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Estudio ultraestructural de las alteractiones locales inducidas en raton blanco por el veneno de Bothrops picadoi de Costa Rica
0041-OIOI/84 ß .00+ .00 B 1984 PerBamon Pros Ltd.
Tatic»n, Vol . 22, No. 2, 1>P. 301-305, 1984 . Printed in Great Brhain .
SHORT COMMUNICATIONS ESTUDIO ULTRAESTRUCTURAL DE LAS ALTERACIONES LOCALES INDUCIDAS EN RATON BLANCO POR EL VENENO DE BOTHROPS PICADOI DE COSTA RICA OLGA ARROYO y LUIS CERDAS Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologia, Universidad de Costa Rica, Costa Rica (Accepted for publication 27 September 1983)
Aaeovo and L. CERDAS . Ultrastructural study of local lesions induced by Bothrops picadoi venom in mice. Taxiton 22, 301- 305 1984 . - The pathogenesis of local lesions induced by Bothrops picadoi venom was studied at the electron microscopic level. White mice were injected i.m. with 100 Ftg of venom. A strong hemorrhagic action was the earliest and most prominent local effect observed in this study. In skeletal muscle fibers, rupture of the sarcolemma was observed and myofibril structure was drastically affected, showing amorphous masses of myofilaments . Myelin layers in many axons were disorganized . O.
EN COSTA RICA hemos realizado estudios sobre la patogenia de los fenomenos involucrados en la accion local indutida por los venenos de las serpientes pertenetientes a la familia Viperidae y en particular al género Bothrops a nivel de microscopia de luz, microscopia electronica y determinacion de los niveles séricos de la enzima creatina fosfoquinasa (CFQ) (GtrrliRREZ et al., 1980; ARROYO y GLrr>~RREZ, 1981) . Estos estudios han sido motivados por investigaciones previas que muestran la relativa incapacidad de los antivenenos para neutralizer los efectos locales tanto en animales de experimentacion como en humanos (Mlrrrox, 1954; HOMMA y Tu, 1970; GuTI>3RREZ et al., 1981 ; MCCOLLOUGH y GENKARO, 1970); y la consecuente ausencia de métodos mâs sensibles y precisos, que pelmitan acelerar y fortalecer el tratamiento en los patientes que safran accidente ofidico . El veneno de Bothrops picadoi, induce un cuadro local muy semejante al descrito para Bothrops asper (terciopelo) (GUTIÉRREZ et al., 1980; ARROYO y GUTI$RREZ, 1981), pero muestra una actividad mayor, fénomeno que ha sido demostrado tanto en la determinacion en piel, como en la reaccion histolo~ca observada en estudios realizados anteriormente (HOMMA y Tu, 1971; GuTI>rRREZ y CHAVES, 1980). En el presente informe se utilizo veneno de la coleccion del Instituto Clodomiro Picado liofilizado mantenido a - 70°C, lote B.P. 2 - 78, ratones blancos los cuales fueron inoculados i.m. con 100 ug de veneno en 0.1 ml de solucion salilina amortiguada a pH 7,2, en la parte lateral del muco derecho (mtisculo biceps femoris) . Los animales se sacrificaron mediante inhalacion de cloroformo a los 15 min, 30 min, 1 hr, 2 hr, 3 hr después de la inoculacion . El tejido se fijo en glutaraldehido al 2,5% en amortiguador de fosfato efectuândose luego deshidratacion alcoholica seriada y finalmente se realizo infiltration en Resina Sparr (formula Tabb) . Los cortes se realizaron con el ultramicrotomo MT-2B y se observaron al Microscopio Electronico HU-12A Hitachi del Centro de Microscopia 301
302
Short Communications
Electrbnica de la Universidad de Costa Rica . Al anâlisis ultraestructural, 1S minutos después de la inoculation riel veneno, las membranes plasmâticas se encuentran interrumpidas en muchas de las fibres musculares, ahn en aquellas en que las miofibrillas conservas su integridad estructural y solamente se observa espaciamiento entre los conjuntos de miofibrillas, posiblemente como resultado riel edema intracelular .. Es notable la dilatation riel reticulo sarcoplâsmico y la aparicibn de detritos extrecelulares . La presencia de mares amorfas como resultado de la desorg ani~A~ ibn y destrucci8n de algunas fibres musculares se aprecia a los cuarenta y cinco minutos después de la inoculation . Las células endoteliales de los vasos capilares muestran un proceso de vacuolizacidn citoplasmAtica progresiva que culmina ~on la pérdida total de la integridad celular de la mayoria de vasos presentes en et ârea afectada (Fig . 1). Se observas grupos de mitocondrias frecuentemente alrededor de las fibres musculares y de los vasos capilares daiïados . Ademâs se encontrb dalio sobre las capas de mielina de los axones (Fig. 2). El modo de action de las toxines mionecrbticas y hemorrAgicas presentes en los venenos de Bothropspicadoi y B. riper no se conoce . Sin embargo los estudios ultraestructurales efectuados (ARROYO y Gtrrl>3RREZ, 1981 ; presente trabajo) permiten proposer posibles morios de acciGn de las miotoxinas presentes en dichos venenos . Las tempranas alteraciones en la continuidad de la membrane plasmâtica de las fibres musculares sugiere que dichos venenos afectan directamente al sarcolema. Dicho efecto inducir(a un desequilibrio en et ambiente intracelular y explicarta ciertas alteraciones observadas, taies como la proste dilatation riel reticulo sarcopl:3smico y la presencia de organelas celulares en et espacio extracelular. También es conocido que los efectos locales inducidos por los venenos de serpientes riel género Bothrops de Costa Rica son de diferente magnitud (GUTI$RREZ y CI-IAVES, 1980), siendo et veneno de B. picadoi et que presenea la mis fuerte actividad hemorrâgica. Investigaciones ~on otros venenos han descrito dos posibles mecanismos para la hemorragia: rexis y diapédesis (OSIiAKA et al., 1971 ; BJARNASON y Tu, 1978 ; OwlvsY et al., 1978). Nuestros resultados seiïalan que et veneno de B. picadoi posiblemente induce hemorragia por rexis ya que las lesiones ocurren sobre las células endoteliales de los vasos capilares permitiendo la salida profusa de eritrocitos . En un tiempo relativamente corto, de aproximadamente dos horas después de la inoculation de este veneno, es dificil encontrar vasos capilares que no estén fuertemente daiïados . Finalmente se observo que et veneno de B. picadoi afecta las capas mielinicas de los axones localizados en nervios periféricos . Este hecho puede eherar drâsticamente las funciones sensoriales y motoras relationslos ~on dichas fibres nerviosas, dado que la destruction de las capas de mielina afecta las propiodades biceléctricas caracteristicas de la membrane axonica. Este fenomeno podria ester también relacionado ~on degeneracion de los axones correspondientes, presentando la interrogante de si este veneno tonfiese toxines ton action directe sobre et tejido nervioso, o si por et contrario, las alteraciones observadas en los nervios periféricos son et resultado indirecto de la action riel veneno . Agrndecimientas - Nuertra ~atitud al Doctor JosE M~eiw Gvr~xeez, por sus sugerencias en la revision riel manuscrito ; al personal riel Instituto Clodomiro Picado quienes con sua constantes apories refuer7sn e impulsas sucettes laborer . A la Viarrector(a de Inveatigacion y Uniriad de Microscopie Flectronica de la Univeraidad de Costa Rica po~ permitir la reali7acion riel presente trabajo .
FIG. 1 . EFecro I~aHORR~,cICO . Micrografia electrdnica que presenta la ruptura de una cElula endotelial de la pared de un vaso capilar ; 2 br después de la inoculacidn . Scale 1 ~m . FIO. 2. DESOROAMZACI6N DE CAPAS MIEL1PiICAS DE AXONES DE NERVIOS PERIFERICOS . Obsérvese en la presente micro~afia electrdnica desorganizacidn de las capes mielinicas rn un axon, 43 minutos después de la inoculacidn del veneno . Scale 0.5 pm .
Short Communications
303
REFERENCIAS M. (1981) AwtoYO, O. y Gvnt3ateez, J. Eatudio ultraeatructural de la mionxrosis indudda en raton por et veneno de terciopelo (Bothrops aspen) de Costa Rica. Toxican 19, 733. BJwwvwsoN, J. B. y Tu, A. T. (1978) Hemorrhagic t070ns from weatan diamondback rattlesnake (Crotahrs atrax) venom: isolation and characterization of five toxins and the role of zinc in hemorrhagic toxin e. Blocharristry 17, 3393 . Gvrt~eaz, J. M. y Cxwves, F. (1980) Efectos proteolttico, hemorrégico y mionxrédco de los venenoa de serpientea coetarricensea de loo géneros Bothrops, CY+ntahrs y Lachesis. Toxican li, 313. GuTnEanuz, J. M. y Bot.wt"vas, R. (1980) El problems de los efatos hemorrâpco y mionecr8tico por mordedura de serpiente en et Continente Americano. Bolrt of. Sortit. 1°~rtam. i9, 149. Gvt~xAez, J. M., AtutoYO, O. y Bot.wnros, R. (1980) Mionecrosis, hemorrhaga y edema inducidos por et veneao de Bothrop~s aspen en raton blanco. TaYlrnn li, 603 Girrra4np~, J. M., Cttwves, F., Hot,wt"vos, R., Cttnnws, L., Rorws, E., ARROYO, O. y PoxTa.Lw, E. (1981) Neutralizacidn de los efectos locales del veneno de Bothrops aspen por un antiveneno polivalente. Toxirnn 19, 493. Ho~tw, M. y Tu, A. T. (1970) Antivenin for the treatment of local tissue damage due to envenomation by Southeast Aaixn snakes . Ineffectiveness in the prevention of local tissue damage in mice after enveaomation . Am. J. trop. Med. Hyg. 1!, 880. Horntw, M. y Tu, A. T. (1971) Morphology of local tissue damage in experimental snake envenomation . Br. J. exp. Path. 32, 538. JutE~mz, E. y GwRCiw, I . (1969) Anâliais de 86 csaoa de ofidismo en ninos. Revta med. Hasp. rte. Ninas 4, 91 . MtNTON, S. (1954) Polyvalent andveain in the treatment of experimental snake venom poisoning. Am. 1. trop. Med. Hyg. 3, 1077 . McCot.LOUatt, N. C. y Ci~nvwRO, J. F. (1970) Treatment of venoms snakebite in the United States . Clin . TaYlc. 3, 483. Ottswxw, A., T"Y"NwcHt, T., OstoRt~wTOe, T. y MuRwrw, R. (1971) Purification and characterization of the hemorrhagc principles in the venom of Tümerrserus,Jlavoviridis. In: Tadrts of Anima! and Plant Origin, Vol. 1 . p. 369 (DE VRQ_S A. and Koct~tvw, E., Eds.) . New York : Gordon and Breach . OwxeY, C., Cw~teot+, D. y Tu, A. (1976) Isolation of myotoxic component from rattlesnake (Crotales virldls viridis) venom. Electron microscopic analysis of muade damage . Am. J. Path. 8S, 149 . OWNHY, C. L., BJA1tNASOti, J. B. y Tu, A. T. (1978) Hemorrhagic toxins from rattlesnakes (Crotales atrax) venom. Pathogenesis of hemorrhage induced by three purified toxins. Am . 1. Path . 93, 201.
Tatic»n, Vol . 22, No. 2, 1>P. 301-305, 1984 . Printed in Great Brhain .
SHORT COMMUNICATIONS ESTUDIO ULTRAESTRUCTURAL DE LAS ALTERACIONES LOCALES INDUCIDAS EN RATON BLANCO POR EL VENENO DE BOTHROPS PICADOI DE COSTA RICA OLGA ARROYO y LUIS CERDAS Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologia, Universidad de Costa Rica, Costa Rica (Accepted for publication 27 September 1983)
Aaeovo and L. CERDAS . Ultrastructural study of local lesions induced by Bothrops picadoi venom in mice. Taxiton 22, 301- 305 1984 . - The pathogenesis of local lesions induced by Bothrops picadoi venom was studied at the electron microscopic level. White mice were injected i.m. with 100 Ftg of venom. A strong hemorrhagic action was the earliest and most prominent local effect observed in this study. In skeletal muscle fibers, rupture of the sarcolemma was observed and myofibril structure was drastically affected, showing amorphous masses of myofilaments . Myelin layers in many axons were disorganized . O.
EN COSTA RICA hemos realizado estudios sobre la patogenia de los fenomenos involucrados en la accion local indutida por los venenos de las serpientes pertenetientes a la familia Viperidae y en particular al género Bothrops a nivel de microscopia de luz, microscopia electronica y determinacion de los niveles séricos de la enzima creatina fosfoquinasa (CFQ) (GtrrliRREZ et al., 1980; ARROYO y GLrr>~RREZ, 1981) . Estos estudios han sido motivados por investigaciones previas que muestran la relativa incapacidad de los antivenenos para neutralizer los efectos locales tanto en animales de experimentacion como en humanos (Mlrrrox, 1954; HOMMA y Tu, 1970; GuTI>3RREZ et al., 1981 ; MCCOLLOUGH y GENKARO, 1970); y la consecuente ausencia de métodos mâs sensibles y precisos, que pelmitan acelerar y fortalecer el tratamiento en los patientes que safran accidente ofidico . El veneno de Bothrops picadoi, induce un cuadro local muy semejante al descrito para Bothrops asper (terciopelo) (GUTIÉRREZ et al., 1980; ARROYO y GUTI$RREZ, 1981), pero muestra una actividad mayor, fénomeno que ha sido demostrado tanto en la determinacion en piel, como en la reaccion histolo~ca observada en estudios realizados anteriormente (HOMMA y Tu, 1971; GuTI>rRREZ y CHAVES, 1980). En el presente informe se utilizo veneno de la coleccion del Instituto Clodomiro Picado liofilizado mantenido a - 70°C, lote B.P. 2 - 78, ratones blancos los cuales fueron inoculados i.m. con 100 ug de veneno en 0.1 ml de solucion salilina amortiguada a pH 7,2, en la parte lateral del muco derecho (mtisculo biceps femoris) . Los animales se sacrificaron mediante inhalacion de cloroformo a los 15 min, 30 min, 1 hr, 2 hr, 3 hr después de la inoculacion . El tejido se fijo en glutaraldehido al 2,5% en amortiguador de fosfato efectuândose luego deshidratacion alcoholica seriada y finalmente se realizo infiltration en Resina Sparr (formula Tabb) . Los cortes se realizaron con el ultramicrotomo MT-2B y se observaron al Microscopio Electronico HU-12A Hitachi del Centro de Microscopia 301
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Electrbnica de la Universidad de Costa Rica . Al anâlisis ultraestructural, 1S minutos después de la inoculation riel veneno, las membranes plasmâticas se encuentran interrumpidas en muchas de las fibres musculares, ahn en aquellas en que las miofibrillas conservas su integridad estructural y solamente se observa espaciamiento entre los conjuntos de miofibrillas, posiblemente como resultado riel edema intracelular .. Es notable la dilatation riel reticulo sarcoplâsmico y la aparicibn de detritos extrecelulares . La presencia de mares amorfas como resultado de la desorg ani~A~ ibn y destrucci8n de algunas fibres musculares se aprecia a los cuarenta y cinco minutos después de la inoculation . Las células endoteliales de los vasos capilares muestran un proceso de vacuolizacidn citoplasmAtica progresiva que culmina ~on la pérdida total de la integridad celular de la mayoria de vasos presentes en et ârea afectada (Fig . 1). Se observas grupos de mitocondrias frecuentemente alrededor de las fibres musculares y de los vasos capilares daiïados . Ademâs se encontrb dalio sobre las capas de mielina de los axones (Fig. 2). El modo de action de las toxines mionecrbticas y hemorrAgicas presentes en los venenos de Bothropspicadoi y B. riper no se conoce . Sin embargo los estudios ultraestructurales efectuados (ARROYO y Gtrrl>3RREZ, 1981 ; presente trabajo) permiten proposer posibles morios de acciGn de las miotoxinas presentes en dichos venenos . Las tempranas alteraciones en la continuidad de la membrane plasmâtica de las fibres musculares sugiere que dichos venenos afectan directamente al sarcolema. Dicho efecto inducir(a un desequilibrio en et ambiente intracelular y explicarta ciertas alteraciones observadas, taies como la proste dilatation riel reticulo sarcopl:3smico y la presencia de organelas celulares en et espacio extracelular. También es conocido que los efectos locales inducidos por los venenos de serpientes riel género Bothrops de Costa Rica son de diferente magnitud (GUTI$RREZ y CI-IAVES, 1980), siendo et veneno de B. picadoi et que presenea la mis fuerte actividad hemorrâgica. Investigaciones ~on otros venenos han descrito dos posibles mecanismos para la hemorragia: rexis y diapédesis (OSIiAKA et al., 1971 ; BJARNASON y Tu, 1978 ; OwlvsY et al., 1978). Nuestros resultados seiïalan que et veneno de B. picadoi posiblemente induce hemorragia por rexis ya que las lesiones ocurren sobre las células endoteliales de los vasos capilares permitiendo la salida profusa de eritrocitos . En un tiempo relativamente corto, de aproximadamente dos horas después de la inoculation de este veneno, es dificil encontrar vasos capilares que no estén fuertemente daiïados . Finalmente se observo que et veneno de B. picadoi afecta las capas mielinicas de los axones localizados en nervios periféricos . Este hecho puede eherar drâsticamente las funciones sensoriales y motoras relationslos ~on dichas fibres nerviosas, dado que la destruction de las capas de mielina afecta las propiodades biceléctricas caracteristicas de la membrane axonica. Este fenomeno podria ester también relacionado ~on degeneracion de los axones correspondientes, presentando la interrogante de si este veneno tonfiese toxines ton action directe sobre et tejido nervioso, o si por et contrario, las alteraciones observadas en los nervios periféricos son et resultado indirecto de la action riel veneno . Agrndecimientas - Nuertra ~atitud al Doctor JosE M~eiw Gvr~xeez, por sus sugerencias en la revision riel manuscrito ; al personal riel Instituto Clodomiro Picado quienes con sua constantes apories refuer7sn e impulsas sucettes laborer . A la Viarrector(a de Inveatigacion y Uniriad de Microscopie Flectronica de la Univeraidad de Costa Rica po~ permitir la reali7acion riel presente trabajo .
FIG. 1 . EFecro I~aHORR~,cICO . Micrografia electrdnica que presenta la ruptura de una cElula endotelial de la pared de un vaso capilar ; 2 br después de la inoculacidn . Scale 1 ~m . FIO. 2. DESOROAMZACI6N DE CAPAS MIEL1PiICAS DE AXONES DE NERVIOS PERIFERICOS . Obsérvese en la presente micro~afia electrdnica desorganizacidn de las capes mielinicas rn un axon, 43 minutos después de la inoculacidn del veneno . Scale 0.5 pm .
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REFERENCIAS M. (1981) AwtoYO, O. y Gvnt3ateez, J. Eatudio ultraeatructural de la mionxrosis indudda en raton por et veneno de terciopelo (Bothrops aspen) de Costa Rica. Toxican 19, 733. BJwwvwsoN, J. B. y Tu, A. T. (1978) Hemorrhagic t070ns from weatan diamondback rattlesnake (Crotahrs atrax) venom: isolation and characterization of five toxins and the role of zinc in hemorrhagic toxin e. Blocharristry 17, 3393 . Gvrt~eaz, J. M. y Cxwves, F. (1980) Efectos proteolttico, hemorrégico y mionxrédco de los venenoa de serpientea coetarricensea de loo géneros Bothrops, CY+ntahrs y Lachesis. Toxican li, 313. GuTnEanuz, J. M. y Bot.wt"vas, R. (1980) El problems de los efatos hemorrâpco y mionecr8tico por mordedura de serpiente en et Continente Americano. Bolrt of. Sortit. 1°~rtam. i9, 149. Gvt~xAez, J. M., AtutoYO, O. y Bot.wnros, R. (1980) Mionecrosis, hemorrhaga y edema inducidos por et veneao de Bothrop~s aspen en raton blanco. TaYlrnn li, 603 Girrra4np~, J. M., Cttwves, F., Hot,wt"vos, R., Cttnnws, L., Rorws, E., ARROYO, O. y PoxTa.Lw, E. (1981) Neutralizacidn de los efectos locales del veneno de Bothrops aspen por un antiveneno polivalente. Toxirnn 19, 493. Ho~tw, M. y Tu, A. T. (1970) Antivenin for the treatment of local tissue damage due to envenomation by Southeast Aaixn snakes . Ineffectiveness in the prevention of local tissue damage in mice after enveaomation . Am. J. trop. Med. Hyg. 1!, 880. Horntw, M. y Tu, A. T. (1971) Morphology of local tissue damage in experimental snake envenomation . Br. J. exp. Path. 32, 538. JutE~mz, E. y GwRCiw, I . (1969) Anâliais de 86 csaoa de ofidismo en ninos. Revta med. Hasp. rte. Ninas 4, 91 . MtNTON, S. (1954) Polyvalent andveain in the treatment of experimental snake venom poisoning. Am. 1. trop. Med. Hyg. 3, 1077 . McCot.LOUatt, N. C. y Ci~nvwRO, J. F. (1970) Treatment of venoms snakebite in the United States . Clin . TaYlc. 3, 483. Ottswxw, A., T"Y"NwcHt, T., OstoRt~wTOe, T. y MuRwrw, R. (1971) Purification and characterization of the hemorrhagc principles in the venom of Tümerrserus,Jlavoviridis. In: Tadrts of Anima! and Plant Origin, Vol. 1 . p. 369 (DE VRQ_S A. and Koct~tvw, E., Eds.) . New York : Gordon and Breach . OwxeY, C., Cw~teot+, D. y Tu, A. (1976) Isolation of myotoxic component from rattlesnake (Crotales virldls viridis) venom. Electron microscopic analysis of muade damage . Am. J. Path. 8S, 149 . OWNHY, C. L., BJA1tNASOti, J. B. y Tu, A. T. (1978) Hemorrhagic toxins from rattlesnakes (Crotales atrax) venom. Pathogenesis of hemorrhage induced by three purified toxins. Am . 1. Path . 93, 201.