Études immunoélectrophorétiques de quelques protéines modifiées I. L'albumine sérique humaine

CLINICX

ETUDES

CHIMICA

ACTS

345

IMMCNOELECTROPHORETIQUES PROTEINES I. L’ALBUMINE M. STEINBUCH,

DE

QCELQUES

MODIFIEES SERIQUE

J. hi. L:INE

avec la collaboration

ET

HUMAINE A.

HATTISTISI*

technique

de

Mme QUENTIN et de Mlle COLAS Celrtre .Vatioml

de Transfusion (Rep

Sanguim,

Paris

(Fvmce)

le 9 aodt 1959)

INTRODUCTION

Depuis les travaux de LANDSTEINER sur les proteines substituees par diazotation, l’etude des proteines modifiees a toujours et& consideree comme un des moyens les plus fructueux pour elucider les rapports entre l’antigeniciti: et la structure moleculaire d’une proteine don&e. L’etude en est complexe, car la plupart des reactions aboutissant a la formation de proteines modifiees portent simultanement sur plusieurs groupements chimiques. L’importance d’un groupement chimique determine ne peut done se degager que de l’etude cornparke de differents derives d’une proteine. Par ailleurs, les conditions &n&ales de la substitution (PH, solvants organiques, etc.) etant souvent par ellesmemes denaturantes, il ne faut jamais perdre de vue la possibiliti: d’une diminution de l’antigenicite a la suite d’une modification due a un deplissement de la molecule ecartant l’un de l’autre deux groupements essentiels. L’etude comparative de la proteine native exposee le plus fidelement possible aux conditions de l’experience aide a l’interpretation des resultats, notamment dans les cas de pH extr&me par exemple. De toutes man&es, il nous semble que seule la multiplicitC des experiences peut permettre de degager quelques faits essentiels. 11 nous a paru interessant de voir dans quelle mesure certaines methodes electrophoretiques modernes (electrophorese de zone en milieu gelosi: 1 ou en gel d’amidon “), ainsi que des techniques immunochimiques d’apparit ion relativement recentes (double diffusion en gelose3 et immunoClectrophoresel) peuvent contribuer B eclaircir un probleme dont la complexite n’est plus B souligner. Ce travail n’a pas pour but l’etude critique et quantitative de la nature reelle des modifications obtenues, mais de voir dans quelle mesure il est possible de suivre, par les techniques precedemment citees, les modifications apportees a une proteine par differents traitements chimiques. Les conclusions de cette etude ont pour but de demontrer que de telles mkthodes ,ont une valeur d’orientation permettant a la fois d’aborder un point plus p&is d’un probleme et d’evaluer au fur et a mesure de leur preparation les proteines modifiees. * Boursibz RISSICH)

PXlTle,

du Gouvernement Italie.

Franpis,

Assistante

de la Clinique

de I’Cdiatrie,

(Prof.

I,AI:-

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- I I. l\l:l

: II,

1.

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IMMCNOtiLECTROPHORkSEDE PROTkIKES MODIFItiES. I.

347

une t” entre o” et -2”. Le PH est maintenu entre g et 9.5 par addition de bicarbonate en substance. Action. L’action principale Porte sur les groupements &-amirks de la lysine et sur les K-terminaux. Une action secondaire consiste en la substitution des groupements phknol, sulfhydryle et hydroxyle.

Technique prkoniske par E(ABAT~~. La protkine est trait&e en prksence d’un tampon phosphate par de l’oxychlorure de phosphore dissous dans le tktrachlorure de carbone. Le PH est maintenu entre 8.5 et 9 par addition de soude; la rbaction s’effectue entre 0’ et -2O. _4ction. F,lle Porte en premier lieu sur la substitution des groupes aminks libres. Les reactions secondaires sont similaires B celles observkes dans la tolu&nesulfonation. Les groupes acides de I’acide phosphorique introduits dans la protkine accentuent le caract&c nnionique de celle-ci au del& du simple bloquagedesgroupementscationiques. Albumixe

formok

Technique. La formolation, quoique t&s rkpandue, est une des plus complexes parmi les r&actions de substitution. Les groupes aminks sont bloquks, mais ce bloquage est partiellement ritversible par dialyse. La r&action peut porter en plus sur les noyaux de l’indole et de l’imidazole.

Albumine

performyle’e

Technique selon HIRS 12. L’oxydation par l’acide performique est effectuke B o” pendant 1jo min, puis la solution obtenue est diluke, prkcipitke par l’alcool & pH 4.5 ; le pr&ipitC est redissous et la solution lyophiliske. Action. Oxydation de tous les @o&s S-S, qui sont transform& en groupements sulfoniques, par oxydation de la cystine en acide cystkique. -S-S-CH,-CH-COOH I SH,

--f HO,S-CH,-CH-COOH I SH,

La mkthionine est transformke en sulfone. Une rkaction secondaire sur le tryptophanne, la thrkonine et la sCrine est possible. 11 faut noter que l’oxydation des ponts S-S peut amener la rupture partielle ou totale d’une chaine peptidique. Albumine

nit&e

Technique de BAUER ET STRAUSS'~: 3 g d’albumine sont dissous dans IO ml d’eau. On ajoute 400 mg d’urke, puis IOO ml d’acide nitrique Q.zo(f/,refroidi & o’, doucement, en agitant. On laisse ensuite 12 h en contact B 0”. Action. Introduction de groupes nitro (NO,) dans les noyaux aromatiques des acides aminks (phknylalanine, tyrosine, tryptophanne). Cette substitution correspond &la rkaction xanthoprotkique bien connue. Des r&actions secondaires, dues au pouvoir oxydant du mirlange, sont possibles, en particulier sur les groupes sulfhydryle. Une modification profonde avec rkarrangement de la molkule est B craindre.

.-1Ibl4~?Zi1iEmith \‘ltk ‘l‘echniquc~ do, S;.woI;t~ I’. On nivt cw slI~p~7lsion 12 I)rott:illc, ~1;1n-. (III nic:tll;lnf,l anh~drc, on ajoutc’ du chlwurc~ d’acG~\-k cat on I;k\;k~ 24 Ii :I IS .-Ictioiz. I~st&ificrrtioi2 dc.5 ,,~~i’oufies(‘2c’rmiuuu.v f’t ciczspoic/w\ cil7ho 1\~icaiillrc..\(It’ l’acidc glutamiqw (‘t d(, I’aci&~ ahp;irtiqu<‘. IA dCnatur_ation pw,~il)lv due> ;III iolv;~nt e5t &tudik ii l’niclv tl’un tbmoin chlorure d’acCt\-1(x.

Idis4

(‘11contact

;i\‘(~c 1~~m6tl~a~~ol

;icldition

;;IIIY

tk,

AIDUMIZWS hzzmailit~sdtGrdtu~&s Albumine

chau.fle’c

L’nc solution

B _jc’o d’albumine

(‘St

Chnufftk’

IO mill

:I 7-j' ;I 1111pH d<’ 7.-j

; didvsr

;

lyophilisation. Albumine

dekaturtk $ar l’a&e

Dkztzuutiw~ $wtielle. La poudre d’albumine 30 min; dialysc. d’urk ?* 3o’l,i et IaissCc en contact

/Xnatzwation Albumine

$lu.s ~ousse’~~. Mbme

traitcment

est

dissoute

dans

;I\XYYunc solution

unc’ solution

d’urk

B qj”,,.

de’natuve’t, par lu ,~un~&li~~c

ILkzturation

$avtiellc. L’nlbumine

cst dissoutc

guanidine a.$I. IM~aturatiotz @us j~ozk.s.st+.Solution

dans

ulie solution

de carbonate

de

(XV.

Chau_fage suii,i r~‘ac&ylntio~~ MI?THOnES (a)

L’dlectrophorPsc

HANNIG~~. Il’ampon Lumik-e j I ‘,I(,. (1~) Lcs analyses tuks pour unc part selon

In Lrs Les (I)

Pasteur

sur papier

a &tC:rtalis&

T-k-onal-vkonal

sod6

~lectroplior~tiques se100 la technique

a

selon la technique

pH

8.f);

p -= 0.05.

de (~KASSMA~~ ET

et im~iiuno~lectrophor~ticlucs de (;R;1U.\R

ET Wrr.I_r.~a~

au

C‘oloration

I, pour

ont me

I7c,rt

Ct4 cfkpart

autre

microm4thode dc S(.HErr)IxGEI<16. colorations ont Ct& rkli&w wlon lcs techniques d’UIwx IX ( ;R.\I:.u< Ii. anti&rums utilisk dans ces espkriences ont bt&: LTn s&urn de cheval antis&rum humain total commercialis par l’Inst_itut (Paris).

(2) Plusieurs

sk-ums de lapins anti&rums humains totaus. (c) L’identification des relations immunologiques cntre les diffkcnts

examirk a 6t6 r6alisk par une micro-mithode technique d’OP(.HTEKI~ONI’~. ((1) Lcs Clcctrophorkes c’n gel d’amidon SMITHIES

2 appliquk

sui\xnt

nos

modalit&

I&SL-LT.YIZ

de diffusion ont

cYP rCalist!es

personnelles

khantillons

vn gC:low, \xiantcl scalon la technique

dtl la de

ly.

ET DISCUSSIC)N

La Fig. I montrc ICS altCrations dt, mobilit ~Iectrophor~ticlLl~~ vt de colorabilitd observbes par 6lectrophorkc sur pnpicr. La Fig. z montre ce~ mCmrts modifications aprPs 4lectrophorke en g&lose. La Fig. -3 correspond A deus esemplrs nprPs Glectrophork en gel d’amidon. IALI‘:~bl~~au I, enfin. r4suriic~ Irs rGsiIltat_; obtt~nus.

( Iii?. ( l/iii!. 1
I~~IU~O~LECTROPHOR~S~

Nous discuterons chimiques

successivement

DE I’ROThES

la repercussion

MODIFI8ES.

339

1.

des differentes

modifications

sur :

la mobilite electrophoretique et la colorabilite des albumines modifiees: (2) sur la reactivite de ces albumines vis-a-vis d’un serum animal antiserum

(I)

humain.

DCpbt 1

Fig. 1. l?lectrophort?se sur papier de quelques albumines modifi6es (coloration au Vert Lumi&e A 17/o). I, Albumine acCtylCe; 2, carboxymCthylCe; 3. traitke par i’anhydride phtalique; 4, tosylke; 5, trait& par la ninhydrine; 6, traitbe par 45:; d’urke; 7, dtnaturte par la guanidine; 8, performyl6e; 9, m&h$@e.

Influewe

des modifications

chimiques

I?iv,,. 2. l?lectrophorPse en &lose (tampon vCrnna1 ~7:’ 8.2; i(l = 0.025; coloration B 1’.4midoschwarx), St-IN, s&urn humain normal; 31, dCsaminCe; 35, a& tylde; 5, traitCe par la ninhydrine; 27, tosyli?c: I.+, nit&e; 3, mCthylCe; 32, chauff&e: 13, d&natnrCe par I’m&; 21, d&at&e par la guanidine -k ac&ylation; L, albumine hnmainc cristallisCe.

SW la charge dlectrique totale des molekdes

fvwttiiques

L’etude habituelle des proteines seriques en electrophorese A PH 8.6 reflete la charge electrique globale de ces proteines dans ces conditions. A ce pH, l’ionisation Porte sur les groupements -COOH, entrainant une migration anodique d’autant plus rapide que la charge negative totale est plus CIevee. Le comportement apr&s electrophorese de zone des colorants se fivant sur les groupements basiques des proteines et rendant visible la quantite de ces protlines, se trout-e modifie lorsqu’il s’agit de proteines substituees.

2

3

IMMUNOfiLECTROPHORkSE

DE PROTtiINES MODIFkES.

I.

3s

Albumine dksamine’e. 11 est logique que la suppression de la plupart des groupements cationiques aboutisse & une proteine plus acide. Cependant, il faut noter que le traitement par l’acide nitreux entraine la production d’une proteine plus ou moins color&e (jaune ou rougeatre) indiquant l’introduction de groupes chromophores dans la molecule. 11ne semble pas y avoir aggregation de moleculeslg, mais une repercussion sur la structure moleculaire*. Album&e actitylke. L’accdleration correspond approximativement a celle observee dans le cas de l’albumine desaminee. Un meme phcnomene a et4 observe par EHRENPREIS~Q sur l’albumine bovine acetylee. Cette substitution, resultant d’un traitement moins brutal que la desamination, est parmi les reactions plus specifiques. En effet, seuls les groupes e-amines de la lysine et N-terminaux sont touches. On peut penser egalement que la chaine introduite est

Flg.

4. ImmunoClectrophor~se de l’albumine carboxymkthylke et de l’albumine traitke l’anhydride phtalique vis-&-vis d’un s&urn de Lapin anti-s&urn humain.

par

relativement courte et n’interfere pas avec la structure intime de la molecule (pas d’empechement sterique). Albumine carboxym&hyltfe. La plus forte acceleration que nous ayons rencontree est don&e par la carboxymethylation (augmentation de IOO~/~ par rapport a l’albumine non modifiee). Cette substitution bloque non seulement les groupes amines mais remplace les charges positives par des charges negatives. Notons que la carboxymkthylation est le pendant chimique de l’acetylation. En effet, le groupe adtyle est attache au groupe imine par une fonction CO, alors que la molecule de l’acide acetique est fix&e par le groupe CHs- au groupe imine dans le cas de la carboxymethylation. Cette deuxieme position donne Cvidemment lieu a la formation d’une proteine plus acide, expliquant son comportement electrophoretique. COOH

C’% Ac&yle

:

co I

-NH

Carboxymhthyle

:

I

CH,

I

--SH

* Les quantitCs de nitrite utilisCes sont moindres clue celles mentionn&s Clit~.Cki>~.A&,

par ces auteurs. ,j (1960) 345-358

IMMUNOfiLECTROPHOR&EDE PROTRINES MODIFIRES. I.

353

Albumine nitde. Notre echantillon jaune-paille montre une mobiliti: electrophoretique analogue a celle de l’albumine native. L’introduction de groupes NO2 chromophores dans les noyaux aromatiques suffit a elle seule a expliquer la couleur du produit obtenu. Les conditions peu denaturantes de la reaction (t”) ont evite apparemment des reactions secondaires dues au pH acide (HNO,) et le pouvoir oxydant s’est peu manifeste. Cette reaction est analogue a celle observee apres introduction d’iode dans les noyaux aromatiques, modification qui n’altere pas la mobilite electrophoretique a condition que des reactions secondaires d’oxydation ne soient pas intervenues. Albumine m~thylke. A pH 8.6 cette proteine perd completement sa mobilite. Apparemment tres homogene, elle se montre plus etalee a un pH plus acide (pH 6.8). L’esterification des groupements carboxyle aboutit a une proteine ayant une charge positive importante. Album&es dt!natukees. Le chauffage, le traitement par l’uree ou celui par la guanidine ne nous ont pas montre d’alterations significatives de la mobilite. Le chauffage suivi d’acetylation entraine une tres legere augmentation de mobilite due 8. l’acetylation. Ces constatations sont analogues a celles observees par M.4URER sur l’albumine bovine denaturee 23. Modifications

chimiques

et colorabilitk

L’affiniti: de l’albumine pour les colorants anioniques et l’influence de la modification chimique ont Cte etudiees principalement par KLOTZ et ses collaborateurs2*. Le bloquage desgroupes amines diminue l’affinite de l’albumine pour les anions organiques. Ces memes traitements suppriment l’affinitk de l’albumine pour la surface Crythrocytaire (action anti-spherocytaire) comme l’un de nous l’a montre dans un travail anterieur 25, 26. On pourrait objecter que l’adsorption des colorants Ctudies en phase liquide ne correspond pas aux conditions de coloration des bandes de papier s&h&es a de colorabiliti: 100’. Cependant, HERKEN et cdl. 27 ont observe la meme diminution des proteines modifiees apres dessiccation sur papier. 11 est done nature1 que les traitements bloquant les groupes amines (albumines substituees I a 7) montrent une nette diminution de la colorabilite. Cette diminution est encore plus nette apres Clectrophorese en gel d’amidon, car, dans ce substrat, l’albumine normale du serum s’etale beaucoup plus qu’au tours de l’electrophorese sur papier, et la coloration ne touche que la couche superficielle du gel, le colorant ne per&rant que difficilement a l’interieur de celui-ci. Un colorant basique serait plus indique pour les proteines les plus acides, comme nous avons pu le constater nousmemes (vert malachite). En &et, PERKINS~~ a demontre une affinite accrue de l’albumine carboxymethylee pour les cations. L’albumine methyl&e au contraire adsorbe avec avidite le colorant acide (voir Fig. 2) et conserve son action anti-spherocytaire, tout en devenant agglutinante a concentration plus dlevee. Enfin, en ce qui concerne les albumines denaturees, nous n’avons pas observe de modifications notables, alors que UZMAN*~ observe une adsorption accrue du methylorange apres denaturation par l’uree, et diminuee apres denaturation par la chaleur. Activite’ immunologique

L’introduction la chimie organique

des album&es

modifikes

apparemment contradictoire de methodes jusqu’alors reservees a dans l’etude des proteines naturelles, a fait de L4NDSTEINER3’ le

pionnier

dc I’itnt~~unocltitnic.

Ikpuis

SC’s tra\xus

fotidat~~~t~t~~uz. d(l notnl~~-~~~ts c11t.1~

chcurs ont essay6 d’~lucid~~t- 1~ tii~c~rt~istiie ititimc~ dc3 rCaction5 atitigi2tc~ ;Ittticot-ph. mais ce n’wt quv dcpiiih la miw au point tk tc~cltnicltw pwt~~~ttatit cl’ol)tcnit- tl(5 protkines put-ifiCe quf~ I’imttintiochittii~ pcsut s’appliqwr :I\.CV iruit 211x protCitir5

tnodifikes. La substitution dw prot&nes ;I p~wii.5 (9 csffet d’alw-d(7- tl~5 probli~tnr5 conccrnant l’acti\.iti~ tlch (~tt~~mc~s, 3~ortiion(5, tosint5, I’infibct i\-itc: &Y virus l);u ewmple. En ce qui cotiwrnc~ l’imt~iunocltitni~~ plus particuliiw de I’allniti~inc~, ICYtt-a\xus rkents de M.ivliI
otit et6 rapport&s:

des courbes amine’

dc ptkipitntiou

IIC $avticifx

ll-:l:l. M.-I~‘RER rt roll. y:I, ckdiattt

spkifiquc

fms ci /‘i/lfrracfiorl

I’;~lhttninc~ ho\ittc

pat

scion HI~II)~~I~I:I~I~~EI~, ont concltt quc Ic groups dv I’all~utmitic~ Iw\iticl rt dc soft atitisc~t-uni prCpa”l

chez Ic Lapin. L’UCtiOll

MAVRER

fit3

/(L

C~l~tlO.~-~~~l~t/Z~~f4tioil

ET I
de la r6action

de prkipitntion

c&fXl&t

hlKOl~~

ET MIIITIN:‘:~

;L\W 1’atttis;brum

$14,

ont constatP

anti-albumine

F:Jl

C0Wlpk.W.

C’fk’t,

utt~’ disparitiott tot;tlt, ttatiI.c>, les premic~t-s par

la mGthodr de HEIL)I:LJ~EK(;ER, Its wconds (311 mitt-o-immuno~lectrophorirse. I-n comportemcnt identiquc cst obscrl-6 pout- l’albuminc succinyl6r:“, cc‘ qui ~ttii~nc~ cc’s autcurs :t penscr que l’introduction des grouprs carbosyk aboutit TVunc modification profonde dc la molkulc~ dans sa configuration st6rique. De mEmt%, la succinylatiott dc la g&latine supprime la prGcipitation de cctte prot&ne a\~ I’anticorps corrcsporttl3nt:‘j. SOS propres obser\-ations sent qurlquc~ peu discordatt~rs a\w celit,s de ces autettt-s. En effet, divers 6chantillons d’nlbuminc carbox~m~th~lit~ doniicnt itti(’ r6actioti tk~ pri,cipitation ar-ec la plupart des antistkutns utilisk, nussi hien vn diffusion YJJ g~losc~ qu’en irnmuno~lcctrophor~se. (‘Me constntation nous a ameribs fl t’+uditxr ~‘actiott COJW park de 2 stkutns de (‘heval vt 0 sCrums de Lapins antisPrum hutiiaiti possCdatit tin anticorps anti-albutnine humainc actif stir I’all~uniint~ carhosJ-m~tliyl~~,. L’action sut- dcs solutions d’albutnine normak> et carbosyni6thyl6e ;I IIJJC~COJIC~~~Jtration de 32 mg par 1x11st‘ traduit par une rktion de prbcipitntion dr I’albutnine carbosym6thyl4e avcc UJI st’wtm de C‘hc\~~l ct j s&-urns de 1,apins. Lcs s&-urns tie dormant plus de reaction ;I\TC l’albumine carbosym6thylbe SC’SOJlt rkY616s i!tt? ct’us poskdant lcs anticorps les plus foibles contrr I’albumine natives. Les antixkums 6puisk par de l’alhuminc~ carborym~thyl~t~ (So mgjtnl) perdettt leur pouvoir ptkipitatit contre crllc-ci, mais consc~r\-ent lcur pouvoir prCcipitant contre l’albumine native, alors que les tn?mcs antis&-urns, 4puis6s par I’albumine native, perdent leur pouvoir prtkipitant conk-e I’albumine carbosym6thylk. dr la fitant don+ que les auteurs prkit6s”” :I5 OJlt pens& qw la disparition tit albumins carlx~s,:mcWiylk 011 Saction de prkipitation t~rttw anti-albumins, succinylde rclcvait de la crktion de IIOU\KIUS groupvs carbosylc 5 la surface de Ia moltktle, nous avons de notre c&G prc~par4 une albumine traitk par I’anhydri&L phtalique, r6action qui donnt> 6galemcwt une albumittt~ acide, mais A tm de& moindtw. (‘/ili.( ilriil. lil.1,

i

11)1X11

31

i-iih

IMMuNOkLECTROPHORhSE

DE PROTlhNES

MODIFIkES.

I.

355

Cette albumine modifiee presente une acceleration electrophoretique identique a celle observee pour l’albumine carboxymethylee et donne encore une reaction de precipitation avec les antiserums anti-albumine native. L’albumine nit&e presente un comportement immunologique identique a celui de I’albumine native. Cet echantillon peu modifie peut &tre rapproche de certaines albumines iodees, dont la reactivite immunologique ne se trouve pas modifiCe36. L’albumine phosphoryle’e montre la conservation de la reaction de precipitation en &lose avec l’antiserum specifique. Nous passerons t&s rapidement sur la formolation, qui attenue l’antigenicite et peut m&me aboutir a une perte complete de I’antigenicite suivant le degre de la formolation, comme dans le cas de l’echantillon examine. Les albumines denaturkes par le chaufage, l’urke et la guanidine montrent une leur perte d’antigenicite si on les injecte au Lapin 3’938. En immunoelectrophorese, precipitation avec l’antiserum est analogue a celle observee avec l’albumine native. Nos kchantillons paraissent correspondre a ce que PUTNAM appelle “albumines reversiblement denaturees”. Des etudes recentes de la denaturation de l’albumine bovine 39montrent qu’il peut exister un comportement immunologique different suivant le de@ de la denaturation. Abolition

de la r&action de @&pitation

fitant donne le peu d’importance des groupes amines libres dans la reaction antigene-anticorps, nous avons pen& qu’il etait particulierement interessant d’etudier I’influence de la suppression de la majorite des groupements acides dans cette reaction. L’est&ification des groupes carboxyle selon la technique de SAROFF~~ nous a donnC une proteine tres basique ayant completement perdu son pouvoir de reactiviti: avec l’antiserum specifique. Ce fait a pu &tre observe sur plusieurs Cchantillons. Nous nous sommes demand6 si les conditions de preparation provoqueraient une denaturation de la proteine et nous avons prepare une albumine temoin exposee a l’action du methanol sans addition de chlorure d’acetyle, ainsi que d’autres albumines traitees par des quantitts decroissantes de chlorure d’acetyle. Nous avons pu constater que le methanol seul n’avait aucune influence sur la reactivitt! immunologique de l’albumine modifiee et que la perte de cette reactivite par l’esterification etait proportionnelle au degri: de cette esterification. Ainsi, une albumine partiellement methylee et presentant une mobilite Clectrophoretique diminuee de moitie reagissait encore normalement avec le serum anti-albumine native. En redigeant ce travail, nous prenons connaissance d’une courte note de SRI RAM ET MAURER~O confirmant ces faits et Claborant une interessante theorie sur l’importance des groupes carboxyle dans la reaction antigene-anticorps. Le bloquage de ces groupes carboxyle aurait une influence non sur la formation du complexe antigene-anticorps, mais sur l’insolubilisation du complexe form& Notons que la deesterification de l’albumine methylee leur a don& un produit B reactivite normale. L’oxydation

tion

de l’albumine

par l’acide

performipue

Parmi les reactions aboutissant Q une modification profonde des proteines, l’acoxydante de l’acide performique merite une attention particuliere. Nous ne Cli.

Chim.

Acta,

5 (1960) 345-358

Sous pensons quo 1~s techniqurs m&tent, par leur simplicitb, d’orientcr cherchant dc l’antigk

j 6tablir

des Irelations

et la rtactiviti’

(lue now utilement

;bvons utilisk les investigations

dc c;tusc :I rffct entrc

de cette

mol6kulc

dans CC‘tra\-ail p~lrimiiiumocl~imiclu~~s

un groqwment

avec son anticorl)s

chimique

domli~

sptWiclue.

I. L’btude en ~lcctroplior&se de zone’s sur diffPrents supports (papic~r, g~lox~, ~(‘1 d’amidon), en diffusion on g&lose et VII immuno~lectrophor2se de di\.ersrs alhumint~s modifiks :I Ptb praticlubc. 2. L’albumine skiqw dCsnmination, l’a&ylation,

liumainc~ ;I Ct6 soumiw la cnrl)os~m~thyl3tion,

aux traitcmcnts sui\xntb: la le trnitemwt par l’unhydridt~

phtnliquc, la ninhydrinv, la tolu~iiesulfonr~tion, la ~~~iosl~l~or~lation, lc traitcmwt 1x11 l’aldthycle formiqucl, la performylation, la nitration, le mPthr~lation. (‘c~taines 111-Cparations cl6nnturPcs par la chaleur, l’ur6e ou la guanidine ont bt6 bgalement Ctudiks. 3. La conclusions principales se d@qgeant de ce travail sont lcs sui\witeh: (a) La substitution des groupcmcnts cationiques R cntraink unt’ acci~lb-ation dans le champ ~lectropliorbtiquc~ sl pH 8.0, unc diminution dc colorabilit6 \-is-k\ris dw colorants anioniclucs usuels. (‘(5 tlcus critfkes constituent un contrblv rapidti et aixC pour appr&%lc rkultat dct la modification chimique dGrCv. En imriiuno~l~ctrophork, ccs mt?mes nlbuminvs modifiCes donncnt une r&&ion normA% en cc’ (lui concerne la prfkipitation avec le sCrum anti-albuminc native, c(’ qui soulignc le pvu d’importnnce des groupvs amin& dc l’nlbumine dans la rb_ction antigPne~~anticol-1,s.

IMMUNO~LECTROPHOR~SE

Le cas de l’albumine la diminution

DE PROTkINES

carboxymethylee

de la charge

negative

MODIFIkES.

pose un probleme de la proteine

357

I.

special.

(b) Par contre,

par esterification

des groupes

carboxyle aboutit a une suppression a la fois de la mobilite a pH 8.6 et de la reactivite avec l’anticorps anti-albumine native. L’aviditt: pour les colorants anioniques est au contraire fortement renforcee. (c) La performylation, portant essentiellement sur l’oxydation des ponts S-S, provoque un ralentissement de la mobilite electrophoretique et entraine une diminution plus ou moins importante de la reactivite immunoelectrophoretique suivant le degre d’oxydation.

IMMUNOELECTROPHORETIC

STUDIES

OF SOME MODIFIED

PROTEINS

I. HUMAN SEKC’M ALBUMIN I. Modified human albumins are studied by zone electrophoresis on paper, starch gel, and agar, by immunoelectrophoretic analysis and by the agar diffusion technique. 2.

albumin

The modified proteins used in this study were derived from human serum (H.S.A.), by deamination, acetylation, carboxymethylation, treatment with

phthalic

anhydride,

with ninhydrin,

tosylation,

phosphorylation,

formaldehyde, oxidation with performic acid, nitration, by heating, or by treatment with urea or guanidine. 3. Blocking of amino-groups alone carboxyle groups results in acceleration in decrease of affinity for the usual acid horse or rabbit anti-human sera is not

treatment

methylation,

with

denaturation

or combined with the introduction of new of the electrophoretic mobility at pH 8.6 and dyes. The immunological reactivity towards impaired by the blocking of the free amino

groups. 4. Blocking of the free carboxyle groups of albumin results in a diminution of the electrophoretic mobility and an increase in staining. Esterification of the carboxyle groups suppresses fication. 5. After reactivity

the immunological

oxidation

of the S-S

activity,

in proportion

groups in human

to the degree of esteri-

albumin,

the immunological

disappears. BIBLIOGRAPHIE

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