Etude de la germination des spores de Bacillus Stearothermophilus en milieux artifiels et dans des conserves alimentaires

Etude de la germination des spores de Bacillus Stearothermophilus en milieux artifiels et dans des conserves alimentaires O. Diep, 1\1. Boulet et J. P. Julien Departement des Vivres Universite Laval Quebec Canada.

Resume Le taux de germination de spores de B. stearothermophilus a ete mesure en milieu anaerobique en presence de composes stimulants de la germination (germinant) et d'extraits d'aliments. La L-alanine (lOmM/l) au pH 6 a 7 s'est revelee un germinant efficace Ipouvant provoquer la germination de plus de 99% des spores en 30 min. Des extraits de petits pois, d'haricots verts et de carottes ainsi que la saumure de conserves de ces memes legumes ont une action stimulante sur la germination et cet effet semble etre reliea la presence d'alanine libre. Le nombre total de cellules viables (gemlees et dormantes) demeure oonstant ou decrolt dans Ie milieu de germination pendant plusieurs heures apres Ie debut de la germination.

Abstract The rate of germination of spores of B. stearothermophiIus has been examined under anaerobic conditions in the presence of germinating agents and food extracts. L-alanine (lOmM/l) at pH 6 to 7 was an effective agent and pmdll'ced over 99% gel111ination in 30 min. Water extracts of green peas, green beans and carrots and the brine of these canned products were all effective in stimulating germination and this effect appeared to be related to the presence of free alanine. The total number of viable cells (germinated and dormant) in the germination medium or remained constant or decreased for several hours after the beginning of germination.

Introduction La germination est Ie procede par lequel une spore de bacterie refractile dormante et resistante a la chaleur est transformee en une cellule non refractile, active et sensible a la chaleur. Les travaux recents sur Ie sujet semblent indiquer que la germination des spores de plusieurs especes de Bacillus et Clostridium peut etre provoquee ou acceleree par divers facteurs, pI'is separement ou en eombinaison: un traitement de chaleur sub-Ietal (choc thermique), la presence dans Ie milieu de nutriments specifiques (acides amines, sucres, vitamines, etc.) ou de reactifs chimiques capables de modifier la composition des spores (agents chelateurs, echangeurs d'ions, reducteurs, etc.) ou Faction d'agents qui peuvent modifier la structure des spores (abrasifs, surfactants, etc.). Dne revue sur Factivation des spores de bacteries a ete publiee par Berg et Sandine (1970). Les exigences pour la germination de Bacillu8 stearothermophilus ont ete tres peu etudiees et les resultats obtenus sont parfois contradictoires. Les chocs thermiques a des temperatures de 105 a 115°C (Brachfield, 1955, Titus, 1957, Finley et Fields, 1962), Facidification du milieu au pH 1.5 (Lewis et al., 1965) et la presence d'acides amines specifiques comme la LContribution No 141 Faculte des Sciences de l'Agriculture ct de l'Alimentation Universite Laval, Quebec. (1) Dileo Laboratories, Detroit 1. Michigan, U.S,A.

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histidine (Titus, 1957), Facide L-glutamique et la Llysine (Campbell et al., 1965) auraient pour effet d'ae. tiver les spores de B. 8tearotherJlwlJhilus. La resistance thermique des spores bacterienues constitue toujours un des problemes majeurs dans Fin. dustrie de la conserve (Reed et al., 1951, EI-Bisi et al., 1956, Walker et al., 1961, Murell et Warth, 1965, Yoko· ya et York, 1965). Plusieurs travaux ont ete effectues en vue de reduire cette resistance, sans beaucoup de succes. La germination des spores a ete tres peu ex· ploitee dans la recherche des moyens pour reduire leur resistance a la chaleur (Diep, 1969). L'objet de cette etude est la recherche des condi· tions favorables a une germination ra pide des spores dans Ie but d'en diminuer Ie plus possible Ie nombre dans les aliments destines a etre misen conserve.

Materiels et Methodes Le milieu de croissance utilise pour Ie Bacillu8 stearothermophilus 8005 (American Type Culture Col· lection) est Ie bouillon nutritif Difco 1 (extrait de boeuf 0.3% et peptone 0.5%) au pH 6.8. Le milieu de sporu· lation contient: "Nutrient Agar" (Difco), 1.5%, glu· cose 0.05%, MnS04.H 20 30 ppm, selon les recommanda· tions de Titus (1957). Le milieu utilise pour la mise en plaques est Ie meme que Ie milieu de croissance auquel on a ajoute 1.5% d'agar. Pn3paration des spores La production massive et rapide des spores a ete faite selon la methode proposee par Halvorson (1957) avec cette modification que la derniere inoculation est faite sur Ie milieu de sporulation gelose, prealable· ment coule dans des bouteilles de Roux. En general, la sporulation est tres abondante et complete apres 3 jours d'incubation a. 45°C C0Il1111e Findique Fabsence presque totale de cellules capables d'absorber la tein· ture "crystal violet". De plus, des numerations microscopiques directes en contraste de phas~ indique la presence de moins de 0.5% de spores non refringentes. Les spores sont lavees 5 fois par centrifugation dans Feau distillee sterile, puis sont gardees en suspension dans de Feau distillee sterile a. 4°C. Ger'mination Le dispositif que nous avons utilise pour les experiences de germination en conditions anaerobies consiste en une bouteille flanquee de deux trappes liquides, Fune a Fentree et l'autre a la sortie. La bouteille est munie d'une entree fermee par un bouchon hypodermique et contient Ie milieu (200 ml) dans lequel doit s'effectuer la germination. De Fazote filtre est circul e dans Ie dispositif pendant toute la duree de l'expe· rience. Can. lnst, Food Sci. Techno!. J. Vo!. 5. No.3, 1972

pour la germination en conditions aerobies, II's ores sont inoculees (1 ml) dans des tubes de culture spntenant 9 ml de milieu de culture. Les tests de gel'CO ' 4- o C'. Illination sont f't al saD Emtraits de legumes " . , Lesextraits sont prepares en chauffant les le~!;uIlles dans l'eau, dans la proportion de 1 kg/1 a 121°C endant 30 min. Les acides amines libres presents aans ces extraits ont ,ete deter~1ines a l:aide d~un analyseUr d'acides aminI's (Techmcon Ammo ACId autoanalyzer) . Les conserves de feves vertes utilisees dans l'etude de germination sont preparees en imitant un procede industriel de mise en conserve. Les boites metalliques (dim. 300 x 400) sont munies d'un presseetoupe ferme par une membrane de caoutchouc, semblables aux boites utilisees pour la determination des combes de penetration de la chaleur (Bigelow, 1920). La membrane permet Ie prel(~vement d'echantillons a l'aide de seringues hypodermiques. Apres avoir ete lavees, II's feves sont coupees en morceaux d'environ 5 cm de long, puis blallchies dans un bain d'eau it 85°C pendant 2 min. Les feves refroidies par aspersion a l'eau froide sont mises en boites a raison de 100 g environ par boite. Les boites sont ensuite rem plies avec une saumure a 95°C contenant 2% de chlorure de sodium. Apres remplissage, la temperature du contenu des boites est d'environ 70°C. Lorsqu'il y a inoculation (environ 300,000 spores par boite), I'llI' est faitI' a ce ill'oment-ci en introduisant 1 ml d'une suspension de spores de dilution appropriee. 1mmediatement apres l'inoculation, II's boites sont fermel'S sous un jet de vapeur a l'aide d'une sertisseuse automatique. MeStlre de la germination Des Ie debut des etudes sur II'S spores, Wynne et Foster (1948) ont suggere d'utiliser la perte de la resistance thermique comme mesure de la germination. Le nombre de spores germees etait calcule par la difference entre la nUllH~ration totale de cellules vivantes immediatement avant et apres la pasteurisation. Dans la presente etude, Ie nombre de spores germees est calcuIe a partir du nombre total avant la germination (au temps 0 de germination) au lieu de celui avant la pasteurisation. Cette methode de calcuI tient compte des cellules qUi apres avoir germe ne sont pas viables et evite l'erreur due it la division cellulaire des cellules vegetatiYes. Comme il est indique plus loin, la population totale peut augmenter ou diminuer considerablement durant la periode de germination. Les spores a l'etat dormant, tel que postule par Finley et Fields (1962) sont toutefois incluses avec les cellules non-viables et ne peuvent etre evaluees separement par les methodes disponibles. Le pourcentage de germination est donc calcuIe de la fa~on suivante: No - Npt G t = ---- x 100 No G t = Pourcentage de germination au temps "t" de J, lnst. Can. Sci. Techno!. Aliment. Vol. 5. No 3. 1972

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Figure 1.

Gennination de Bacillus stearothermophilus 8005 en presence de germinants: (1) alanine (10 mM), (2) glucosamine 00 mM), (3) dipicolinate de calcium (40 mM), (4) glucose 00 mM), (5) eau distillee.

la germination. Nombre total des spores vivantes au temps o avant la germination. Npt Nombre de spores vivantes apres pasteurisation, au temps "t". La pasteurisation est faite par chauffage a 80°C pendant 7 min. La numeration des spores vivantes est obtenue par la methode officielle des plaques d'agar. Les dilutions (avec de l'eau distillee sterile) sont faites de telle sorte qu'elles donnent environ 100 colonies par plaque. Les plaques sont incubees a 45°C, dans des conditions aerobies. No

Resultats et Discussion Selection des "germinants" Quelques-uns des agents connus comIlle activateurs de la germination des spores de bacteries (germinants) ont ete aj'outes a la suspension de spores de B. stearothermophilus 8005, dans Ie but de verifier leur efficaciteo Le traitement a ete fait dans des conditions anaerobies. L'alanine apparait comme la substance la plus active avec une germination de 99% de la population apres une heure d'incubation (Figure 1). Les germinants essayes se classent comme suit, selon l'ordre decroissant d'efficacite: l'alanine, la glucosamine, Ie dipicolinate de calcium (CaDPA) et Ie glucose. Les resultats obtenus avec l'alanine en melange avec un autre germinant comme Ie glucose, Ie CaDPA, Ie KCI ou Ie CaCl 2 sont rapportes au tableau 1. La presence d'un autre germinant avec l'alanine ne semble pas accroitre la vitesse de germination provoquee par l'alanine seule. Cependant la presence du chlorure de calcium hate Ie depart de la germination. 160

Tableau 1. Pourcentage de germination de Bacillus stearothermophilus 8005 dans des solutions aqueuses d'alanine OOmM) en presence d'un autre germinant. Concentration (mM)

Autre germinant Aucun CaDPA KCl CaC1 2

40 1 1

Temps de gennination (h) pH 6.4 7.0 6.2 6.2

0

0.25

0.50

1.0

2.0

3.0

20.0

30 37 32 60

95 92 62 91

98 97 88 99

99 98 96 99

99.5 99.0 99.5 99.5

99.8 99.9 99.9 99.6

99.90

Titus (1957) a trouve qu'avec B. stearothennophilus 1518 et Z la L-alanine ne pouvait pas activer la germination des spores et que parmi les 22 acides amines essayes, seule la L-histidine avait un pouvoir d'activation. Plus recemment, Campbell et al. (1965) ont isole deux lignees de B. stearothermophilus 1518 dont les exigences pour la germination sont differentes, soit une lignee activee specifiquement par l'acide L-glutamique et l'autre par la L-lysine en concentrations de 1 mM/l. Activation thermique Le nombre de cellules viables dans une suspension de spores a laquelle on a ajoute de la L-alanine (10 mM) diminue rapidement durant l'incubation a 45°C et il en est de meme pour les spores ayant rec;u un traitement thermique (80°C, 10 min) en presence de la L-alanine avant l'incubation (Figure 2). Le traitement de pasteurisation (80°C, 10 min.) faisant suite a l'incubation, a cause dans les deux cas une diminution importante du nombre de spores viables, ce qui indique qu'il y a eu effectivement germination d'un grand nombre de spores (Figure 2). Le pourcentage de germination calcule par difference augmente aussi en fonction du temps avec cependant une Iegere avance des spores chauffees sur les spores non chauffees durant les premieres 15 minutes (Tableau 2). Tableau 2.

Traitement Temoin non chauffe 10 min. it BO°C

o 7 72

96.0 98.4

99.0 98.6

99.6 99.2

99.80 99.98

99.90 99.99

D'autres auteurs ont rapporte que les conditions optimum de chauffage pour l'activation dans l'eau distilIee sont de 110°C pendant 6 a 9 min. pour Ie B. stearothermophilus Z et 1518 (Titus, 1957). Par ailleurs, Finley et Fields (1962) ont observe que les traitements a la chaleur entre 65 et 80°C dans l'eau distilIee induisent les spores (lignee 1518) it la dormance plutOt que de Ies activeI'. L'activation a He obtenue a des temperatures plus elevees. La diminution apparente du nombre de cellules viables (Figure 2) peut etre causee soit par un retour a la dormance, soit par la mort de cellules nouvellement germees. Ilnous semble cependant que Ie deuxieme mecanisme est probablement predominant parce qu'il parait invraisemblable qu'un meme traitement puisse provoquer a la fois une activation et un retour it la dormance; Ceci n'elimine pas cependant la possi161

bilite qu'une nouvelle sporulation puisse se faire (Knaysi, 1945). Influence du pH sur' la germination L'influence du pH sur Ie taux de germination des spores de B. stearothennophilus 8005 a Heetudiee dans des solutions d'alanine (10 mM) tamponnees aux pH 4.0, 5.0 et 6.0 avec du citrate (0.1 M) et au pH 7.0 avec du phosphate (0.1 M). Le traitement a ete fait dans des conditions aerobies. Les resuItats obtenus (Figure 3) montrent que la germination est nettement plus rapide aux pH 6.0 et 7.0 qu'aux pHs 4.0 et 5.0. Les pourcentages de germination en conditions aerobies aux pH 6.0 et 7.0 slont comparables a ceux obtenus aux temps correspondants en anaerobies au pH 6.4 (Tableau 1). Ceci indique que Ia presence ou l'absence d'oxygene ne semble pas influencer Ie taux de germination de B. steat·othermophilus. Les resultats sur l'effet du pH (Figure 3) sont en accord avec plusieurs etudes qui ont montre que Ie pH optimal pour la germination vade habituellement entre 6 et 8 (Church et al., 1954, Lawrence, 1955, Gibbs, 1964). D'autres auteurs ont aussi rapporte que la germination est inhibee it des pH inferieurs it 4 (Heiligman et al., 1958). Titus (1957), par contre, a trouve que la germination de B. stearothennophilus

Effet d'un traitement thermique de Bacillus stearothermophilus 8005 dans une solution d'alanine 00 mM), sur Ie pourcentage de germination. Temps de germination (h) -'---0.25 0.50 1.0 2.0 3.0

99.99 99.95

,., E. cD'

o

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~ ~

o o

I

rompi d'lncubalion - houro

Figure 2.

Effet de la germination de Bacillus stearothermophilus 8005 provoquee par la L-alanine (10 mM) avec ou sans choc thermique 00 min, 80°C), sur Ie nombre de cellules viables durant !'incubation subsequente (45°C). 0-0 sans traitement thermique, X-X traitement thermique pre-incubation, 0---0 traitement thermique post-incubation, X---X traitements thermiques pre-incubation et postincubation. Can. Inst. Food Sci. Techno!. J. Vo!. 5, No.3, 1972

Tableau 3. Germination des spores de Bacillus stearothermophilus 8005 dans un bouillon nutritif(a), en milieu anaerobie. pH 7

_==::t======'========Z pH 6

Nombre de ceIlules vivantes Temps (h)

pH ~

;,'

..... -- - -- -------- - - ---- --_ .. - -; -- - -------1

0 0.25 0.50 0.75 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 5.0 6.0 10.0 22.0

Tableau 4. Effet du pH sur la germination de Bacillus stearothermophilus 8005 en /presence de L-alanine (l0 mM), sauf pour T, = tampon phosphate de pH 7 et T2 = eau distillee ne contenant pas de L-alanine.

est retardee a des pH de 7 et plus, et qu'elle augmente avec l'abaissement du pH. Nath et Clegg (1969) ont montre qu'il existe une relation tres complexe entre la germination et les agents activateurs lorsque ceux-ci sont utilises en co~binaison. Ceci peut se traduire par une stimulation ou par une depression apparente de la germination. Par ailleurs, Rode et Foster (1960) et Thorley et Wolf (1961) ont demontre que l'effet du pH sur la germination depend non seulement de l'organisme, mais aussi du germinant utilise. Ceci pourrait etre une des raisons qui expliquerait les divergences entre les resultats de Titus et ceux du present travail. Germination des spores dans un bouillon nutritif La germination des spores dans un bouillon nutritif Difco(l) a ete etudiee dans des conditions anaerobies et aerobies. La vitesse de germination est semblable dans les deux conditions (Tableaux 3 et 4) soit 99.1 et 99. 7% en 30 min, et est sensiblement superieure a celle des tests faits en presence de germinants simple~. La population totale de cellules (avant pasteurisatIOn) exposees aux conditions anaerobies accuse une regression progressive pendant les 5 premieres henres su.ivie d'une faible remontee. Des changements similalres dans la population initiale sont aussi obtenus avec les aliments et les extraits d'aliments en milieu anaerobie tan dis qu'avec l'eau distilIee et Ie tampon phosphate (pH 7.0) la population reste constante avec l~ temps. Ces resultats ne sont pas rapportes. En miheu aerobie, la remontee de la population dans Ie bouillon nutritif commence apres une heure. Cette difference serait due au fait que Ie B. stearothermophilus est un organisme anaerobique facuItatif. La regression de la population totale semble etre en rapport avec la germination, c'est-a-dire que plus la germination ~ grande, plus la regression est poussee. 0) "Nutrient Broth Difco" contenant 0.3% d'extrait de boeuf et 0.5% de peptone au pH 6.8. J. lnst. Can. Sci. Techno!. Aliment. Vo!. 5, No 3, 1972

900 830 735 735 520 450 220

000 000 000 000 000 000 000

3 700 450 1 250 1 000 10 000

Apres pasteurisation

855 15 7 3 3 2 1

000 000 900 600 300 000 400 825 750 550 600 150 350

5.0 98.3 99.1 99.60 99.63 99.80 99.85 99.90 99.90 99.94 99.93 99.98 99.96

(a) Bouillon nutritif Diko oontenant de l'extrait de boeuf 0.3% du peptone 0.5% au pH 6.8.

remp, - heurc

Figure 3.

% de germination Avant pasteurisation

Temps (h)

orb) 0.25 0.50 0.75 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.5 5.0 6.0 9.5 22.0

Germination des spores de Bacillus stearothermophilus 8005 dans un bouillon nutritif(a) en milieu aerobie. Nombre de ceIlules vivantes Apres Avant pasteurisation pasteurisation

250 235 200 100 150 200 500 4 000

000 000 000 000 000 000 000 000

6 4 6 9 3

000 000 000 000 000

000 000 000 500 000

55 000 10 000 800 800 720 420 J70 270 450 300 200 200 400 200

% de germination 78.0 96.0 99.7 99.7 99.7 99.8 99.8 99.9 99.8 99.9 99.9 99.9 99.8 99.9

(a) Bouillon nutritif Difco contenant de l'extrait de boeuf 0.3% et du peptone 0.5% au pH 6.8. (b) A cause du temps requis pour !'inoculation des 15 tubes, Ie temps 0 oorrespond a une incubation it temperature de la piece pendant environ 10 min.

Le nombre de spores restuntes apres la pasteurisation semble atteindre une limite entre 200 et 400 spores apres une heure d'incubation (Tableau 4) ce qui indiquerait que la suspension de spores n'est pas homoge!1e. Fields et Finley (1964) ont fait une observation sembiable avec la lignee 1518. Gern~ination dans des aliments Nous avons fait l'etude de la germination dans du lait, des extraits de pois verts, d'haricots verts et de carottes et aussi de l'influence de l'addition de la Lalanine aux extraits de pois verts et d'haricots verts sur la vitesse de germination (Tableau 5). Le tableau 6 rapporte les concentrations des sept acides amines les plus importants dans ces extraits de legumes. Les resultats montrent ainsi que la germination dans ces milieux llaturels fut presque aussi rapide que dans la solution d'alanine (Pigure 1). Cela n'est pas etonnant car ces milieux contiennent certainement de nombreux elements susceptibles de provoquer la germination des spores. En effe!, les extraits de legumes contiennent presque tous les acides amines naturels a 162

Tableau 5.

Pourcentage de germination des spores de Bacillus stearothermophilus 8005 dans Ie lait et dans des extraits de legumes. pH

0

0.25

Lait homogeneise Carottes Haricots verts Haricots vers Alanine (10 mM) Pois verts Pois verts Alanine (10 mM)

6.6 5.6

10 31 4

85.0 85.0 78.0

92.5 88.0 94.5

98.5 92.0 97.5

99.0 93.0 99.5

99.7 97.0 99.9

99.95 99.99 99.99

+

5.6 6.1

12 34

94.5 91.5

99.0 95.0

99.5 98.7

99.8 99.2

99.9 99.6

99.95 99.94

+

6.1

78

95.0

97.0

99.0

99.5

99.7

99.90

504

Tableau 6. Concentrations (mM) des acides amines libres predominants dans les extraits de pois verts, haricots verts et carottes. Acide amine Acide aspartique Threonine Acide glutamique Alanine Valine Phenylalanine Arginine (a)

Pois

Carottes

Haricots vers

(a)

2.54 6.95 4.01 3.67 1.34 1.09 2.64

1.15 8.58

7.05 8.52 11.13 2.28 (a)

17.85

(a)

1.24 0.79 0.62 0.1

Concentration inferieure it 0.1 mM.

l'etat libre y compris l'alanine qui est present en COIlcentrations com parables it celles que nous avons employees dans les milieux artificiels. Les taux de germination sont com parables dans Ie cas des feves, des pois verts et du lait, mais legerement plus lents dans l'extrait de carottes. L'addition d'alanine a eu pour effet d'accelerer la vitesse de germination (Tableau 5). L'extrait d'haricots verts a subi la plus forte augmentation et c'est celui qui contenait initialement la plus faible concentration en plusieurs acides amines, y compris l'alanine (Tableau 6). Fields et Finley (1964) ont rapporM qu'a la suite d'une activation par choc thermique (110°C, 7 min) la croissance apparente de B. stearothermophillls l\f est partiellement inhiMe par des extraits de pois, d'epinards et de mals et stimuIee par un extrait d'haricots verts. Ce phenomene est probablement dft a une diminution de la population totale faisant suite a l'activation comme nous l'avons observe avec Ie bouillon nutritif (Tableaux 3 et 4).

Gerrnination dans des conserves (i'haricots verts en presence de "gm'minants)) ajoutes. Nous avons realise une serie de tests de germination dans des conserves d'haricots verts en presence de "germinants" ajoutes (Tableau 7). Les spores de B. stearothermophilu8 ont germe a 88% apres une heure d'incubation sans l'aide d'aucun activateur ajoute, tandis qu'en presence d'alanine ou du melange alaninechlorure de calcium, la germination est passee a 98 et 99% dans Ie meme temps. L'augmentation de la concentration de l'alanine de 10 a 100 mM/1 a aussi augmente la vitesse de germination.

Discussion II est possible de stimuler la germination de spores de Bacillus stearothermophilus 8005 par l'addition 163

Temps de germination (h) 0.50 1 2 3

Extrait

19

Tableau 7. Pourcentage de germination (a) des spores de Bacillus stearothermophilus 8005 dans des conserves d'hari_ cots verts, avec addition d'alanine et de chlorure de calcium. Temps de germination (h) Germinant ajoute Aucun Alanine Alanine Alanine CaC1.

+

(a)

Concentration (mM/1)

0

0.5

10 100

4 5 62

65 90 98

88 98 99

10

60

98

99

Moyenne de quatre repetitions.

d'un germinant a un milieu de culture synthetique ou a un aliment. La L-alanine (10 mM) s'est revelee un germinant tres puissant pour cet organisme (Figure 1). D'autres composes presents dans les aliments penvent aussi stimuler la germination a des degres divers comme par exemple Ie calcium qui semble avoir une action synergique en presence de la L-alanine (Tableau 1). De meme, Ie pH a une action stimulante lorsqu'il est pres de la neutralite (Figure 3). II semble aussi qu'un choc thermique acceU~re la vitesse de germination et que cet effet s'ajoute a celui de la L-alanine (Tableau 2). II est difficile de s'appuyer sur les resultats publies par d'autres auteurs pour etablir des comparaisons entre les exigences de germination de diverses especes ou lignees de bacteries sporulantes parce que diverses methodes de mesure de la germination ont ete utilisees. En effet, Campbell et al. (1965) ont montre que les taux de germination de deux lignees de B. stea1'othermophilus mesures par les methodes de la perte de la birefringence, de la perte de la resistance a la chaleur et de la permeabilite aux colorants avaient des valeurs comparables, tandis que Riemann (1963) a montre avec des spores de Clostridium Putrefactive Anaerobe 8 2 que la permeabilite des cellules aux colorants apparait plus tardivement que la perte de la refringence tandis que la perte de la resistance a la chaleur arrive plus t6t. Les travaux de plusieurs auteurs semblent indique I' que 1a L-alanine est un activateur efficace pour un grand nombre d'especes des genres Bacillus et Clos-

tridium: B. anthracis (Hills, 1949), B. cereus (Jary et Halvorson, 1965), B. megatherimn (Hyatt et Levinson, 1964), B. terminalis) B. globigii et B. polyrnixa (Church et al., 1954), B. subtilis (Hermier, 1962), B. therrnoacidurans Can. Inst. Food Sci. Technol. J. Vol. 5, No.3, 1972

(lJeiligman et al., 1956), B. coagulans (Diep, 1969), ros eu1n, O. botulinum type B (Hitzman et al., 1955) et c. putrefactive anaerobe (P.A.) 3679 h (Yehara et Frank, 1965). La L-alanine n'apparait pas cependant conune un erminant universel puisque certaines lignees de B. ;tearothermophilus ne reagissent pas en sa presence, Inais sont plutOt activees par la L-Iysine, l'acide L-glutamique ou la L-Histidine (Campbell et al., 1965, Titus, 1957). On peut conclure de ces travaux que les spores de bacteries sont generalement activees par la presence d'un ou plusieurs acides amines libres et la L-alanine est l'acide amine dont Ie spectre d'action est Ie plus etendu. La germination des spores peut etre relativement rapide lorsque les conditions sont favorables: au-dell\ de 99% des spores germent en 30 min dans Ie cas de B. stearothermophilus (Tableau 4) et en 10 min dans Ie cas de B. cereus (Vary et Halvorson, 1965) et C. sporogenes (Riemann, 1963). Par contre, dans certains cas la germination est relativement lente et incomplete, c'est-a-dire plusieurs heures avec B. thermoacidurans (Heiligman et al., 1956) et B. megaterium (Levinson et Hyatt, 1962). Ces temps de germination pourront certainement etre diminues lorsque les conditions de germination seront mieux connues. La concentration des spores dans un aliment a une influence considerable sur les exigences thermiques de la sterilisation qui se traduit par une augmentation de la duree du chauffage avec l'augmentation de la concentration initiale (Cheftel et Thomas, 1963 et Stumbo, 1965). La germination apparait donc comme un moyen de reduire la charge initiale de spo· res dans un aliment et par consequent de reduire, comme l'a suggere Titus (1957) les traitements de chaleur pour la sterilisation des conserves. Dans la plupart des procedes conventionnels de mise en conserve, il existe entre Ie blanchiment, Ie sertissage des boites et la sterilisation, des temps d'attente plus ou moins longs. Les reglements de I'Etat de la Californie limitent a un maximum de deux heures la periode entre Ie sertissage des boites et la sterilisation. II est probable que ces periodes d'attente C'ontribuent a diminuer Ie nombre de spores. Cependant, avec les nouveaux procedes de sterilisation en continu (hydrostatiques ou autres) les temps d'attente sont generalement plus Courts ce qui limite Ie temps alloue a la germination. Des recherches devront etre faites dans Ie but d'exploiter avantageusement ces periodes d'attente. On peut presumeI' que toute multiplication cellul~ire post-germinative se ferait au detriment de la qualIte de la conserve. Les resultats que nous avons obtenus semblent indiquer que Ie nombre total de cellules (Spores et cellules vegetatives) reste constant ou meme diminue pendant plusieurs heures, au lieu d'augment~r durant la germination, et cela meme dans un milIeu riche en elements nutritifs (Tableau 3). II sera cependant necessaire de verifier si ce phenomene se repMe avec d'autres organismes et dans d'autres milieux se rapprochant davantage des conserves.

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