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Étude de la glycolyse et de la perméabilité des érythrocytes aux ions orthophosphates dans le rachitisme vitamino-résistant hypophosphatémique héréditaire
CLISICA
CHIMICA
I?TUDE
DE
CYTES
AUX
L4
GLYCOLYSE
IONS
MINO-RI?SISTANT
I’.
CARTIER”,
261
ACTA
ET
DE
Lt\ PERMI?ABILIT~
ORTHOPHOSPHATES
DANS
HYPOPHOSPHAT&IQUE
J. P. LEROUXa,
S. H.-\LS.4Nhs*
ET P.
LE
DES
GRYTHRO-
RACHITISME
VITA-
HI?RI?DITAIRE
ROYER”
a Unite’ d’Emyymologie Me’dicale (U 75 INSERT) et h Unite’ d’.&ude dcs Maladies du ~M&abolisme chew I’Enfant (lY 30 INSER.W), HJpital des Enfants-Malades, r+y, Rue de Sduvcs, Paris Xlvdwze (France) (Rqu
lc 2j mars,
1970)
SUMMARY
Study on Glycolysis and Permeability of Erythrocytes to Ortho@hos$hate ions in Hereditary Hy@ophosphatemic Vitamin D-Resistant Rickets Whole glycolysis, enzymatic activities in the Embden-Meyerhof pathway, kinetics of the penetration of orthophosphate ions, and the concentration of various intracellular fractions, i.e. orthophosphates, intermediate phosphoderivatives of glycolysis and ATP, were studied in 30 normal subjects and in 17 subjects with hereditary hypophosphatemic vitamin D-resistant rickets. A comparison of the results obtained with children treated with vitamin D, those not treated with vitamin D and untreated adults shows no significant differences among the three categories. The following results were obtained in our study of affected subjects: I. Glycolytic activity is elevated without inducing any accumulation of the intermediates between glucose and lactate. 2. Enzymatic activity in the Embden-Meyerhof pathway is normal, except for pyruvate kinase which is significantly increased. 3. The concentration of the intermediate normal.
phosphoderivxtives
of glycolysis
is
4. ATP concentration is increased (P = 0.01). Intracellular orthophosphate concentration is decreased (P = o.ooz). 6. The kinetics of the entrance of extracellular orthophosplrates into red blood cells is significantly increased (P = 0.001) without affecting the final equilibrium of distribution of phosphate ions throughout all parts of the membrane. These results make one think that the hypophosphatemia seen in hereditary vitamin D-resistant rickets cannot be explained either by modification of the plasma membrane permeability to phosphorus or by alteration of glycolysis. The problem of vitamin D resistance and the resultant disturbances which it causes in the cellular transport of calcium are cited as a tentative explanation for 5.
* Mlitre
de
Rxherchc
au
CNRS.
Cliw. Chirn. Acta,
29 (1970)
261-271
the abnormalities which have been observed. Mrtabolic exploration in otlrcr types of cells and in affected individuals treated by active metabolites of vitamin 1) iy suggested.
1NTRODI:CTIOiX
Le rachitisme
vitamino-resistant
hypophosphatemique
hereditaire
a trans-
mission dominante like au sexe est la variete la plus frequente des resistances idiopathiques & la vitamine D. 11 est appele encore: hypophosphatemie familiale et diabhte phosphatique hereditaire. Son mecanisme est encore peu clair. On a invoque successivement pour l’expliquer : - une anomalie primaire de l’absorption hyperparathyroidie secondairer ; --
intestinale
du calcium
entrainant
un trouble initial des transferts du phosphore au niveau du tubule ou non a une perturbation identique de la muqueuse intestinale2; une maladie primitive du squelette3.
Aucune de ces explications ne rend des faits observes4. L’orientation actuelle l’activation du cholecalcifCro15T6. Le degre de croissance staturale est variable, mais
une
renal associe
compte de facon satisfaisante de l’ensemble est d’evoquer une anomalie hereditaire de du rachitisme, de l’osteomalacie, du defaut il est admis que l’hypophosphatemie y est
constante, qu’elle peut etre asymptomatique chez certains sujets des familles atteintes, qu’elle est la premiere anomalie a apparaitre d&s les premieres semaines de la vie, qu’elle est incomplement corrigee par les supplements de phosphore et les doses massives de vitamine D. 11 est apparu ainsi que la baisse de concentration des ions orthophosphates dans les liquides extracellulaires etait au centre des systemes d’explication de la maladie, qu’elle ne se justifiait pas entierement a partir des troubles de transferts tubulaires et intestinaux et qu’elle etait sans doute secondaire a des anomalies gCnerales du metabolisme cellulaire7. Ce travail a pour but de preciser sur les erythrocytes de 17 malades atteints d’hypophosphat6mie familiale: (I) la glycolyse globale; (2) l’activitir des enzymes de la voie d’Embden-Meyerhof ; (3) la cinetique de penetration des ions orthophosphates ; (4) la concentration des diverses fractions phosphorees intracellulaires (orthophosphates,
phosphoderives
MATCRIEL
ET
intermediaires
de la glycolyse,
ATP).
MI:THODES
r. Sujets L’Ctude a et& faite chez 17 sujets atteints de rachitisme vitamino-resistant hypophosphatemique hereditaire et concerne II families. Dans quatre familles, les enfants et l’ascendant atteints ont CtC CtudiCs (un p&e et deux filles dans deux observations; une mere et un fils dans deux autres). Pour cinq autres enfants, il s’ag-it d’atteinte sporadique. La distribution des cas est la suivante: 4 adultes ages de 38 a 45 ans, Clin. Chim.
Acta,
~9 (I~;o)
261-271
RACHITISME
-
VITAMINO-RtiSISTAKT
13 enfants
263
HltRIhITAIRE
ages de 4 B 15 ans dont 5 gar$ons et 8 filles.
Les quatre
adultes n’ont pratiquement
jamais
et& trait&
par la vitamine
D.
Sur les 13 enfants etudies: pour quatre d’entre eux, le traitement par la vitamine D n’avait pas encore ete commence au moment de l’etude. Les onze autres malades etaient tous trait& par la vitamine D seule (I observation) ou par la vitamine D associee & une supplementation en calcium et en phosphore depuis des periodes allant de 3 mois a plus de 5 ans. 2. l’cchiques
a~aalytiq~~es
a. Le jwdtkerne7zt
de sang Deux Cchantillons de sang sont preleves: (I) L’un sur heparine, dans un tube a centrifuger refroidi et a@. Sur deux microprises d’essais, on determine l’hematocrite et le taux des reticulocytes. Le sang est centrifuge immediatement et le culot est lave deux fois avec une solution de KC1 0.154 p\Irefroidie. Sur ce culot globulaire seront effectuees: -
les dosages des activites des enzymes de la glycolyse, la mesure de l’activite glycolytique ifz V&O. (2) L’autre est directement preleve de la veine, sous agitation
efficace (dans un
tube a centrifuger refroidi et tare) dans IO ml d’acide perchlorique 1.2 N; IO ml de sang environ sont recueillis et le tube est a nouveau pese pour determiner le volume precis du prelevement. Apres homogeneisation du defecat, le tube est centrifuge a o”, le surnageant est preleve et conserve dans un bain de glace. Le culot est remis 2 fois en suspension homogene dans 5 ml d’acide perchlorique 0.6 N. Les surnageants rassembk sont neutralis& dans la glace sous agitation, soit par KHCO, solide, soit par KOH 5 N en evitant des surconcentrations locales. Le pH est controle a l’electrode de verre. Apres 15 min de contact, le precipite est Climine et l’extrait est aussitot lyophilise. Le residu set est dissout dans l’eau bidistillee glacee et complete de 20 ml. Sur cet extrait perchlorique conserve rapidement possible : les divers intermediaires de la glycolyse, les nucleotides adenyliques.
perchlorique a un volume
dans la glace, on determine
1). Tcclmiques de dosage Les techniques de dosage ont ete precedemment
le plus
detaillees:
-
Dosage des enzymes de la glycolyse. Les activites sont exprimees en ,umoles de substrat transform& par heure et par ml de globules rouges*. Dosage des intermediaires de la glycolyse et de l’acide lactiqueg. Dosage du z,3-diphosphoglycerate et du glucose r,6-diphosphatero. Les orthophosphates ont ete determines par la technique spectrophotometrique de Mozerskyll adapt6 au globule rouge. Cette methode tres sensible permet d’appretier moins de 3 ,ug de P. Xesure de l’activite glycolytique: Les globules rouges la&s (I ml) sont remis en suspension dans I ml de liquide de Krebs-Ringer isotonique (NaCl 115 mM; KC1 4 mM; MgCl, 5 mM; P0,3- 20 mhl; glucose IO mM) ajuste tres exactement a pH 7.4. On preleve aussitot 0.5 ml et la fiole est incubee a 37O a l’agitateur de Dubnoff. Un second prelevement de 0.5 ml est effect& au bout de 3 11. Les Cchantillons sont dCfCquirs par I ml d’acide perchlorique 0.9 M. Le glucose est dose enzymatiquement9. Clan. Chive.
-4cta,
zg (1970)
~61-271
Le glucose consommk est exprimil en pmoles par h par ml de globules rouges. CinCtique d’incorporation du 32P0,3- : L a cinktique d’entrke des ions PO,“- tlans les hkmaties a 6t6 d&ermin&e selon la technique de Cartier et Chedru12 sur des pr6 lhements effect&s aprk 15, 30, 60, 90, et 120 min d’incubation A 37“.
Les rhultats
obtenus
chez les sujets
vitamino-r&stank+
ont k!
cornpark
li
une moyenne &ablie sur une sCrie de trente cnfants normaus, d’2ge compris entre 3 et 16 ans. Les valeurs normales des diverses explorations sent identiques k c-elles que nous avions prkkdemment ditfinies chez des adultes. Pour analyser ces rhsultats, nous avons d’abord shies : (a) Enfants trait& par la vitamine D. (b) Enfants
non trait&
par la vitamine
r@parti nos 17 sujets
en trois
D.
(c) Adultes (non trait& par la vitamine D). Comme le montrent les Tableaux 1 et II, il n’apparait pas de diffkrences significatives entre ces diverses catkgories. Nous avons rassemblk les 17 vitamino-resistants et nous analyserons l’ensemble des rhultats en un seul groupc (Tableaux III et I\’ et Fig. I). r. L’nctizlite’ glycolytiqz~c~ L’activitP glycolytique exprimke en pmoles de glucose consommk par 11 A 37” et par ml de globules rouges est nettement plus Clevke (Tableau III) chez les rachitiques (1.61) que chez les normaux (1.31). Cette Gvation de la consommation de glucose pourrait correspondre A un exch de dkgradation empruntant la voie oxydativc directe des pentoses phosphates : la dktermination du rapport lactate/z glucose, clui TABLEAU
fntevm~diaivc
I
de la glycolys~
c0*zc17. (?moi! Sonnaclw 32.9 9.1 1.’ ‘7.3 66.1
Glucose-h-phosphate I’ructose-O~phosphate Fructose-I,6diphosphate Trioscs phosphates 3-PhosphoglycCrate z-Phosphoglyckate l’hosphoknol pyruvak
PO,3CinBtique L h Glucose cOnSOmme Lactate ford Lactate/z glucose Clin.
Chim.
Acta,
5. I T9.4 .5s..5
3.7 21.9 62.1
12.3
1 I.0
10.7
TX.2
19.8
2.04
0.7x 261-271
H 31.4
477.0 30.4 I.31
29 (1970)
d’i:rytkvocyti5)
.4 ‘9.7 IO.6
s7.x 97.0 4 770.0 I‘t35.0 1‘+203.0
Pyruvate Glucose-1,6-diphosphatc 2.3.DiphosphoglycCratc ATP P organiquc total
S/ill/
60.3
76.0 .+ 140.0 1503.0 ‘3 100.0 300.0 33.’ I.49 2.35 0.79
TO.4
T-t.5 59.9 94.6 1775.0 1603.0 14 706.0 303.0 34.9 I.72 2.61 0.76
RACHITISME VITAMINO-RiSISTANT
265
HtiRtiDITAIRE
TABLE.L\U II ACTWIT&
DES
ENZYMES
MISO-Rk.ISTASTS
DE
ESFANTS
_ ~~~~ EZZJWZ?
LA GLYCOLYSE liOpI‘ TRAIT&
LES
/moles
Phosphohe~omutasc Hcxokinasc Phosphohcxoisom&ase l’hosphofructokinasc Aldolase Trioses phosphates isom&ases Trioses phosphates d&hydrogdnases I’hosphoglycGrate kinase Phosphoglyc&-ate mutasc Enolase Pyrux-ate kinasc Lactic0 d&hydrog&ase Glucose-h-phosphate d&hydrog&ase h-Phosphofiluconate dbhydrogenase
0
CHEZ
(A, fi = 4)
60
SUJETS
NORMAUX
ET CHEZ LES PAREXTS
subs&at
(ti =
30).
LES
VITA-
(B, % = 4)
tvansfovd pav h par ml d’e’vythrocytrs
Normaux
A
B
17.0 8.7 408.0 49.0 22.4 15 720.0 659.0 1570.0 300.0 x3.0 127.0
22.6 7.5 387.0 47.3 23.6 ‘4 790.0 699.0 I 609.0 235.0 105.0 1X6.0 980.0
18.5 9.7 427.0 45.5 22.1 15 3x0.0 664.0
1010.0
CHEZ
KON TRAITh
7x.0 33.6
1702.0
238.0 9x.x 161.0 1140.0
75.5 31.9
86.0
29.0
120
Temps (min)
Fig. I. CinCtique d’entr& mine-rCsistants.
reflete l’intensite
dcs ions orthophosphate
dans l’grythrocyte.
de la voie d’Embden-Meyerhof,
montre
R\-R = rachitismes
que la repartition
vita-
entre les
deux processus glycolytiques est normale. Le dosage des divers enzymes de la voie d’EmbdenNeyerhof et des deux deshydrogenases de la voie des pentoses phosphates fournit des valeurs d’activites qui se situent dans les limites de variation de celles du globule rouge normal. Seule la pyruvate kinase est significativement augmenthe chez les rachitiques vitaminoresistants (Tableau IV). 2. La r&partition des Phos@hodtkriv& intvacellulaires La concentration intraglobulaire du phosphore
organique Clin. Chim.
n’est Acta,
29
pas sensible(1970)
261-271
Glucose-h-phosphate I;ructose-6-phosphate FructoseI,6-diphosphate Trioses phosphates 3-Phosphoglyc&ate z-Phosphoglyckrate PhosphoBnol pyruvate Pyruvate Glucose-1.6.diphosphatc l,j-Diphosphogly&ate ATP I’ organiquc total 1’04”Cin&ique I h Cindtiquc L h c;lucosc consomnl~ Lactate formt Lactate/z glucose * N.S. :
32.9 9. I 4.’
17.3
66.1 12.3 18.2
Sj.8 97.0 4770 143.5 ‘4203 477 22.X
3o.4 I.31 2.04
0.+
non significativcmcnt.
E:l.S.
lil
Phosphohexomutase Hcxokinasc I’hosphohesoisomCrasc Phosphofructokinasc Aldolase Trioses phosphates isomCrases Triose phosphate d&hydrogCnasc PhosphoglycCrate kinase PhosphoglycA-ate mutase Enolasc I’yruvate kinase Lactic0 dCshydrogbnase Glucose-6-phosphate d&hydrog&ase h-Phosphogluconate d&hydrog&nasc
17.0 x 7 40s -to 22.4 I5 7”’
hgc) 1570 3oo 83.0 127 IO10 78.0
33.6
I.3 0.5-l IS.0
3.3
1.o
73
3X 74 IO
4.2 6.4 4’ 3.8
2.2
ment modifiee: le taux de P total acidosoluble, qui comprend les orthophosphates et les phosphoderives participant a la glycolyse (intermediaires phosphoryles et nucleotides) est identique chez les rachitiques (14.4 mM) et chez les temoins (14.7 m&I) (Tableau III). L’augmentation de l’activite glycolytique ne provoque pas d’accumulation des intermediaires de la voie d’Embden-Meyerhof, ni d’elevation des diphosphodbrives caracteristiques de l’hematie (z,3-diphosphoglydrate et glucose-I,6-diphosphate). Clin. Chim. Acta,
29 (1970)
261-2 71
RACHITISME
VITAMINO-RIiSISTANT
Toutefois, phore mineral (P = 0.002)
chez les sujets (orthophosphates)
et celle de I’ATP
HcRtiDITAIRE
rachitiques,
267 la concentration
est significativement augmentee
intracellulaire
abaissee
en phos-
de 0.477 a 0.326 mM
de 1.43 a 1.60 mM (P = 0.01).
3. Ln jwrme’abilite aux io?Ls POb3La Fig. I compare la cinetique d’entree des orthophosphates extracellulaires dans le globule rouge chez les sujets normaux et rachitiques : la vitesse de pen&ration est significativement accrue chez les vitamino-resistants. En 2 h, elle passe de 30.4 a du P mineral extracellulaire (P = 0.001). 34.1;;; COMMENTAIRES
11s porteront d’une part sur l’interpretation cellulaire des faits observes, d’autre part sur l’integration de cette interpretation dans le concept general de resistance au cholecalciferol. I. Inter~rdation des fads obseds Lil’tkhelon cellulaire (a) Certains aspects de la glycolyse ont deja CtP: CtudiCs dans les rachitismes humains et eq%rimentaux. Des 1926, Freudenberg
avait constate
que la glycolyse
est diminuee
dans les
erythrocytes d’enfants atteints de rachitisme vitamino-prive. Une observation identique Ctait faite dans le rachitisme experimental par carence phosphoree chez le rat. La diminution de la glycolyse s’accompagne d’une baisse de la concentration intraerythrocytaire des orthophosphates, de 1’ATP et du z,3-diphosphoglycCrate13~14. Cette baisse a CtC confirmee recemment par Jacobasch et aLI chez le rat rachitique: ils l’attribuent a la depletion phosphoree car elle est corrigee par l’addition de POd3- au milieu d’incubation. Sur les erythrocytes de malades atteints de rachitisme vitamino-resistant hypophosphatemique, Syllm-Rapoport et al.16 ont constate que l’activite glycolytique du globule rouge est normale et que l’addition d’orthophosphates est sans effet sur elle. Mais l’activite de l’hexokinase est diminuee de moitie. Apres traitement prolong& par I a 2 mg par jour de vitamine D par la bouche, associee a une solution de phosphate apportant 2 g de P par jour, le niveau intra et extracellulaire des orthophosphates s’eleve et l’activite de l’hexokinase redevient normale. Les Crythrocytes nouvellement form& sont caracterises par une elevation de l’hexokinase. Syllm-Rapoport et al. attribuent a l’abaissement prolonge du niveau des ions POh3- un effet de repression sur la svnthese de l’hexokinase et a la vitamine D un effet inducteur. Cartels et aL2 ont etudie les hepatocytes d’un enfant de 18 mois atteint de rachitisme vitamino-resistant hypophosphatemique. 11s ont trouve un abaissement de l’activite de l’hexokinase et de la diphosphofructoaldolase. La glucose-6-phosphate deshydrogenase et la 6-phosphogluconate deshydrogenase Ctaient accrues de 5 a 6 fois. Dans le foie, la quantite de fructose-r,6-phosphate Ctait diminuee. A propos de l’ensemble de ces resultats, deux remarques peuvent &tre faites. D’une part, les resultats notes sur l’hepatocyte sont difficiles a comparer avec ceux vus sur l’erythrocyte, &ant don& les differences normales de l’equilibre des diverses voies glycolytiques dans ces deux types de cellules. D’autre part, les resultats sur le rat ont et& observes au tours du rachitisme par carence phosphor&e. 11 est interesClin. Chim. Acta, zg (1970)261~271
sant de noter & ce propos les observations faites par Lichtman et al.” chez un ur&iquc en dCplCtion phosphorke grave due & 1’hPmodialyse chronique et A la prise d’hydroxJ& d’alumine. L’hypophosphatemie s&&-e coi’ncidait avec une chute de 1’ATP dans 1~s krythrocytes, contrairement & ce que nous awns observ& chez nos malades. Ccttrl situation &ait &par&e par administration de phosphates. (b) Les re’sultats obtenus chez nos 17 malades peuvent &tre r&urn& en plwieurpropositions. L’activite’ glycolytique est plus 6levCe chez les malades que chez les tdmoins normaux. Le m&anisme de la glycolvse n’est pas modifii: et le rapport du lactate form6 au glucose consommk est normal. Ainsi la repartition de la glycolyse entrc la XYG~: d’Embden-Meyerhof et la voie de Rapoport-Luebering qui conduit j l’accumulation de z,3-diphosphoglyc&ate fonctionne normalement, puisque le taux de cette substanw n’est pas modifS. L’activitk des enzymes de la voie d’Embden_Meyerhof est normale, S_l’exception de la pyruvate kinase qui est augment&e chez les malades. La vitesse de la glycolyse de l’&-ythrocyte est Ctroitement like 2 l’activitk de trois enzymes catalysant Its &apes irrkversibles de la glycolyse qui s’accompagnent d’une importante d&n&lation &erg&clue : l’hexokinase, la phosphofructokinase et la pyruvate kinase. (‘es trois enzymes ont une activiti: faible, done limitante, par rapport A celle des autres &apes non rkgulatrices de la glycolyse et prCsentent un caracthre allost&-ique, leur activitP. &ant Ctroitement contrblGe par le niveau de certains intermkdiaires de la glycolysel”. Les modifications d’activitk de la pyruvate kinase ont une influence directe sur l’intensitir de la glycolyse. Dans l’ankmie hCmolytique par dCficit en pyruvate kinase, la glycolyse &ythrocytaire est diminut!e et cette enzymopathie provoque, dans l’&ythrocyte, une accumulation secondaire de certains intermkdiaires de la voie d’Embden-Meyerhof19. Chez nos malades, l’accroissement de l’activitk de la pyruvate kinase provoque une augmentation de la glycolyse, sans entrainer de modifications au niveau des d&iv& intermkdiaires qui se forment entre le glucose et le lactate. La r+artition du ~hos#zorc intrae’rythrocytnirc est particuliPrc. La concentration des phosphod&iv& intermediaires de la glycolyse est dans lcs limites de la normale. La concentration de 1’ATP est augment&: cette variation est en bonne corr&lation avec l’exagkration de la glycolyse. La concentration en orthophosphates est diminuke, comme dans le liquide extracellulaire. Le niveau intracellulaire des ions P0,3- est le reflet d’un double kquilibre qui s’ktablit : d’une part entre les orthophosphates intra et extracellulaires par un processus de diffusion simple, d’autre part j l’intkrieur de la cellule, entre les orthophosphates et l’ensemble dcs
-
phosphodCriv& qui apparaissent et disparaissent au tours de la glycolyse. Ces deux kquilibres Cvoluent avec des vitesses diffkrentes. La vitesse de diffusion de P0,8- A, travers la membrane est indirectement dCpendante de l’intensitk de la glycolyse: lorsque 1’activitC glycolytique est accrue-comme tel est le cas chez nos sujets rachitiques-la vitesse d’entrCe des ions P0,8- est Cgalement augmentbe. Mais cette permkabilitk accCl&e n’affecte pas l’kquilibre final de repartition entre les ions POd3- de part et d’autre de la membrane: la concentration intraglobulaire du P minCra1 est abaisske en proportion de l’hypophosphat4mie, comme le laisse prkvoir la CIi,z.
Chim.
Acta,
29
(1070)
261-271
R.kCHITISME VITAMINO-RIkSTANT
relation
de Gibbs-Donnan.
HfiRtiDITAIRE
Dans le rachitisme
globule rouge aux ions orthophosphates
269 vitamino-resistant,
n’est done pas modifiee,
la permeabilite
du
et l’hypophosphate-
mie n’apparait pas comme la consequence d’une fuite intracellulaire des ions P0,3provoquee par une modification de structure de la membrane ou par une accumulation des formes organiques du P associees a la glycolyse. (c) L’la~~~ophos$hattGnie du rachitisme vitamino-resistant idiopathique a recu deux explications. L’une est l’insuffisance de l’absorption intestinale du phosphore alimentaire; il a et6 demontre qu’elle etait secondaire a la malabsorption intestinale et qu’en diminuant l’apport alimentaire de calcium, l’absorption du phosphore redevenait normale20~21. L’autre est l’abaissement du coefficient de reabsorption tubulaire du phosphore (TRP). Le TRP est en v&it6 moderement abaisse dans cette maladieZ2; il varie normalement avec l’apport alimentaire de phosphore4 et remonte sous l’effet de la perfusion veineuse de calcium23. Cette diminution du TRP est en general conside&e comme le reflet d’un hyperparathyroi’disme secondaire. Toutefois, ces deux explications de l’hypophosphatemie sont insuffisantes. Nos constatations permettent d’en Cvoquer une troisieme. Tout se passe comme si une entree exageree d’orthophosphate dans la cellule maintenait la baisse de concentration de l’ortophosphate dans le milieu extracellulaire. Cette situation est secondaire a deux faits correlatifs: l’augmentation de la synthese d’ATP et l’accroissement de la glycolyse avec l’elevation de l’activite de la pyruvate kinase. Enfin, il est necessaire de souligner deux points importants: d’une part, il est evident qu’une telle explication ne prendrait sa valeur que s’il
-
etait demontre que les anomalies metaboliques constatees retrouvees sur d’autres cellules; d’autre part, il apparait que des anomalies metaboliques
sur l’erythrocyte
etaient
ont Cte retrouvees
chez
les malades atteints de deformations osseuses trait&es par des doses massives de vitamine D avec ou sans supplement de phosphore ou non traitees, et chez les sujets de leur famille atteints d’hypophosphatemie asymptomatique. On peut dire que ces anomalies ne sont pas modifiees par le traitement au niveau de l’erythrocyte et qu’elles sont identiques, qu’il y ait ou non de production clinique de la maladie. II.
I@yation duns le concept de r&stance h&dditaire au choltkalcif+ol (a) Le chole’calcif~~ol ou vitamine D, peut etre consider& chez l’homme ou comme
une vitamine apportee par l’alimentation et absorbee par l’intestin g&e, ou comme une hormone ClaborCe dans la peau en partie par une reaction photochimique. Le cholecalciferol a un systeme de transport specifique dans le plasma, une cr,-globulineZ3. 11 est metabolise en differents produits isoles en chromatographie en quatre pits. La plus grande partie du Pit IV est faite d’un des metabolites actifs du cholecalciferol, le z5-hydroxycholecalcifCro1 25. Celui-ci a pour effecteurs principaux 1’0s et la muqueuse intestinale26,27. A l’echelon cellulaire ce derive z5-hydroxyle semble se concentrer au niveau du noyau : membraneZ8 ou chromatine26 et peut-&tre en partie au niveau du cytoplasme. 11 agirait en permettant la liberation du message hereditaire necessaire a la syntlrese d’une proteine de transport cellulaire du calcium, voisine ou identique ,i celle d&rite par WassermanZ9, ou d’une structure de la membrane cellulaire permettant le transfert du calcium30. L’action du cholecalciferol se fait par l’intermediaire d’une activation de l’adenylcyclase et de la synthese d’AMP cyclique31. Cette action est bloquee par l’actinomycine32. Clin. Chim. Ada,
zg (1970) 261-271
270
C:?RTIER
Ct rd.
On peut, en fonction de ces donnees recentes, supposer theoriquement quatrc mecanismes de vitamino-resistance: (I) excretion rxagerPe des derives actifs, cc qui a Pti: retrouve au niveau des urines des uremiques3”; (2) anomalie du systPme de tr-ansport plasmatique; (3) insuffisance ou absence de I’activation par exemple en derive polaire as-hydroxyle ; (4) anomalie des recepteurs cellulaires. Les travaux d’Avioli et aL5, et de Deluca ct al.6 montrent que dans le rachitismc vitamino-resistant idiopathique, le metabolisme du cholecalciferol est ralenti, sa z5hydroxylation est diminuee. Certains resultats therapeutiques avec le 25-h~drosycholecalciferol dans cette maladie semblent en partie confirmer ces constatation+‘. (b) Qu’il existe dans la maladie en cause une anomalie hfireditaire de l’activation du cholecalcif&ol, ou une reponse anormale des recepteurs, dans les deux cas, le transport cellulaire du calcium est perturbe, et les consequences d’une diminution de ces mouvements intracellulaires sont encore ma1 connues. On peut cependant, speculatif, rapprocher ce qui est etabli dans deux situations inverses.
a titre
D’une part, on sait depuis 20 ans que l’addition de calcium a des mitochondries stoppe l’absorption des orthophosphates necessaires a la recharge de 1’4TP35~3i. D’autre part, la vitamine D diminue l’utilisation du citrate au niveau des mitochondries
des cellules de l’os, du rein et du cartilage
epiphysaire
du rat rachitique
(refs. 38, 39). I1 est possible, mais non demontr6, qu’une situation de resistance a la vitamine D et d’anomalie secondaire de transfert cellulaire de calcium aboutisse a une situation inverse : consommation exageree de citrate au niveau du cycle de Krebs et exageration ce qui aboutirait a un desequilibre metaboliquc des phosphorylations oxydatives, comparable a celui que nous constatons dans les hematies. I1 convient cependant de faire certaines reserves sur ces speculations. On con nait bien les effets de l’exces de vitamine D ou de calcium sur les modeles mitochondriaux, mais non de son absence. Par ailleurs, l’erythrocyte depourvu de noyau et de mitochondries n’est certainement pas un type cellulaire favorable pour etudier les effets des derives metaboliques actifs du cholecalciferol, puisqu’il semble demontrer que ceux-ci agissent initialement au niveau du noyau. Dans ce travail, nous nous proposions de mettre en evidence, chew Irs vitaminoresistants,
une fuite intracellulaire
eventuelle
des ions P0.13-, expliquant
l’hypophos-
phatemie, soit par modification de la permeabilitit de la membrane plasmale, soit par une alteration metabolique entrainant, par un trouble de la glycoiyse, une accumulation de P sous forme organique. En raison de sa structure simplifiee et des facilites de prelevement, l’ervthroc?;t ta reoresentait le materiel cellulaire le plus favorable. Les resultats de cette etude nous montrent qu’il conviendrait d’etendre cette exploration mirtabolique : - i d’autres types cellulaires que l’erythrocyte, sur des malades trait6 par le z5-OH-cholecalcifirol, sur des nouveaux-nPs de familles atteintes avant i’apparition de l’l~~;~~o~~l~o~pl~;~temie.
RACHITI%lE
VITAMINO-Rl%ISTANT
271
HkRtiDITAIRE
BIHLIC)C;R.L\PHIE I P. ALBRIGHT, ,\. RI. BUTLER ET E. BLOOMBERG, Am. J. Diseases Children, 54 (1937) 529. 2 H. BARTELS ET H. GUNSCHERA, Helv. Paediat. Acta, z (1967) 181. 3 J. WIXBERG,C.G. BERGSTRAND,B. ENGPELDT ET R.~ETTERSTROM, Acta Pardiat.,43 (1954) 4 5 6 7 X 9
IO II 12
13 14 15 16
347. Ii. STEENDIJK, Helv. Paediat. Acta, 17 (1962) 65. L. 1.. AVIOLI, T. li.WILLIAMS, J. LUND ET H. DELUCA, J. Clin. Invest., 46 (1967) 1907. H. 12. LIELUCA, J. LUND, A. ROENBLOOM ET C. C. LOBECK, J. Paedzat., 70 (1967) 828. J. R&Y ET J, FREZAL, l
57. 17 bl. .A. LICHTMAN,
D. R. MILLER ET R. B. FREEMAS, New E+zgZ. J. Med., 280 (1969) 240. 18 f'.CARTIER, .4.NAJI\IAN,J. P. LEROUX ET H. TEMKINE, Clin. Chim. Acta, 22 (1968) 165. 19 11. :I. ROBINSON, P. BROWE?; LODER ET G. C. DE GRUCHY,L?Y~~. J. Haematol., 7 (1961) 327. 20 S. GERBEAUX-BALSAN, Rev. Fran~.l?tudes Clin. Biol.,IO (1965) 65. 21 L. GUSTHER, E. T. COHN, W. E. COHX ET D. M. GREENBERG, Am. J. Diseases Children, 66 (‘943) 5’7. 22 P. FOURRIAS
ET P. ROYER,
Calcium Metabolism
and theBone,
Vol. I, Blackwell,Oxford, 1968,
23 &.~~%,TRADET, P. ROVER ET D. JACOB, I
31 E.~XEVILLE ET E. S. HOLDSWORTH, FEBS Letters, 2 (1969) 313. 32 J. ZULL, E. ELWOOD, CZARNOWSKA-MISZTAL ET H. F. DELUCA, Science,149 (1965) 182. 33 L. 1'.;\VIOLI,S. BIRGE, S. WONLEE ET E. SLATOPOLSKY, J, Clin. Invest., 47 (1968) 2239. q-i C. T. C. PAK. H. F. DELUCA, 1. &I. CHAVEZ DE Los RIOS ET T. SUDA, Clin.Res., 17 (1969) 291. .?; A. L. LEHSIKGER, J. Biol. Chim., 178 (1949) 625. 36 R. \',\NPOTTER, J. Biol. Chew, 169 (1947) ‘7. 37 L. ~VOJTCZAK ET A. L. LEHKINGER, Biochim. Biophys. Acta, 57 (1961) 442. 3X H. 1’. DELUCA, I;. C. GRAN ET H. STEENBOCK, J. Biol. Chrm., 224 (1957) 201. 39 A. IV. NORMAX ET H. F. DELUCA, Biochrm. J., 91 (1964) 124. Clin. Chim.
Acta,
29 (1970)
261-271
CHIMICA
I?TUDE
DE
CYTES
AUX
L4
GLYCOLYSE
IONS
MINO-RI?SISTANT
I’.
CARTIER”,
261
ACTA
ET
DE
Lt\ PERMI?ABILIT~
ORTHOPHOSPHATES
DANS
HYPOPHOSPHAT&IQUE
J. P. LEROUXa,
S. H.-\LS.4Nhs*
ET P.
LE
DES
GRYTHRO-
RACHITISME
VITA-
HI?RI?DITAIRE
ROYER”
a Unite’ d’Emyymologie Me’dicale (U 75 INSERT) et h Unite’ d’.&ude dcs Maladies du ~M&abolisme chew I’Enfant (lY 30 INSER.W), HJpital des Enfants-Malades, r+y, Rue de Sduvcs, Paris Xlvdwze (France) (Rqu
lc 2j mars,
1970)
SUMMARY
Study on Glycolysis and Permeability of Erythrocytes to Ortho@hos$hate ions in Hereditary Hy@ophosphatemic Vitamin D-Resistant Rickets Whole glycolysis, enzymatic activities in the Embden-Meyerhof pathway, kinetics of the penetration of orthophosphate ions, and the concentration of various intracellular fractions, i.e. orthophosphates, intermediate phosphoderivatives of glycolysis and ATP, were studied in 30 normal subjects and in 17 subjects with hereditary hypophosphatemic vitamin D-resistant rickets. A comparison of the results obtained with children treated with vitamin D, those not treated with vitamin D and untreated adults shows no significant differences among the three categories. The following results were obtained in our study of affected subjects: I. Glycolytic activity is elevated without inducing any accumulation of the intermediates between glucose and lactate. 2. Enzymatic activity in the Embden-Meyerhof pathway is normal, except for pyruvate kinase which is significantly increased. 3. The concentration of the intermediate normal.
phosphoderivxtives
of glycolysis
is
4. ATP concentration is increased (P = 0.01). Intracellular orthophosphate concentration is decreased (P = o.ooz). 6. The kinetics of the entrance of extracellular orthophosplrates into red blood cells is significantly increased (P = 0.001) without affecting the final equilibrium of distribution of phosphate ions throughout all parts of the membrane. These results make one think that the hypophosphatemia seen in hereditary vitamin D-resistant rickets cannot be explained either by modification of the plasma membrane permeability to phosphorus or by alteration of glycolysis. The problem of vitamin D resistance and the resultant disturbances which it causes in the cellular transport of calcium are cited as a tentative explanation for 5.
* Mlitre
de
Rxherchc
au
CNRS.
Cliw. Chirn. Acta,
29 (1970)
261-271
the abnormalities which have been observed. Mrtabolic exploration in otlrcr types of cells and in affected individuals treated by active metabolites of vitamin 1) iy suggested.
1NTRODI:CTIOiX
Le rachitisme
vitamino-resistant
hypophosphatemique
hereditaire
a trans-
mission dominante like au sexe est la variete la plus frequente des resistances idiopathiques & la vitamine D. 11 est appele encore: hypophosphatemie familiale et diabhte phosphatique hereditaire. Son mecanisme est encore peu clair. On a invoque successivement pour l’expliquer : - une anomalie primaire de l’absorption hyperparathyroidie secondairer ; --
intestinale
du calcium
entrainant
un trouble initial des transferts du phosphore au niveau du tubule ou non a une perturbation identique de la muqueuse intestinale2; une maladie primitive du squelette3.
Aucune de ces explications ne rend des faits observes4. L’orientation actuelle l’activation du cholecalcifCro15T6. Le degre de croissance staturale est variable, mais
une
renal associe
compte de facon satisfaisante de l’ensemble est d’evoquer une anomalie hereditaire de du rachitisme, de l’osteomalacie, du defaut il est admis que l’hypophosphatemie y est
constante, qu’elle peut etre asymptomatique chez certains sujets des familles atteintes, qu’elle est la premiere anomalie a apparaitre d&s les premieres semaines de la vie, qu’elle est incomplement corrigee par les supplements de phosphore et les doses massives de vitamine D. 11 est apparu ainsi que la baisse de concentration des ions orthophosphates dans les liquides extracellulaires etait au centre des systemes d’explication de la maladie, qu’elle ne se justifiait pas entierement a partir des troubles de transferts tubulaires et intestinaux et qu’elle etait sans doute secondaire a des anomalies gCnerales du metabolisme cellulaire7. Ce travail a pour but de preciser sur les erythrocytes de 17 malades atteints d’hypophosphat6mie familiale: (I) la glycolyse globale; (2) l’activitir des enzymes de la voie d’Embden-Meyerhof ; (3) la cinetique de penetration des ions orthophosphates ; (4) la concentration des diverses fractions phosphorees intracellulaires (orthophosphates,
phosphoderives
MATCRIEL
ET
intermediaires
de la glycolyse,
ATP).
MI:THODES
r. Sujets L’Ctude a et& faite chez 17 sujets atteints de rachitisme vitamino-resistant hypophosphatemique hereditaire et concerne II families. Dans quatre familles, les enfants et l’ascendant atteints ont CtC CtudiCs (un p&e et deux filles dans deux observations; une mere et un fils dans deux autres). Pour cinq autres enfants, il s’ag-it d’atteinte sporadique. La distribution des cas est la suivante: 4 adultes ages de 38 a 45 ans, Clin. Chim.
Acta,
~9 (I~;o)
261-271
RACHITISME
-
VITAMINO-RtiSISTAKT
13 enfants
263
HltRIhITAIRE
ages de 4 B 15 ans dont 5 gar$ons et 8 filles.
Les quatre
adultes n’ont pratiquement
jamais
et& trait&
par la vitamine
D.
Sur les 13 enfants etudies: pour quatre d’entre eux, le traitement par la vitamine D n’avait pas encore ete commence au moment de l’etude. Les onze autres malades etaient tous trait& par la vitamine D seule (I observation) ou par la vitamine D associee & une supplementation en calcium et en phosphore depuis des periodes allant de 3 mois a plus de 5 ans. 2. l’cchiques
a~aalytiq~~es
a. Le jwdtkerne7zt
de sang Deux Cchantillons de sang sont preleves: (I) L’un sur heparine, dans un tube a centrifuger refroidi et a@. Sur deux microprises d’essais, on determine l’hematocrite et le taux des reticulocytes. Le sang est centrifuge immediatement et le culot est lave deux fois avec une solution de KC1 0.154 p\Irefroidie. Sur ce culot globulaire seront effectuees: -
les dosages des activites des enzymes de la glycolyse, la mesure de l’activite glycolytique ifz V&O. (2) L’autre est directement preleve de la veine, sous agitation
efficace (dans un
tube a centrifuger refroidi et tare) dans IO ml d’acide perchlorique 1.2 N; IO ml de sang environ sont recueillis et le tube est a nouveau pese pour determiner le volume precis du prelevement. Apres homogeneisation du defecat, le tube est centrifuge a o”, le surnageant est preleve et conserve dans un bain de glace. Le culot est remis 2 fois en suspension homogene dans 5 ml d’acide perchlorique 0.6 N. Les surnageants rassembk sont neutralis& dans la glace sous agitation, soit par KHCO, solide, soit par KOH 5 N en evitant des surconcentrations locales. Le pH est controle a l’electrode de verre. Apres 15 min de contact, le precipite est Climine et l’extrait est aussitot lyophilise. Le residu set est dissout dans l’eau bidistillee glacee et complete de 20 ml. Sur cet extrait perchlorique conserve rapidement possible : les divers intermediaires de la glycolyse, les nucleotides adenyliques.
perchlorique a un volume
dans la glace, on determine
1). Tcclmiques de dosage Les techniques de dosage ont ete precedemment
le plus
detaillees:
-
Dosage des enzymes de la glycolyse. Les activites sont exprimees en ,umoles de substrat transform& par heure et par ml de globules rouges*. Dosage des intermediaires de la glycolyse et de l’acide lactiqueg. Dosage du z,3-diphosphoglycerate et du glucose r,6-diphosphatero. Les orthophosphates ont ete determines par la technique spectrophotometrique de Mozerskyll adapt6 au globule rouge. Cette methode tres sensible permet d’appretier moins de 3 ,ug de P. Xesure de l’activite glycolytique: Les globules rouges la&s (I ml) sont remis en suspension dans I ml de liquide de Krebs-Ringer isotonique (NaCl 115 mM; KC1 4 mM; MgCl, 5 mM; P0,3- 20 mhl; glucose IO mM) ajuste tres exactement a pH 7.4. On preleve aussitot 0.5 ml et la fiole est incubee a 37O a l’agitateur de Dubnoff. Un second prelevement de 0.5 ml est effect& au bout de 3 11. Les Cchantillons sont dCfCquirs par I ml d’acide perchlorique 0.9 M. Le glucose est dose enzymatiquement9. Clan. Chive.
-4cta,
zg (1970)
~61-271
Le glucose consommk est exprimil en pmoles par h par ml de globules rouges. CinCtique d’incorporation du 32P0,3- : L a cinktique d’entrke des ions PO,“- tlans les hkmaties a 6t6 d&ermin&e selon la technique de Cartier et Chedru12 sur des pr6 lhements effect&s aprk 15, 30, 60, 90, et 120 min d’incubation A 37“.
Les rhultats
obtenus
chez les sujets
vitamino-r&stank+
ont k!
cornpark
li
une moyenne &ablie sur une sCrie de trente cnfants normaus, d’2ge compris entre 3 et 16 ans. Les valeurs normales des diverses explorations sent identiques k c-elles que nous avions prkkdemment ditfinies chez des adultes. Pour analyser ces rhsultats, nous avons d’abord shies : (a) Enfants trait& par la vitamine D. (b) Enfants
non trait&
par la vitamine
r@parti nos 17 sujets
en trois
D.
(c) Adultes (non trait& par la vitamine D). Comme le montrent les Tableaux 1 et II, il n’apparait pas de diffkrences significatives entre ces diverses catkgories. Nous avons rassemblk les 17 vitamino-resistants et nous analyserons l’ensemble des rhultats en un seul groupc (Tableaux III et I\’ et Fig. I). r. L’nctizlite’ glycolytiqz~c~ L’activitP glycolytique exprimke en pmoles de glucose consommk par 11 A 37” et par ml de globules rouges est nettement plus Clevke (Tableau III) chez les rachitiques (1.61) que chez les normaux (1.31). Cette Gvation de la consommation de glucose pourrait correspondre A un exch de dkgradation empruntant la voie oxydativc directe des pentoses phosphates : la dktermination du rapport lactate/z glucose, clui TABLEAU
fntevm~diaivc
I
de la glycolys~
c0*zc17. (?moi! Sonnaclw 32.9 9.1 1.’ ‘7.3 66.1
Glucose-h-phosphate I’ructose-O~phosphate Fructose-I,6diphosphate Trioscs phosphates 3-PhosphoglycCrate z-Phosphoglyckate l’hosphoknol pyruvak
PO,3CinBtique L h Glucose cOnSOmme Lactate ford Lactate/z glucose Clin.
Chim.
Acta,
5. I T9.4 .5s..5
3.7 21.9 62.1
12.3
1 I.0
10.7
TX.2
19.8
2.04
0.7x 261-271
H 31.4
477.0 30.4 I.31
29 (1970)
d’i:rytkvocyti5)
.4 ‘9.7 IO.6
s7.x 97.0 4 770.0 I‘t35.0 1‘+203.0
Pyruvate Glucose-1,6-diphosphatc 2.3.DiphosphoglycCratc ATP P organiquc total
S/ill/
60.3
76.0 .+ 140.0 1503.0 ‘3 100.0 300.0 33.’ I.49 2.35 0.79
TO.4
T-t.5 59.9 94.6 1775.0 1603.0 14 706.0 303.0 34.9 I.72 2.61 0.76
RACHITISME VITAMINO-RiSISTANT
265
HtiRtiDITAIRE
TABLE.L\U II ACTWIT&
DES
ENZYMES
MISO-Rk.ISTASTS
DE
ESFANTS
_ ~~~~ EZZJWZ?
LA GLYCOLYSE liOpI‘ TRAIT&
LES
/moles
Phosphohe~omutasc Hcxokinasc Phosphohcxoisom&ase l’hosphofructokinasc Aldolase Trioses phosphates isom&ases Trioses phosphates d&hydrogdnases I’hosphoglycGrate kinase Phosphoglyc&-ate mutasc Enolase Pyrux-ate kinasc Lactic0 d&hydrog&ase Glucose-h-phosphate d&hydrog&ase h-Phosphofiluconate dbhydrogenase
0
CHEZ
(A, fi = 4)
60
SUJETS
NORMAUX
ET CHEZ LES PAREXTS
subs&at
(ti =
30).
LES
VITA-
(B, % = 4)
tvansfovd pav h par ml d’e’vythrocytrs
Normaux
A
B
17.0 8.7 408.0 49.0 22.4 15 720.0 659.0 1570.0 300.0 x3.0 127.0
22.6 7.5 387.0 47.3 23.6 ‘4 790.0 699.0 I 609.0 235.0 105.0 1X6.0 980.0
18.5 9.7 427.0 45.5 22.1 15 3x0.0 664.0
1010.0
CHEZ
KON TRAITh
7x.0 33.6
1702.0
238.0 9x.x 161.0 1140.0
75.5 31.9
86.0
29.0
120
Temps (min)
Fig. I. CinCtique d’entr& mine-rCsistants.
reflete l’intensite
dcs ions orthophosphate
dans l’grythrocyte.
de la voie d’Embden-Meyerhof,
montre
R\-R = rachitismes
que la repartition
vita-
entre les
deux processus glycolytiques est normale. Le dosage des divers enzymes de la voie d’EmbdenNeyerhof et des deux deshydrogenases de la voie des pentoses phosphates fournit des valeurs d’activites qui se situent dans les limites de variation de celles du globule rouge normal. Seule la pyruvate kinase est significativement augmenthe chez les rachitiques vitaminoresistants (Tableau IV). 2. La r&partition des Phos@hodtkriv& intvacellulaires La concentration intraglobulaire du phosphore
organique Clin. Chim.
n’est Acta,
29
pas sensible(1970)
261-271
Glucose-h-phosphate I;ructose-6-phosphate FructoseI,6-diphosphate Trioses phosphates 3-Phosphoglyc&ate z-Phosphoglyckrate PhosphoBnol pyruvate Pyruvate Glucose-1.6.diphosphatc l,j-Diphosphogly&ate ATP I’ organiquc total 1’04”Cin&ique I h Cindtiquc L h c;lucosc consomnl~ Lactate formt Lactate/z glucose * N.S. :
32.9 9. I 4.’
17.3
66.1 12.3 18.2
Sj.8 97.0 4770 143.5 ‘4203 477 22.X
3o.4 I.31 2.04
0.+
non significativcmcnt.
E:l.S.
lil
Phosphohexomutase Hcxokinasc I’hosphohesoisomCrasc Phosphofructokinasc Aldolase Trioses phosphates isomCrases Triose phosphate d&hydrogCnasc PhosphoglycCrate kinase PhosphoglycA-ate mutase Enolasc I’yruvate kinase Lactic0 dCshydrogbnase Glucose-6-phosphate d&hydrog&ase h-Phosphogluconate d&hydrog&nasc
17.0 x 7 40s -to 22.4 I5 7”’
hgc) 1570 3oo 83.0 127 IO10 78.0
33.6
I.3 0.5-l IS.0
3.3
1.o
73
3X 74 IO
4.2 6.4 4’ 3.8
2.2
ment modifiee: le taux de P total acidosoluble, qui comprend les orthophosphates et les phosphoderives participant a la glycolyse (intermediaires phosphoryles et nucleotides) est identique chez les rachitiques (14.4 mM) et chez les temoins (14.7 m&I) (Tableau III). L’augmentation de l’activite glycolytique ne provoque pas d’accumulation des intermediaires de la voie d’Embden-Meyerhof, ni d’elevation des diphosphodbrives caracteristiques de l’hematie (z,3-diphosphoglydrate et glucose-I,6-diphosphate). Clin. Chim. Acta,
29 (1970)
261-2 71
RACHITISME
VITAMINO-RIiSISTANT
Toutefois, phore mineral (P = 0.002)
chez les sujets (orthophosphates)
et celle de I’ATP
HcRtiDITAIRE
rachitiques,
267 la concentration
est significativement augmentee
intracellulaire
abaissee
en phos-
de 0.477 a 0.326 mM
de 1.43 a 1.60 mM (P = 0.01).
3. Ln jwrme’abilite aux io?Ls POb3La Fig. I compare la cinetique d’entree des orthophosphates extracellulaires dans le globule rouge chez les sujets normaux et rachitiques : la vitesse de pen&ration est significativement accrue chez les vitamino-resistants. En 2 h, elle passe de 30.4 a du P mineral extracellulaire (P = 0.001). 34.1;;; COMMENTAIRES
11s porteront d’une part sur l’interpretation cellulaire des faits observes, d’autre part sur l’integration de cette interpretation dans le concept general de resistance au cholecalciferol. I. Inter~rdation des fads obseds Lil’tkhelon cellulaire (a) Certains aspects de la glycolyse ont deja CtP: CtudiCs dans les rachitismes humains et eq%rimentaux. Des 1926, Freudenberg
avait constate
que la glycolyse
est diminuee
dans les
erythrocytes d’enfants atteints de rachitisme vitamino-prive. Une observation identique Ctait faite dans le rachitisme experimental par carence phosphoree chez le rat. La diminution de la glycolyse s’accompagne d’une baisse de la concentration intraerythrocytaire des orthophosphates, de 1’ATP et du z,3-diphosphoglycCrate13~14. Cette baisse a CtC confirmee recemment par Jacobasch et aLI chez le rat rachitique: ils l’attribuent a la depletion phosphoree car elle est corrigee par l’addition de POd3- au milieu d’incubation. Sur les erythrocytes de malades atteints de rachitisme vitamino-resistant hypophosphatemique, Syllm-Rapoport et al.16 ont constate que l’activite glycolytique du globule rouge est normale et que l’addition d’orthophosphates est sans effet sur elle. Mais l’activite de l’hexokinase est diminuee de moitie. Apres traitement prolong& par I a 2 mg par jour de vitamine D par la bouche, associee a une solution de phosphate apportant 2 g de P par jour, le niveau intra et extracellulaire des orthophosphates s’eleve et l’activite de l’hexokinase redevient normale. Les Crythrocytes nouvellement form& sont caracterises par une elevation de l’hexokinase. Syllm-Rapoport et al. attribuent a l’abaissement prolonge du niveau des ions POh3- un effet de repression sur la svnthese de l’hexokinase et a la vitamine D un effet inducteur. Cartels et aL2 ont etudie les hepatocytes d’un enfant de 18 mois atteint de rachitisme vitamino-resistant hypophosphatemique. 11s ont trouve un abaissement de l’activite de l’hexokinase et de la diphosphofructoaldolase. La glucose-6-phosphate deshydrogenase et la 6-phosphogluconate deshydrogenase Ctaient accrues de 5 a 6 fois. Dans le foie, la quantite de fructose-r,6-phosphate Ctait diminuee. A propos de l’ensemble de ces resultats, deux remarques peuvent &tre faites. D’une part, les resultats notes sur l’hepatocyte sont difficiles a comparer avec ceux vus sur l’erythrocyte, &ant don& les differences normales de l’equilibre des diverses voies glycolytiques dans ces deux types de cellules. D’autre part, les resultats sur le rat ont et& observes au tours du rachitisme par carence phosphor&e. 11 est interesClin. Chim. Acta, zg (1970)261~271
sant de noter & ce propos les observations faites par Lichtman et al.” chez un ur&iquc en dCplCtion phosphorke grave due & 1’hPmodialyse chronique et A la prise d’hydroxJ& d’alumine. L’hypophosphatemie s&&-e coi’ncidait avec une chute de 1’ATP dans 1~s krythrocytes, contrairement & ce que nous awns observ& chez nos malades. Ccttrl situation &ait &par&e par administration de phosphates. (b) Les re’sultats obtenus chez nos 17 malades peuvent &tre r&urn& en plwieurpropositions. L’activite’ glycolytique est plus 6levCe chez les malades que chez les tdmoins normaux. Le m&anisme de la glycolvse n’est pas modifii: et le rapport du lactate form6 au glucose consommk est normal. Ainsi la repartition de la glycolyse entrc la XYG~: d’Embden-Meyerhof et la voie de Rapoport-Luebering qui conduit j l’accumulation de z,3-diphosphoglyc&ate fonctionne normalement, puisque le taux de cette substanw n’est pas modifS. L’activitk des enzymes de la voie d’Embden_Meyerhof est normale, S_l’exception de la pyruvate kinase qui est augment&e chez les malades. La vitesse de la glycolyse de l’&-ythrocyte est Ctroitement like 2 l’activitk de trois enzymes catalysant Its &apes irrkversibles de la glycolyse qui s’accompagnent d’une importante d&n&lation &erg&clue : l’hexokinase, la phosphofructokinase et la pyruvate kinase. (‘es trois enzymes ont une activiti: faible, done limitante, par rapport A celle des autres &apes non rkgulatrices de la glycolyse et prCsentent un caracthre allost&-ique, leur activitP. &ant Ctroitement contrblGe par le niveau de certains intermkdiaires de la glycolysel”. Les modifications d’activitk de la pyruvate kinase ont une influence directe sur l’intensitir de la glycolyse. Dans l’ankmie hCmolytique par dCficit en pyruvate kinase, la glycolyse &ythrocytaire est diminut!e et cette enzymopathie provoque, dans l’&ythrocyte, une accumulation secondaire de certains intermkdiaires de la voie d’Embden-Meyerhof19. Chez nos malades, l’accroissement de l’activitk de la pyruvate kinase provoque une augmentation de la glycolyse, sans entrainer de modifications au niveau des d&iv& intermkdiaires qui se forment entre le glucose et le lactate. La r+artition du ~hos#zorc intrae’rythrocytnirc est particuliPrc. La concentration des phosphod&iv& intermediaires de la glycolyse est dans lcs limites de la normale. La concentration de 1’ATP est augment&: cette variation est en bonne corr&lation avec l’exagkration de la glycolyse. La concentration en orthophosphates est diminuke, comme dans le liquide extracellulaire. Le niveau intracellulaire des ions P0,3- est le reflet d’un double kquilibre qui s’ktablit : d’une part entre les orthophosphates intra et extracellulaires par un processus de diffusion simple, d’autre part j l’intkrieur de la cellule, entre les orthophosphates et l’ensemble dcs
-
phosphodCriv& qui apparaissent et disparaissent au tours de la glycolyse. Ces deux kquilibres Cvoluent avec des vitesses diffkrentes. La vitesse de diffusion de P0,8- A, travers la membrane est indirectement dCpendante de l’intensitk de la glycolyse: lorsque 1’activitC glycolytique est accrue-comme tel est le cas chez nos sujets rachitiques-la vitesse d’entrCe des ions P0,8- est Cgalement augmentbe. Mais cette permkabilitk accCl&e n’affecte pas l’kquilibre final de repartition entre les ions POd3- de part et d’autre de la membrane: la concentration intraglobulaire du P minCra1 est abaisske en proportion de l’hypophosphat4mie, comme le laisse prkvoir la CIi,z.
Chim.
Acta,
29
(1070)
261-271
R.kCHITISME VITAMINO-RIkSTANT
relation
de Gibbs-Donnan.
HfiRtiDITAIRE
Dans le rachitisme
globule rouge aux ions orthophosphates
269 vitamino-resistant,
n’est done pas modifiee,
la permeabilite
du
et l’hypophosphate-
mie n’apparait pas comme la consequence d’une fuite intracellulaire des ions P0,3provoquee par une modification de structure de la membrane ou par une accumulation des formes organiques du P associees a la glycolyse. (c) L’la~~~ophos$hattGnie du rachitisme vitamino-resistant idiopathique a recu deux explications. L’une est l’insuffisance de l’absorption intestinale du phosphore alimentaire; il a et6 demontre qu’elle etait secondaire a la malabsorption intestinale et qu’en diminuant l’apport alimentaire de calcium, l’absorption du phosphore redevenait normale20~21. L’autre est l’abaissement du coefficient de reabsorption tubulaire du phosphore (TRP). Le TRP est en v&it6 moderement abaisse dans cette maladieZ2; il varie normalement avec l’apport alimentaire de phosphore4 et remonte sous l’effet de la perfusion veineuse de calcium23. Cette diminution du TRP est en general conside&e comme le reflet d’un hyperparathyroi’disme secondaire. Toutefois, ces deux explications de l’hypophosphatemie sont insuffisantes. Nos constatations permettent d’en Cvoquer une troisieme. Tout se passe comme si une entree exageree d’orthophosphate dans la cellule maintenait la baisse de concentration de l’ortophosphate dans le milieu extracellulaire. Cette situation est secondaire a deux faits correlatifs: l’augmentation de la synthese d’ATP et l’accroissement de la glycolyse avec l’elevation de l’activite de la pyruvate kinase. Enfin, il est necessaire de souligner deux points importants: d’une part, il est evident qu’une telle explication ne prendrait sa valeur que s’il
-
etait demontre que les anomalies metaboliques constatees retrouvees sur d’autres cellules; d’autre part, il apparait que des anomalies metaboliques
sur l’erythrocyte
etaient
ont Cte retrouvees
chez
les malades atteints de deformations osseuses trait&es par des doses massives de vitamine D avec ou sans supplement de phosphore ou non traitees, et chez les sujets de leur famille atteints d’hypophosphatemie asymptomatique. On peut dire que ces anomalies ne sont pas modifiees par le traitement au niveau de l’erythrocyte et qu’elles sont identiques, qu’il y ait ou non de production clinique de la maladie. II.
I@yation duns le concept de r&stance h&dditaire au choltkalcif+ol (a) Le chole’calcif~~ol ou vitamine D, peut etre consider& chez l’homme ou comme
une vitamine apportee par l’alimentation et absorbee par l’intestin g&e, ou comme une hormone ClaborCe dans la peau en partie par une reaction photochimique. Le cholecalciferol a un systeme de transport specifique dans le plasma, une cr,-globulineZ3. 11 est metabolise en differents produits isoles en chromatographie en quatre pits. La plus grande partie du Pit IV est faite d’un des metabolites actifs du cholecalciferol, le z5-hydroxycholecalcifCro1 25. Celui-ci a pour effecteurs principaux 1’0s et la muqueuse intestinale26,27. A l’echelon cellulaire ce derive z5-hydroxyle semble se concentrer au niveau du noyau : membraneZ8 ou chromatine26 et peut-&tre en partie au niveau du cytoplasme. 11 agirait en permettant la liberation du message hereditaire necessaire a la syntlrese d’une proteine de transport cellulaire du calcium, voisine ou identique ,i celle d&rite par WassermanZ9, ou d’une structure de la membrane cellulaire permettant le transfert du calcium30. L’action du cholecalciferol se fait par l’intermediaire d’une activation de l’adenylcyclase et de la synthese d’AMP cyclique31. Cette action est bloquee par l’actinomycine32. Clin. Chim. Ada,
zg (1970) 261-271
270
C:?RTIER
Ct rd.
On peut, en fonction de ces donnees recentes, supposer theoriquement quatrc mecanismes de vitamino-resistance: (I) excretion rxagerPe des derives actifs, cc qui a Pti: retrouve au niveau des urines des uremiques3”; (2) anomalie du systPme de tr-ansport plasmatique; (3) insuffisance ou absence de I’activation par exemple en derive polaire as-hydroxyle ; (4) anomalie des recepteurs cellulaires. Les travaux d’Avioli et aL5, et de Deluca ct al.6 montrent que dans le rachitismc vitamino-resistant idiopathique, le metabolisme du cholecalciferol est ralenti, sa z5hydroxylation est diminuee. Certains resultats therapeutiques avec le 25-h~drosycholecalciferol dans cette maladie semblent en partie confirmer ces constatation+‘. (b) Qu’il existe dans la maladie en cause une anomalie hfireditaire de l’activation du cholecalcif&ol, ou une reponse anormale des recepteurs, dans les deux cas, le transport cellulaire du calcium est perturbe, et les consequences d’une diminution de ces mouvements intracellulaires sont encore ma1 connues. On peut cependant, speculatif, rapprocher ce qui est etabli dans deux situations inverses.
a titre
D’une part, on sait depuis 20 ans que l’addition de calcium a des mitochondries stoppe l’absorption des orthophosphates necessaires a la recharge de 1’4TP35~3i. D’autre part, la vitamine D diminue l’utilisation du citrate au niveau des mitochondries
des cellules de l’os, du rein et du cartilage
epiphysaire
du rat rachitique
(refs. 38, 39). I1 est possible, mais non demontr6, qu’une situation de resistance a la vitamine D et d’anomalie secondaire de transfert cellulaire de calcium aboutisse a une situation inverse : consommation exageree de citrate au niveau du cycle de Krebs et exageration ce qui aboutirait a un desequilibre metaboliquc des phosphorylations oxydatives, comparable a celui que nous constatons dans les hematies. I1 convient cependant de faire certaines reserves sur ces speculations. On con nait bien les effets de l’exces de vitamine D ou de calcium sur les modeles mitochondriaux, mais non de son absence. Par ailleurs, l’erythrocyte depourvu de noyau et de mitochondries n’est certainement pas un type cellulaire favorable pour etudier les effets des derives metaboliques actifs du cholecalciferol, puisqu’il semble demontrer que ceux-ci agissent initialement au niveau du noyau. Dans ce travail, nous nous proposions de mettre en evidence, chew Irs vitaminoresistants,
une fuite intracellulaire
eventuelle
des ions P0.13-, expliquant
l’hypophos-
phatemie, soit par modification de la permeabilitit de la membrane plasmale, soit par une alteration metabolique entrainant, par un trouble de la glycoiyse, une accumulation de P sous forme organique. En raison de sa structure simplifiee et des facilites de prelevement, l’ervthroc?;t ta reoresentait le materiel cellulaire le plus favorable. Les resultats de cette etude nous montrent qu’il conviendrait d’etendre cette exploration mirtabolique : - i d’autres types cellulaires que l’erythrocyte, sur des malades trait6 par le z5-OH-cholecalcifirol, sur des nouveaux-nPs de familles atteintes avant i’apparition de l’l~~;~~o~~l~o~pl~;~temie.
RACHITI%lE
VITAMINO-Rl%ISTANT
271
HkRtiDITAIRE
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