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Etude de la Sécrétion de Mucilage par les Cellules des Glandes Digestives de Drosera capensis L.
Originalarbeiten . Original Papers
Universite de Nancy T, Laboratoire de Botanique II, Nancy Cede x, France
Etude de la Secretion de Mucilage par les Cellules des Glandes Digestives de Drosera capensis L. Localisation Ultrastructurale des Phosphatases Neutres et de l'ATPase Study of Mucilage Secretion by the Cells of the Digestive Glands of
Drosera capensis L. Ultrastructural Localization of Neutral Phosphatases and ATPases JEAN DEXHEIMER
Avec 16 figures Res;u Ie 10 Juin 1977 . Accepte Ie 20 Septembre 1977
Summary This paper describes a study ot the localization of phosphatase activity, detected at a pH close to neutral, in the digestive cells of Drosera capensis during the mucilage-forming phase. The author distinguishes between an ATPase activity and a neutral phosphatase activity detected using IDP, TPP and sodium (i-glycerophosphate as substrates. During the initial mucilage-forming phase, the neutral phosphatase activity in the cytoplasm is present in the dictyosomes, along the membranes of the enormous secretory vesicles and on the plasmalemma. The activity is very diffuse in the cell walls. In the course of the following phases, the phosphatase activity disappears from the dictyosomes but remains on the plasmalemma. The cell walls become very active, but the activity is limited to the zone where mucilage accumulates. Cytoplasmic ATPase activity is limited to the plasmalemma. In the cell walls, the activity is concentrated, as is that of the other phosphatases, in the median zone. Finally, the very intense reactivity of the cuticular pores shows that all these enzymes are exuded from the gland. The presence of neutral phosphatases activity in the dictyosomes, during mucilage synthesis, indicates structural and functional differentiation of these organelles. The presence of intense activity along the plasmalemma may be explained in terms of active transport phenomena. However, the role of phosphatase activity in the mucilage excreted outside the gland remains to be explained.
Key words: Drosera capensis, mucilage-forming phase, neutral phosphatases, ATPases. Z. Pflanzenphysiol. Bd. 86. S. 189-201. 1978.
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Introduction
Au cours de publications pn!cedentes, nous avons decrit les modalites de la secretion de mucilage (DEXHEIMER, 1976), puis, nous nous sommes interesses it la localisation des phosphates acides (DEXHEIMER, 1977 a) et de la glucose-6-phosphatase (DEXHEIMER, 1977 b). Le present travail, en etudiant la localisation des activites phosphatasiques neutres et ATPasiques, complete ces resultats. Dans la litterature, beaucoup d'auteurs comprennent dans les «phosphatases neutres», les activites phosphatasiques, mises en evidence it un pH proche de la neutralite, en utilisant les substrats suivants (parmi les plus couramment employes): adenosine triphosphate (ATP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine monophosphate (AMP), inosine diphosphate (IDP), thiamine pyrophosphate (TPP), fJ-glycerophosphate de sodium. Au contraire, d'autres auteurs distinguent, dans les phosphatases neutres plusieurs categories d'activites enzymatiques: ATPases, nucleoside diphosphatases- (NDPases), thiamine pyrophosphatases (TPPases). Quant it nous, nous avons adopte, en partie ce point de vue et nous separerons les activites phosphatasiques neutres proprement dites (NDPases, TPPases) de l'activite ATPasique. Techniques Nous exposerons les techniques de mise en evidence des phosphatases neutres et de I'adenosine triphosphatase. Phosphatases neutres Les objets sont fixes par Ie glutaraldehyde a 2,5 Ofo dans Ie tampon cacodylate a MilO et a pH 7,2, a 0° pendant 45 minutes. Les objets sont ensuite rinces par Ie tampon cacodylate sucre (10 Ufo de saccharose; 3 X 20 minutes), I'eau distillee sucree (10 ~/o de saccharose; 3 X 5 minutes) Ie tampon tris-maleate wcre et a pH 7,2 (10 Ofo de saccharose; 2 X 5 minutes, puis, les objets sont incubes dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER (1961) sucre 10 Ofo, pendant une nuit a froid et 1 heure a 37°. Les substrats utilises sont les suivants: inosine diphosphate (IDP), thiamine pyrophosphate (TPP), /I-glycerophosphate de sodium. Apres I'incubation, les objets sont laves 3 fois dans I'eau distillee sucree (10 Ofo), puis
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Fig. 1 et 2: Incubation dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER sans substrat (temoin). II n'y a pas de precipites. mi: mitochondrie; P: paroi; v: vesicule de secretion golgienne. (XI7000). Fig. 3: Incubation dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER avec I'IDP comme substrat. 3 a: phase initiale de la secretion de mucilage. Les en ormes vesicules golgiennes (v) montrent une activite IDPasique sur leur membrane, mais leur contenu ne reagit pas. Le plasmalemme est actif; la paroi faiblement marquee. 3 b: dictyosome peu actif pendant la phase d'expulsion. II n'y a plus de marquage (X 17 000). Fig. 4: Incubation comme en 3. Phase d'expulsion du mucilage. II y a une tres forte activite sur les membranes des vesicules de secretion et sur Ie plasmalemme, La paroi est beaucoup plus active qu'au stade precedent (X 19 000).
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postfixes pendant 45 minutes par Ie tetroxyde d'osmium tamponne par Ie tampon phosphate (pH 7,2). Preparation du milieu d'incubation de NOVIKOFF et GOLDFISCHER Substrat: 25 mg; Eau distillee: 7 ml; Tampon tris-maleate (0,2 M) (pH 7,2): 10 ml; Solution a0.5 % des chlorure de manganese: 5 ml; Solution a 1 % de nitrate de plomb: 3 ml. Au moment de la preparation, Ie milieu d'incubation se trouble. Apres 10 minutes il est filtre et utilise immediatement. Adenosine triphosphatase (ATPase) Les objets sont fixes dans Ie glutaraldehyde a 2,5 % dans Ie tampon cacodylate a pH 7 pendant 45 minutes. Puis les echantillons sont laves dans Ie m&me tampon (5 bains; 3 heures) et dans l' eau distillee (2 X 5 minutes). Les echantillons sont incubes dans Ie milieu de WACHSTEIN et MEISEL (in HAYAT, 1973), pendant 2 heures a la temperature de la piece, puis, apres un lavage soigneux par l'eau distillee, ils sont fixes, pendant 45 minutes, par Ie tetroxyde d'osmium dans Ie tampon phosphate ou veronal a pH 7,2. Preparation du milieu de W ACHSTEIN et MEISEL ATP (sel sodique): 25 mg; Eau distillee: 22 ml; Tampon tris-maleate (0,2 M) (pH 7,2): 20 ml; Solution de sulfate de magnesium 2%: 5 ml; Nitrate de plomb 2 %: 3 ml. Comme Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER, il se trouble et doit hre filtre avant l'emploi. Pour contr81er l'influence du milieu d'incubation, nous avons aussi utilise Ie milieu de NOVIKOFF et GOLD FISCHER. Les resultats ont ete identiques a ceux observes avec Ie milieu de WACHSTEIN et MEISEL (fig. 15). Pour toutes les reactions, les temoins sont constitues par des objets incubes dans des milieux sans substrat. Dans ces conditions, nous n'avons jamais observe de precipites (fig. 1 et 2, fig. 11).
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Resultats
Nous exposerons, d'une part, les nfsultats concernant les phosphatases neutres, d'autre part, ceux portant sur les ATPase. Fig. 5: Incubation comme en 3. Phase finale de l'expulsion de mucilage. L'activite IDPasique est visible Ie long du plasmalemme et dans la partie me diane des parois (X 19 000). Fig. 6: Incubation dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLD FISCHER avec la TPP comme substrat. Phase initiale de la secretion de mucilage. Les membranes des vesicules de secretion montrent une activite TPPasique (X 19000). Fig. 7: Incubation comme en 6. Phase d'expulsion du mucilage. Des cellules voisines peuvent hre dans des etats differents: la cellule du haut et celle de gauche, mont rent, en bordure de la zone me diane, une bande tres active. Dans la cellule de droite, toute l'activite enzymatique a migre dans la partie mediane. Le plasmalemme est borde d'une ligne continue de phosphate de plomb (X 19 000). Fig. 8: Incubation comme en 6. Phase d'expulsion du mucilage. Au niveau des parois externes de la glande, on remarque que la cuticule (C) n'est pas marquee. Les pores cuticulaires et les traces de mucilage a la surface de la glande ont une activite phosphatasique. Le plasmalemme de la cellule (it gauche) est tres actif (X 34000). Z. PJlanzenphysiol. Bd. 86. S. 189-201. 1978.
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Phosphatases neutres
Comme dans nos etudes precedentes sur la localisation des phosphatases acides (DEXHEIMER, 1978 a) ou de la glucose-6-phosphatase (DEXHEIMER, 1978 b), il convient de distinguer entre la phase initiale de la production de mucilage, caracterisee par une forte activite golgienne, et les phases suivantes, pendant lesquelles les diet yo somes sont beaucoup moins actifs, et ou Ie mucilage, expulse du cytoplasme, migre dans les parois. Pour mettre en evidence cette categorie de phosphatase, nous avons utilise trois substrats: inosine diphosphate, thiamine pyrophosphate, fJ-glycerophosphate de sodium. Avec l'IDP comme substrat, nous a vons observe, pendant la phase initiale, une activite phosphatasique dans les dictyosomes: les precipites de phosphate de plomb sont localises Ie long des membranes des enormes vesicules de secretion et parfois dans les saccules (fig. 3 a). Le plasmalemme manifeste des ce stade une activite phosphatasique neutre; au contraire, les parois cellulaires ne montrent que quelques precipites epars (fig. 3 a). A la phase suivante, les dictyosomes, beaucoup moins actifs, ne sont plus marques, mais les vesicules de secretion qui vont s'ouvrir dans Ie periplasme montrent une forte activite IDPasique sur leur membrane (fig. 3 b et 4). Simultanement a la migration et a ['accumulation du mucilage dans la partie mediane des parois (DEXHEIMER, 1976), une activite phosphatasique apparah dans cette zone (fig. 4). Enfin, Ie plasmalemme est desormais borde d'une ligne continue de phosphate de plomb.
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A la phase finale, lorsque les vesicules sont reduites des protuberances parietales (DEXHEIMER, 1976), l'activite IDPasique n'est decelee que Ie long du piasmalemme et dans Ia partie mediane des parois (fig. 5). II est a remarquer que Ie contenu mucilagineux des protuberances a une activite phosphatasique quasiment nulle (fig. 5). Fig. 9: Incubation dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER avec Ie p-glycerophosphate de sodium comme substrat. Phase d'expulsion du mucilage. Coupe semi-tangentielle d'une cellule digestive superficielle. L'activite enzymatique est particulierement forte Ie long du plasmalemme et dans la partie mediane des parois. La cuticule (C) ne presente pas de marquage, mais Ie pore (fleche) est tres actif. II est en relation avec une zone parietale ou I'activite phosphatasique est particulierement forte (X 9000). Fig. 10: Incubation comme en 9. Phase d'expulsion du mucilage. Detail montrant la localisation des precipites de phosphate de plomb Ie long du plasmalemme (X 40 000). Fig. 11: Incubation dans Ie milieu de WACHSTEIN et MEISEL sans ATP (t~moin). II n'y a pas de marquage (X 25000). Fig. 12: Incubation dans Ie milieu de WACHSTEIN et MEISEL avec I'ATP comme substrat. Phase initiale de la secretion. Les vesicules ne montrent aucune activite enzymatique (comparer avec fig. 3 et 6) (X 15 000).
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Avec la TPP comme substrat, les resultats sont identiques ceux obtenus avec l'IDP (fig. 6 et 7). 11 nous a ete possible d'observer une etape intermediaire de la migration de I'activite phosphatasique dans les parois: avant que toute I'activite soit concentree dans la partie mediane, nous avons mis en evidence une region tres fortement reactive entre cette zone et Ie plasmalemme (fig. 7). La m~me figure montre aussi que les cellules adjacentes peuvent presenter des etats differents dans la migration de I'activite phosphatasique puisque l'une des cellules, contrairement ses voisines, montre une concentration de l'activite enzymatique dans la partie parietale centrale. Enfin, au niveau de la cuticule (fig. 8), l'activite phosphatasique est nulle, mais elle est tres forte dans les pores cuticulaires, ce qui semble indiquer que les phosphatases sont entrainees par Ie mucilage l'exterieur de la glande. Avec Ie Ii-glycerophosphate de sodium, qui cst Ie substrat habituellement utilise pour mettre en evidence les phosphatases acides, la repartition des precipites au cours des diverses phases de la secretion est sensiblemcnt identique celie que nous avons decrite pour les autres substra:ts (fig. 9 et 10). Toutefois, Ie marquage des dictyosomes actifs est tres faible et sou vent absent. Enfin, comme avec la TPP, nous avons remarque une forte activite ph osphatasique au niveau des pores cuticulaires (fig. 9).
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ATPascs
Nous distinguerons, ici aussi, entre les diverses phases de la secretion de mucilage. Pendant la phase initiale, l'activite A TPasique est forte Ie long du plasmal em me, mais les parois ne montrent qu'une activite faible et diffuse (fig. 13). Dans Ie cytoplasme, aucun organite, m~me les dictyosomes ou leurs grosses vesicules de secretion, ne montre d'activite ATPasique (fig. 12). Au cours des phases suivantes, l'activite ATPasique devient encore plus forte sur Ie plasmalemme. Elle est aussi importante dans les protuberances parietales et dans la zone mediane des parois (fig. 14 et 15). Nous avons observe une forte activite ATPasique au niveau des pores de la cuticule. Cette activite cst aussi decelee dans Ie mucilage exude par la glande (fig. 16). Fig. 13: Incubation comme en 12. Phase initiale de la secretion. L'activite ATPasique est tres forte Ie long du plasmalemme. Elle est peu visible dans la paroi (X 15 000). Fig. 14: Incubation comme en 12. Phase d'expulsion du mucilage. L'activite ATPasique est mise en evidence Ie long du plasmalemme, dans les protuberances parictales et dans la zone mediane des parois ( <30 000). Fig. 15: Incubation dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER avec I'ATP comme substrat. Phase d'expulsion du mucilage. Les rcsultats sont identiques it ceux obtenus avec Ie milieu de WACHSTEIN et MEISEL (;' 25000). Fig. 16: Incubation (omme en 12. Phase d'expulsion du mucilage. II y a une activite ATPasiquc au niveau des pores cuticulaircs et dam Ie mucilage exude par la glande (X 34 000).
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Discussion et Conclusion Peu d'auteurs se sont interesses a la localisation ultrastructurale des phosphatases neutres chez les vegetaux. Nous citerons les travaux de DAUWALDER et al. (1966, 1969), GOFF (1973), HEINRICH (1975), MAURUYAMA(1974), NOVIKOFF et GOLDFISCHER (1961), Poux (1967), ZAAR et SCHNEPF (1969), ZERBAN et WERZ (1975). Les resultats de DAUWALDER et al. (1966, 1969) nous interessent plus particulierement car ils concernent l'activite IDPasique et TPPasique des cellules de la coiffe radiculaire pendant la production de mucilage. Dans ces cellules, comme dans celles des glandes digestives de Drosera pendant la phase mucigene, les dictyosomes sont tres actifs et bourgeonnent d'enormes vesicules. Ces auteurs ont montre que les dictyosomes specialises dans la production de polysaccharides pres en tent une activite nucleoside diphosphatasique, sou vent associee a une activite TPPasique. L'activite phosphatasique neutre serait directement liee a la synthese des molecules polysaccharidiques: «the tissues in which a high reactivity for IDPase is consistently found in the Golgi apparatus ... are characterized by specific developmental modification of the apparatus for secretion of a product with a high polysaccharide content» ... (DAUW ALDER et al., 1969). Nos resultats confirment cette interpretation, puisque dans les glandes digestives de Drosera capensis, pendant la phase mucigene, les dictyosomes produisent une quantite considerable de polysaccharides et montrent une activite IDPasique et TPPasique. De plus, nous avons remarque, com me ces auteurs, que les precipites de phosphate de plomb se trouvent sur les membranes limitantes des vesicules de secretion, ce qui semble indiquer que ces enzymes sont associes aux membranes golgiennes. L'activite phosphatasique neutre du plasmalemme, qui est toujours presente dans les cellules digestives de Drosera, a ete aussi signalee dans les cellules mucigenes de la coiffe de Zea mays par DAUWALDER et al. (1966, 1969). Cette localisation est bien connue dans les cellules animales (GOLDFISCHER et al., 1964; NOVIKOFF et al., 1966; ROSTGAARD et BARRNETT, 1964) et certaines cellules vegetales (Poux, 1967). DAUWALDER et al. emettent l'hypothese que cette localisation est la consequence de l'incorporation au plasmalemme des membranes des vesicules de secretion qui presentent une activite phosphatasique. Dans notre materiel, bien qu'il existe deja une activite phosphatasique neutre au debut de la secretion, nous avons remarque qu'elle devient beaucoup plus forte apres l'expulsion des vesicules, ce qui semble con firmer l'interpretation de ces auteurs. Enfin, DAUWALDER et al. (loc. cit.) n'observent pas de relation entre Ie mucilage exude et l'activite enzymatique. Au contraire, chez Drosera capensis, il existe une liaison tres etroite entre la migration du mucilage et Ie deplacement intraparietal de cette activite phosphatasique. De plus, les pores cuticulaires, tres reactifs, mont rent que les phosphatases sont entrainees a l'exterieur de la glande. La mise en evidence d'une activite phosphatasique neutre en utilisant comme substrat Ie jJ-glycerophosphate de sodium merite une mention particuliere. Ce substrat est habituellement employe pour localiser les phosphatases acides. Dans un
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mileu d'incubation pH neutre, Ies precipites de phosphate de plomb presentent une repartition totalement differente de celle qu I'on peut observer apres l'incubation dans Ie milieu de GOMORI (DEXHEIMER, 1977 a). Ce qui confirme que nous avons mis en evidence pH neutre des phosphatases bien distinctes des phosphatases acides.
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Comme pour Ies phosphatases neutres, les essais de localisation de l'activite ATPasique chez les vegetaux sont peu nombreux. De plus, ils ne concernent qu'une categorie tres limitee d'objets: meristt:mes radiculaires (COULOMB, 1973; HALL, 1971; Poux, 1967), parenchyme de Sueda maritima (HALL et DAVIES, 1975), elements conducteurs (GILDER et CRONSHAW, 1973; ROBARDS et KIOWAI, 1969), nectaires (HEINRICH, 1975). Chez Drosera capensis, pendant la phase muclgene, nous avons observe, dans Ie cytoplasme, une activite ATPasique uniquement Ie long du plasmalemme. Cette localisation cst tout fair classique et a ete decrite par divers auteurs. De plus, comme pour les enzymes precedentcs, une activite ATPasique est deceiee dans les parois, aux niveaux ou s'accumule Ie mucilage. Enfin, Ie marquage des pores cuticulaires ct du mucilage exude montre que des ATPases sont excretees par la glande.
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Nous remarquerons aussi, que quel que soit Ie milieu d'incubation utilise, les resultats sont identiques, ce qui indique que les ATPases mises en evidence sont reiativement indifferentes ~1 la composition du milieu d'incubation et en particulier la nature des ions activateurs (magnesium: milieu de \VACHSTEIN et MEISEL; manganese: milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER).
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A aucun stade de la production de mucilage, nous n'avons observe d'activite A TPasique dans les dictyosomes ou leurs vesicules de secretion, ce qui differencie nettement cette categoric d'enzymes des phosphatases neutres. Dans ces dernieres, il ne nollS a pas ete possible de distinguer, comme Ie font certains auteurs (DAUWALDER et aI., 1966, 1969; GOFF, 1973; NovlKoH et GOLDFISCHER, 1961; ZERBAN et WERZ, 1975) entre une ani vite nucleoside diphosphatase et une activite thiamine pyrophosphatase. Dc notre etude, nous pouvons retenir des resultats concernant Ie fonctionnement des dictyosomes et du plasmalemme pendant la phase mucigene et l'emission d'enzymes avec Ie mucilage exude. L'existencc d'une activite phosphatasique neutre dans les dictyosomes pendant la phase mucigene initiale, confirme les observations de DAUWALDER et al. (loc. cit.) et montre que ces organites presentent une differenciation structurale et physiologique tres profonde. Au cours des phases suivantes, les dictyosomes sont beau coup moins actifs et I'activite phosphatasique neutre disparait. Tous les substrats utilises (ATP, IDP, TPP, [i-glycerophosphate de sodium) ont mis en evidence une tres forte activite enzymatique Ie long du plasmalemme. Les cellules, pendant la phase mucigene initiale, drainent une quantite considerable de metabolites et de precurseurs polysaccharidiques. Le plasmalemme est Ie lieu de passage obZ. PJlanzenphysiol. Bd. 86. S. 189-201. 1978.
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ligatoire pour ces substances et il n'est pas surprenant d'y observer des activites d'enzymes impliquees dans des phenomenes de transport actif. De m&me, no us avons revele des activites enzymatiques dans les zones d'accumulation du mucilage et au niveau des pores cuticulaires. Les enzymes sont done accumulees dans les parois sur Ie m&me sites que Ie mucilage, puis entraines a l'exterieur de la glande. Ainsi, en plus des phosphatases acides dont l'exudation a deja ete signalee par HESLOP-HARRISON (1975), notre travail montre que d'autres phosphatases (ATPases, phosphatases neutres) sont aussi emises a l'exterieur de la glande. Toutefois, il est tout a fait douteux que des enzymes aussi specialises interviennent directement dans les processus digestif, mais il est possible qu'ils participent au transport et a la resorption de produits de la lyse extraglandulaire.
Bibliographie
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Prof. ]. DEXHEIMER, Universite de Nancy I, Laboratoire de Botanique II, Case officielle 140, F-54037 Nancy Cedex, France.
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Etude de la Secretion de Mucilage par les Cellules des Glandes Digestives de Drosera capensis L. Localisation Ultrastructurale des Phosphatases Neutres et de l'ATPase Study of Mucilage Secretion by the Cells of the Digestive Glands of
Drosera capensis L. Ultrastructural Localization of Neutral Phosphatases and ATPases JEAN DEXHEIMER
Avec 16 figures Res;u Ie 10 Juin 1977 . Accepte Ie 20 Septembre 1977
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Key words: Drosera capensis, mucilage-forming phase, neutral phosphatases, ATPases. Z. Pflanzenphysiol. Bd. 86. S. 189-201. 1978.
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Introduction
Au cours de publications pn!cedentes, nous avons decrit les modalites de la secretion de mucilage (DEXHEIMER, 1976), puis, nous nous sommes interesses it la localisation des phosphates acides (DEXHEIMER, 1977 a) et de la glucose-6-phosphatase (DEXHEIMER, 1977 b). Le present travail, en etudiant la localisation des activites phosphatasiques neutres et ATPasiques, complete ces resultats. Dans la litterature, beaucoup d'auteurs comprennent dans les «phosphatases neutres», les activites phosphatasiques, mises en evidence it un pH proche de la neutralite, en utilisant les substrats suivants (parmi les plus couramment employes): adenosine triphosphate (ATP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine monophosphate (AMP), inosine diphosphate (IDP), thiamine pyrophosphate (TPP), fJ-glycerophosphate de sodium. Au contraire, d'autres auteurs distinguent, dans les phosphatases neutres plusieurs categories d'activites enzymatiques: ATPases, nucleoside diphosphatases- (NDPases), thiamine pyrophosphatases (TPPases). Quant it nous, nous avons adopte, en partie ce point de vue et nous separerons les activites phosphatasiques neutres proprement dites (NDPases, TPPases) de l'activite ATPasique. Techniques Nous exposerons les techniques de mise en evidence des phosphatases neutres et de I'adenosine triphosphatase. Phosphatases neutres Les objets sont fixes par Ie glutaraldehyde a 2,5 Ofo dans Ie tampon cacodylate a MilO et a pH 7,2, a 0° pendant 45 minutes. Les objets sont ensuite rinces par Ie tampon cacodylate sucre (10 Ufo de saccharose; 3 X 20 minutes), I'eau distillee sucree (10 ~/o de saccharose; 3 X 5 minutes) Ie tampon tris-maleate wcre et a pH 7,2 (10 Ofo de saccharose; 2 X 5 minutes, puis, les objets sont incubes dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER (1961) sucre 10 Ofo, pendant une nuit a froid et 1 heure a 37°. Les substrats utilises sont les suivants: inosine diphosphate (IDP), thiamine pyrophosphate (TPP), /I-glycerophosphate de sodium. Apres I'incubation, les objets sont laves 3 fois dans I'eau distillee sucree (10 Ofo), puis
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Fig. 1 et 2: Incubation dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER sans substrat (temoin). II n'y a pas de precipites. mi: mitochondrie; P: paroi; v: vesicule de secretion golgienne. (XI7000). Fig. 3: Incubation dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER avec I'IDP comme substrat. 3 a: phase initiale de la secretion de mucilage. Les en ormes vesicules golgiennes (v) montrent une activite IDPasique sur leur membrane, mais leur contenu ne reagit pas. Le plasmalemme est actif; la paroi faiblement marquee. 3 b: dictyosome peu actif pendant la phase d'expulsion. II n'y a plus de marquage (X 17 000). Fig. 4: Incubation comme en 3. Phase d'expulsion du mucilage. II y a une tres forte activite sur les membranes des vesicules de secretion et sur Ie plasmalemme, La paroi est beaucoup plus active qu'au stade precedent (X 19 000).
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postfixes pendant 45 minutes par Ie tetroxyde d'osmium tamponne par Ie tampon phosphate (pH 7,2). Preparation du milieu d'incubation de NOVIKOFF et GOLDFISCHER Substrat: 25 mg; Eau distillee: 7 ml; Tampon tris-maleate (0,2 M) (pH 7,2): 10 ml; Solution a0.5 % des chlorure de manganese: 5 ml; Solution a 1 % de nitrate de plomb: 3 ml. Au moment de la preparation, Ie milieu d'incubation se trouble. Apres 10 minutes il est filtre et utilise immediatement. Adenosine triphosphatase (ATPase) Les objets sont fixes dans Ie glutaraldehyde a 2,5 % dans Ie tampon cacodylate a pH 7 pendant 45 minutes. Puis les echantillons sont laves dans Ie m&me tampon (5 bains; 3 heures) et dans l' eau distillee (2 X 5 minutes). Les echantillons sont incubes dans Ie milieu de WACHSTEIN et MEISEL (in HAYAT, 1973), pendant 2 heures a la temperature de la piece, puis, apres un lavage soigneux par l'eau distillee, ils sont fixes, pendant 45 minutes, par Ie tetroxyde d'osmium dans Ie tampon phosphate ou veronal a pH 7,2. Preparation du milieu de W ACHSTEIN et MEISEL ATP (sel sodique): 25 mg; Eau distillee: 22 ml; Tampon tris-maleate (0,2 M) (pH 7,2): 20 ml; Solution de sulfate de magnesium 2%: 5 ml; Nitrate de plomb 2 %: 3 ml. Comme Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER, il se trouble et doit hre filtre avant l'emploi. Pour contr81er l'influence du milieu d'incubation, nous avons aussi utilise Ie milieu de NOVIKOFF et GOLD FISCHER. Les resultats ont ete identiques a ceux observes avec Ie milieu de WACHSTEIN et MEISEL (fig. 15). Pour toutes les reactions, les temoins sont constitues par des objets incubes dans des milieux sans substrat. Dans ces conditions, nous n'avons jamais observe de precipites (fig. 1 et 2, fig. 11).
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Resultats
Nous exposerons, d'une part, les nfsultats concernant les phosphatases neutres, d'autre part, ceux portant sur les ATPase. Fig. 5: Incubation comme en 3. Phase finale de l'expulsion de mucilage. L'activite IDPasique est visible Ie long du plasmalemme et dans la partie me diane des parois (X 19 000). Fig. 6: Incubation dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLD FISCHER avec la TPP comme substrat. Phase initiale de la secretion de mucilage. Les membranes des vesicules de secretion montrent une activite TPPasique (X 19000). Fig. 7: Incubation comme en 6. Phase d'expulsion du mucilage. Des cellules voisines peuvent hre dans des etats differents: la cellule du haut et celle de gauche, mont rent, en bordure de la zone me diane, une bande tres active. Dans la cellule de droite, toute l'activite enzymatique a migre dans la partie mediane. Le plasmalemme est borde d'une ligne continue de phosphate de plomb (X 19 000). Fig. 8: Incubation comme en 6. Phase d'expulsion du mucilage. Au niveau des parois externes de la glande, on remarque que la cuticule (C) n'est pas marquee. Les pores cuticulaires et les traces de mucilage a la surface de la glande ont une activite phosphatasique. Le plasmalemme de la cellule (it gauche) est tres actif (X 34000). Z. PJlanzenphysiol. Bd. 86. S. 189-201. 1978.
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Phosphatases neutres
Comme dans nos etudes precedentes sur la localisation des phosphatases acides (DEXHEIMER, 1978 a) ou de la glucose-6-phosphatase (DEXHEIMER, 1978 b), il convient de distinguer entre la phase initiale de la production de mucilage, caracterisee par une forte activite golgienne, et les phases suivantes, pendant lesquelles les diet yo somes sont beaucoup moins actifs, et ou Ie mucilage, expulse du cytoplasme, migre dans les parois. Pour mettre en evidence cette categorie de phosphatase, nous avons utilise trois substrats: inosine diphosphate, thiamine pyrophosphate, fJ-glycerophosphate de sodium. Avec l'IDP comme substrat, nous a vons observe, pendant la phase initiale, une activite phosphatasique dans les dictyosomes: les precipites de phosphate de plomb sont localises Ie long des membranes des enormes vesicules de secretion et parfois dans les saccules (fig. 3 a). Le plasmalemme manifeste des ce stade une activite phosphatasique neutre; au contraire, les parois cellulaires ne montrent que quelques precipites epars (fig. 3 a). A la phase suivante, les dictyosomes, beaucoup moins actifs, ne sont plus marques, mais les vesicules de secretion qui vont s'ouvrir dans Ie periplasme montrent une forte activite IDPasique sur leur membrane (fig. 3 b et 4). Simultanement a la migration et a ['accumulation du mucilage dans la partie mediane des parois (DEXHEIMER, 1976), une activite phosphatasique apparah dans cette zone (fig. 4). Enfin, Ie plasmalemme est desormais borde d'une ligne continue de phosphate de plomb.
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A la phase finale, lorsque les vesicules sont reduites des protuberances parietales (DEXHEIMER, 1976), l'activite IDPasique n'est decelee que Ie long du piasmalemme et dans Ia partie mediane des parois (fig. 5). II est a remarquer que Ie contenu mucilagineux des protuberances a une activite phosphatasique quasiment nulle (fig. 5). Fig. 9: Incubation dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER avec Ie p-glycerophosphate de sodium comme substrat. Phase d'expulsion du mucilage. Coupe semi-tangentielle d'une cellule digestive superficielle. L'activite enzymatique est particulierement forte Ie long du plasmalemme et dans la partie mediane des parois. La cuticule (C) ne presente pas de marquage, mais Ie pore (fleche) est tres actif. II est en relation avec une zone parietale ou I'activite phosphatasique est particulierement forte (X 9000). Fig. 10: Incubation comme en 9. Phase d'expulsion du mucilage. Detail montrant la localisation des precipites de phosphate de plomb Ie long du plasmalemme (X 40 000). Fig. 11: Incubation dans Ie milieu de WACHSTEIN et MEISEL sans ATP (t~moin). II n'y a pas de marquage (X 25000). Fig. 12: Incubation dans Ie milieu de WACHSTEIN et MEISEL avec I'ATP comme substrat. Phase initiale de la secretion. Les vesicules ne montrent aucune activite enzymatique (comparer avec fig. 3 et 6) (X 15 000).
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Avec la TPP comme substrat, les resultats sont identiques ceux obtenus avec l'IDP (fig. 6 et 7). 11 nous a ete possible d'observer une etape intermediaire de la migration de I'activite phosphatasique dans les parois: avant que toute I'activite soit concentree dans la partie mediane, nous avons mis en evidence une region tres fortement reactive entre cette zone et Ie plasmalemme (fig. 7). La m~me figure montre aussi que les cellules adjacentes peuvent presenter des etats differents dans la migration de I'activite phosphatasique puisque l'une des cellules, contrairement ses voisines, montre une concentration de l'activite enzymatique dans la partie parietale centrale. Enfin, au niveau de la cuticule (fig. 8), l'activite phosphatasique est nulle, mais elle est tres forte dans les pores cuticulaires, ce qui semble indiquer que les phosphatases sont entrainees par Ie mucilage l'exterieur de la glande. Avec Ie Ii-glycerophosphate de sodium, qui cst Ie substrat habituellement utilise pour mettre en evidence les phosphatases acides, la repartition des precipites au cours des diverses phases de la secretion est sensiblemcnt identique celie que nous avons decrite pour les autres substra:ts (fig. 9 et 10). Toutefois, Ie marquage des dictyosomes actifs est tres faible et sou vent absent. Enfin, comme avec la TPP, nous avons remarque une forte activite ph osphatasique au niveau des pores cuticulaires (fig. 9).
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ATPascs
Nous distinguerons, ici aussi, entre les diverses phases de la secretion de mucilage. Pendant la phase initiale, l'activite A TPasique est forte Ie long du plasmal em me, mais les parois ne montrent qu'une activite faible et diffuse (fig. 13). Dans Ie cytoplasme, aucun organite, m~me les dictyosomes ou leurs grosses vesicules de secretion, ne montre d'activite ATPasique (fig. 12). Au cours des phases suivantes, l'activite ATPasique devient encore plus forte sur Ie plasmalemme. Elle est aussi importante dans les protuberances parietales et dans la zone mediane des parois (fig. 14 et 15). Nous avons observe une forte activite ATPasique au niveau des pores de la cuticule. Cette activite cst aussi decelee dans Ie mucilage exude par la glande (fig. 16). Fig. 13: Incubation comme en 12. Phase initiale de la secretion. L'activite ATPasique est tres forte Ie long du plasmalemme. Elle est peu visible dans la paroi (X 15 000). Fig. 14: Incubation comme en 12. Phase d'expulsion du mucilage. L'activite ATPasique est mise en evidence Ie long du plasmalemme, dans les protuberances parictales et dans la zone mediane des parois ( <30 000). Fig. 15: Incubation dans Ie milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER avec I'ATP comme substrat. Phase d'expulsion du mucilage. Les rcsultats sont identiques it ceux obtenus avec Ie milieu de WACHSTEIN et MEISEL (;' 25000). Fig. 16: Incubation (omme en 12. Phase d'expulsion du mucilage. II y a une activite ATPasiquc au niveau des pores cuticulaircs et dam Ie mucilage exude par la glande (X 34 000).
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Discussion et Conclusion Peu d'auteurs se sont interesses a la localisation ultrastructurale des phosphatases neutres chez les vegetaux. Nous citerons les travaux de DAUWALDER et al. (1966, 1969), GOFF (1973), HEINRICH (1975), MAURUYAMA(1974), NOVIKOFF et GOLDFISCHER (1961), Poux (1967), ZAAR et SCHNEPF (1969), ZERBAN et WERZ (1975). Les resultats de DAUWALDER et al. (1966, 1969) nous interessent plus particulierement car ils concernent l'activite IDPasique et TPPasique des cellules de la coiffe radiculaire pendant la production de mucilage. Dans ces cellules, comme dans celles des glandes digestives de Drosera pendant la phase mucigene, les dictyosomes sont tres actifs et bourgeonnent d'enormes vesicules. Ces auteurs ont montre que les dictyosomes specialises dans la production de polysaccharides pres en tent une activite nucleoside diphosphatasique, sou vent associee a une activite TPPasique. L'activite phosphatasique neutre serait directement liee a la synthese des molecules polysaccharidiques: «the tissues in which a high reactivity for IDPase is consistently found in the Golgi apparatus ... are characterized by specific developmental modification of the apparatus for secretion of a product with a high polysaccharide content» ... (DAUW ALDER et al., 1969). Nos resultats confirment cette interpretation, puisque dans les glandes digestives de Drosera capensis, pendant la phase mucigene, les dictyosomes produisent une quantite considerable de polysaccharides et montrent une activite IDPasique et TPPasique. De plus, nous avons remarque, com me ces auteurs, que les precipites de phosphate de plomb se trouvent sur les membranes limitantes des vesicules de secretion, ce qui semble indiquer que ces enzymes sont associes aux membranes golgiennes. L'activite phosphatasique neutre du plasmalemme, qui est toujours presente dans les cellules digestives de Drosera, a ete aussi signalee dans les cellules mucigenes de la coiffe de Zea mays par DAUWALDER et al. (1966, 1969). Cette localisation est bien connue dans les cellules animales (GOLDFISCHER et al., 1964; NOVIKOFF et al., 1966; ROSTGAARD et BARRNETT, 1964) et certaines cellules vegetales (Poux, 1967). DAUWALDER et al. emettent l'hypothese que cette localisation est la consequence de l'incorporation au plasmalemme des membranes des vesicules de secretion qui presentent une activite phosphatasique. Dans notre materiel, bien qu'il existe deja une activite phosphatasique neutre au debut de la secretion, nous avons remarque qu'elle devient beaucoup plus forte apres l'expulsion des vesicules, ce qui semble con firmer l'interpretation de ces auteurs. Enfin, DAUWALDER et al. (loc. cit.) n'observent pas de relation entre Ie mucilage exude et l'activite enzymatique. Au contraire, chez Drosera capensis, il existe une liaison tres etroite entre la migration du mucilage et Ie deplacement intraparietal de cette activite phosphatasique. De plus, les pores cuticulaires, tres reactifs, mont rent que les phosphatases sont entrainees a l'exterieur de la glande. La mise en evidence d'une activite phosphatasique neutre en utilisant comme substrat Ie jJ-glycerophosphate de sodium merite une mention particuliere. Ce substrat est habituellement employe pour localiser les phosphatases acides. Dans un
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mileu d'incubation pH neutre, Ies precipites de phosphate de plomb presentent une repartition totalement differente de celle qu I'on peut observer apres l'incubation dans Ie milieu de GOMORI (DEXHEIMER, 1977 a). Ce qui confirme que nous avons mis en evidence pH neutre des phosphatases bien distinctes des phosphatases acides.
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Comme pour Ies phosphatases neutres, les essais de localisation de l'activite ATPasique chez les vegetaux sont peu nombreux. De plus, ils ne concernent qu'une categorie tres limitee d'objets: meristt:mes radiculaires (COULOMB, 1973; HALL, 1971; Poux, 1967), parenchyme de Sueda maritima (HALL et DAVIES, 1975), elements conducteurs (GILDER et CRONSHAW, 1973; ROBARDS et KIOWAI, 1969), nectaires (HEINRICH, 1975). Chez Drosera capensis, pendant la phase muclgene, nous avons observe, dans Ie cytoplasme, une activite ATPasique uniquement Ie long du plasmalemme. Cette localisation cst tout fair classique et a ete decrite par divers auteurs. De plus, comme pour les enzymes precedentcs, une activite ATPasique est deceiee dans les parois, aux niveaux ou s'accumule Ie mucilage. Enfin, Ie marquage des pores cuticulaires ct du mucilage exude montre que des ATPases sont excretees par la glande.
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Nous remarquerons aussi, que quel que soit Ie milieu d'incubation utilise, les resultats sont identiques, ce qui indique que les ATPases mises en evidence sont reiativement indifferentes ~1 la composition du milieu d'incubation et en particulier la nature des ions activateurs (magnesium: milieu de \VACHSTEIN et MEISEL; manganese: milieu de NOVIKOFF et GOLDFISCHER).
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A aucun stade de la production de mucilage, nous n'avons observe d'activite A TPasique dans les dictyosomes ou leurs vesicules de secretion, ce qui differencie nettement cette categoric d'enzymes des phosphatases neutres. Dans ces dernieres, il ne nollS a pas ete possible de distinguer, comme Ie font certains auteurs (DAUWALDER et aI., 1966, 1969; GOFF, 1973; NovlKoH et GOLDFISCHER, 1961; ZERBAN et WERZ, 1975) entre une ani vite nucleoside diphosphatase et une activite thiamine pyrophosphatase. Dc notre etude, nous pouvons retenir des resultats concernant Ie fonctionnement des dictyosomes et du plasmalemme pendant la phase mucigene et l'emission d'enzymes avec Ie mucilage exude. L'existencc d'une activite phosphatasique neutre dans les dictyosomes pendant la phase mucigene initiale, confirme les observations de DAUWALDER et al. (loc. cit.) et montre que ces organites presentent une differenciation structurale et physiologique tres profonde. Au cours des phases suivantes, les dictyosomes sont beau coup moins actifs et I'activite phosphatasique neutre disparait. Tous les substrats utilises (ATP, IDP, TPP, [i-glycerophosphate de sodium) ont mis en evidence une tres forte activite enzymatique Ie long du plasmalemme. Les cellules, pendant la phase mucigene initiale, drainent une quantite considerable de metabolites et de precurseurs polysaccharidiques. Le plasmalemme est Ie lieu de passage obZ. PJlanzenphysiol. Bd. 86. S. 189-201. 1978.
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ligatoire pour ces substances et il n'est pas surprenant d'y observer des activites d'enzymes impliquees dans des phenomenes de transport actif. De m&me, no us avons revele des activites enzymatiques dans les zones d'accumulation du mucilage et au niveau des pores cuticulaires. Les enzymes sont done accumulees dans les parois sur Ie m&me sites que Ie mucilage, puis entraines a l'exterieur de la glande. Ainsi, en plus des phosphatases acides dont l'exudation a deja ete signalee par HESLOP-HARRISON (1975), notre travail montre que d'autres phosphatases (ATPases, phosphatases neutres) sont aussi emises a l'exterieur de la glande. Toutefois, il est tout a fait douteux que des enzymes aussi specialises interviennent directement dans les processus digestif, mais il est possible qu'ils participent au transport et a la resorption de produits de la lyse extraglandulaire.
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