Étude de la survie des plaquettes transfusées chez le lapin dans les conditions optimales et en fonction de certaines variables

T r a n s f u s i o n . T . V. N ° 3-4. - -

1962.

I~tude de la survie des plaquettes transfusdes chez le lapin dans les conditions optimales et en fonction de certaines variables par B. MAUPIN ~

L

problbme du devenir des plaquettes transfus6es n'est que partielElement r&olu : on salt que les plaquettes non viables sont retenues par les organes du systbme r6ticulo-endoth4lial (1), avec une pr6dilection pour la rate [12 a. b, 13, 14 a. b. c., 16, 21, 25]. Le potentiel de vie des plaquettes est pour l'Homme de 9 h 11 jours et pour diverses esp~ces animales (dont le Lapin) il est voisin de 5 jours. Cependant, la survie des plaquettes transfus~es, d~finie par la dur~e de leur s6jour dans la circulation de l'h6te est moins bien connue [1, 2 14 c, 15 b, 17, 18]. D'autre part, si la s6paration des plaquettes ellcs-rn6mes, grace h la suppression des actions de surface, est actuelloment bien an point, il n'en est pas de m6me de leur conservation [4 a. b., 8, 9, 10, 11, 20, 22, 23]. I1 nous a paru int6ressant de pr4ciser le d61ai de survi¢ des plaquettes transfus6es clans les conditions les plus favorables. Ce d61ai de *Centre de T r a n s f u s i o n et R d a n i m a t i o n de l'At'rnde (< J e a n J u l l i a r d ~, 1, rue i'~aoulB a l a n y , Clan-tart (Seine). (1) Mieux appeld, d'apr&s C~I~vn'~ONT, (( s y s t b m e h l s l i o c y t a i r e )).

23.6

B. M_3UPIN

base (qni p o u r r a servir ult6rieurement au choix des meilleures m6thodes de conserve) nous a permis, clans l'imm6diat, d'appr6cier rinfluence de quelques variables. Le pr6sent m~,moire c o m p r e n d trois parties : 1) - - Mise au point d'une technique de marquage, de pr61~vements et de mesures, adapt~s h la survie des plaquettes clans la circulation du L a p i n ; 2) - - D6finition de la survie des plaquettes de L a p i n inject~es au Lapin clans les conditions optimales ; 3) - - l~tude de l'inftuence de certaines variables : 1 ° retard dans la transfusion des plaquettes (injection diffSrSe de 3 heures et de 24 heures) ; 2 ° provocation d'un choc chez l ' a n i m a l receveur (par injection de p e p t o n e ou lev6e de garrot) ; 3 ° injection de plaquettes h&6rologues (plaquettes de l ' H o m m e on du Chien injectSes au Lapin) ; 4 ° injection de plaquettes h6t~,rologues h un animal sp$cifique. merit immunis~. I. ~

TECHNIQUE DE M A R Q U A G E . IN VITRO DES PLAQUETTES SANGUINES DU LAPIN

,,

La survie des plaquettes transfus6es se d$finit c o m m e le temps de leur s6jour dans la circulation de l ' a n i m a l receveur. Puisqu'il n'existe pas d ' a u t r e m o y c n p r a t i q u e de reconna~tre les plaqucttes d'apport, nous avons eu recours au m a r q u a g e isotopique. Si la technique utilis6e n'est pas /~ p r o p r e m e n t p a r l e r originale (puisqu'elle s'inspire a m p l e m e n t des travaux de: Baldini [4 a]) elle a n$cessit6 n6anmoins une d$1icate mise au point. Le pr~l~vement des 6chantillons et leur f r a c t i o n n e m e n t ont 6t6 sp~cialement ~tudiSs. ~oix

du

traceur.

Le choix de l'isotope ob6it ~ un certain h o m b r e d'impSratifs qui peuvent se r6sumer c o m m e suit : -affinit$ p o u r les $1$ments figur6s que l'on d6sire m a r q u e r ; -stabilit$ suffisante p o u r une observation de plusie~rs jours ; -absence de toxicit6 p o u r r o r g a n i s m e reeeveur - - aussi bien que p o u r les 61~ments figures ; - - p~riode convenable ;

SURV1E DES PL.4QUETTES TRANSFUS~,ES CHEZ LE LAPIN

237

- - facilit6 de, la mesure des activit6s. De nombreuses raisons militaient p o u r le choix du r a d i o c h r o m a t e de sodium (Na2 Cr 51 0 4) : on sait qu'il se fixe sur les plaquettes sanguines apr~s une br~ve incubation << in vitro >>, avec u n e efficacit6 nettement inf6rieure h celle des h~maties mais cependant appreciable. La stabilit6 (que nous avons 6tudi6e pr~c6demment clans le cas des plaquettes humaines) est satisfaisante, sans ~tre parfaite. L'activit6 sp~,cifique du produit livr6 p a r le C.E.A. est assez forte p o u r que nous demeurions largement en de~h des doses toxiques. La p6riode du Cr ~x est de 27,8 jours. I1 Smet des r a y o n s / 3 et des rayons ? de forte 6nergie qui permettent la mesure ais6e d'6chantillons liquides par le compt.eur h scintillations. L'4talonnage p a r le spectrom6tre en usage au C.T.R.A. a fix~ le seuil de la mesure h 41 volts et la largeur de la fen6tre h 20 vohs. De plus, le r a d i o c h r o m a t e a 6t$ l a r g e m e n t utilis$ p o u r le marquage des plaquettes sanguines p a r de n o m b r e u x auteurs [1, 4 a, 14 b, 15 b, 17, 21). L'addition, en fin d'incubation, d'un rSducteur tel que l'acide ascorbique, t r a n s f o r m e le r a d i o c h r o m a t e en sel de Cr cationique, ce qui ~carte toute ~entualit~, de m a r q u a g e secondaire des globules rouges clans la circulation du receveur. Nous avons ~limin~ le p32 __ utilis6 p a r nous pour la premiere fois sous f o r m e de p h o s p h a t e disodique (12 a. b., 14 a) - - en raison de l'instabilit~ du m a r q u a g e <~ in vitro >> [14 f]. L ' I T M est h a u t e m e n t toxique (15 a). Le C ~4 et le S ~5, 6metteurs de rayons /3 mous, se prOtent bien h l'autoradiographie, mais beaucoup moins ais6ment h la mesure d'activit6 des 6chantillons. L ' A u T M h l'atat colloidal assure un m a r q u a g e p a ~ i c u l i b r e m e n t stable, mais l'efficacit6 en est faible et impose une incubation de longue dur4e difficilement c o m p a t i b l e avec la survie des plaquettes [Maupin 1958, 14 e 1959, 14 f]. Le tracem- $,taut d$fini, le mode de m a r q u a g e n e pr6sentait plus de difficuhSs particuli6res. Cependant, il fallait convenir du sujet d'exp~rience et r~gler les modalit6s de l'4chantillonnage, de mani~re h donner route sa valeur l'exp6rimentation rSalis6e. Choix d e l'anirnal d'exp6rience. Bien que nous ayons acquis une large pratique de la s~paration et du m a r q u a g e des plaquettes sanguines de l ' H o m m e , nous avons op~r(~

B. MAUPIN

,238

sur le Lapin pour des raisons de facilit& I1 6tait n6cessaire en effet, pour appr~cier une survie aprbs transfusion, d'injecter des plaquettes homologues, en se m6nageant les possibilit6s de pr61ever ~t intervalles d6termin6s le sang du receveur. Guid6 par l'expSrience ant~rieure et par les donn6es de la litt6rature, sp6eialement de Baldini, nous avons d6cid6 d'effectuer des pr$16vements 15 minutes puis 3 heures apr~s l'injection de plaquettes marquSes, puis de jour en jour jusqu'~ ~puisement de Factivit6 li6e aux plaquettes. D6terrnlnation de l'activit6 li6e aux plaquettes. I1 ne suffisait pas de disposer des $chantillons de sang: encore 6tait-il indispensable de s6parer, dans l'activit6 globale d'un Sehantillon de sang total, le nombre des coups/minute exprimant l'activit6 des plaquettes circulantes. Elimination des causes d'erreur. En dehors des erreurs inhSrentes h route manipulation de radioisotopes, il en est qui tiennent aux difficuh6s de l'isolement des plaquettes elles-m6mes, "~ partir d'un ~chantillon donn6, e t h la prSsenee d'un petit nombre de globules rouges accompagnant les plaquettes.

Protocole exp6rimental. Toutes cos considerations nous ont conduit ~ 6laborer le protocole suivant : 1°

--

S ] ~ P A R A T I O N DES P L A Q U E T T E S DU L A P I N :

Deux animaux sont saign~s par tm catheter de polyvinyleins6r6 dans la carotide d~nud6e. Apr6s rejet des premi6res gouttes, le sang est reeueilli sans moussage dana des tubes de 50 ml silicon6s (2), qui contiennent chacun 10 ml d'une solution de tStrac~rnate disodique (3). Au d6but de la (2) P o u r 6 v i t e r des redites, n o t o n s qu.e t o u t e la verreri~e a 6t6 silieon6e p a r t r a i t e m e n t a u R h o d o r s i l 240, dilu6 ~t 10 % d a n a l'6ther de p 6 t r o l e ( M a u p i n et L e r o u x , 1957, 14d). (3) T6trac6mate disodique ...................... 1 g NaC1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......... 0,7 g p o u r 100 m l Solution filtr6e et st6rilia6e /~ l ' a u t o c l a v e .

SURVIE DES PL,IQUETTES TRANSFUSEES CHEZ LE LAPIN

239

saignSe, 4 m l de sang sont recueillis sur 1 m l d'une solution de citrate ~t 3,8 ~ , e n v u e des contrS!es thrombSlastographiques. On n o t e r h c u r e de la premi&re saignSe, qui m a r q u e le dSbut du sSjour extra-vasculaire des plaquettes. L e s 4 ou 6 tubes de sang sont portSs sans dSlai clans une eentrifugeuse refroidie du t y p e PR2 ( G e n e r a l Electric C o ) p o u r u n e premibre centrifugation de 5 minutes ~ 2.500 t o u r s / m i n u t e , ~ la temp@ature d e + 4 ° C . Le plasma surnageant (plasma riche en plaquettes ou P R P ) est pipets avec prfieaution et transfSrS dans de nouveaux tubes cylindriq u e s siliconSs. La seconde centrifugation p o r t e habituellement sur 4 tubes de P R P qui sont tournSs 25 minutes ~ 2.800 t o u r s / m l n u t e . Elle fournit un surnageant clair ou dicrbtement opalescent (plasma dSplaquett6 ou PDP) q u i est reeueilli p a r dgcantation clans un flacon siliconS. Les culots blancs, discr&tement contaminSs p a r des hSmaties (4), sont dissociSs fi r a i d e d ' u n agitateur de v e r r e siliconS, dans quelques ml de P D P additionn6 de Triton W I I 1339 (5). Ils sont rSuuis dans un t u b e fi centrifuger ~ fond r o n d et ~ virole ; quelques va-et-vient l'aide d ' u n e pipette & b o u l e assurent la dispersion des grumeaux. On obtient ainsi une suspension plaquettaire homogSne, de teinte chamois, dont le v o l u m e total ne doit pas excSder 6 ml. 20 --

M A R Q U A G E DES P L A Q U E T T E S :

On dispose d'une solution m a r q u a n t e de r a d i o c h r o m a t e de sodium de bonne activitS spScifique, fom~aie p a r le Commissariat h l'l~ncrgie A t o m i q u e (activit6 voisine de 1 m C / m l - - teneur en Cr $16ment : environ 20 3,/ml). Avec une pipette de prScision, on ajoute aux plaquettes la quantitS qui correspond h une activit6 de 300 ~C (microcuries). Le tube, ferm$ p a r une virole, est p o r t s au bain-marie + 37°C, et agit6 toutes les 5 minutes, p e n d a n t 15 minutes. A ce m o m e n t , le t u b e est remis sur son p o r t o i r et le m a r q u a g e est aussitSt arr~t6 pa r r a d d i t i o n d ' u n e petite quantit6 d'acide aseorb i q u e (1 m l d'une Solution ~ 5 ~ , soit 50 rag). O n ajoute environ 15 m l de solution de Triton ~ 2 % et 15 ml de P D P puis on centrifuge 25 minutes ~ 2.800 tours/minutes. On a rSalis~ ainsi un p r e m i e r lavage des plaquettes marquSes, lavage qui (4) Darts les expdricnces les plus rdcentes, il a paru avmatageux de rdpdter In premiere centrifugati0n pour rdduire la contamination par les globules rouges. (5) A 2 % dans une solution salin e lsotoniqne.

B. M A U P I N

240

dans nos exp~riences, comme dans celles de Baldini [4 a], demeure unique. En effet, le temps compte, et il semble superflu de multiplier les lavages alors que le premier surnageant contient la presque totalit6 de l'activit6 non fix$e par les plaquettes. La d~cantation s'op~re ais6ment par r e t o u r n e m e n t du tube, audessus d'une 6prouvette de 50 ml gradu~e. Le culot plaquettaire est repris par 2 ml de T r i t o n /t 2 % et 5 ml de P D P : quelques marreeuvres douces d'aspiration et de refoulement l'aide d'une p i p e t t e silicon6e apparaissent plus efficaces que la dissociation par un agitateur de verre. Le tout est transport6 dans un flacon de 20 ml (type : p~nicilline), qui a 6t6 tar6 : on note le poids et on complete h 17,5 g par addition de PDP. Avant de nous rendre au Laboratoire de Physiologie pour rinjection des animaux, nous pr$1evons 1 ml de la suspension plaquettaire marquee (P+) p o u r mesure d'activit$, plus 0,5 ml pour contr61es h6matologiques. L'ensemble de ces manipulations a demand6 environ 2 heures (maximum : 2 h. 30). 3 ° • --

INJECTION

AU

LAPIN

:

La suspension homog6ne de plaquettes marquees est aspir6e dans une seringue de 5 ml, qui est tarSe avec son aiguille avant et apr~s injection. Chaque animal re~oit environ 5 g par voie veineuse (veine marginale de roreille), la quantit$ inject6e 6tant autant que possible proportionn6e au poids du Lapin. Une m i n u t e r i e est raise en marche. 4 °.

--

PRELEVEMENTS.

Tous les pr616vements ont 6~t6 opSr6s uniform6ment par ponction eardiaque, ~ l'aide d'une seringue de 10 ml rinc6e /t l'h6parine et d'une aiguille de 40 x 12. L'animal 6rant fix6 en position dorsale sur une planche ~ contention, nous retirons environ 8 ml de sang. R y t h m e des pr6l$vements : le premier jour, 15 minutes et 3 heures apr~s l'injection, puis apr~s 21 heures, 45 heures, 3 et 5 jours. Tant pour faciliter les ponctions cardiaques que pour minimiser les rSpercussions sur la masse sanguine de ces saign6es rapproch6es (elles se traduisent par un abaissement sensible de l'h6matocrite), nous avons choisi des Lapins d'un poids de 3,500 kg.

SURVIE DES PLAQUETTES TRANSFUSI~ES CHEZ LE LAPIN 5 °. - -

241

PRI~PARATION DES I~CI-IANTILLONS.

Toutes les mesures d'activit6 s'op~rent sur un volume de 3 ml dans des tubes h collerette de g~om&rie constante. ,4)

--

ContrSles

:

S+ = P+ =

solution m a r q u a n t e dilute au 1/10.000; plaquettes marquSes diluSes au 1/100 dans une solution de t$tracSmate disodique (dispersion homogSne) ; 1~r surnageant dilu6 au 1/250. Nous y ajoutons les ~chantillons rSsultant de deux lavages pratiqu6s sur le restant de la suspension plaquettaire, qui n'a pas 6t6 utilisSe en totalit6 p o u r les injections. B) -- Pr~l$vements effectuSs sur les a n i m a u x d'exp~rience : chaque $chantillon de ponction cardiaque est d6sign~ par une lettre (cot, respondant ~ un animal) et un chiffre (num6ro d ' o r d r e de la ponction). Cinq d6terminations sont nSeessaires aux conclusions de l'exp6rience : l'h~matocrite (mesur6 dans un t u b e de Wintrobe) ; et quatre mesures d'activit$, p o r t a n t s u r : le sang total (3 ml) et les fractions suivantes : plasma d~plaquett6 (3 ml) G.R. lav6s (1 m l dilu$ dans 2 m l d'eau distill6e) <~ huffy coat >~ ou tapis leucocyto-plaquettaire. D~s l'arriv~e des ~chantillons au L a b o r a t o i r e d'H6matologie, nous pr61evons la quantit6 de sang n6cessaire h la d6termination de l'h6matocrite (tube de W i n t r o b e ) , et nous mesurons i m m ~ d i a t e m e n t sur 3 ml l'activit6 du sang total. Aussit~t apr~s, un t u b e de K a h n est garni de la totalit6 du volume de sang disponible (habituellement 7 ml) et tourn$ p e n d a n t 10 minutes ~ 3.800 t o u r s / m i n u t e . Le PDP, dont le volume dSpasse l a r g e m e n t 3 ml, est pipet6 jusq u ' a u ras du tapis leucocyto-plaquettaire (ou <~ buffy-coat ~>). Celui-ci est ensuite dStach6 en bloc ~ l'aide d ' u n fin crochet de verre et transp o r t s dans un t u b e de mesure oh il sera dig~r~ p a r mle trypsine ou de l ' a m m o n i a q u e diluSe. Restent les G. R., qui sont lav6s deux fois avant d'etre soumis ~ u n e mesure d'activit~. Connaissant l'h~matocrite, il est facile de calculer ensuite les activitSs de chacune des fractions (PDP, G.R., ~ buffy coat ~>)pr6sentes

3

B. MAUPIN

242

dans un v o l u m e de 3 m l de sang, et de faire la s o m m e de ces activitSs partielles p o u r la c o m p a r e r ~ l'activit6 de 3 ml de sang total.

R~sultats techniques. 1 ° - - EFFICACITI~ ( o n r e n d e m e n t du m a r q u a g e ) : C'est le pourcentage de l'activit6 prSsent6e qui demeure fix~ apr~s trois lavages sur les plaquettes marqu6es. Dans nos conditions d'expSrience, oh les plaquettes du L a p i n ne sent soumises qu'~ un seul lavage, elle oscille entre 5 et 10,8 % (4,35 ~ 9,4 % si 1'on en soustrait l'activit6 qui aurait 6t6 enlevSe p a r demx lavages suppl6mentaires). 2 ° - - ACTIVITF, FIXI~E PAR UNITI~DE PLAQUETTE : Elle se situe entre 1,48.10 -a et 3.10 -6 coups/minute, sous r6serve d ' u n faible poureentage qui a p u ~tre apport6 p a r los globules rouges de contamination. 3 ° --

STABILITI~ DU M A R Q U A G E :

La fixation sur les plaquettes d ' u n traceur tel que le radiochrom a t e n'est pas irr6versible. Avec le temps se manifeste u n e certainc porte d'activit6 que l'on serait tent6 d ' a t t r i b u e r h une disparition des plaquettes circulantes, et qui correspond en fait h u n e 6~ution que N a j e a n (17) ~value h 10 p. cent p a r jour. Dans le cas des plaquettes hunlaines marqu6es in vitro, nous avions 6valu6 cette perte d'activit6 h 30 % dans les premieres 24 heures (14 f). Nous n'avons pas cherch6 h chiffrer la perte d'activit6 p a r $1ution dans notre s~rie d'exp6riences : nous leur demandons moins un renseignement en valeur absolue q u ' u n e comparaison entre le devenir des plaquettes dans des conditions normales et darts des conditions modifi6es. 4o

~

CONTRoLE

IN VITRO

a) aspect morphologique des plaquettes : sur frottis color~ au MayGriinwald-Giemsa, les plaquettes marquees apparaissent isolSes, avec un pourcentage i m p o r t a n t de formes dendritiques et de formes de transition ; b) aetivit$ dynamique appr~ci~e par la thromb~htstographie :tou-

SURVIE DES PLAQUETTES TRANSFUS~ES CHEZ LE LAPIN

243

tes nos pr6parations out 6t6 soumises h ce contr61e. La figure I pr6sente un trac6 type (exp6rience n ° 12) :

I

./

Fla. 1. - - Contr~le de l'activitd dynamique des plaqueftes moJ'qtzdes ( c o r r e c t i o n d ' u n p l a s m a d6plaquett6) : 1. p l a s m a d~plaquett6 de L a p i n n o r m a l ; 2. le m ~ m e apr~s a d d i t i o n d'e p l a q u c t t e s m a r q u 6 c s ; 3. p l a s m a t 6 m o i n r i c h e en p l a q u e t t e s .

1. p]asma citrat6 de Lapin normal, d6plaquett6 par une centrifugation 6nergique ; 2. Plasma de s6dimentation, fiche en plaquettes ; 3. suspension de plaquettes marqu6es, dilu6e en 1/5 dans le plasma d6plaquett6. Les plaquettes marqu6es raccourcissent n e t t e m e n t le temps de t h r o m b o p l a s t i n e (m~me e n - d e ~ des valeurs normales) et corrigent le d6faut d'amplitude du plasma d6plaquett6. c) activit6 respiratoire : la consommation d'oxyg6ne a 6t6 mesur6e au manom6tre de Warburg sur les plaquettes de rexp@ience n ° 11. Son importance a &6 trouv6e de 7,66 microlitres d'oxyg~ne par nail. liard de plaquettes et par heure, ce qui rentre dans los valeurs normales. 5 ° --

DISCUSSION

DE LA T E C H N I Q U E :

1) - - A p p r e c i a t i o n de l'activit~ inject~e : A r e x e m p l e de Baldini [4 a], nous ne lavons qu'une fois les plaquettes de Lapin marqu6es. I1 en r6sulte que celles-ci entrainent une fraction d'activit6 qui n'est pas n@ligeable, li6e ~ l'atmosph~re p6riplaquettaire. Cette fraction ne peut 6tre consid~r6e comme li6e aux plaquettes ear elle diffusera rapidement dans le milieu ambiant.

244

B. MAUPIN

I1 est facile d'en d6terminer l'importauce en op6rant deu_x lavages suppl6mentaires sur un 6chantillon de plaquettcs marqu6es, non destin6 ~ la transfusion. Nous l'avons fair dans deux exp6riences, et trouv6 que 85 % et 87,5 % (respectivement) du Cr 51 demeurait li6 aux plaquettes h l'issue de ces lavages. P a r cons6qucnt, en extrapolant ees r6sultats h 1'ensemble de nos exp6riences, nous pouvons consid6rer que 85 % environ de l'activit6 inject6e est bien li6 aux plaquettes. I1 cst plus difficile d'61iminer des globules rouges et blancs de contamination, qui ont fix6 6galement le radiochromate. L'exp6rience nous a montr6 le bien.fond6 d'une scconde centrifugation ~ vitesse mod6r6e, op6r6e au stade pr6liminaire de la s6paration des plaquettes. Toutes corrections effectu6~es, chaque animal reccvait une activit6 totale de 225.000 ~ 532.000 coups/minute, soit une activit6 th6orique de 1.220 ~ 3.200 e / m par ml de sang. 2) - - Le probl~me crucial est l'apprdciation de I'activit~ plaquettaire "~p a r t i r d'un 6chantillon du sang circulant du Lapin. Nous avions cru pouvoir la d6terminer en soustrayant, de l'activit6 du P R P obtenu par une centrifugation br~ve, celle du P D P f o u m i par une centrifugation plus pouss6e de l'6chantillon de sang : activit6 li6e aux plaquettes = activit6 du P R P - - activit6 du P D P

(en e/m). E n fair le n o m b r e de coups/minute mesur6 est souvent important. Mais le P R P ne contient pas, A beaucoup pr6s, le m~me chiffre de plaquettes que le sang total. Un tel proc6d6 ne serait valable que si l'on pratique une num6ration des plaquettes, d'une part sur le PRP, d'autre part sur le sang total, pour conclure p a r une r$gle de trois. Ce mode op6ratoire est compliqu6, il additionne les causes d ' e r r e u r li6es h dcux num6rations. I1 eCtt 6t6 possible 6galement de mesurer l'activit6 du culot plaquettaire fourni par la centrifugation du m~me PRP. Mais cette mesure ne nous a pas p a r u assez fiddle (le culot doit ~tre remis en suspension hornog~ne ou dig6r6 par la soude) et n'aurait pas dispens6 des num6rations indiqu6es ci-dessus. Le proc6d6 que nous avons choisi p e r m e t de rassembler, dans un tapis leucocyto-plaquettaire r6sultant d'une centrifugation 6nergique, la presque totalit6 des plaquettes contenues dans l'6chantillon de sang. Ce tapis contient, par d6finition, des leucocytes, mais nous savons qu'il ne peut s'agir des leucocytes transfus6s, 6ventuellement marqu6s car ceux.ci ne demeurent pas dans la circulation du receveur [Weisberger,

245

SURVIE DES PLAQUETTES TRANSFUSEES CHEZ LE LAPIN

24 ; Maupin, 14 a.b ; thSse Perrault, 19]. L'activit6 apport6e p a r les globules rouges ou le plasma de contamination est n6gligeable. En fait, l ' e r r e u r de mesure est plus souvent une erreur p a r d$faut, qui tient ~ la difficult~ m6canique du pr6l~vement du tapis leucocyto-plaquettaire. I m p o r t a n t et coherent, celui-ci vient en un seul bloc, entrain6 facilement p a r un fil de verre coud6, ell incllnant le tube. S'il se fragTnente, l ' e r r e u r p a r dSfaut est in6vitable. Elle se prate h e u r e u s e m e n t ~ une correction qui s'effectue c o m m e s u i t : on soustrait de ractivit6 de l'$chantillon de sang total (3 ml) les activitSs partielles du plasma et des globules rouges contenus dabs 3 m l de sang. La diffSrence traduit la seule activit6 plaquettaire. Ce calcul est rapide, et dispense des num@ations plaquettaires. II exige simplement, e o m m e nous l'avons indiqu6, la mesure de l'hSmatocrite sur chaque $chantillon. IT. __ SURVIE DES PLAQUETTES DU LAPIN INJECT~.ES AU LAPIN DANS LES CONDITIONS NORMALES A. - - R 6 s u l f a t s e x p ~ r i m e n t a u x .

Sept Lapins out re~u des plaquettes homologues pr~par~es et inject~es dabs les conditions optimales. Les r$sultats e n sont consign~s dans la T a b l e a u I, oh l'activit6 des plaquettes contenues dans 3 m l de TABLEAU I

Lapins t~moins ACTIVITE PLAQUET, TAIRE INJECTEE EXP.

POUItCENTAGE DE L~ACTIVITE PLAQUETTAXRE 1NJEETEE PRESENT DANS LA CIRCULATION DE L'H~TE A U ~ TEMPS DON,N3~

(en~ eoups/min, pour 3 ml de sang + 15 mn

PL 5-1..

8.080

PL 6-1..

5,600

PL 7-1..

5.550

4,6

PL 0-1..

[

+ 3h

56,1

6--g f-,7 I

6.500

56,2

6.290

66

59,2

PL 10-G

8.190

51,2

47,1

PL ll-X

3.720

68,8

+ ,15 h -~ 3 jour~ -~- 5 jours

40,6

PL 9-2..

i

+21h

14,8

_ _

26,9 28

48 I_ 47

10,7 32,5

1,5

-12

.....

1

5,5

0,4

17 5,2 16

0,5 4,8

B. MAUPIN

246y

sang de i ' a n i m a l receveur est rapport~e ~ la valeur th6orique injectSe p o u r un m ~ m e volume de sang. Co m o d e de pr~,sentation d e m a n d e ~ ~tre jnstifi~. La mesure nous a donn$ plusieurs chiffres : activit6 du sang total (6chantillon de 3 ml) -<< du plasma d6plaquett6 -<< des G.R. lav6s << du tapis leucocyto-plaquettaire. L'h~matocrite 6tant d6termin6 p o u r chaque Sehantillon. il est facile de r a p p r o c h e r la s o m m e des activit$s des fractions de l'activit~ du sang total. La s o m m e des activit6s partielles mesurSes est parfois inf&iettre (de 5 ~ 20 %) h l'activit6 du sang total. Nous attribuons cette difference p a r d~faut aux diffieult~s de pr~l~vement du << buffy coat >> tapis leucoeyto-plaquettaire, souvent fragment~, et nous avons corrig~ la valeur mesurSe en nous a p p u y a n t sur les autres variables. E n effet, l'activit6 du plasma est relativement i m p o r t a n t e dans les premieres heures et d~crolt rapidemeut. L'aetivit~, des G.R., i m p o r t a n t e dans certaines experiences, dSerolt lentement mais r6gulibrement (la demi-vie des G.R. du L a p i n est de l'ordre de 15 jours). L'aetivit$ des plaquettes elles-m6mes repr6sente la principale variable h la mesure de laquelle hens avons pr~t$ le m a x i m u m d'atteution. Cette aetivit~ d6finie, "~ quelle valeur la r a p p o r t e r ? Deux possibilit~s se prSsentaient : 1 ° --- calcul de la demi-vie des plaquettes transfus~es, bas~ sur la d$t e r m i n a t i o n d u p i c d'activit~ m a x i m a : ce pie se situe tant6t ~a 15 minutes et tant6t ~ 3 heures apr~s r i n j e c t i o n ; ce qui laisse supposer que nous pouvons l'avoir m a n q u 6 f a u t e de mesure aux t e m p s intermSdiaires. E n fixant a r b i t r a i r e m e n t le 100 % p o u r le p r e m i e r ~ehantillon (I-I -~- 15 minutes), nous avons Svalu~ sur une m o y e n n e de 7 experiences ]a demi-vie a p p a r e n t e des plaquettes transfusSes h 29,5 heures. Notons que ]e 50 % du sang total est atteint seulement apr~s 33,5 heures, ee qui traduit l'aetivit~ non n6gligeable liSe aux G.R., d e n t le potentiel de vie est plus-61ev~ : l'aetivit6 du sang total est done une rSsultante. 2 ° - - pourcentage de survie des plaquettes par rapport au ehiffre th~orique injeet~ : Nous dSterminons d ' a b o r d l'aetivit6, plaquettaire injectSe en nous - -

- -

o u

SURVIE DES PLAQUETTES TRANSI;'USEES CHEZ LE LAPIN

247

basant sur ractivit6 d'un 6chantillon plaquettaire lav6e 3 lois, ou en soustrayant 15 % de l'activit6 de l'6chantillon lay6 1 lois. L'activit6 th6orique T de 3 ml de sang se d6duit de la f o r m u h :

T (ell coups/minute) = 3 >(

AX18 P

A - - aetivit6 totale injeet6e P - - poids de r a n i m a l en grammes. E n effet, d'apr~s Burke (1954) [7], le vohtme sanguin du Lapin, en ml, reprSsente 1/18 du poids du corps exprim6 en grammes. L'allure g$n~rale des courbes est donn~e par la figure 2.

60 ' ~

50

15m 3h

',

o....... o

21h

,¢$h

• ddloi~ opr~ Lapitts tdmoins.

courbe

3j

?ype

sj

.

injechon

FI~. 2. - S u r v i e des p l a q u e t t e s p o u r e e n t a g e de l ' a c t i v i t 6 injectde).

darts

les c o n d i t i o n s

optirr~aIes (en

D'autres modes de repr6sentation ont 6t6 propos6es : ainsi Baldini a d6fini un index de viabilit6 plaquettaire, d6termin6 h la lois par la surface sous-jaeente h la courbe des pourcentages et par le temps oh

B. M A U P I N

248

cette courbe atteint ]a ligne des 10 %. Le point 10 % correspond en effet, pour cet auteur, h ~m point d'inflexion de la courbe. I1 est en tout cas plus facile ~ appr6cier flue la demi-vie apparente des plaquettes transfusSes. Duns nos expSriences, le point 10 % se situe entre la 48 ° et la 98 ~ heures, avec u n e valeur m o y e n n e de 76 heures (85 --- 5 heures pour Baldini).

4 000

3000

2000

xx• \ 0

1 000

""

l

\

'l. \.

0 15m

3h

21 h 4,5 h d61015 o p r d ~

3j injection

3j

FI6. 3. - - Cottrbe type

(expfri'ence PL - 6) : A - Aetivit6 d u s a n g t o t a l .(mesurde sur 3 II11) ; B - %ctivit6 p l a q u e t t a i r e calcul6e ; C - Activit6 p l a q u e ~ a i r e rnesur~e ; D - Aetivit6 li6e a u x globules rouges ; E - Aetivit6 li~e au p l a s m a .

La figure 3 pr6sente l'$volution avec le temps des aetivitSs du sang total, et de ses fractions, rapport~es ~ un v o l u m e de 3 m l (exp~rien. ce PL 6). On volt que l'activit6 du sang total a pour principale composante l'activit6 proprement plaquettaire telle que nous l'avons pr~c6-

249

SURVIE DES PL.4QUETTES TRANSFUSEES CHEZ LE LAPIN

demment dSfinie. L'activit6 du plasma baisse rapidement par suite de l'6puration r~nale, eelle des hSmaties est ici p r a t i q u e m e n t n@ligeable.

Citons pour mSmoire u n essai de transfusion au Lapin de plaquettes homologues marqu6es par r A u colloidal radioactif : cette experience (PL 12) ne diffSrait des exp6riences tSmoins que par le choix du traceur et la durSe de rincubation. Ce mode de marquage prSsentait par r a p p o r t au marquage par le radioehromate un double int6r~t th$orique : 1 ° - - la plus grande stabilit$ du marquage plaquettaire 2 ° - - rabsence de fixation par les globules rouges de r o t radioactif ~ l'$tat colloidal. Or la survie des plaquettes marqu6es Aulgs a $t6 tr~s eourte : apr~s 15 minutes, on retrouvait seulement 2,8 et 3,4 % de l'activit$ injectSe, apr~s 3 heures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . apr~s 22 heures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1,6 et 1,9 % 0,5 et 0 , 1 %

Cependant, ces plaquettes prSsentaient une activit$ respiratoixe appr$ciable au manom~tre de W a r b u r g (4,07 pl d ' 0 J 1 0 ° plaq/heure, contre 5,66 pour les plaquettes tSmoins) et corrigeaient l'image thromb$1astographique d'ml plasma dSplaquett$. ~g

B. ~

Discussion.

Une premiere constatation s'impose : nous ne retrouvons dans la circulation du receveur q u ' u n e partie de ractivit6 plaquettaire inject6e (44,6 h 68,8 % salon nos experiences). Mais dans 4 expSriences o/1 nous avons pu comparer l'activit6 des 15 minutes et celle des 3 heures qui suivaient rinjection, l'activit6 des 3 heures se trouve 2 lois sup$rieure et 2 lois iuf6rieure ~ celle des 15 minutes. La m o y e n n e arithm6. tique des valeurs suecessivement obtenues nons donne, en partant d'une valeur initiale 100 aprbs 15 minutes : ACTIVITE SANG TOTAL

apr~s apr~s apr~s apr~s apr~s

3 heures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 heures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 heures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

102

61,3 44,3 26,2 12,6

ACTIVITE PLAQUETTAIRE CORHIG~E

106 63,7 39,5 16,4 2,7

250

B. MAUPIN

~qous confirmons ainsi la s~questration t e m p o r a i r e des plaquettes transfusSes, dans u n organe qui pourrait ~tre le p o u m o n [Bierman, 6]. D'autre part, la diffSrence entre les pourcentages d'activit$ dans le sang total et dans la fraction plaquettaire s'explique par la contamination &Tthrocytaire ties 6chantillons injectSs, contamination qui a 6t$ irnportante dans quelques exp&iences. Cette diffSrence s'accentue avec le temps, puisque les globules rouges de Lapin out un potentiel de vie de 50 ~ 70 jours (trSs sup&ieur celui des plaquettes, de l'ordre de 5 jours) avee une demi.vie appa. rente de 13 h 18 jonrs [Berlin et coll., 1959, 5 ; Allison 1960, 3]. P o u r cette raison, nous ne pouvons nous rSf&er ~ l'activit6 du sang total, mais nous suivrons l'6volutiou de la seule activit$ des plaquettes circulantes. E n conclttsiort : apr~s injection au Lapin de plaquettes homologues, nous observons chez certains animaux le phSnom~ne de s~questration initiale.

Le point 10 %, correspondant h la survie apparente d'un dixi~me des plaquettes injectSes, est atteint entre 48 et 98 heures, avee une valeur moycnne de 76 heures dans nos conditions d'exp$rienee. Les globules rouges de contamination, qui se trouvent m a r q u & par le radiochromate en m~me temps que les plaquettes, constituent dans certaines s6ries une cause d'errenr non nSgligeable.

m. ~ SURVIE DES PLAQUETTES EN FONCTION DE DIVERSES CONDITIONS EXP~.RIMENTALES Plusieurs facteurs sont susceptibles d'affecter la viabilit$ des plaquettes transfusSes : a) - - alterations d'ordre physiqne (actions de surface) et biochimiques (15sio11~ de vleillissement), et c'est tout le probl~me de la conservation ; b) --- destruction ou rejet de la circulation par l'h6te : et c'est tOUt le probl~me de la ~compatibilit$. Aussi avons-nous 6tudi6 sp6cialement l'influenee du facteur t e m p s et du facteur esp$ce. Nous avons 6tendu notre investigation au comp o r t e m e n t des plaquettes h l'occasion du ehoe et dans certaines conditions immunologlques.

S U R V I E DES P L A Q U E T T E S TRANSFUSEES C H ~ Z

A.

-

-

Facteur

,,

temps

LE L A P I N

251

,,.

Nous avons voulu eonfirmer par l'exp6rienee sur l'animal le bienfond6 de ce qui est devenu p o u r notre application clinique une r~gle pratique : u n e s u s p e n s i o n p l a q u e t t a i r e f r a t c h e m e n t p r ~ p a r ~ e d o i t ~ t r e transfus6e sans ddlai.

I1 6tait donc indiqu6 de savoir ce qui se passe lorsqu'un retard est apport6 d61ib6r6ment ~ l'injection des plaquettes. Darts les s6ries de r6f6rence, leur s6jour extra-vasculaire ne d6passait pas 2 heures 1/2. Nous avons prolong~ ce d61ai de 3 heures et de 24 heures, dans deux exp6riences portant chactme sur deux animaux. Entre leur preparation et leur injection, les plaquettes marqu6es 6talent maintenues tt la glaci6re. Les r6sultats sont port6s s u r le tableau II. La valeur obtenue apr~s 15 minutes est importarrte, mais d6j~ inf~rieure ~ celle des arfi. m a l ~ tSm_oins.

70

60

50

40_

~

ploquetle~

e. . . . . . . .

4

oe

J h. 2 4 h.

30.

20.

,

.

.

.

.

10.

0 15n 3 h

-o._. . . . . . . . 21 h d#lai5

~-. . . . . . '4:5 h

opr~s

_ . _ ~.

3j

4j

finjection

FIG. 4. Influence du facteur << temp.~ >>. P o u r e e n t a g e des t r o u v 6 e s darts la ehocu!ation de l'h6te. -

-

plaquettes marqu6es

re-

B. MAUPIN

252

3 heures apr6s l'injection, l'activit6 li6e aux plaquettes circulantes a n e t t e m e n t d6cru ; o n ne retrouve pas ici le << pic >> qui, chez les t6moins, 6voque la s6questration pulmonaire. 21 heures et 45 heures apr~s l'injection, l'activit6 des plaquettes est faible et devient pratiquement n6gligeable. Le petit h o m b r e de nos exp$riences ne pe~anet pas de les soumettre l'analyse statistique. La r6duetion de la survie e s t n e t t e lorsque la transfusion est diff6r6e de trois heures, et beaucoup plus encore lorsque le dalai atteint vingt-quatre heures. La figure 4 pr6sente les co.urbes qui expriment Failure du ph6- -

- -

nom~ne

;

a) Plaquettes inject6es avee u n retard de 3 heures : la demi-vie apparente est 16g6rement inf6rieure h 4 heures. le 10 % de l'activit$ vraie injectSe est atteinte entre 21 et 45 heures.

-

-

-

-

TABLEAU II

Influence du [acteur << temps (rn6mcs c o n v e n t i o n s q u e p o u r le T a b l e a u I) A. - - P l a q u e t t c s injcet6es avec u n retard de 3 h e u r e s .

~Xp

] ACTIVIT~ PLAQUETTAIRE INJECr~ (en c o u p s / minute pour 3 m l de sang

D61ais apr~s l ' i n j e c t i o n

15 Inn

+3h.

+21h.

P L 5-2

9.600

65,7

38,6

7

P L 7-2

5.200

66

38,2

13,4

+ 3 jours

I

4,3

B. - - P l a q u e t t e s inject~es avee u n retard de 24 h e u r e s .

P L ft.2

1.200 (?)

PL

6.420.

7-3

08

2 8 •

12,2 1,5

0,4

SURVIE DES PLAQUETTES TRANSFUSEES CHEZ LE LAPIN

253

b) P o u r les plaquettes inject6es avec un retard de 24 heures, l'activit6 circulante est tomb~e au-dessous de 10 % d~s les deux premieres heures. L'activit~ des G.R. eux-m~mes, dans lcs exp6riences P L 5 et P L 7, o~ elle 6tait initialement importante, d6croit plus r a p i d e m e n t que chez les animaux t6moins. E n conclusion, la survie de plaquettes homologues, soustraites attx conditions de surface, est fortement compromise lorsque leur injection est diff6r6e ne serait-ce que de 3 heures, et h plus forte raison de 24 heures. B. ~ F a c t e u r ,, choc ,,. Nous avons cherch6 h savoir si la survie des plaquettes homologues 6tait modifi6e chez u n animal en 6tat de choe : a) Dans ce but, six Lapins ont ~,t6 soumis h u n choc p e p t o n i q u e , dans trois s6ries exp6rimentales qui comportaient chacune un animal t6moin. Des essais pr~liminaires nous ont conduit h fixer une dose qui soit agressive sans ~tre 16thale : des animaux de l'$levage du C.T.R.A. avaient St~ russ par une dose de 10 m l / k g d'une solution h 30 % de peptone Chapoteaut. Nous avons choisi 5 ml/kg, mats cette dose a 6t~ major6e chez certains animaux qui n'avaient pas r6pondu cliniquement h l'injection initiale. Les plaquettes marquSes ~taient inject~es au m o m e n t de l'apparition des signes cliniques du choc, soit environ 3 minutes apr$s l'injection de peptone. Un animal est m o r t peu apr~s la premibre poaction cardiaque (environ 30 minutes apr~s l'injection de plaquettes marquees). Nous avons v6rifi$ h cette occasion combien l'h6mostase est perturb6e par l'injection de peptone, car ce Lapin prSsentait h l'autopsie u n h$mop6ricarde et un h6mothorax importants, origine 6vidente de sa m o r t (6), et le sang n'6tait pas coagul6. P o u r contr61er l'hypotension qui fait pattie du tableau du choc peptonique, nous avons enregistr$ la P.A. chez denx animaux (cf. fig. 5) (6) U n a u t r e L a p i n , de la m 6 m e s~rie, so.umis h i n j e c t i o n de peptone, a pr~sent6 a p r b s la 2 • p o n c t i o n c a r d i a q u e dcs accidents i n q u i 6 t a n t s a u x q u e l s il a n ~ a n m o i n s s u r v 6 c u . Le p l a s m a de s 6 d i m e n t a t i o n de ce suJet, prdlev6 48 h e u r c s p l u s t a r d e t exar a i n 6 p a r t h r o m b 6 l a s t o g r a p h i e , d o n n a i t u n e a m p l i t u d e tr~s f a i b l e , i n f 6 r i e u r c h 15 m m (ce qui t e n d h d 6 m o n t r e r uric r 6 d u c t i o n c o n s i d 6 r a b l e d u f i b r i n o g ~ n e , s i n o n des p l a quettes c i r c u l a n t e s ) .

B. MAUPIN

254

(PL 10). II a $t6 not6 incidemment que les plaquettes par elles-m~mes ne provoquent pas d'hypotension. E t si nous eomparons les r~sultats obtenus chez les 5 animaux qui

e

\ ¢Ocm/Hg

(I

I

I I"1"i 30~ec

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c Ia

I I I I

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.,.~.~'~-~

(I

I T"-i

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I I I J l l l l l l

Illl

I

I i / t

I I I

Yzc,. 5. - - L a p i n 3,750 k g : choc peptonique .' I n j e c t i o n I.V. s01u¢ion d e p e p t o n e /t 25 % d a r t s u n s 6 r u m p h y s i o l o g i q u e a - d 6 b u t de l ' i n j e c t i o n fin. b I n j e c t i o n I.V. de p l a q u e i t e s h o m o l o g u t , s m a r q u d e s ( C r Z l ) : e - d f b u t de l ' i n j e e t i o n d tin. Ponetion cardiaque : e - d~but f - fin. . -

-

out surv6cu avec ceux des animaux t6moins, ractivit6 li6e aux plaquettes demeure importante (tableau III). Mais lo pic de la 3° heure est, chez 3 sujets, boaucoup plus accus6, surtout chez l'animal 8-3, off il double la valeur des 15 premieres minutes. Chez 2 animaux qui n'ont pratiquement pas prSsent6 do sympt51nes cliniques de choc, l'allure de la courbe est normale. Le 10 % de l'aetivit6 totale inject6e est atteint aux environs du 4 e jour, comme chez les t6moins. Nous pensons pouvoir retenir comme mm constante des animaux soumis au chop peptonique - - et qui on ont ext6rioris6 les sympt6mes - une s6questration plus importante des plaquettes injeeMes. Cette s~,questration est-elle bien localis6e au poumon, comme Pont affirms de n o m b r e u x auteurs (Bierman, etc...) ? L'autopsio du Lapin 8-2, m o r t 30 minutes environ apr~s l'injection de plaquettes marqu6es, nous a fourni l'occasion de le v~rifier : le C.A.D. (coefficient d'absorption diff6rentiolle) est de 35 pour les poumons, qui ont retenu 19,7 % de l'activit6 totale injectSe. Cette valeur est h retenir dans le cas particulier, car l'activit6 des pomnons de Lapin qui, clans nos exp6riences pr6c6dentes, avaient re~u des plaquettes hnmaines n e dSpassait qu'exceptionnellement 5 % des coups/minute inject~s (Lemoine, 13). Le fait que le foie et la rate

255

SURVIE DES PLAQUETTES TRANSFUSI~,ES CHEZ LE L4PIN

TABLEAUI l I htfluence du facteur < choc >>

Lapins soumis /t uu ehoe par injection de peptone ou par lev6e de garrot (mgmes conventions que pour le Tableau I) Choc peptonique,

EXP

ACTIVIT~ PLAQUETTAIRE INJECT~E (on c o u p s / minute pour

DELAIS A'PRES L'IiNIJECTION

3 ml de sang

15 mn

PL 8-2

3.750

19,5" I

PL 8-3

4.330

PL 9-1

6.290

PL 9-3

5.900

PL 10.F

7.950

PL 10-I-I

7.920

÷ 21h

-J- 3 h I

I5 - " ~

-4- 45h ~- 3 jours ~- 5 jonrs

76

42,3

Y

--

12,8

9

25,4

11,8

21,5

14,2

2,1 I

~,3 2~

53,8

Levee de garrot.

PL ll-J ..

3.720

PL ll-L..

3.810

71,3

11

0,4

(*) Molt de l'animal.

s o i e n t m o i n s actifs q u e d a n s les s~ries donn6es e n r~£4rence n o u s arr ~ t e r a m o i n s : l ' a v i d i t ~ d e ces o r g a n e s s ' e x e r c e e n effet h l ' 6 g a r d des p l a q u e t t e s h 6 t 6 r o l o g u e s o u n o n viables, t a n d i s flue les p l a q u e t t e s inj e c t S e s darts l ' e x p 6 r i e n c e 8-2 S t a i e n t v i a b l e s , et p r o v e n a i e n t d ' u n suj e t d e la mfime esp~ce. O r , ee m ~ m e L a p i n 8-2, 15 m i n u t e s apr~s l ' i n j e c t i o n , p r S s e n t a i t d a n s le sang c i r c u l a n t u n e activit~ d e 304 c / m like a u x p l a q u e ttes d ' l ml, d e sang. L ' a c t i v i t 6 d u sang t o t a l 6tait alors de 403 c / m p a r ml. et, d a n s le s a n g d u eoeur pr~]ev6 h r a u t o p s i e , d e 364 c / m (ce q u i corres-

256

I3. MzlUPIN

pond, pour la totalit6 du sang cireulant, & 26,5 % de l'activit6 injectSe). Ainsi, une experience fortuite nous a permis de v6rifier l'importance de la s6questration pulmonaire ehez un animal soumis au choc peptonique, bientft compliqu6 d'un ehoc h6morragique. b) Dans le m6me cadre d'expSriences, 3 Lapins ont $t6 soumis m: cho,c p a r lev6e d e garrot : le garrot appliqu$ & la racine des deux cuisses a 6t& lev6 chez deux animaux apr~s 2 heures, chez l'autre apr~s 3 heures. Nous avons voulu 6viter en effet un choc violent qui aurait entrain$ une mort trop rapide des sujets. En fait, nos sujets d'exp6rience ont surv$cu et ont pu ~tre suivis pendant 5 jours, & l'exception du Lapin ll-J qui a succomb6 & la suite de la premiere ponction cardiaque. La pression art6rielle de cet animal avait 6t6 enregistrSe (fig. 6).

o

:oI [ [ l l l t

[b

c

I111 ld ILl In I1 [EII i i l II il II r] Li I l i t l l t l l

i I I I ~ILII"L'I

10 ~ e c

F i e . 6. - - L a p i n 3,850 k g : c h o c p a r l e o d e de g a r r o t s : I n j e c t i o n I.V. d e p l a q u e t t e s h o r a o l o g u e s m a r c l u ~ e s ( C r 5 1 ) a -.d~but de l'injection b - fin c - l e v e e ffes g a r r o ~ s .

L'animal ll-L avait subi ~galement une application de garrot pendant 2 hettres : la eourbe de survie des plaquettes ne diff6re pas sensiblement de la courbe de r6f6rence. L'animal 12-M avait re£u des plaquettes marqu6es par r o r colloidal radioaetif : la survie a 6t6 du m6me ordre que chez les Lapins t~moins, non garrott6s, c'est-&-dire que l'aetivit~ des plaquettes eireulantes, tr6s faible d'embl~e (3,5 %), a d6eru r6guli6rement jusqu'h devenir n6gligeable apr6s 45 heures. Nous ne pouvons tirer de ees deux experiences des conclusions valables. Cependant, rautopsie de ranimal ll-L a 6t~ tr6s instructive : la ponetion eardiaque avait ~t& diffieile, et r~ussie finalement 23 minutes apr6s l'injeetion des plaquettes marquees, pr~e6dant de peu la levee

SURVIE DES PLAQUETTES TRANSFUSEES CHEZ LE LAPIN

257

des garrots. L'animal avait rSagi par une brusque chute de pression art6rielle, non corrigSe par diverses injections thSrapeutiques, et mourait h 40 minutes.

80.

70

60.

~t--------...e 40

choc peptonique

o- . . . . . . . .o c h o c per- l e v g e de g o p t ' o t 5

30.

,ol \ 15m 3 h

21 h

45 h d~lai5

Fx6.

7. - -

apr'~

3j

Influence dzl facteur << choc >>. P o u r c e n t a g e

v~es dana la circulation

5j

injection des p l a q u e l ~ e s

marqufies

retrou-

de l'h6te.

L'activit~ du sang cireulant repr6sentait aprSs 23 minutes, 55 % de l'activit$ injectSe (dont 48,5 % se rapportant aux plaquettes), apr~s 40 minutes, 32,3 %. Or l'activit~ des poumons prblev6s h l'autopsie ~tait tr~s forte, atteignant 22 % de l'activit6 totale irrject$e. Cette valeur correspond (comme dans le cas du Lapin 8-2 m o r t 30 minutes apr~s une injection de peptone) h une s~questration pulmonaire massive des plaquettes transfus6es. Mais en m~me temps que la levSe de garrot, nous sommes tenus d'ineriminer l'hSmorragie brutale comme facteur de choc. Concluons seulement de cette observation, comme de celle du La-

258

B. MA UP1N

pin 8-2, que la s6questration pulmonaire des plaquettes inject6es accompagnait u n choc ,~ composantes multiples. On sait par ailleurs que l'hypothermie s'accompagne d'une importaute s~questration viscSrale des plaquettes (Adelson et coll. 1957) [2].

C. ~

Faeteur

,, e s p b c e

,,.

La viabilit6 des plaquettes transfus6es ne tient pas seulement aux conditions physiques de leur sSparation : elle est ~,galement fonction des dispositions favorables de l'hSte. P o u r le v6rifier, nous avous inject6 au Lapin des plaquettes marqu~es provenant d'une esp~ce ~trang~re : Homme, Chien. Le Lapin 2-3 a $t6 immnnis6 activement contre lea plaquettes du Chien p o u r une sSrie de 6 injections intraveineuses, rSparties sur 3 semaines. Dix jous apr~s la derni~re injection, nous avons vSrifi6 que le s~rum du sujet agglutinait les plaquettes du Chien ~ un titre $1ev~ (1/320 en tube, 1/1280 sur lame). Le Lapin immunis6 a $t6 pris aussit6t p o u r l'exp~rience PC-2. Le Lapin 1-3 a re~u des plaquettes de chien vieilles de 24 heures. a) - - Tech.nique de s~paration et de m a r q u a g e des p l a q u e t t e s : Notre protocole a 6t6 adapt6 comme suit : sang h u m a i n (experience P H portant sur 3 Lapins) : le sang d'un donneur a ~t6 recueilli dans un flacon standard silicon6, garni de 100 ml d'une solutiou/* 1 % de t6trac6mate disodique et centrifug6 aussitSt ~ faible vitesse pendant 5 minutes. Le plasma surnageant a 6t6 traitS, comme dans la technique d$crite au chapitre I. - - sang de C h i e n (exp6rience PC-1 et PC-2 portant sur 6 Lapins) : le sang a 6t6 recueilli, par une canule ins6rSe dans l'art~re f6morale, dans un flacon silicons de 250 ml. Le reste de la technique est sans changement. ~otons que l'efficacit6 du marquage a 6t6 tr6s i m p o r t a n t e : apr~s un seul lavage, 23,5 % de l'activit6 pr~sentSe reste fix6e sur les plaquettes humaines. - - 10,7 et 34 % sur les plaquettes de Chien. Des 6chantillons ont ~t6 soumis /, deux lavages suppl~mentaires pour permettre une appreciation plus cxacte de l'activit$ liSe aux plaquettes : le facteur de cgrrection est de l'ordre de 92 ~ p o u r les plaquettes humaines, 90 % pour les plaquettes de Chien. -

-

SURFIE

DES

PLAQUETTES

TRANSFUSEES

CHEZ

LE

LAPIN

259

b) - - Rdsultats expdrimentaux : 1 °) - - plaquettes humaines injcct6es au L a p i n : les 3 sujets d'exp6rience ont tous pr6sent~ dans la fraction plaquettaire une activit6 tr~s faible d'embl6e, qui a rapidement d6cru pour devenir n~gligeable apr~s quelques heures (tableau IV et fig. 8 : premiere p a r t i e ) . L'activit6 du plasma, peu importante, d6crolt suivant un mode ex. ponentiel jusqu'~ u n plateau qui con-espond ~ un 6tat d'6quilibre. Notons que la survie des G.R. d'accompagnement est tr&s faible (activit6 de l'ordre de 10 ~ 20 coups/minute). 2 ° plaquettes de Chien injectdes ate Lapin : sur les 4 sujets d'exp6rience trait6s dans des conditions comparables (lapins neufs, plaquettes inject~es dans les meilleurs d61ais), nous observons que l'activit6 li6e aux plaquettes circulantes est relativement importante dans les 15 premieres minutes. Chez 3 sujets, elle d~crolt rapidement eL devient n~,gligeable apr~s ]a 21 ~ heure. Mais Fun des Lapins (1-1) a manifest5 ~ l'6gard des pla-

70

20 60.

10 50. O

$

15~3"

40.

2'Ih

4~"

dela;s op~e~ inj'ech'on 30.

20

•........

•

ho/Time

e

s

chien

10.

0

k

15n '3h

F,IG.

7

21h

"7

45 h ddlai5 a p r ~

72 h injection

8, Influence du factear <( espdce>>. Pourcentaffe des plaquettes h6t@ologues marqu6es re~rouv6es dans la circulation du Lapin. - - - -

260

B. M A U P I N

q u e t t e s d e C h i e n u n e t o l S r a n c e s u r p r e n a n t e p u i s q u e l e u r a c t i v i t 6 se m a n i f e s t e e n c o r e "~ l a 45 ° h e u r e ( t a b l e a u I V e t fig. 8 : 2 e p a r t i e ) . L ' a c t i v i t 6 d u p l a s m a est r e l a t i v e m e n t

importante,

et d a n s u u e ex-

p 6 r i e n c e , c e l l e d e 3 h e u r e s , se m o n t r e s u p 6 r i e u r e ~ c e l l e de 15 m i n u t e s . Dans tousles Comme

a u t r e s cas, e l l e b a i s s e r a p i d e m e n t . clans l e

cas p r 6 c 6 d e n t ,

les

globules

rouges

n e prSsen-

TABLEAU IV

Irt/lttence dtt ]acteur <>

Plaquettes d'Homme ou de Chien inject6es au Lapin (un Lapin a &6 immmfis6 sp6cifiquement contre les plaquettes du Chien) (m&ncs conventions que pour le Tableau I) A. - - Plaquettes humaines inject6es au Lapin.

~,CTIVITE PLAQUET. TAII~E INJEET~ EXP.

DELAIS APRES L'INJECTION

(en coups/minute pour 3 ml de sang) -}- 15 Inn

PH 1-A ..

16.260

PH 1-C ..

13.500

PH 1-D ..

17.220

+3h

1,1

1,5

I +21h

- ~

--i--

+ 45 h

0 - - I ----[

0

i

°

i

B. - - P|aquettes de Chien inject6es au Lapin.

+ 15 toni + 3 h PC 1-1 ..

11.640

PC 1-2 ..

10.320

PC 2-1 ..

48.900

PC 2.2 ..

51.300

PC 1-3 ..

9.510

PC 2-3 ..

54.000

71

_7

I

24

+ 2 21h 1h -8

-l-45h

-t-

--~,1

e2ilJlllrs

0,1 0,1

I

D61ai de 24 h Immunis~

S U R V I E DES PL~4QUETTES T R A N S F U S E E S

CHEZ LE L A P I N

261

tent qu'tme tr~s faible activit$. Nous n'avons pas observ6 l'h& molyse qui aurait p u r~sulter de la destructi6n intra-vasculaire d'unc quantit~ importante d'h6maties. Chez le Lapin 1-3 qui a re~u des plaquettes de Chien marqu6es, conservSes 24 heures h + 4°C, l'activit6 des plaquettes circulantes n'est appr$ciable que sur los deux premiers pr61~vements. Le sang total du Lapin 1-3 (immunis$) pr6sentait une activit6 relativement 6levee. Mais le fractionnement dn sang permettait de rapporter au plasma la m a j e u r e pattie, sinon la totalit6, de cette activit6. La part qui revenait attx plaquettes 6tait d'embl6e extr~mement modique, puisqu'en valour absolue les activit6s mesur6es ne dSpassaient pas quelques dizaines de coups/minute. Parall~lement h c e s mesures iso~opiques, nous avons en la curiosit6 de pratiquer des frottis du sang des Lapins inject6s par des plaquettes ~rang~res : il n'a pas 6t6 possible de diff6rencier sur lame les 616merits transfus6s des 616ments de l'hSte. Cependant, dans une cellule de numeration, les plaquettes de Chien qui affectent volontiers une forme de b~tonnet s'opposent nettement aux plaquettes du Lapin, petites et arrondies. c) - - D i s c u s s i o n : Los experiences PH, PC-1 et 2 nous m o n t r e n t que los plaquettes ~trang~res disparaissent r a p i d e m e n t de ]a circulation du receveur. I1 e n e s t de m6me des globllles rouges, clue nous ne pouvons plus suivre avec la m~me facilit6 qne les h~maties du Lapin inject6es au Lapin. La destrnction des plaquettes transfusSes est encore plus rapide dans le cas d'un Lapin immunis$ sp~dfiquement contre les plaquettes de Chien. Dans les deux cas, et massivement chez l'animal immunis6, le plasma acqu_iert une activit~ plus importante que celui des animaux qui re~oiverrt des plaquettes homologues. Devcns-nous en conclure que la destruction des plaquettes se produit dans le sang circulant et qu'elle rSpond h u n phSnom~ne purement humoral, conditionn6 par la pr6sence d'anticorps natnrels ou immuns ? Nous pouvons l'admettre chez r a n i m a l immunis6 : los thrombocyto.agglutinines sont le t~moin (sinon une autre forme) des thrombocyto-lysines qui, en d~trtfisant los plaquettes, enrichissent le plasma en chrome radioacfif. Mais nous pouvons nous reporter ~ des exp~rie~-

262

B. MAUPIN

ccs ant6rieures, m o n t r a n t que le p o n m m l du L a p i n arrSte massivemerit et r a p i d e m e n t les plaquettes h n m a i n e s auxquelles le L a p i n a 6t6 sensibilis6 [14 b.c]. I1 se superpose v r a i s e m b l a b l e m e n t deux ph6nom~nes : - - u n e agglutination, qui entraine l'arr~t m$canique, p a r les capillaires pulmonaires, des areas plaquettaires lea plus v o l u m i n e u x ; --une lyse qui fait passer le r a d i o c h r o m e h l'~tat inorganique dans le plasma puis dans les urines. Les deux ph6nom~nes concourent la suppression des plaquettes circulantes d'origine Strang~re. Chez les a n i m a u x neufs, une constatation nous a troubl6 : u n seul Lapin, sur quatre, a consetw~ en circulation un n o m b r e i m p o r t a n t des plaquettes du Chien, Les trois autres les ont $1iminSes r a p i d e m e n t de leurs vaisseaux. I1 Stair indiqu6 de r a p p o r t e r cette disparit~ h rexistence d'anticorps naturels. Or nous avons recherch$, dans le sSrum de ces animaux, les agglutinines anti-plaquettes de Chien, actives h froid (technique de Dausset) et h q- 37 ° (technique en tube). Les titres trouv6s p a r l ' u n e et l'autre m~thode le L a p i n 1-1, qui s'$tait r~v616 un bon hSte pour Chien, les agglutinait n6anmoins h u n titre de 1/5. pins moins tol6rants n%tait ni plus ni moins riche nines (titre entre 2/5 et 1/10).

6talent faibles, et les plaquettes du Le sSrum des laen h6t@o-aggluti-

Une destruction intra-vasculaire est probable, ici c0mmc ehez le L a p i n immunis$, mais avee u n e intensit$ moindre, err raison de l'activit$ du plasma, sup~r~eure h eelle des lapins tSmoius. Cependant, nous ne pouvons pas a p p u y c r cette hypoth~se sur les donn~es du titrage. I1 e s t certain, d ' a u t r e part, que les organes du syst~me rSticuloendoth61ial participent ~ la s~questration - - avec ou sans destruction - des plaquettes 6trang~res. Dans le cas des plaquettes h u m a i n e s inject6es au L a p i n normal, nous avous des recoupements stirs dans les nombreuses experiences qui m o n t r e n t l'arr6t des plaquettes transfus6es - - n o n viables parce q u % t r a n g ~ r e s - darts le role, la rate et la moelle osseuse, plus mod~r6ment clans le poumon, d~s les 20 premiSres minutes.

Conclusions 1 ° - - Les plaquettes du Lapin, marquSes p a r le r a d i o c h r o m a t e de sodium et injectSes dans mt d$1ai m a x i m u m de 3 heures survivent plusieurs jours dans la circulation de l'hSte. Une limite fix6e arbitrai-

SURVIE DES PLAQUETTES TR~INSFUSEES CHEZ LE LAPIN

263

r e m e n t ~ 10 % de ractivit~ totale inject~e est atteinte au voisinage de la 768 heure, avec de larges variations individuelles (48 h 98 heures). La constatation d'uxLe activit$ de la 38 h e u r e f r $ q u e m m e n t sup6rieure ?~ celle des 15 minutes fair adrnettre u_ne s~questration dans un organe de l'hSte, organe qui est p r o b a b l e m e n t le p o u m o n . 2 ° - - Les plaquettes marquees, conserv~es ~t la glaci$re et inject6es avec a n retard d~libSr$, ont line survie beaueoup plus br~ve : le point 10 % est atteint apr~s 16 heures et 28 heures (pour rnl retard de 3 heures), apr~s 2,5 et 24 heures (pour u n r e t a r d de 24 heures). 3 ° - - Chez les animaux sornnis ~t u n choc peptonique (ou d'une mani6re beaucoup moins d6monstrative dans nos exp6riences, h lul choc p a r lev6e de garrot) la dur6e de la survie n ' a pas 6t6 modifi6e : le point 10 % est atteint en m o y e n n e apr~s 80,5 heures, avec des va]eurs extremes de 36 et de 101 heures. Mais l ' i m p o r t a n c e de la s6questrafion initiale ressort plus netternent clans eette s6rie. 48 - - La survie des plaquettes hurnaines darts la circulation du L a p i n est p r a t i q u e m e n t n~gligeable ribs le p r e m i e r quart d'heure, ou au plus t a r d aprbs 3 heures. La survie des plaquettes de Chien dans le sang circtdant du Lapin a 6t6 irr@uli~re p u i s q u ' u n seul des animaux d'exp~-ience a eonserv~ u n e activit6 i m p o r t a n t e : point 10 % atteint aprbs 19 henres. Chez u n Lapin irnmunis6 sp$cifiquement, ]es plaquettes de Chien marqn6es ont disparu trbs pr6cocernent du sang circnlant, tandis que le plasma prSsentait u n e trbs forte activit6. I1 est p r o b a b l e que s'associent dans ce cas deux phSnom~nes concourant h r~limination des plaquettes : arr~t irnm$diat p a r les capillaires pulrnonaires des agglutinats les plus volurnineux, lyse intravasculaire. L'observation de deux animaux soumis f o r t u i t e m e n t ~ une h6morragie b r u t a l e (clans les 30 on 40 minutes suivant l'injection de plaquettes marqu~,es) a perrnis de localiser dans les poumons u n e fraction de l'activit6 inject6e, trbs sup~rieure ?~ celle qui s'observe chez le L a p i n normal. Nous sommes hettreux de remercier le V6t6rinaire LieutenantColonel THEILLEUXet le Dr J.-C. LELO~ qui nons ont aid~ clans la r6alisation dn programme exp6rimental, ainsi que Mcsdames BRiAnD et LA ROSA. M6moire r6dig$ en mars 1961 et pr6sent6 pour le titre de Maitre de Recherehes des Services de Sant6 des Arna6es.)

B. MAUP1N

264

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SURVIE DES PLAQUETTES TRANSFUSEES CHEZ LE L/IPIN

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