- Email: [email protected]
Mionecrosis, hemorragia y edema inducidos por el veneno de Bothrops asper en ratón blanco
Toxkoa. VoL 18, pp. 603-010. ® Peraamoa Peen Ltd 1990. Printed
0041-0101/90/1101-0603 502000
m Great Britain.
MIONECROSIS, HEMORRAGIA Y EDEMA INDUCIDOS POR EL VENENO DE BOTHROPS ASPER EN RATEN BLANCO J.
M. GUTI$RRFZ, OLGA ARROYO y R. Bol.nfvos
L3stituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologie, Universidad de Costa Rica, Ciudad Universitaria, Costa Rica (Accepted for publication 27 May 1980) J. M. Gtmga9;PZ, OLGA ARttovo and R. BoLaAos. Myonecrosis, hemorrhage andedemainduced by Bothrops caper venom in white mice. Toxicon 18, 60310,1980.-Pathogenesis of the myonecrotic, hemorrhagc and edema-forming effects in white mice inoculated with Botlvopa riper venom was studied at different time intervals by means of light microscopy, determination of serum levels of the etlzyme creatinephosphokinase (CPK), and evaluation of edema. Although the three effects were evident in the first hour, theirdevelopment was relatively independent. Myonectoric activity reached its maximum levels in the first 3 hr, as judgod by serum CPK. This indicates that myonecrotic toxins have a very rapid action on mundefibers, after which CPK levels decrease to near normal values 24 hr after venom inoculation. Histological studies showed severe myonxroais at 3, 6, 9, 12 and 24 hr, characterized by myolytic and coagulative necrotic fibers mixed with normal fibers. Maximum hemorrhagc effect was observed between 9 and 12 hr, whereas at 6, 9, 12 and 24 hr there was an intense polymorphonudear leucocyteinfiltration.On the older hand, l hr aftervenom injection there eras a local edema of 44 %, reaching a maximum value of 70 ~ within the first 24 hr, decreasing afterward. This edema is more prolonged than that induced by Apkistrodon piscioorous or Trimeresurua depans venoms . This could have important clinical implications since local swelling oontributea to tissue compression and is related to other physiological alterations. One week after venom inoculation therewenfibroblasts, fragments of necrotic muscle fibers,and amononuclear cell exudate. At this time, we did not observe hemorrhagic areas. Determination of serum levels of CPK wind be a useful and powerful technique in order to quantify muscle tissue destruction due to snake bite. Sinceonly ecaaty hemorrhagic andnecrotic areas wen observed in heart muscle,thedrastic and rapid increase in CPK levels mainly reflected skeletal muacknecrosis . CPK determination is a simple and quick laboratory technique that should be used to evaluate muscle necrosis and to improve treatment in snake venom poisoning.
INTRODUCCION
LA SERPIENTE Bothrops asper, llamada
popularmente `terciopelo' en Costa Rica, es la m~s importante desde el punto de vista de salad pnblica en este pala . Algunos estudios han demostrado que esta especie es responsable de alrodedor de185% de las mordeduras en las que se ha identificado el ofidio agresor (VA1 .1,1:1o-FR1uRE, 1967 ; J1M~xez y GARCin, 1969). Su veneno provoca, ademâs de efectoa sistémicos, un severo y complejo cuadro en el sitio aliatbmico de la mordodura, caracteriTado por fenbmenos hemorrtlgicos, mionecr6ticos e inflamatorios (hM>Sxsz y G~lede,1969 ; GvT1~AAP7 y CxwBS,1980). Le severidad del cuadro, junto a la aparente ineficacia de los antiveneaos para neutralizarlo (M~LRr~Iv;1978), hace que mochas veoes ocasione secuelas irreversibles que van desde la pi tdida de tejido hasta la amputaci6n de la extremedad afectada. Se ha estudiado el efecto que produce este veneno sobre el tejido muscular de rat6n (Tu y HOMMA, 1970 ; HOMMA y Tu, 1971 ; GU'l'I$RREZ y CHAVFS, 1980) modiante observaciones efectuadas a lln solo intervalo de tiempo después de la inoculaciGn : 24 hr en los dos primeros 603
604
J. M. GUTIÉRREZ, OLGA ARROYO y R. HOLAfYOS
casus y 6 hr en el tercero. En dichos estudios se observb un severo cuadro de necrosis, principahnente miolitica, con intensa hemorregia y un fuerte cuadro infiamatorio ; sin embargo, no conocemos datos sobre la dinâmica de los eventos que se desarrollan. Por otra parte, en la evaluacibn de la magnitud de la necrosis muscular han sido empleados principahnente dos criterios : (a) la observacibn microscôpica con semicuantificaciGn del efecto por medio de cruces (e.g. HoMMn y Tu, 1971) y (b) la evaluaci6n macrosc6pica basada en la cuantificacidn del volumen de tejido necrdtico (e.g. FUKAMI, 1978). El primer par~metro presenta el problema de que mediante el anâlisis microsc6pico es muy diHcil formarse una idea del cuadro global que se estudia, en tanto que la valoracibn macroscôpica tiene el inconveniente de que es muy dificil identificar tejido muscular necrbtico si no es mediante el anâlisis microscbpico. La determinacibn de los niveles séricos de la enzima creatinafosfoquinasa (CFQ) ATP creatina fosfotransferasa ; EC 2.7.3.2.) se ha utilizado en la evaluaciGn de alteraciones de muscuao esquelético, mûsculo cardiaco y cerebro (CANTAROW y TRUMPER, 1975). Esta determinaciôn ha sido muy ütil en el diagnbstico de la distrofia muscular progresiva, asi como de otras miopatias ; adem~s, se le utiliza en el diagnc5stico de infarto de miocardio y de trastornos que involucren destrucciôn de tejido cerebral . GENNARO y WATT (1978), al estudiar los perfiles séricos de ciertas enzimas luego de inoculaciones de veneno de Crotales adamanteus seguidas de la administracibn de antiveneno, observaron elevaciones en los niveles de CFQ, atribuyéndolos fundamentalmente a la destrucciôn de müsculo esquelético, dado que en tales circunstancias el examen histoldgico del corazGn no mostrô daiïos evidentes. En el presente trabajo pretendemos estudiar la secuencia de los eventos locales (mionecrosis, hemorragia y edema) provocados por el veneno de Bothrops asper en ratdn. También se pretende utilizar los niveles séricos de la enzima CFQ como lndice cuantitativo de la necrosis de mûsculo esquelético provocado por este veneno.
MATERIAL Y METODOS Se utilizd veneno de B. asper de la zona Atléatica de Costa Rica, obtenido en nuestro labostorio, liofilizedo y conservado a -70°C (loteBAA 1-79). Es una rr~zclade veneno de unagran cantidad de ejemplares prooedentes de dicha regidn . Ralones bhmcos Wobster, entre 18 y 20 gde peso,fueron inoculados intramuscularmente en el muslo wn SO pg de veneno disuelto en 0~1 ml de solucidn selina amortiguados a pH 7~2. Previo a su inoculacidn, la solucidn se eateriGzd por filtraâdn en membrane de 0~22Ean de poro. Pas el anéliaia histoldgico ae tonuuron muestss de ooszdn, cerebro y miSsculo esquelético del muslo a los siguieales intervalos : 1, 3, 6, 9,12 y 24 hr y 1 eemana . Todos los eatudios histoldgicos ae hicieron por triplicado. Las mueatras se 6jaron en formalisa al 10'/ a t~pestus ambiente y fueron tstadas tn forma conventional pas su posterior ooloracidn cos hematoxilina eusins. Se efectuaron experimentos costrol inoculando 0~1 ml de solucidn ealina en idénticaa oondicionea La CFQ ac determind en stones alosque se inoculd veseno en lasmismas condicionas deecritaspas losestudios histoldgicos ;a los mismos intervalas de tiempo se obtuvo de la cola de cada stdn un capilar de sangre . La CFQ ac carantiticd colorimétricamente mediante la medicidn de la craatina formada en la reaocidn ADP/fosfocreatisa (Si~a Tecbnical Bulletin No. 520). Los tontrolea fueron inoculados con 0~1 ml da solucidn salina . EI m5mero de animales pas cada experimento varidentre8 y 13 y pas loscontroles ac emplearon 3. La relacidn dosis-reapuesta se obtuvo inoailando, en grupos de 10 stones, les siguientes cantidadea de veneno : 10, 20, 30, 40 y SO Pg intramuscularmente. Tres horss despub se sasgcaron de la cola y se cuantificd los nivales de CFQ. H edema se cuentißod de awerdo al método y Yesux~w~ et al. (1976} Cuarcata y dnto stones fueron inoculados eo k pata trasera deracba oon 60 Ng (ea 30 pl) de venmo y oon 30 pl de sohrcion salina en la pata izquiada.Grupos de S ratones fseron saa~iScados, sus pataa cortadas a la ahus da la articulacids y pesades ea balanrs analitica a los siguieatas intervalos de tiempo :1,3, 6, 9y 12 hr y 1, 3, Sy 7dias. El edemase expresd camo el aummto ea pornentaje de peso de la pata derecha en relaacüdn con la izquierde.
1 . EPBCaO MIONECAOIICO DE SO /!g DE VENENO DE B. C13j1Cr G hr DESPUÉS DE LA INOCULACIbN . Se observan fibres de aspocto miolitico y ooagulativo, predominando las primeras . TinciSn de Hematoxilina-Eosina FICi.
FIG. 2. EXTENSA HEMORRAOIA EN EL TEJIW MUSCULAR 9 }lr DESPUÉS DE LA INOCULA('I~N DE SO /4g DE VENENO DE B. asper.
Se observa también un grupo de leucocitos y fibres necr6ticas de aspecto coagulativo. Hematoxilina-Eosina.
FIC3. 3. FIHRAS MUSCULARES NECROI'ICAS DE TIPO MIOLfTICO Y EXUDADO INFLAMATORIO 12 hr DESPUÉS DE LA INOCULACItSN DE SO~Ig DE VENENO DE B. asper.
El exudado est~ compuesto principalmente de leucocitoa polimorfonucleares neutr6filos. Hematoxilina-Eosina. FIa . 4.
CUADRO MSTOL60IC0 UNA SEMANA DFSPUÉS DE LA iNOCULACION DE 50 /eg DE VENENO DE
B. asper. Se aprecian rectos de Sbras musoulares necr6ticas, fibras en regeneracidn, fibroblastos y un infiltrado in5amatorio mononuclear. No se observaron grupos de eritrocitos . Hematoxilina-Eosina.
607
Efectos Locales del Veneno de B. riper RESULTADOS
Aruilisis histol6gico Una hora después de la inoculacien se observe una mionecrosis leve sunque evidente, predominando las fibres de aspecto miolitico ; hubo poca hemorragia y un escaso exudado inflamatorio. La necrosis se hizo més evidente a las 3 hr, llegando a ser intensa a las 6, 9,12 y 24 hr ; en dichos cortes histolegicos se observaron fibres necreticas de aspecto miol{tiw y coagulativo, predominando las pimeras (Fig. 1). El cuadro hemorr$gico aumente a las 3 y 6 hr y llege a su mâximo nivel a las 9,12 y 24 hr (Fig. 2). A partir de las 6 hr se aprecie una gran infiltracien leucocitaria, la cual se mantuvo hasta las 24 hr, constituida casi exclusivamente por polimorfonucleares neutrefilos (Fig. 3). Una semana después de la inoculacien se observe un cuadro con gran cantidad de fibroblastos, rectos de fibres necreticas, fibres en regeneracien y un exudado de tipo mononuclear ; no se apreciaron ~reas hemorrâgicas (Fig. 4). En el cuadro No. 1 se resumen las observaciones histolegices m~s importantes del müsculo esquelético. En anâlisis del miocardio deje ver a las 6, 9,12 y 24 hr pequeiïas y escasas zonas de necrosis, asi como algunos pequeiïos focos hemorrâgicos ; ambos fenemenos desaparecieron una semana después de la inoculacien. En el examen histolegico del cerebro no se observaron alteraciones en ninguna oportunidad. Los controles de los tres tejidos estudiados mostraron una estructura histolegica normal, tipica de los mismos. Determinacidn de la creatinafosfoquinasa (CFQ) Los valores séricos de la CFQ se elevaron considerablemente desde la primer Nora y alcanzaron su m~ximo nivel a las 3 hr, disminuyendo paulatinamente basta valores cercanos a la normalidad a las 24 hr ;los controles no mostraron elevaciones significatives (Cuadro 1 ; Fig. 5). La curve de relacien log dosis-respuesta mostre un comportamiento lineal en un ambito entre 10 y 40 hg (Fig. 6). Determinaciôn del edema El edema se inicie inmediatamente después de inoculado et veneno . Una bore después de la inoculacien se observe un edema de144%, et coal sumente progresivamente haste llegar a un m~cimo de170'/ a las 24hr. Luego se produjo un descenso paulatino, llegando a valores del 17~ a los 7 dies (Cuadro 1 ; Fig. 7). DISCUSION
Pese a que et efecto local provocado por et veneno de serpientes en un fenemeno muy complejo, en él participan une Serie de eventos cuya patogenia posee cierta sutonomia. Lo anterior ha lido claramente demostrado en los venenos de dos especies de cascabel CÙADRO 1 . DESARROLLO DE LA MIONECROSiS. HEMORRAOIA Y EDEMA iNDUCmOS POR EL VENENO DE B . asper
Efecto
1 hr
3 hr
6hr
9hr
12 hr
24 hr
7 dias
Mionecrosis Hemorragia Exudado in9amatorio CFQ sErico (ui/litro~ Edema (%)
leve leve
moderada leve
intense moderada
intense intense
intense intense
inteasa inteasa
regeneracibn no hay
kve 4037 44
moderado 7606 53
intenso 4912 55
intenso 3019 59
intenso 875 65
intenso 442 70
intenso 17
Valores normales - 160 ui/litro .
608
J . M . GUTI$RREZ, OLGA ARROYO y R BOLAfYOS
..
S
dw 1r U
TIFMPO (AOilAS)
FIG. S . SECUENCIA DE LAS VARIACIONES DE LOS VALORES 3l5RICOS DE LA CFQ .
Las esferas representan las valores en Ios stones inoculados con veneno, los triângulos los valorea en los stones control y et tra2:o los promedios.
10
20
30
40
VSNSNO
(pg)
50
FIG. 6. CURYA DB RELACIbN L00 DOSIS-RESPUESTA DE LOS YALORES SÉRI003 DB LA CFQ.
EI trazo reproseata los promedioe.
Ffectos Locales dol Veaeno de
B. riper
loo 90
eo ~o SO t0 70 20 10 9
12
2"
901A9
7
S
7
DIA6 TIEMTO
FiO. i . I .URVA QUE MUESTRA EL DESARROLLO DEL EDEMA A CONSECUENCIA DE INOCULACIONES DE 60 /eg DE VENENO DE B . OJpel EN LA PATA TRASERA . Bl trazo repICdeRYB l03 PrOmOd10&
norteamericanas (Crotales atrox y Croialus viridis vlridis) al estudiarae la patogenia de los eïoctos mionecrc5tioos y hemorr6~co oon toxines purificadas (OwxsY, CAMERON y Tu, 1976 ; OWNHY, BJARNASON y Tu, 1978). En el caso de Bothrops asper, la din~mica de los efectos mionecrGticos, hemorr~gico y edematizante también se desarrolla con relativa independencia, siendo los fen6menos mionecr6tieo y edematizante los primeros en alcanzar un alto nivel. En el presente estudio fue notorio el hecho de que .la mionecrosis inducida por este veneno es un fenbmeno que se desarrolla muy r$pidamente después de la inoculacibn y que adquiere gran intensidad al cabo de pocas horns. Ello confirma las observaciones previas de Tu y HOMMA (1970) y de CYUTI$RREZ y CHAVES (1980) que muestran la gran magnitud de esta necrosis. Al estudiar el efecto del veneno de Trimeresurus flavouiridis en mûsculo de cobayo, Oxoxoot, HOMMA y HosFU (1964) observaron un efecto mionecrbtico de râpida aparici6n caracterizado, a nivel histol6gico, por fibres miolltica. Dicho cuadro concide bastante con el originado por B. asper. En cambio, la acci6n mionocrbtica del veneno de Crotales viridis viridis es m~s d6bil ya que los daiïos celulares aparecen mds tarde y son menoa severos, tanto empleando veneao credo (STRINGER, ICAINER y Tu, 1972) como la miotoxina a de dicho VeIIeIIO (OwNHY, CAMERON y TU, 1976~ Se ha estudiado el desarrollo del edema originado por los venenoâ de Agkistrodon piscivarous (BHARCiAVA et al, 1972~ Trimeresurus elegans (YAMAKAWA et al., 1976), T. flavouirldis (FuxAMi,1978) y Boihrops asper (presentetrabajo). En losdos primeros casos este fen6meno se desarroll6 muy r~pidamente, llegando a su m~ximo valor en la primera hora posterior a la inoculaci6n y decreciendo luego con rapiden Sin embargo, en los casos de T. flavoviridis y B. asper el edema alcanza su m~zimo valor a las 24hr, pose a la rapidea de su inicio . Entas divergencias en el desarrollo del edema podrian reflejar diferentes mecanismos responsables de la patogenia de este efecto y podrian toner implicaciones clinicas importantea, dado que el edema oontribuye a la compresi6n tisular y estâ relacionado con otras alteraciones fisiolbgicas.
610
J. M. GUTIÉRREZ, OLGA ARROYO y R. BOLAI~OS
La determinacibn de los niveles de CFQ parece ser un valioso instrumento para evaluar la magnitud de la mionecrosis producto del envenenamiento, pues por su sensibilidad permite demostrar las primeras alteraciones que estân sufriendo las fibres musculares . Existen altes concentraciones de CFQ en otros drganos como corazt5n y cerebro, por lo que niveles séricos elevados podrian serconsecuencia de destruccit5n celular en dichos ôrganos. Sin embargo, en el modelo experimental utilizado en este estudio, las muestras de cerebro y corazdn no mostraron alteraciones significatives, y si bien el corazôn mostrt5 algunos focos de tejido afectado, la necrosis del mnsculo esquelético fue mucho miis severa, por lo que resulta evidente que la elevacibn de los niveles de CFQ se debiG fundamentalmente a la necrosis de las fibres del mtisculo esquelético. La determinacitin de CFQ podria ser utilizada en la pr>~ctica hospitalaria con el objeto de evaluar la magnitud del daiïo tisular, contribuyendo de esta manera en el diseiïo de un adecuado tratamiento. Agradecimieruos-Queremos dejar patente nuestro agradecimiento al Dr . FERNANDO CRAVES por su vaiosa ayuda en el laboratorio y por sus sugerencias a lo largo de esta investigacibn ; ala Dra. ELSA PORTILLA por la elaboracidn de IOS COttC3 hi6tOIÔgiC08 ; 8IOS COmpat'IerOS ALVARO FLORES, ABEL ROBLES y ALFREDO VARGAS pOi SU C01abOfa~ti~Ôn en el trabaj0 de labOrStOr10 y a la SeflOia HILDA HERRERA dC SOLERA pOr el t[abaj0 meCanOg[$fiCO. L3ta investigaci8n fue finaatiada por Ia Univetsidad de Costa Rica y por el Consejo National de Investigaciones Cientificas y Tecnol6gicas (CONICIT) de Costa Rica .
REFERENCIAS
BHARGAVA, N, VARGAFTIG, B. B, Vos, C. J, BONTA, I. y Tus, T. (1972) Dissociation of edema provoking factor of Agkistrodon ptscivorous venom from Kininogtnase. En : Vasopepttdes. Chtmistry . Pharmacology acrd Pathophysiology, p. 141 (HACK, N. y StcuTERt, F., Eda.) . New York : Plenum Puss . CANTAROW, A. y TRUMPER, M. (1975) Clinical Biochemistry. Philadelphia : W. H. Saunders Company. FuKAMt, M . (1978) A quantitative study of local lesions in experimental snake envenomation . I. Studies on composite lesions of muscular tissue caused by venoms of the habu (Trimeresra" usJlavovfridis~ Sakishime-baba (Trimeresarus elegatu) and hime-habu (Trlmeresurus okinavensis) . Snake 10, 114. GENKARO, J. F. y WArr, C. H. (1978) A test of the current theories of snake bite therapy. En : Toxins : Animal, Plant and Microbial, p. 495 (ROSENBERG, P., Ed.). Oxford : Pergamon Press. Gu~rtéRREZ, J. M . y CRAVES,F. (1980) Efectosproteolitico, hemorr$gicoy mionecr6tico de los venenos de serpientes costarrioenses de los géneros Bothrops, Crotalus y Iachesis . Toxicon 18, 315. HOMMA, M . y Tu, A. T. (1971) Morphology oflocal tissue damage in experimental snake envenomation . Br . J. exp . Path . 52, 538. JIMÉNEZ, E. y GARCIA, I. (1969) An$lieis de 86 tacos de Ofidismo en nüios. Rev . Med. Hosp . Nal. Ntnos 4, 91, MARTÉN, E. (1978) The surgical treatment of snake bites. En : Toxins : Animal, Plant and Microbial, p. 417 (ROSENBERG, P, Ed .). Oxford : Pergamon Press. OKOxoay T, HOMMA, M.y Hosrtt, S. (1964) Pathological studies on Habu-snake bite. Gamma J . mad . Sci.13,101 . OWNBY, C., CAMERON, D. y Tu, A. T. (1976) Isolation of a myotoxic component from rattlesnake (Crotahu viridis viridls) venom. Electron microscopic analysis of muscle damage. Am . J . Path. 05, 149. OWNBY, C., HJARNASON, J. y Tu, A. T. (1978) Hemorrhagic toxins from rattlesnake (Crotalus atrox) venom. Pathogenesis of hemorrhage induced by thtroe purified toxins. Am . J . Path. 93, 201. STRINGER, M., KAtKER, R. A. y Tu, A. T. (1972) Myoneaosis induced by rattlesnake venom. Am . J. Path. 67, 127. Tu, A. T. y HOMMA, M. (1970) Toxicologic study of snake venoms from Costa Rica . Toxic. appl. Pharm . 16, 73. VALLFJO-FREIRE, A. (1967) Informe sobre condidones pare la elaboracibn de sueros antiofldicos y programas conrelativoa en Costa Rica. Organi7scibn Panamericana de !a Salad. Oficina Sanitaria Panamericana. Washington. YAMAKAwA, M, NozAKI, M. y HOKAMA,Z. (1976) Fractionation of Sakishima-habu (Trimtresurus elegans) venom and lethal, hemorrhagic, and edema-forming activities of the fractions. En : Animal, Plaru and Microbial Toxins, VoL 1 . Biochemistry (OxsAItA, A, HAYASHI, K. y SAWAI, Y, Ede.). New York : Plenum Press.
0041-0101/90/1101-0603 502000
m Great Britain.
MIONECROSIS, HEMORRAGIA Y EDEMA INDUCIDOS POR EL VENENO DE BOTHROPS ASPER EN RATEN BLANCO J.
M. GUTI$RRFZ, OLGA ARROYO y R. Bol.nfvos
L3stituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologie, Universidad de Costa Rica, Ciudad Universitaria, Costa Rica (Accepted for publication 27 May 1980) J. M. Gtmga9;PZ, OLGA ARttovo and R. BoLaAos. Myonecrosis, hemorrhage andedemainduced by Bothrops caper venom in white mice. Toxicon 18, 60310,1980.-Pathogenesis of the myonecrotic, hemorrhagc and edema-forming effects in white mice inoculated with Botlvopa riper venom was studied at different time intervals by means of light microscopy, determination of serum levels of the etlzyme creatinephosphokinase (CPK), and evaluation of edema. Although the three effects were evident in the first hour, theirdevelopment was relatively independent. Myonectoric activity reached its maximum levels in the first 3 hr, as judgod by serum CPK. This indicates that myonecrotic toxins have a very rapid action on mundefibers, after which CPK levels decrease to near normal values 24 hr after venom inoculation. Histological studies showed severe myonxroais at 3, 6, 9, 12 and 24 hr, characterized by myolytic and coagulative necrotic fibers mixed with normal fibers. Maximum hemorrhagc effect was observed between 9 and 12 hr, whereas at 6, 9, 12 and 24 hr there was an intense polymorphonudear leucocyteinfiltration.On the older hand, l hr aftervenom injection there eras a local edema of 44 %, reaching a maximum value of 70 ~ within the first 24 hr, decreasing afterward. This edema is more prolonged than that induced by Apkistrodon piscioorous or Trimeresurua depans venoms . This could have important clinical implications since local swelling oontributea to tissue compression and is related to other physiological alterations. One week after venom inoculation therewenfibroblasts, fragments of necrotic muscle fibers,and amononuclear cell exudate. At this time, we did not observe hemorrhagic areas. Determination of serum levels of CPK wind be a useful and powerful technique in order to quantify muscle tissue destruction due to snake bite. Sinceonly ecaaty hemorrhagic andnecrotic areas wen observed in heart muscle,thedrastic and rapid increase in CPK levels mainly reflected skeletal muacknecrosis . CPK determination is a simple and quick laboratory technique that should be used to evaluate muscle necrosis and to improve treatment in snake venom poisoning.
INTRODUCCION
LA SERPIENTE Bothrops asper, llamada
popularmente `terciopelo' en Costa Rica, es la m~s importante desde el punto de vista de salad pnblica en este pala . Algunos estudios han demostrado que esta especie es responsable de alrodedor de185% de las mordeduras en las que se ha identificado el ofidio agresor (VA1 .1,1:1o-FR1uRE, 1967 ; J1M~xez y GARCin, 1969). Su veneno provoca, ademâs de efectoa sistémicos, un severo y complejo cuadro en el sitio aliatbmico de la mordodura, caracteriTado por fenbmenos hemorrtlgicos, mionecr6ticos e inflamatorios (hM>Sxsz y G~lede,1969 ; GvT1~AAP7 y CxwBS,1980). Le severidad del cuadro, junto a la aparente ineficacia de los antiveneaos para neutralizarlo (M~LRr~Iv;1978), hace que mochas veoes ocasione secuelas irreversibles que van desde la pi tdida de tejido hasta la amputaci6n de la extremedad afectada. Se ha estudiado el efecto que produce este veneno sobre el tejido muscular de rat6n (Tu y HOMMA, 1970 ; HOMMA y Tu, 1971 ; GU'l'I$RREZ y CHAVFS, 1980) modiante observaciones efectuadas a lln solo intervalo de tiempo después de la inoculaciGn : 24 hr en los dos primeros 603
604
J. M. GUTIÉRREZ, OLGA ARROYO y R. HOLAfYOS
casus y 6 hr en el tercero. En dichos estudios se observb un severo cuadro de necrosis, principahnente miolitica, con intensa hemorregia y un fuerte cuadro infiamatorio ; sin embargo, no conocemos datos sobre la dinâmica de los eventos que se desarrollan. Por otra parte, en la evaluacibn de la magnitud de la necrosis muscular han sido empleados principahnente dos criterios : (a) la observacibn microscôpica con semicuantificaciGn del efecto por medio de cruces (e.g. HoMMn y Tu, 1971) y (b) la evaluaci6n macrosc6pica basada en la cuantificacidn del volumen de tejido necrdtico (e.g. FUKAMI, 1978). El primer par~metro presenta el problema de que mediante el anâlisis microsc6pico es muy diHcil formarse una idea del cuadro global que se estudia, en tanto que la valoracibn macroscôpica tiene el inconveniente de que es muy dificil identificar tejido muscular necrbtico si no es mediante el anâlisis microscbpico. La determinacibn de los niveles séricos de la enzima creatinafosfoquinasa (CFQ) ATP creatina fosfotransferasa ; EC 2.7.3.2.) se ha utilizado en la evaluaciGn de alteraciones de muscuao esquelético, mûsculo cardiaco y cerebro (CANTAROW y TRUMPER, 1975). Esta determinaciôn ha sido muy ütil en el diagnbstico de la distrofia muscular progresiva, asi como de otras miopatias ; adem~s, se le utiliza en el diagnc5stico de infarto de miocardio y de trastornos que involucren destrucciôn de tejido cerebral . GENNARO y WATT (1978), al estudiar los perfiles séricos de ciertas enzimas luego de inoculaciones de veneno de Crotales adamanteus seguidas de la administracibn de antiveneno, observaron elevaciones en los niveles de CFQ, atribuyéndolos fundamentalmente a la destrucciôn de müsculo esquelético, dado que en tales circunstancias el examen histoldgico del corazGn no mostrô daiïos evidentes. En el presente trabajo pretendemos estudiar la secuencia de los eventos locales (mionecrosis, hemorragia y edema) provocados por el veneno de Bothrops asper en ratdn. También se pretende utilizar los niveles séricos de la enzima CFQ como lndice cuantitativo de la necrosis de mûsculo esquelético provocado por este veneno.
MATERIAL Y METODOS Se utilizd veneno de B. asper de la zona Atléatica de Costa Rica, obtenido en nuestro labostorio, liofilizedo y conservado a -70°C (loteBAA 1-79). Es una rr~zclade veneno de unagran cantidad de ejemplares prooedentes de dicha regidn . Ralones bhmcos Wobster, entre 18 y 20 gde peso,fueron inoculados intramuscularmente en el muslo wn SO pg de veneno disuelto en 0~1 ml de solucidn selina amortiguados a pH 7~2. Previo a su inoculacidn, la solucidn se eateriGzd por filtraâdn en membrane de 0~22Ean de poro. Pas el anéliaia histoldgico ae tonuuron muestss de ooszdn, cerebro y miSsculo esquelético del muslo a los siguieales intervalos : 1, 3, 6, 9,12 y 24 hr y 1 eemana . Todos los eatudios histoldgicos ae hicieron por triplicado. Las mueatras se 6jaron en formalisa al 10'/ a t~pestus ambiente y fueron tstadas tn forma conventional pas su posterior ooloracidn cos hematoxilina eusins. Se efectuaron experimentos costrol inoculando 0~1 ml de solucidn ealina en idénticaa oondicionea La CFQ ac determind en stones alosque se inoculd veseno en lasmismas condicionas deecritaspas losestudios histoldgicos ;a los mismos intervalas de tiempo se obtuvo de la cola de cada stdn un capilar de sangre . La CFQ ac carantiticd colorimétricamente mediante la medicidn de la craatina formada en la reaocidn ADP/fosfocreatisa (Si~a Tecbnical Bulletin No. 520). Los tontrolea fueron inoculados con 0~1 ml da solucidn salina . EI m5mero de animales pas cada experimento varidentre8 y 13 y pas loscontroles ac emplearon 3. La relacidn dosis-reapuesta se obtuvo inoailando, en grupos de 10 stones, les siguientes cantidadea de veneno : 10, 20, 30, 40 y SO Pg intramuscularmente. Tres horss despub se sasgcaron de la cola y se cuantificd los nivales de CFQ. H edema se cuentißod de awerdo al método y Yesux~w~ et al. (1976} Cuarcata y dnto stones fueron inoculados eo k pata trasera deracba oon 60 Ng (ea 30 pl) de venmo y oon 30 pl de sohrcion salina en la pata izquiada.Grupos de S ratones fseron saa~iScados, sus pataa cortadas a la ahus da la articulacids y pesades ea balanrs analitica a los siguieatas intervalos de tiempo :1,3, 6, 9y 12 hr y 1, 3, Sy 7dias. El edemase expresd camo el aummto ea pornentaje de peso de la pata derecha en relaacüdn con la izquierde.
1 . EPBCaO MIONECAOIICO DE SO /!g DE VENENO DE B. C13j1Cr G hr DESPUÉS DE LA INOCULACIbN . Se observan fibres de aspocto miolitico y ooagulativo, predominando las primeras . TinciSn de Hematoxilina-Eosina FICi.
FIG. 2. EXTENSA HEMORRAOIA EN EL TEJIW MUSCULAR 9 }lr DESPUÉS DE LA INOCULA('I~N DE SO /4g DE VENENO DE B. asper.
Se observa también un grupo de leucocitos y fibres necr6ticas de aspecto coagulativo. Hematoxilina-Eosina.
FIC3. 3. FIHRAS MUSCULARES NECROI'ICAS DE TIPO MIOLfTICO Y EXUDADO INFLAMATORIO 12 hr DESPUÉS DE LA INOCULACItSN DE SO~Ig DE VENENO DE B. asper.
El exudado est~ compuesto principalmente de leucocitoa polimorfonucleares neutr6filos. Hematoxilina-Eosina. FIa . 4.
CUADRO MSTOL60IC0 UNA SEMANA DFSPUÉS DE LA iNOCULACION DE 50 /eg DE VENENO DE
B. asper. Se aprecian rectos de Sbras musoulares necr6ticas, fibras en regeneracidn, fibroblastos y un infiltrado in5amatorio mononuclear. No se observaron grupos de eritrocitos . Hematoxilina-Eosina.
607
Efectos Locales del Veneno de B. riper RESULTADOS
Aruilisis histol6gico Una hora después de la inoculacien se observe una mionecrosis leve sunque evidente, predominando las fibres de aspecto miolitico ; hubo poca hemorragia y un escaso exudado inflamatorio. La necrosis se hizo més evidente a las 3 hr, llegando a ser intensa a las 6, 9,12 y 24 hr ; en dichos cortes histolegicos se observaron fibres necreticas de aspecto miol{tiw y coagulativo, predominando las pimeras (Fig. 1). El cuadro hemorr$gico aumente a las 3 y 6 hr y llege a su mâximo nivel a las 9,12 y 24 hr (Fig. 2). A partir de las 6 hr se aprecie una gran infiltracien leucocitaria, la cual se mantuvo hasta las 24 hr, constituida casi exclusivamente por polimorfonucleares neutrefilos (Fig. 3). Una semana después de la inoculacien se observe un cuadro con gran cantidad de fibroblastos, rectos de fibres necreticas, fibres en regeneracien y un exudado de tipo mononuclear ; no se apreciaron ~reas hemorrâgicas (Fig. 4). En el cuadro No. 1 se resumen las observaciones histolegices m~s importantes del müsculo esquelético. En anâlisis del miocardio deje ver a las 6, 9,12 y 24 hr pequeiïas y escasas zonas de necrosis, asi como algunos pequeiïos focos hemorrâgicos ; ambos fenemenos desaparecieron una semana después de la inoculacien. En el examen histolegico del cerebro no se observaron alteraciones en ninguna oportunidad. Los controles de los tres tejidos estudiados mostraron una estructura histolegica normal, tipica de los mismos. Determinacidn de la creatinafosfoquinasa (CFQ) Los valores séricos de la CFQ se elevaron considerablemente desde la primer Nora y alcanzaron su m~ximo nivel a las 3 hr, disminuyendo paulatinamente basta valores cercanos a la normalidad a las 24 hr ;los controles no mostraron elevaciones significatives (Cuadro 1 ; Fig. 5). La curve de relacien log dosis-respuesta mostre un comportamiento lineal en un ambito entre 10 y 40 hg (Fig. 6). Determinaciôn del edema El edema se inicie inmediatamente después de inoculado et veneno . Una bore después de la inoculacien se observe un edema de144%, et coal sumente progresivamente haste llegar a un m~cimo de170'/ a las 24hr. Luego se produjo un descenso paulatino, llegando a valores del 17~ a los 7 dies (Cuadro 1 ; Fig. 7). DISCUSION
Pese a que et efecto local provocado por et veneno de serpientes en un fenemeno muy complejo, en él participan une Serie de eventos cuya patogenia posee cierta sutonomia. Lo anterior ha lido claramente demostrado en los venenos de dos especies de cascabel CÙADRO 1 . DESARROLLO DE LA MIONECROSiS. HEMORRAOIA Y EDEMA iNDUCmOS POR EL VENENO DE B . asper
Efecto
1 hr
3 hr
6hr
9hr
12 hr
24 hr
7 dias
Mionecrosis Hemorragia Exudado in9amatorio CFQ sErico (ui/litro~ Edema (%)
leve leve
moderada leve
intense moderada
intense intense
intense intense
inteasa inteasa
regeneracibn no hay
kve 4037 44
moderado 7606 53
intenso 4912 55
intenso 3019 59
intenso 875 65
intenso 442 70
intenso 17
Valores normales - 160 ui/litro .
608
J . M . GUTI$RREZ, OLGA ARROYO y R BOLAfYOS
..
S
dw 1r U
TIFMPO (AOilAS)
FIG. S . SECUENCIA DE LAS VARIACIONES DE LOS VALORES 3l5RICOS DE LA CFQ .
Las esferas representan las valores en Ios stones inoculados con veneno, los triângulos los valorea en los stones control y et tra2:o los promedios.
10
20
30
40
VSNSNO
(pg)
50
FIG. 6. CURYA DB RELACIbN L00 DOSIS-RESPUESTA DE LOS YALORES SÉRI003 DB LA CFQ.
EI trazo reproseata los promedioe.
Ffectos Locales dol Veaeno de
B. riper
loo 90
eo ~o SO t0 70 20 10 9
12
2"
901A9
7
S
7
DIA6 TIEMTO
FiO. i . I .URVA QUE MUESTRA EL DESARROLLO DEL EDEMA A CONSECUENCIA DE INOCULACIONES DE 60 /eg DE VENENO DE B . OJpel EN LA PATA TRASERA . Bl trazo repICdeRYB l03 PrOmOd10&
norteamericanas (Crotales atrox y Croialus viridis vlridis) al estudiarae la patogenia de los eïoctos mionecrc5tioos y hemorr6~co oon toxines purificadas (OwxsY, CAMERON y Tu, 1976 ; OWNHY, BJARNASON y Tu, 1978). En el caso de Bothrops asper, la din~mica de los efectos mionecrGticos, hemorr~gico y edematizante también se desarrolla con relativa independencia, siendo los fen6menos mionecr6tieo y edematizante los primeros en alcanzar un alto nivel. En el presente estudio fue notorio el hecho de que .la mionecrosis inducida por este veneno es un fenbmeno que se desarrolla muy r$pidamente después de la inoculacibn y que adquiere gran intensidad al cabo de pocas horns. Ello confirma las observaciones previas de Tu y HOMMA (1970) y de CYUTI$RREZ y CHAVES (1980) que muestran la gran magnitud de esta necrosis. Al estudiar el efecto del veneno de Trimeresurus flavouiridis en mûsculo de cobayo, Oxoxoot, HOMMA y HosFU (1964) observaron un efecto mionecrbtico de râpida aparici6n caracterizado, a nivel histol6gico, por fibres miolltica. Dicho cuadro concide bastante con el originado por B. asper. En cambio, la acci6n mionocrbtica del veneno de Crotales viridis viridis es m~s d6bil ya que los daiïos celulares aparecen mds tarde y son menoa severos, tanto empleando veneao credo (STRINGER, ICAINER y Tu, 1972) como la miotoxina a de dicho VeIIeIIO (OwNHY, CAMERON y TU, 1976~ Se ha estudiado el desarrollo del edema originado por los venenoâ de Agkistrodon piscivarous (BHARCiAVA et al, 1972~ Trimeresurus elegans (YAMAKAWA et al., 1976), T. flavouirldis (FuxAMi,1978) y Boihrops asper (presentetrabajo). En losdos primeros casos este fen6meno se desarroll6 muy r~pidamente, llegando a su m~ximo valor en la primera hora posterior a la inoculaci6n y decreciendo luego con rapiden Sin embargo, en los casos de T. flavoviridis y B. asper el edema alcanza su m~zimo valor a las 24hr, pose a la rapidea de su inicio . Entas divergencias en el desarrollo del edema podrian reflejar diferentes mecanismos responsables de la patogenia de este efecto y podrian toner implicaciones clinicas importantea, dado que el edema oontribuye a la compresi6n tisular y estâ relacionado con otras alteraciones fisiolbgicas.
610
J. M. GUTIÉRREZ, OLGA ARROYO y R. BOLAI~OS
La determinacibn de los niveles de CFQ parece ser un valioso instrumento para evaluar la magnitud de la mionecrosis producto del envenenamiento, pues por su sensibilidad permite demostrar las primeras alteraciones que estân sufriendo las fibres musculares . Existen altes concentraciones de CFQ en otros drganos como corazt5n y cerebro, por lo que niveles séricos elevados podrian serconsecuencia de destruccit5n celular en dichos ôrganos. Sin embargo, en el modelo experimental utilizado en este estudio, las muestras de cerebro y corazdn no mostraron alteraciones significatives, y si bien el corazôn mostrt5 algunos focos de tejido afectado, la necrosis del mnsculo esquelético fue mucho miis severa, por lo que resulta evidente que la elevacibn de los niveles de CFQ se debiG fundamentalmente a la necrosis de las fibres del mtisculo esquelético. La determinacitin de CFQ podria ser utilizada en la pr>~ctica hospitalaria con el objeto de evaluar la magnitud del daiïo tisular, contribuyendo de esta manera en el diseiïo de un adecuado tratamiento. Agradecimieruos-Queremos dejar patente nuestro agradecimiento al Dr . FERNANDO CRAVES por su vaiosa ayuda en el laboratorio y por sus sugerencias a lo largo de esta investigacibn ; ala Dra. ELSA PORTILLA por la elaboracidn de IOS COttC3 hi6tOIÔgiC08 ; 8IOS COmpat'IerOS ALVARO FLORES, ABEL ROBLES y ALFREDO VARGAS pOi SU C01abOfa~ti~Ôn en el trabaj0 de labOrStOr10 y a la SeflOia HILDA HERRERA dC SOLERA pOr el t[abaj0 meCanOg[$fiCO. L3ta investigaci8n fue finaatiada por Ia Univetsidad de Costa Rica y por el Consejo National de Investigaciones Cientificas y Tecnol6gicas (CONICIT) de Costa Rica .
REFERENCIAS
BHARGAVA, N, VARGAFTIG, B. B, Vos, C. J, BONTA, I. y Tus, T. (1972) Dissociation of edema provoking factor of Agkistrodon ptscivorous venom from Kininogtnase. En : Vasopepttdes. Chtmistry . Pharmacology acrd Pathophysiology, p. 141 (HACK, N. y StcuTERt, F., Eda.) . New York : Plenum Puss . CANTAROW, A. y TRUMPER, M. (1975) Clinical Biochemistry. Philadelphia : W. H. Saunders Company. FuKAMt, M . (1978) A quantitative study of local lesions in experimental snake envenomation . I. Studies on composite lesions of muscular tissue caused by venoms of the habu (Trimeresra" usJlavovfridis~ Sakishime-baba (Trimeresarus elegatu) and hime-habu (Trlmeresurus okinavensis) . Snake 10, 114. GENKARO, J. F. y WArr, C. H. (1978) A test of the current theories of snake bite therapy. En : Toxins : Animal, Plant and Microbial, p. 495 (ROSENBERG, P., Ed.). Oxford : Pergamon Press. Gu~rtéRREZ, J. M . y CRAVES,F. (1980) Efectosproteolitico, hemorr$gicoy mionecr6tico de los venenos de serpientes costarrioenses de los géneros Bothrops, Crotalus y Iachesis . Toxicon 18, 315. HOMMA, M . y Tu, A. T. (1971) Morphology oflocal tissue damage in experimental snake envenomation . Br . J. exp . Path . 52, 538. JIMÉNEZ, E. y GARCIA, I. (1969) An$lieis de 86 tacos de Ofidismo en nüios. Rev . Med. Hosp . Nal. Ntnos 4, 91, MARTÉN, E. (1978) The surgical treatment of snake bites. En : Toxins : Animal, Plant and Microbial, p. 417 (ROSENBERG, P, Ed .). Oxford : Pergamon Press. OKOxoay T, HOMMA, M.y Hosrtt, S. (1964) Pathological studies on Habu-snake bite. Gamma J . mad . Sci.13,101 . OWNBY, C., CAMERON, D. y Tu, A. T. (1976) Isolation of a myotoxic component from rattlesnake (Crotahu viridis viridls) venom. Electron microscopic analysis of muscle damage. Am . J . Path. 05, 149. OWNBY, C., HJARNASON, J. y Tu, A. T. (1978) Hemorrhagic toxins from rattlesnake (Crotalus atrox) venom. Pathogenesis of hemorrhage induced by thtroe purified toxins. Am . J . Path. 93, 201. STRINGER, M., KAtKER, R. A. y Tu, A. T. (1972) Myoneaosis induced by rattlesnake venom. Am . J. Path. 67, 127. Tu, A. T. y HOMMA, M. (1970) Toxicologic study of snake venoms from Costa Rica . Toxic. appl. Pharm . 16, 73. VALLFJO-FREIRE, A. (1967) Informe sobre condidones pare la elaboracibn de sueros antiofldicos y programas conrelativoa en Costa Rica. Organi7scibn Panamericana de !a Salad. Oficina Sanitaria Panamericana. Washington. YAMAKAwA, M, NozAKI, M. y HOKAMA,Z. (1976) Fractionation of Sakishima-habu (Trimtresurus elegans) venom and lethal, hemorrhagic, and edema-forming activities of the fractions. En : Animal, Plaru and Microbial Toxins, VoL 1 . Biochemistry (OxsAItA, A, HAYASHI, K. y SAWAI, Y, Ede.). New York : Plenum Press.