgM -FTA- Abs-T (Nr. II) oder beide IgM-Teste zusammen (N r. I). Die KBR-Titer war en besond ers ho ch (66,7% > 1 :20) in den T estkornbina -

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Tab clle 3. Auswcrtung von positivcn Testergebnissen mit KBR, IgM-FTA-Abs-T und IgM-TPHA-T in verschiedenen Testkombinationen * Testkombinationen

Zahl der positiven Reaktionen

KBR-Titer

I KBR + II KBR + III KBR IV V KBR VI VII

9 9 12 10 4 2 4

66,7% > 1:20 66,7% > 1:20 50% > 1:20

<.

IgM-FTA-Abs-T + IgM-TPHA-T IgM-FTA-Abs-T + IgM-TPHA-T IgM-FTA-Abs-T + IgM-TI'HA-T IgM-FTA-Abs-T

IgM-TPH A-T

75%

< 1:20

Aufschlusselung der Testergebnisse von Tab elle 2 mit 36 Luetikerseren

tionen Nr. I und II; etwas ni edr igere Titer (50% > 1:20) wurden in der Kornbinati on Nr. III beobachtet und ub erwi egend sehr niedrige KBR-Titer (75% < 1 :20) erg aben sich bei negativem Au sfall beider IgM-Teste. Diskussion Die untersuchten Seren sta mmten iiberw iegend (63% ) von Pat ienten mit einer angeblich fr iiher di agno stizierten Lues. Zum Zeitpunkt der Unt ersuchung waren in den meisten Fallen kein e klin ischen Syrnptome einer ak tiven In fekti on bekannt. Da von vielen Pat ienten abe r keine gena uen Angaben tiber eine friihe re Therap ie gernacht werden konnten, stellre sich die Fra ge nach der Beh andlungsbediirftigkeir. Sie sollte durch das Ergebn is der Unte rsuch ungen auf spez ifische IgM -Antikorper gegen T. pallidum eine Antwort finden. Wir selbst gaben auch bei positi vern Ausfall der IgM- Teste keine Stellungn ahme zur Behandlungsbedurftigk eit ab, d a in der Regel die ana mnest ischen und klinischen Daten unzureichend waren und wiederholt e Serumeinsendungen zu eine r Kontrolle der Antikorperkinet ik ausblieben. Bei Auswertung der lab ordi agn ostischen Te ste fallt auf, daf der IgM -FTA-Abs- T haufig (44%) po siti v ausfiel (Ta b. 1). In einer deutlich geri ngeren Anz ahl (19,5%) waren sowohl IgM-FTA-Abs-T wie auch KBR positiv (Tab . 1). In d ieser Gruppe waren die KBR-Titer in der Mehrzahl hoch, wohingegen d ie KBR-T iter bei n egativen IgM -FTA-Abs-T deutlich niedr iger lagen (T ab. 1). Nur in der G ru ppe mit posiriven IgM -FTA-Abs-T und hoh ern KBR-Titer (> 1:20) befanden sich in unserem Pati entengut faile mit klini sch symptomatischer Syphilis des Erwachsenen oder N eugeborenen. Diese Befunde konnten darauf hinweisen, daR der N achweis spezifischer Antikorper im IgM-FTA-Abs-T nur bei gleichzeitig positiver KBR ein Fortbestehen der Infektion und die N otwendi gkeit einer antiluetischen Therapie aufzeigt (2, 6, 7). Aile Patienten, bei den en wir nur einen po sitiv en IgM -FTA-Abs-T festsrellten , zeigten dem gegen iiber keine Symptorne einer aktiven In fekt ion. Hier erscheint es zweifelhaft, ob der spezifische IgM-Nachweis noch im Sinne einer Behandlungsbediirftigkeit gedeute t werd en kann. Alternativ war e d ie M oglichkeit einer langeren Persistenz von IgM-Antiko rpern bei kl inisch ausgeheilte r Lues zu erwagen (3,4, 7). Auf die besondere Notwcndigke it, die ses Problem einer mo glicher-

Nachweis von spezifischem IgM in Luetikerseren

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wei se sehr langen IgM-Persi stenz insbe sondere auch n ach Zweitinfektionen eingeh end zu untersuchen, wurde scho n friiher hin gewie sen (4). Ergebnisse aus solchen langfri st ig an gelegten Untersuchungen sind Vor aussetz un g fiir die Beurteilung von Patienten, bei denen nur spezifische IgM- Ami korper oh ne einen we ireren Anh alt einer noch aktiven Infektion n achgewiesen werdcn , In einer kleineren Patiente ngru ppe brac hte de r IgM-TPHA-T no ch h aufiger ein po sitiv es Ergebnis als der IgM -FTA-Ab s-T (T ab. 2). Dieses gute Ergebnis im IgMTPHA-T liels sich nu r d an n erzielen, wenn mit dem IgM-Konzentrat gear beitet wurde. Bei den meisten Seren besta nd ein e gute Ober ein st immung zw ischen beiden IgM -Testen sowohl bei posiriver wie auc h neg.ui ver KBR (Tab. 3). Weitere Untersuchungen werden zeigen miissen , ob dem IgM-TPHA-T eine zusat zlich e di agnostische Bedeutung durch z. B. h oh ere Empfindlichkcit zukommt, oder ob dieser T est im wesent lichen nur eine Besta tig ung der mit dem Flu or eszen ztest ermittelten Ergebn isse liefert. Da n ach unserer Erfahru ng der IgM-TPHA-T zusatzlich e Sicherheir in der IgM-Diagnostik bietet, mochten wir sein e routincmaiiige Anwendung mit dern absorbiert en IgM-Kon zent rat empfehlen. Der iiberraschend haufige N ach weis von spezifischem IgM wi rft di e Frage nach der Sicherheit der einges etzten M eth oden auf. Insbesonder e wu rd c friiher diskuticrr, daf die Anwesenheit von Rh eumafaktoren falschlich zu einem positiven Erge bnis fuhren kann (4). Wir h ab en uns vor dieser Gefahr der Fehlinterpreration von IgM vTesten dadurch geschiitzt, daf wir eine gute T rennun g von IgG und IgM anstrebten (Abb. 1) und nur Frakt ionen mit hohem IgM -Geh alt ohne erk en nbare IgG -Kontam ination zur He rstellu ng des Kon zent rats verwendet en. Z usa tzliche Sicherh eit bei un serer A uswertung ga b uns di e Beob achtung, daiS die ein gesetzren Trepo nemen und die sensi bilisiert en Erythrozyten keine na chweisbaren M engen von Kan inch en-IgG a uf ihr cr Ob erflachc tr ugen. Literatur 1. Brau n-Falco, O. und R. Scherer : Diagnost ische Bedeutung der Luesserologie. Dt sch. med. Wschr. Pr axis-Foru m 104 (1979) 275-277 2. Burkhar dt, F. : Der heut ige Stand der sero logis chen Lucsd iagnostik. Klin ika rzt 9 (1980) 197-205. 3. DGHM-Standards : Sero diagnostik der Syph ilis (Lues). Z bI. Bak r. H yg., I. Abt. Orig, A 250 (1981) 1-8 4. Mii hlenbe rg, W., G. M idler-Prasuhn und W. H oph en : M oglichkeiten und Grenzen des IgM- FTA-Abs-Tests in de r R outi ne-Serodi agno stik der Lues. Z bI. Bakt. Hy g., I. Abt. Or ig. A 249 (1981) 104- 123. 5. M iiller, F. : Methoden mod ern er Syphilis-Sero diagnostik und Int erpretation der Untersuchungsbefundc. Dtsch. ArztebI. 74 (1977) 1851-1856 6. M iiller, F. : Serodiagnostik der Syphilis aus der Sicht des Immunologen . Der Hautarzt 28 (1977) 167- 172 7. M iiller, F.: Ocr 19 S (lgM -)FTA-Ahs-T est in der Serodiagnost ik der Syphilis. Immun. ln fekt, 10 (1982) 23-34 8. Sch midt, B. und A. Luger: Eine ne ue M ethode zum serol ogischen N achw eis von Reininfektio nen mit Trep onema pallidu m. Ocr Hautarzt 30 (1979) 662-665

Prof. Dr. med. V. Brad e und Dipl . BioI. H . U. Beu scher, Institut fiir Klinische Mi krobiologic und Infektionsh ygiene der Universi rar Erlangcn -Niirnberg, Wass ertur mstr. 3, 0-8520 Erla ngen