Evolution des réactifs de détection des anticorps anti-VIH

REVUE GENERALE

M~d Mal infect, t998 ;28 : 496-504

Evolution des rdactifs de d6tection des anticorps anti-VIH* Y. A T A M A N - ( ) N A L * * ,

F. B I R O N * * *

et B. V E R R I E R * *

RESUME

Les tests de d6pistage de l'infection ~ VIH sont de type ELISA. Its d6tectent les anticorps s6riques anti-VIH-1 et 2, permettant ainsi d'assurer la s6curit6 transfusiom~elte. Au tours des ann6es, ces rdactifs sont devenus non seulement plus sp6cifiques grfice ~ l'utilisation de prot~ines recombinantes ou de peptides syntMtiques, mais aussi plus sensibles gr0,ce ~t la ddtection des immunoglobulines totales. La tr~s grande variabilit6 g~n~tique des VIH, et plus particuli~rement du groupe O de VIH-1, constitue une difficult~ majeure de cette sfirologie. R~cemment, de nouveaux tests ELISA, tr~s sensibles, ont 6td mis au point 9 ils permettent la d~tection des anticorps dans des ~chantillons de salive ou d'urine. Des tests simplififis, unitaires et rapides, sont utilisfis en compl6ment des trousses ELISA. Cette simplification des formats des tests, associfie ~t l'utilisation des prdl~vements autres que le sang, prfisage une 8re nouvelle : le test ~ domicile. Mots-el6s : Anticorps anti-VIH- Trousse ELISA - Test sur salive - Test sur urine - Test h domicile.

Environ 75 millions de tests de diagnostic de 1' infection par le Virus de I'Immunoddficience Humaine (VIH) sont effectu~s chaque annde aux Etats-Unis et 40 millions en Europe. Les strategies de d6tection mises en oeuvre sont de deux types. La d6tection directe consiste en l'identification de la particule virale enti6re ou de certains de ses fil~ments structuraux, dans un pr616vement biologique. Les techniques utilis6es ddpendent de la mol6cule cibl6e. La raise en ~vidence des prot6ines virales, en particulier de la prot~ine p24 de la capside, se fait pal" dosage immuno-enzymatique. Lorsque les acides nuclfiiques sont ciblds, les techniques de biologie mol6culaire bas6es sur l'hybridation et I' amplification g~nique sont de choix. Les nouveaux r6actifs, mettant en oeuvre ce type de technologies, sont de plus en plus nombreux sur le marcM du diagnostic (1). La d6tection indirecte ou s6rologique vise ~. mettre en dvidence les anticorps dirig~s sp6cifiquement contre le VIH. Les r6actifs de d6pistage actuels sont des dosages immuno-enzymatiques, plus pr6cis~ment des Enzyme Linked ImmunoSorbent Assays (ELISA) permettant de tester la pr6sence de ces anticorps anti-VIH1 et 2 dans Ie sang, avec trois objectifs pfincipaux : sdcurit6 lors des transfusions et transplantations, surveillance de l'6pid6mie et diagnostic de l'infection par le VIH (2). Cet article retrace I'6volution des m6thodes de d6tection des anticorps antiVIH, en faisant le point sur leurs performances et leurs limites.

* Requ le 30.7.97. Acceptation definitive le 16.12.97. ** Unit6 Mixte CNRS/bioM6rieux, Ecole Normale Sup6rieure de Lyon, 46 all6e d'Italie - F-69364 Lyon Cedex 07. *** Service des Maladies infectieuses, H6pital de la Croix-Rousse, 93 grande rue de la Croix-Rousse - F~-69317 Lyon Cedex 04. 496

C L A S S I F I C A T I O N DES R E A C T I F S POUR LE DIAGNOSTIC DU VIH Les r~actifs de d~pistage 9 Les trousses ?l sensibilitd dprouvde

L'utilisation des tests immuno-enzymatiques pour la d6tection des anticolps anti-VIHl a 6t6 d6crite db,s 1984 (3) et les premi6res trousses ELISA ont 6t6 raises sur le marcM en d6but 1985 (4). A la marne p6riode, le VIH2, un autre virus provoquant le Syndrome d'Immunod6ficience Acquise (SIDA), a 6t6 isol6. L'homologie de s6quence entre ces deux types de vires a permis i'utilisation des r6actifs VIH 1 spfcifiques pour le d6pistage de l'infection par le VIH2; ce ne felt qu'un succ~s part[el (5). D~s lots, plusieurs auteurs ont soulign6 la n6cessit6 d'un d6pistage sp6cifique des anticorps anti-VIH2 en m~me temps que celui des anticorps anti-VIH1 (5, 6). L'identification d'un 6pitope immunodominant et lin6aire dans la r~gion N-tem~inale de la glycoprot~ine transmembranaire a rendu possible la r6atisation de tels r6actifs. Cet 6pitope n'est que faiblement conserv6 entre les deux types de virus, mais il est antig6niquement peu variable pour un virus donn6 (7). Des antig~nes artificiels (peptides synth6tiques ou prot6ines recombinantes), reproduisant s61ectivement une s6quence de type V IH1 ou VIH2, d6tectent sp6cifiquement les anticorps anti-VIH1 ou anti-VIH2. Un test ELISA p r6sentant ces deux types de s6quences permet un d6pistage simultan6 des deux types d' anticorps. I1 est qualifi6 de trousse mixte par opposition aux tests monosp~cifiques (8). Les r6actifs mi• sont utilisgs dans deux objectifs diff,rents, le dgp[stage et le diagnostic. Selon l'objectif, Ies strategies de test raises en oeuvre varient. Le d~pistagc est la

TABLEAU

Firme

d e s trousses ELISA enregistr~es ou en cours d ' e n r e g i s t r e m e n t l'Agence du M~dicament au 14 n o v e m b r e 1996

I : Caraet~ristiques

Nom ddposd VIH I

Origine des prot6ines VIH l/gr O VIH2

Orth~ Diagnostic Systems Ortho HIV-I/HIV-2 Enhanced ELISA test Lysat viral+pine env -, Akzo Organon Teknika Akzo Organon Teknika

Vironostika HIV uniform II Vimnostika HIV uniform II plus 0

Abbott Diagnostic Biotest/Sorin Boehringer Murex Diagnostics Murex Diagnostics Abbott Diagnostics Abbott Diagnostics Roche Diagnostic Systems Sanofi Diagnostics Pasteur

Principe

Peptide env

Indirect

Virus env+prec gag

Peptide env

Peptide env

Sandwich

HIV I-HIV2 plus 3e gdn6ration Biotest anti-HIV 1/2 recombinant Enzymum test anti-HIV 1+2+0 Mure x HIV l +2 Murex ICE HIV-1.O,2

Prec env+gag

Peptideenv

Prec env Prec env Peptideenv Peptide env Peptide env

Sandwich Indirect Indirect Sandwich Sandwich

Axsym HIV I/HIV2 PRISM HIV I/HIV2 Cobas Core anti-HIVl/HIV2 EIA DAGS Genscreen H tVI/2

Prec env+gag Peptide env

Prec env+peptide env Prec env+peptide env Prec env+peptide env Peptide env

Sandwich Sandwich Sandwich Sandwich

Sanofi Diagnostics Pasteur Genelavia mixte

Prec env+peptide env -

Peptide env

Indirect

bioMdrieux VIDAS HIVI/2 new Sanofi Diagnostics Pasteur Access HIVI/2

Prec gag+peptide env -

Peptide env

Indirect Capture Ig

Behfing Diagnostic Enzygnost anti-HIV 1/_9plus Biochem Immumosyst~mes EIAgen Detect HIV bioMdrieux VIDAS HIV 1+2

Peptide env

Peptide env

Indirect

-

Peptideenv

Peptide env -

Behring Diagnostics OPUS anti-HIV 1+2 plus Ortho Diagnostic Systems Ortho HIV-I/HIV-2 Ab capture ELISA Prec ' protdine recombinante. recherche systdmatique d'individus infectds au sein d'une population ~t faible prdvalence, comme les donneurs de sang ou de greffe. La 16gislation actueIle impose l'utilisation d'une tmusse mixte pour le criblage des donneurs de sang, et de deux rdactifs diff6rents pour le criblage des donneurs d'organe. Le diagnostic concerne les sujets ayant un risque d't3tre exposd .'m virus et vise ,1 dtablir si l'infection a lieu ou pas. Dans ce cas, deux tests ELISA sont effectuds, et le recours aune trousse monospdcifique est envisageable. Si un rdsultat positif est obtenu avec l'un des deux rdactifs, il dolt ~.tre vdrifid par un test de conformation, technique plus longue mais aussi tr6s sp6cifique (8). En date du 14 novembre I996, 20 tests ELISA mixtes sont disponibles sur le marchd fi'anqais (tableau I). Le r6actif ETI AB HIV I/2K de Sorin, qui manque de sensibilitd pour le VIH2, est considdr6 comme une trousse monospdcifique (9). Les ELISA monospdcifiques de sensibilit6 insuffisante ont dt6 retires du march6 et ceux suffisamment sensibles vis-a-vis du VIHI ont dt6 reclassds dans tree troisi~me cat6gorie ddnomrode "rdactifs de diff6renciation et d'analyses compldrnentaires"" ils ne peuvent en aucun cas &re utilisds en premiere intention. L'unique trousse monospdcifique maintenue parmi les r6actifs de d6pistage ~ sensibilit6 6prouvde est le test Serodia HIV de Fujirebio qui est un dosage par agglutination 497

(10). Du lysat viral VIHI est adsorb~ sur des particules d e gelatine; il y a agglutination lorsque Ie s6rum ~ tester contient des anticorps anti-VIH 1. Rficemment, une version mixte a 5td d6veloppde, elle est en cours d'6valuation (11). 9 Les trousses mixtes rapides

A partir de 1988, sont apparues des techniques de d6pistages alternatives aux ELISA mixtes anti-VIH : le dosage p a r agglutination et l'immunor6vdlation sur support solide (dotblot). Ces tests sont plus rapides (rdponse en 10-15 rain) et plus simples de rdalisation que les ELISA (12). J u s q u ' e n 1990, ces trousses unitaires, ~. lecture subjective n'dtaient pas reconnues par I' Agence du M6dicament (ADM). L' apparition de tests automatisds de qualit6 variable a entrain6 une modification du classement des rdactil's de ddpistage au niveau de I'ADM. Les tests mixtes rapides se diffdrencient des autres tests par une sensibilitd moindre, du fait que les 6valuateurs et I ' A D M sont un peu moins exigeants pour ce type de rdactifs. Ils ne peuvent en attcun ca s ~tre utilis6s seuls et doivent &re associds, comme les tests monosp6cifiques d'ailleurs, tl une trousse mixte de sensibilit6 6prouv6e. Ndanmoins, ils constituent un outil efficace pour les pays manquant de mat6riel et de personnel qualil'i6 (8). Les 6valuations r6alisdes sur les tests rapides rdcents concluent, pour

certains, 5, des performances comparables ?t celles des tests ELISA (13, 14). I1 existe sur Ie marcM frangais 4 tests mixtes rapides (tableau II). 9 L'automatisation Depuis 1991, les tests automatisables sont venus complfiter la gamme des r6actifs disponibles. Les instruments de mesure actuellement sur le march6 ont des degx6s divers d' automatisation. Plusieurs firmes ont ddvelopp6 des syst~mes ferm6s o~a chaque dtape, depuis le pr61~vement de l'6chantillon jusqu'au rendu des r6sultats, est automatis6e. Ils apportent une sdcurit~ suppl~mentaire lors des manipulations, minimisent les erreurs et amdliorent le rendement du laboratoire d'analyse. Leur intdr~t principal r6side cependant clans la standardisation des proc6dures, ce qui augmente Ia fiabilit6 du r~sultat obtenu (15). Sept tests ELISA anti--VIH sur automate sont disponibles sur Ie march~ fran~ais : Axsym et PRISM/Abbott, OPUS/Behring, VIDAS/bioM6rieux, Enzymun sur ES 300 ou ES 700/Boehringer Mannheim, Cobas CORE/Roche et Access/Sanofi Diagnostic Pasteur.

Les r6aetifs de confirmation

La technique du Western Blot permet de ddtecter les anticorps anti-VIH et d'identifier les protdines virales contre lesquelles ils sont dirigds. En th6orie, un sujet infect6 par le VIH devrait possdder des anticorps spdcifiques de chacune des prot6ines structurales du virus (produits des g~nes gag,

pol et env). Mais les sujets infectds n'6laborent pas tous une r6ponse humorale contre routes les prot6ines du VIH. Les sfirums de certaines personnes non contaminfies peuvent donner des r~actions croisgms avec une ou plusieurs prot6ines du VIH (12, 16). Le test est lu visuellement : l'interpr6tation est subjective. Pour rem6dier ~ ces difficultSs, une certaine standm'disation au niveau de l'interpr~tation des pmfils observes a 6td tentde. Plusieurs organismes ont propos6 des ensembles de crit6res, qui sont r~capituI6s dans le tableau III. Pour tous, la ndgativitd du Western Blot repose sur i' absence de rdactivit6 : il n'appara~t aucune bande correspondant ?~ l'une des trois prot6ines Env (gpl60, gpl20, gp41), Gag (p55,p24,p 17) et Pol (p66,p51,p31). Pour la positivitfi, les crit~res sont divergents 9 pour certains, une r~activitd au niveau de 2 bandes est suffisante alors que d'autres exigent 3 bandes. Les profils ne remplissant ni les crit~res de positivit~ ni ceux de ndgativit6 sont considdrSs comme ind&el"min~s (12, 17). A I'heure actuelle, le Western Blot reste toujours la principale technique de confirmation 9 6 trousses sont enregistrdes ~t l'Agence du M6dicament.

La firrne Innogenetics a d6velopp~ une technique de confirmation alternative : le Line Immunoassay (LIA) ou encore l'immunodosage sur bandelettes (18). A la mani~re d'un Western Blot, le LIA d6tecte les anticorps spdcifiques r6agissant avec Ies antig~nes viraux. Les prot~ines virales sont cependant remplac6es pat" des prot6ines recombinantes (p24,

TABLEAU II' Caract6ristiques des tests rapides mixtes VIH1 et VIH2 enregistr6s ou en cours d'enregistrement l'Agence du M6dicament au 14 novembre 1996

Firme

Nora d6pos6

Principe

Origine antig~nes VIH- 1/VIH-2

Cambrige Biotech/Biodis

Recombigen HIV-1PHIV-2 RTD plus

Dot-blot

Prec env/Prec env

PBS-Orgenics

Immunocomb II bispot HIV-1/HIV-2

Dot-blot

Pep env/Pep env

Ortho Diagnostic Systems

HIV 1+2 Double Check

Chromatographic et immunofiltration

Prec env/Pep env et prot~ine A

Sanofi Diagnostic Pasteur

Multispot HIV- I/HIV-2

Immunoconcenu-ation

Prec env/Pep env

Prec : prot6ine recombinante; Pep : peptide.

TABLEAU III : Crit~res pour l'interprdtation des Western Blots

Crit~res Organisation

Positivit6 (au minimum)

Ndgativit~

Organisation Mondiale de la Sant~

2 bandes env

Aucune bande

Centers for Disease Control

2 bandes parmi les 9 p24, gp41, gp 120/160

Aucune bande

Consortium pour la Standardisation de la S~,rologie des R6trovirus

i bande p24 ou p32 et 1 bande gp41 ou gp120/160

Aucune bande

Croix-Rouge am6ricaine

Au moins une bande de gag, pol et env

Aucune bande

Food & Drug Administration

p24, p32, et gp41 ou gp120

Aucune bande

Les profils ne remplissant ni les crit6res de positivit6 ni les cl"itSres de nggativitd sont considgrds comme "indgterminds".

498

p17, p31) et des peptides de synthase (gp41-VIH1, gp36VIH2), ddposds en bandes paralleles sur une membrane en nylon. On peut ainsi determiner le profil de reconnaissance des anticorps presents dons le serum. Ce test ~t caractere analytique permet de standardiser la qualit6 et la quantit~ des antig~nes prEsentfis et minimise les contaminations pat" des protEines cellulaires (12, 18). Ce rdactif, commercialis~ depuis 1991, a 6t6 class~ en 1996 pamai les rEactifs de confirmation. D'autres rdactifs bases sur le marne principe sont depuis peu disponibles (19, 20). Leur plus grande spEcificite permet de rdsoudre les cos de Western Blot inddterminfis, mais il reste 5. valider leurs performances au niveau de la sensibilit6 et en particulier pour les sous-types trEs divergents. Deux autres mEthodes permettent une detection tr~s sensible des anticorps anti-VIH : l'irmnunofluorescence indirecte (IFA) et la radioimmunoprdcipitation (RIPA). Cependant, elles n6cessitent 1' isolement du vires, sa culture in vitro et l'emploi de m~queurs fluorescents ou radioactifs. Ce sont des techniques Iongues et on6reuses qui ne sont pratiquement plus utilis~es en diagnostic.

nEgatif- par rapport au panel que nous venons de ddcrire. Quant aux tests mixtes rapides, un faux-nEgatif est toldr6 (9, 22). Les socidtEs ameficaines Boston Biomedica Inc. (BBI) et North American Biologicals Inc. (NABI) commercialisent des pr~F:vements sEquentiels effectu~s chez Ie m~me sujet avant et pendant la seroconversion. Ces fichantillons, appelds prE- et per-sEroconversions, sont systEmatiquement utilis~s lors des Evaluations afin de determiner les rEactifs les plus precoees, c' est-~.-dil'e, les plus sensibles. En France, parmi ces sfirums ,~ tr~s faible quantit6 d'anticorps anti-VIH1 inclus dans le panel d'Evaluation, au moins 25 % doivent ~tre reconnus. Pour 6valuer la spEcificit6 d'un test anti-VIH, 2 000 s~rums de donneurs de sang choisis au hasard sont testes. Les eriteres d'acceptabilit6 retenus par I'ADM sont une sp~cificit6 supErieure ~ 99,5 % de vrai-nfigatifs pour les trousses mixtes ELISA, et ~t 98 % pour les tests rapides (9, 22). Des Echantillons n~gatifs, donnant des reactions crop sees non spdcifiques d'une infection VIH, sont Egalement test~s 5. titre informatif.

L e s crit~res d' 6valuation La commercialisation en France des trousses anti-VIH est soumise h une rEglementation rigoureuse. L'enregistrement est accord6 par l'Agence du MEdicament apr~s examen d'un dossier incluant impErativement les rEsultats obtenus avec le rdactif sur divers panels et en tenant compte des ~valuations rEalisEes par le groupe de travail R~trovirus de la SociEt6 Nationale de Transfusion Sanguine (SNTS) (9, 21, 22). De faqon similaire, dans la plupart des pays europfens existent des organismes charges du contrEle continu des rEactifs de d@istage et de confirmation ' le Patti Erlich Institut en Allemagne, les Public Health Laboratories en Grande-Bretagne et l'Office FEddral de la Santd en Suisse. L'autorisation de commercialisation est accordEe au• Etats-Unis par la Food and Drug Administration. Dans le cadre de son action contre le SIDA, t' Organisation Mondiale de Ia Sant6 aussi 6value les trousses commercialisEes et ~met des recommandations (2). La finalit6 de ce contrEle est ia determination des performances du rEact[f 9 la sensibilit6 et la spEcificitE. Pour un panel d~terminE de serums, la sensibilit~ est le pourcentage d'Echantillons contenant rEellement des anticorps anti-VIH et donnant un rEsultat positif avec le test h Evaluer (w-aipositifs). La spEcificit6 est le pourcentage de serums nEgatifs qui donnent un rEsultat n~gatif (vrai-n~gatifs) (2, 22).

Pour juger de la sensibilitE d'un rEactif, le groupe de travail Rdtrovirus de la SNTS dispose d'un panel de quelques centNnes d'dchantillons VIH 1+ ou VIH2+. Le hombre de serums de sdroconversion VIHI recente inclus dans cet 6chantillonnage va en croissant. Ces prEl~vements, qui ne poss~dent qu'un faible taux d' anti corps anti-VIH1, constituent une prdcieuse source d'infon-nation sur les performances d'un rEactif (23, 24). Darts le cas du VIH2, des serums de sdroconversion rEcente sont tr~s rares. La sensibilit~ aux faibles taux d'anticorps est apprEeiEe par une dtude de dilutions de serums VIH2+. Pour qu'une trousse mixte ELISA soit agr66e par 1' ADM, elle doit avoir une sensibilit6 de 100 % - aucun faux499

E V O L U T I O N DES TROUSSES ELISA : LES G E N E R A T I O N S DE TESTS Les termes de premiare, seconde et troisi~me gEnEration ont 6td appliquds aux tests ELISA anti-VIH selon Ies am~Iiorations successives apportdes. Elles visent ~. augmenter les performances des r~actifs et b. reduire au minimum la fenfitre de s&oconversion. C'est la pdriode de "sErologic muette" pendant laquelle le sujet infect6 peut transmettre le virus, alors qu'aucun anticorps anti-V1H n'est ddcelable ni pax"ELISA, ni par Western Blot (16, 251). Ces ameliorations concernent principalernent la source d'antig~ne VIH utilisEe et le principe de la technique ELISA raise en oeuvre. La ddtection des anticorps suit actuellement deux principes de dosage 9 ELISA indirect et ELISA en sandwich double antigone. Dans les deux cos, les antig~nes sont adsorbEs sur un support solide

substrat

produit colore, fluorescent ....

substrat

preduit colore, fluorescent ....

ELISA sandwich double antigone

ELISA indirect

,

Antig#ne Conjugu~ antlcorps anti Ig G humain - enzyme

--~

Ig G

l

l

~

Ig M

Conjugu6 antigone - enzyme

Fig. 1 : Principe des diff~rentes techniques ELISA

(billes ou puits de microplaque) puis incubEs avec le sdrum ~ tester. Les complexes antigene-anticorps formds sont r6v~lEs par un ligand conjugud ~t une enzyme ~t substrat chromogEne. Pour I'ELISA indirect, le conjugu6 est une immunoglobuline (ig) anti-IgG humaine; pour I'ELISA sandwich e'est un antig6ne recombinant prEsentant les memes 6pitopes que l'antig6ne de capture (figure 1). Darts certains tests ELISA, une capture sp6cifique des IgG est realistic au prEalable, de mani~re ~ augmenter la sensibilit6 (26). Premiere gEnEration 9 dEpister les anticorps anti-VIH Ces tests utilisent des antig~nes viraux purifids ~tpartir de cultures de lymphocytes infectds et sont de type indirect. Ils peuvent manquer de spdcificit6 en raison de reactions avec les protEines cellulaires contaminantes, et de sensibilit6 en raison des hautes dilutions de l'6chantillon nEcessaires pour obtenir une spEcificit6 acceptable (27). Les proportions des diverses protdines virales et leur puret6 peuvent varier d'une extraction l'autre, ce qui empeehe la standardisation des rEsultats (28). Pour contourner ces probl&mes les tests de deuxi~me gEnEration ont 6td ddveloppEs. Deuxi~me gEnEration 9 am6liorer les performances Pour les tests de deuxi&me gEnEration, la definition des antig~nes a 6td prdcisde grfice aux progrEs de la recherche fondamentale sur le VIH. L'identification et le sdquenqage des sites immunodominants a rendu possible la production d'antigenes artificiels soit par expression d'un fl'agment d'ADN recombinant de VIH dans un syst~me procaryote (29) ou eucaryote (30), soit par synth~se chimique d'oligopeptides contenant ces 6pitopes (7). Les protEines mcombinantes et les peptides de synthEse, obtenus de fa~on plus simple et plus reproductible, ont permis des ameliorations substantielles de l a sensibilitd et de la spdcificit6 (31). Ils offrent 6galement une meilleure sEcurit6 d'emploi, 6vitant la manipulation de cultures infectEes (28). En ce qui concerne le principe, les tests de deuxieme gEnEration sont pour Ia plupart des ELISA indirects. La premiere trousse commercialisEe par Murex (Wellcome) est un dosage par competition mais ne dEtectant que les anticorps anti-VIH 1, elle ne peut plus ~tre utilisOe en France en premiere intention. Un grand nombre de parametres conditionnent les performances de ce type de rdactiE Les protEines recombinantes, gEndralement produites chez Escherichia coli, nEcessitent une purification tr~s pouss~e pour 6viter les faux-positifs dus h des anticorps anti-E, coli. De plus, ces recombinants ne sont pas glycosylds : Ieur conformation est diffErente de celle de la glycoprotEine Env native (32). La sequence des peptides de synth~se n'est d6terminEe qu'~ la lumiEre d'une cartographie ddtaillEe des 6pitopes reconnus par les lyrnphocytes B. Cette technique mesule l'intensit6 et l'efficacit6 d'une rEponse immune humorale dirigde contre chaque 6pitope de la protdine 6tudiEe. Une Etude complete sur les glycoprot6ines d'enveloppe du VIH a 6t6 publiEe par Neurath (33). La region choisie doit ~tre conservde clans la plupart des variants viraux et induire une rdponse anticorps chez toutes les personnes infectdes, le plus tEt possible. L'intensit6 de cette rEponse doit 500

lg Lotale ,

T

~

.-.

3~mr

Gl~ndtalion

2~me l~,re

G6n6talinn Ggl]~r~lJon

//--~ Prima-infection

Sdr~onversion complete

(Mois / Annees)

Contamination

Fig. 2 : La rdponse humorale prdcoce anti-VIH et "l'effet de vague" des tests ELISA en sandwich double antigone etre maintenue ~ un niveau detectable tout au long de l'infection (28). La troisi~me gEnEration 9 detecter les faibles taux d'anticorps Les tests de troisi~me gEnEration utilisent les m0.mes sources d'antigene que les trousses de Ia gEnEration pr~c~dente. Le changement se situe au niveau du principe du d o s a g e ' I'ELISA indirect est remplac6 par un ELISA en sandwich double antigone, Les consequences immMiates sont la dEtection des immunoglobulines totales et une diminution des reactions croisEes. La reaction de rEvElation est plus spEcifique que la reconnaissance d'une IgG.

Une 6tude menEe par une 6quipe hollandaise a montr6 la meilleure sensibilit~ des trousses de u'oisiEme gEnEration Iors de s6roconversions (34). Sur un 6chantillonnage de 36 serums pr~levEs chez des individus en phase prEcoce de t'infection, les tests de deuxiEme gEn6ration avaient une sensibilit6 de 89 % contre 94 % pour ceux de troisi~me gEnEration. Des strums sEquentiels permettant de suivre 10 s6roconversions ont 6galement 6tE test~s. Un jour apr~s le pie d' antigEnEmie, les tests de troisiEme gEnEration 6taient positifs alors qu'il a fallu en moyenne 5 jours suppl6mentaires aux ELISA deuxi~me gdndration pour detecter la s6roconversion. Les Evaluations rEalisdes rEguliErement par les organismes chargEs du contrEle des rEactifs confirment cette 6tude. Le principe du sandwich app,'ua~t souvent, mais pas exclusivement, le plus pmformant pour le dEpistage prdcoce des anticorps (23, 24). La rEponse primaire de type IgM est transitoire. Elle apparatt tors de l'Episode de primo-infection, atteint son niveau maximal en 2 ~ 3 sen-mines, puis chute. Les IgG caractdristiques de la rEponse secondaire n'apparaissent que plus tard mais persistent tout au long de l'infection. Une dizaine de jours apr~s la sdroconversion, le taux des IgM se trouve considdrablement bas alors que les IgG n'ont pas encore pris le relais (16). Ceci est ~ I' origine de "1' effet de vague" (wave effect) des tests de troisiEme generation : pour des 6chantillons prElevEs 3 ~t 4 semaines apr~s le debut de l'infection, leur sensibilit6 est moins bonne. Elle retrouve ensuite son niveau initial (figure 2). Si cette technique est utile en laboratoire d' analyse biologique pour d~tecter plus prEcocement

des individus ayant un risque reel d'etre en sdroconversion, elle n'apporte pas un bEnEfice Evident pour Ie ddpistage des donneurs de sang, compte tenu de la faible prevalence du virus dans cette population. Dans le contexte des transfusions, le laps de temps de 5 jours gagn~ par les ELISA troisi~me gEnEration est trop court pour apporter une sdcurit~ supplEmentaire. Par contre en biologie clinique, dtant donnde la prevalence dlevde de sEropositivit~ dans certains laboratoires, ils sont compl~mentaires des rdactifs de deuxi~me gEndration. En France, l'utilisation de double test ~tant dEj~t impos6e, il est conseill6 de choisir des trousses de gEnErations et de matiEres premieres diffErentes.

tits de dEpistage sont assez performants : le taux de fauxndgatif pour les virus non-B est tr&s faible mais non nul (38, 40). REcemment, deux faux-n~gatifs ont ~tE rapport~s en utiIisant les tests commemialisEs en France. De plus, pour les sdroconversions non sous-type B, la plupart des rdactifs, ceux de ta'oisi~me gEnEration compris, manquent de sensibilit6 (35, 41). I1 est important de remEdier 5. cette situation, non seulement pour les regions comme 1'Afrique et l'Asie o,5 ies virus non-B sont majoritaires mais aussi pour l'Europe et les EtatsUnis oil l'introduction de sous-types varies est de plus en plus document~e (42, 43). En France environ 20 % de la population infect~e est porteur d'un virus non-B' ce chiffi'e atteint 40 % pour la r~gion parisienne.

LES NOUVELLES TENDANCES

La detection des virus du groupe O pose quelques probl~mes. En 1994, il a ~t~ mis en Evidence que certains tests de d~pistage manquaient de sensibilit6 pour ces variants (44), ce qui a conduit l'Agence du MEdicament ~ une rEEvaluation de l'ensemble des rEactifs de diagnostic VIH. PrEs de la moiti6 des trousses ont prEsentd des d~fauts de reconnaissance (fauxndgatifs) (45). La trousse distribuEe par Clonatec, qui n'a reconnu aucun ~chantilIon, ainsi que la ta'ousse Wellcozyme HIV-1 Rec CompEtition ont ~td reclassEes en "r~actifs de diffErenciation et d' analyses compMmentaires". Globalement, les tests de deuxi~me gEnEration ont eu des performances supErieures ~. celles de troisi&me generation. Les rEactifs qui prEsentaient des ddfauts de reconnaissance ont dt6 rapidement corrigEs par leurs fabricants, soit par adjonction de peptide ou de protEines spEcifiques du VIH1 O, soit par modification des antig~nes ou des conjuguEs (46). Depuis, 6 s~rums du groupe O sont inclus dans le panel d'dvaluation des rEactifs de ddpistage (47). Lors de la derni~re ~valuation pour la sensibilitE vis-fi-vis du groupe O, les rdsultats obtenus avec les trousses testEes 6taient satisfaisants (47).

De 1985 ~ nos jours, les progrgs r~alis~s dans le domaine de la detection du VIH sont considErables. Cependant l'Evolution des r6actifs est loin d'etre achevEe car certains problames ne sont qu'~. moitiE rEsolus: il faut detecter tous les variants VIH-1 et VIH-2, des Ia primo-infection (35). De plus, pour pouvoir augmenter l'efficacitE du dEpistage du VIH en tant qu'ot~til de prevention et de contrEle de l'~pid& mie, la simplification des formats de tests s'impose (36). La prochaine gEnEration de tests devrait r6pondre ~t ces exigences, avec des performances et une fiabilit6 Equivalentes voire supErieures ~t celles des rdactifs actuels. Les industriels proposent diverses solutions, qui sont en cours d'dvaluation. L a detection simultande de l'antig~ne p24 et des anticorps anti-VIH1 et 2 Lors de la primo-infection par le VIH, l'antig~ne p24 est present chez la majoritd des sujets, ~ des titres gdnEralement supErieurs ~t 100 pg/ml. Durant cette phase, la vire!mie est Elevde, le risque de transmission maximal. I1 a cependant EtE ddmontr6 que l'utilisation d'un test spEcifique pour la dEtermination de 1' antigEnEmie p24, en sus des tests pour la dEtection des anticorps~ n'est pas 6conomiquement justifi6e en routine. La sociEt6 bioMdrieux ddveloppe un rEactif permettant la detection simultan~e de l'antig~ne p24 et des anticorps a nti-VIH1 et 2, appel6 VIDAS HIV DUO. Une 6valuation multicentrique a permis de montrer que ce rEactif prdsente une spEcifieitE et une sensibilit6 comparables fl celles des autres tests, de la sEroconversion au stade SIDA. A la primo-infection, comme le pic d' antig~n~mie precede 1' apparition des anticorps, la d~tection de l'infection est plus prEcoce.

La variabilit6 gEnEtique des VIH et ses cons6quences diagnostiques D'un point de rue gEn~tique, le VIH1 est divis6 en deux groupes : le groupe M (majeur) et le groupe O (outlier) (37). Le groupe M, qui correspond ~ la major it~ des isolats connus, est rEparti en 10 sous-types dEnomm6s A ~t J. Le groupe O comprend, pour le moment, 21 isolats tr~s divergents par rapport au groupe M e t assez 61oignEs les uns des autres. Quant au VIH2, cinq sous-types sont actuellement connus (38, 39). A 1' intErieur du groupe M et pour le VIH2, les rEae501

Les chercheurs rapportent rdguliarement leurs observations sur des nouvelles souches de VIH1 non dEtect~es par les tests sdrologiques ou seulement tr~s tardivement (48, 49). Dans la plup~t des cas, ce ne sont pas de nouveaux soustypes viraux. II s'agit plutEt de variants s&ologiques oil la modification de quelques acides amines se traduit par des differences sensibles d'antig~nicitE. Ces mutations se situent souvent dans l'~pitope immunodominant de la gp41 (48). L'utilisation prdfErentielle de protdines recombinantes, qui prEsentent plus d"Epitopes que les peptides, peut &le une solution ~1ce problEme. La tr~s grande variabilit6 des VIH exige une trEs grande vigilance pour contr61er le maintien des performances des rdactifs actuels. Prdl~vements alternatifs au sang Une nouvelle donnEe dans le domaine du diagnostic du VIH est le dfveloppement de technologies permettant Ia dEtection des anticorps anti-ViH dans les liquides corporels autres que le sdrum ou le plasma. L'utilisation de prdlEvements alternatifs, comme la salive ou l'urine, prEsente plusieurs avantages 9 leur obtention est aisEe et non-invasive, ils sont moins infectieux que le sang et se conservent mieux (36), Le probl~me technique majeur ?t surmonter est que les niveaux

d'IgG et d'lgA dans la salive et 1'urine sont considErablement infErieurs ~ ceux du sang. Or, il taut une concentration minimale en IgG de 0,1 mg/1 pour detecter de faqon fiable les anticorps anti-VIH (50). Lorsque les trousses commerciales sont utilisEes pour tester des prE16vements de salive ou d' urine, il est nEcessaire d' augmenter le volume de 1'6chantillon ou de le concentxer au prdalable (36). A vant d'envisager I'utilisation des pr~16vements alternatifs en routine, il faut s'assurer que les performances des tests sont bien Equivalentes ~, celles obtenues sur le sang. 9 La salive

L'Echantillon de salive peut ~tre obtenu ~t l'Etat brut, en crachant darts un rdcipient ou collectd ~ I' aide d'un dispositif de prdl~vement (36). Parmi ceux-ci, un dispositif commercialisd aux Etats-Unis sous le nora de OraSure, permet d'obtenir du transsudat oral mucosal, plus concentrd en IgG que la salive. OraSure contient un coton-tige large et tr6s absorbant qu'il faut placer entre la muqueuse .jugale inl'~rieure et les gencives, et presser, de mani~re h provoquer la transsudation. Apl'6S la collecte, si le test n'est pas imm6diatement r6alis6, le pl'dlevement dolt 8tre r6fi'ig6rd ou diluE dans une solution de conservation, pour inhiber l'activitd des enzymes pouvant d6grader les anticorps anti-VIH (51). De nombreuses Equipes ont compar6 les performances des tests disponibles stir le march6, stir des pr616vements sanguins et de satire. Schopper et Vercauteren ont publi6 en 1996, une revue de ces dtudes comparatives (36). Globalement, les sensibilit6s varient de 95 % ~t 100 % et les sp6cificitEs de 98 % ~t 100 %, Les meilleurs r6sultats sont obtenus avee les tests qui travaillent en capture d'IgG, comme le GACELISA de Murex (52). En effet, cette technique comprend une drape pl'dalable de capture des IgG totales, ce qui permet de concentrer substantiellement l'Echantillon. Les deux derni6res Etudes en date, rdalis6es respectivement sur 3 570 (51) et 615 (53) pr~l~vements concluent ~t des performances 6quivalentes sur sdrum et sur transsudat mucosal oral. En juin 1996, la Food and Drug Administration am&icaine a donn~ un accord de commercialisation au rdactif OraSure HIV-1 Kit, un test de premiere intention utilisant le transsudat mucosal oral. Une trousse de Western Blot est en cours d'enregistrement. L'exemple am6ricain permettra de juger sur un large 6chantillonnage la fiabilit6 des tests sur salive.

sont s~crEtds par les lymphocytes B qui se trouvent dans les muqueuses du tractus urogdnital. D'apr~s Urnovitz, 6tant donn6 le mode de transmission majoritairement sexuel du VIH, il semblerait que la r6ponse humorale a u VIH soit restreinte, pour certains sujets, aux muqueuses urogEnitales (56). D' autres ~tudes corr61ant cette hypoth~se ne sont pas disponines. Dans leur article publi6 en 1996, Schopper et Vercauteren ont 6galement r~capitul~ les ~tudes comparant les performances de divers tests sur des pr~l~vements sanguins et d'urine (36). Les sensibilit6s varient de 70 % ~t 100 % et Ies sp6cificit6s de 88 % ~t 100 %. En concordance avec les donn6es sur la salive, les performances des tests travaillant en capture d'IgG sont sup~rieures h celles des tests traditionnels. Par rapport aux autres prE16vements le nombre de faux-positifs est relativement Elev~. Chez les patients ayant des maladies urogdnitales ou auto-immunes, les diabdtiques, les femmes enceintes et les toxicomanes les tests urinaires ne sont pas fiables. En effet, certains mEtabolites inhabituels presents dans l'6chantillon interf~rent avec le dosage immuno-enzymatique. La f i ~ e am6ricaine Calypte a d6velopp6 un test ELISA sp~cifique pour l'urine, qui vise ~t diminuer ces rdactions croise~es. Le fabricant annonce des pert'ormances presque dquivalentes ~ celles des tests traditionnels mais une 6valuation de ce r6actif r6alis6 par une Equipe indEpendante n'est pas encore pub liEe. Pour le moment, les tests sur urine ne sont pas suffisamment fiabtes, ce qui rend impossible leur utilisation en routine.

9 L'urine

L'obtention d'Echantillons d'urine est tout aussi simple que la collecte de salive et d' autres m'guments favorisent aussi l'utilisation de l'urine pour Ia detection des anticorps anti-VIH. En premier lieu, les anticorps sont tr~s stables dans ce milieu : 55 jours ~t temp6rature ambiante et environ 1 an ~t 2-8~ (54). Le risque de contamination est probablement nul, parce que la presence de virus Iibre dans l'urine n'a jamais did dEcrite jusqu'~ prdsent. Or, la salive peut contenir, chez certains sujets, une faible quantit6 de virions infectieux (55). Cependant, 1'int6ret principal du diagnostic sur urine vient du fait que des anticorps anti-VIH pourraient y ~tre d6tectEs alors que le sujet est sdronEgatif d'apr~s les tests e ffectuds sur sdrum ou plasma (56). Les anticorps prdsents dans l'urine

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Le test VIH h domicile L' utilisation des pr~l~vements non-invasifs et facile d' obtention pour la d6tection des anticorps anti-ViH, ainsi que l'apparition de tests rapides et simples ~ effectuer permettent d'envisager le passage vers une ~,re nouvelle dans le diagnostic du VIH : le test ~ domicile. D'aprgs les donn6es du Centers for Disease Control (CDC) amErieain, environ un tiers des personnes infectEes par le VIH ne font un test de d6pistage qu'apr~s diagnostic clinique du SIDA (57). Les enqu~tes menEes auprSs des populations ?arisque et des populations h faible prevalence, ont mis en 6vidence un int6r8t certain, voire une demande, pour le test ~t domicile (57-59). En effet, le terme test 'a domicile englobe deux approches de d6pistage bien distinctes. La premi6re correspond aux tests pour lesquels seulement l'obtention du prdl~vement se fair ~t domicile. En mai 1996, la Food and Drug Administration am6ricaine a donnO, son accord pour la commercialisation du premier r~actif de c~ type. Depuis, le test Confide de Direct Access Diagnostics est vendu aux Etats-Unis darts les pharmacies et pea" t~lSphone. Du sang p6riphdl'ique est recueilli par piqfire au niveau du doigt, dEposE sur un support en papier absorbant et sEchS. Cet 8chantillon, muni d'un num&o d'identification, est ensuite envoy8 par courrier ~ un laboratoire central qui r6alise 1' analyse. Le rdsultat peut ~tre appris 4 ~ 7 jours apr~s pea" t61~phone (36). Deux autres r6actifs bas6s sur le m~me principe sont disponibles sur le march~ am~ricain. La seconde approche correspond aux tests ~ domicile proprement dits, qui s'effectuent sans recours ~ un Iaboratoire ou ~ une tierce personne (57, 59). Ces derniers

s'effectuent sur sang pdriphdrique, salive ou urine avec un rendu imm6diat du rdsultat. Parmi les tests rapides d6jgt utilis6s pro"les laboratoires, certains peuvent servir comme test domicile : SUDS HIV-1 de Murex et SalivaCard de Trinity Biotech (36). Pour le moment, ces r6actifs ne sont accessibles que aux laboratoires d'analyse, leur vente au grand public est une 6tape qui n'a pas encore 6t6 franchie. En France et dans la plupa.rt des pays europ6ens, la politique actuelle en mati~re de VIH est un accompagnement de la personne qui effectue le test avec un entretien d'information avant le test et une prise en charge mddicale apr~s le test, si n6cessaire. Donc, pour le moment, Ia commercialisation de tests ~t domicile n'est pas envisag6e. Pour les tests anonymes avec pr61~vements ~ domicile, une 6valuation multicentfique am6ricaine a d~montr6 une sensibilit6 et une sp6cificit6 de 100 % sur le panel test6 (60). Toujours d'apr~s la m~me ~tude, les conseils par t616phone donnEs avant et apr~s Ie test seraient b6nEfiques. Bien entendu, ces conseils indirects ne peuvent pas remplacer Ia relation rn6decin-malade, mais les

tests anonymes permettraient de toucher une population qui veut 6viter cette confrontation directe. En ce qui concerne les tests 5. domicile proprement dits, il est tr~s difficile de pr6voir I'impact qu'ils peuvent avoir sur les comportements et l'6piddmie. Mais plusieurs pays, et plus pm'ticuli~rement ceux en vole de d6veloppement, 6valuent cette alternative. Depuis l'6mergence du SIDA, Ies efforts constants des autorit6s de sant6 publique et des fabricants de r6actifs ont permis de r6duire consid6rablement les risques de transmission du VIH par transfusion ou greffe et d'6tablir une surveillance 6pid6miologique. Les am61iorations successives apport6es, en particulier l'utilisation des antig~nes synth6tiques, de I'ELISA sandwich et des nouvelles techniques de d6tection rapide des anticorps, ont 6galement 6t6 appliqu6es 5. la ddtection s6rologique d'autres virus. Pour les virus des hdpatites, et surtout pour le virus de l'h6patite C, l'dvolution des r6actifs de d6tection s'est directement calqude sur celle de VIH. Les progr~s r6alisds en matiSre de d6pistage du VIH sont aujourd'hui l'exemple 5_ suivre pour ana61iorer Ie diagnostic s6rologique d'autres maladies infectieuses.

SUMMARY

EVOLUTION OF HIV ANTIBODY TESTING

The HIV screening ELISA detects anti-HIV 1 and anti-HIV2 antibodies in blood samples. This is the most commonly used method tbr the detection of infection in blood donors or individuals at risk. Thanks to progress in technology, recombinm~t or synthetic peptide based antigens were incorporated in these assays to address specificity problems. The sensitivity was improved by the ability to detect all immunoglobulin classes. The high genetic variability of HIV and especially that of the group O is another problem to be dealt with. New kinds of high sensitivity ELISA can detect antibodies in non-blood samples such as saliva or urine. Simple, rapid, non-insta'un'tental HIV tests m'e used in addition to ELISA. These simple assays, combined with non-invasive sample collection have made HIV home tests possible. Key-words: Anti-HIV antibodies- ELISA-- Saliva testing- Urine testing- HIV home test. REFERENCES NICOT T., ROGEZ S., DENIS F:- Application en virologic humaine des diffiSrentes techniques de biologic mol6culaire (hybridation, amplification g6nique). Spectra Biol. 1995; 95/6 : 33-51. 2, WORLD HEALTH ORGANIZATION.- JNnt United Nations programme on HIV/AIDS (UNAIDS). WHO revised recommendations for the selection and use of HIV antibody tests. Wkly Epidemiol Rec. 1997 : 72. SARNGADHARAN M.G., POPOVIC M., BRUCH L., SCHUPBACH J., '3ALLO R.C, - Antibodies reactive with human T-lymphotropic retroviuses (HTLV-III) in the serum of patients with AIDS. Science. 1984; 24 : 506-8. VEISS S.H., GOEDERT J.J., SARNGADHARAN M.G., BODNER A,J., 3ALLO R.C., BLATTNER W.A. - Screening test for HTLV-III (AIDS agent) antibodies. Specificity, sensitivity, and applications. JAMA. 1985; 253221-5. DENIS F., LEONARD G,, MOUNIER M., SANGARE A., GERSHYDAMET G,, REY G.L., BARIN F.- Efficacy of five enzyme immunoassays for antibody to HIV in detecting antibody to HTLV-IV. Lancet. 1987; 1:324-5. 6, CONSTANTINE N.T., CALLAHAN J.D., WATTS D.M.- Time for HIV- I/HIV-2 combination tests ? J Virol Methods. 1989; 26 : 219-21, 7. GNANN J.W. Jr, McCORMICK J.B., MITCHELL S,, NELSON J.A., OLDSTONE M.B. - Synthetic peptide Lrnmunoassay distinguishes HIV type 1 and HIV type 2 infections, Science. 1987; 237 : I346-9. 8, COUROUCE A.M.- Trousses de d6pistage des anticorps anti-VIH et les difficult~s de la sdrologie. Groupe de travail "'R~trovirus" de la Soci~t~ Fran~aise de Transfusion Sanguine. Transfus Clin Biol. 1994;1: 387-95. 9. COUROUCE A.M. - Rd6valuation de la sensibilit6 des trousses de d6pisrage des anticorps anti-HIV. Groupe de travail "'R6trovirus" de la Soci6te~ Fran~aise de Transfusion Sanguine. Transfus Clin Biol. 1995; 2 : 395-408. I0. YOSHIDA T., MATSUI T., KOBAYASHI S., YAMAMOTO N. - EvaI.

503

11.

12. 13.

I4.

15. 16. 17.

18.

19.

Iuation of passive particle agglutination test for antibody to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol, 1987; 25 : 1433-7. VERCAUTEREN G., BEELAERT G., VAN DER GROEN G. - Evaluation of an agglutination HIV-I + 2 antibody assay. J ViroI Methods. 1995; 51 : 1-8. CONSTANTINE N.T.- Serologic tests for the retroviruses: approaching 11decade of evolution. AIDS. 1993; 7 : 1-13. BURGESS-CASSLER A., BARRIGA ANGULO G., WADE S.E., CASTILLO TORRES P., SCHRAMM W. - A field test for the detection of antibodies to human immunodeficiency virus types 1 and 2 in serum or plasma. Clin Diagn Lab Immunol. 1996; 3 : 480-2. STETLER H.C., GRANADE T.C., NUNEZ C.A., MEZA R., TERRELL S., AMADOR L., GEORGE J.R.- Field evaluation of rapid HIV serologic tests for screening and confirming HIV-I infection in Honduras. AIDS. t997;11:369-75. CAPOLAGHI B., CAZAUBIEL M., YVERT J.P., TRUCHAUD A, Syst~mes int6grds ell immunoanalyse. Spectra Biol. 1994; 94/4 : 55-63. MORTIMER P.P.- Antibody tests: progress and pitfalls. Clin Diagn Virol. 1996; 5 : 1 3 I - 6 . CHATTOPADHYA D., AGGARWAL R.K., KUMARI S.- Profile of antigen-specific antibody response detectable by western blot in relation to diagnostic criteria for human immunodeficiency virus type-I (HIV-I) infection. Clin Diagn Virol. 1996; 7 : 35-42. FRANSEN K., POLLET D.E., PEETERS M., VAN KERCKHOVEN I., BEELAERT G., VERCAuTEREN G., PIOT P., VAN DER GROEN G.Evaluation of a line imlnunoassay for simultaneous confirmation of antibodies to HIV-I and HIV-2. Eur J Clin Microbio[ Infect Dis. I991; 10 : 939-46. KLINE R.L., McNAIRN D., HOLODNIY M,, MOLE L., MARGOLIS D., BLATTNER W., QUINN T.C.- Evaluation of Chiron HIV-I/HIV-2

recombinant immunoblot assay. J Clin Microbiol. 1996; 34 : 2650-3, 20. ZAAIJER H.L., VAN RIXEL T., VAN EXEL-OEHLERS P., CUYPERS H.T., LELIE P.N. - New anti-human immunode[~ciency virus immunoblot assays resolve nonspecific westenl blot results. Transfusion. 1997; 37 : 193-8. 21. COUROUCE A.M. - Srl'opositivit6 VIH dans los dons do sang : prrvalence, risque rrsiduel et 6pidrmiologie. Groupe de travail "Rrtrovirus" de la Soci6t~ Franqaise de Transfusion Sanguine. Transfus Clin Biol. 1995; 2: 357-63. 22. NORTH M.L, COUROUCE A . M . - Bilan de 32 ranis de contr61e continu des trousses de drpistage des anticorps anti-VIH, anticolps anti-HTLV et antigrne HBs les plus utilisdes en biologie t,'ansfusiolmelle. Groupes de travail "R6trovirus" et "Hdpatites virales" de la Socidt6 Franqaiso de Transfusion Sanguine. Transfus Clin Biol. 1997; 4 : 185-201. 23. KUUN E., BRASHAW M., HEYNS A.D. - Sensitivity and specificity of standard alad rapid HIV-antibody tests evaluated by seroconversion and non-seroconversinn low-titre panels. Vox Sang. 1997; 72 : 11-5. 24. CONSTANTINE N.T., VAN DER GROEN G., BELSEY E.M., TAMASHIRO H. - Sensitivity of HIV-antibody assays determined by seroconversion panels, AIDS, 1994; 8 : 1715-2I). 25. PETERSEN L.R,, SATTEN G.A., DODD R., BUSCH M., KLEINMAN S.H.. GRINDON A., LENES B. - Durvtion of time from onset of human immunodeficiency virus type I infectiousness to development of detectable antibody. The HIV Seroconversion Study Group. Transfusion. 1994: 34 : 283-9. 26. PARRY J.V., CONNELL J.A., REINBOTT P., GARCIA A.B., AVILLEZ F., MORTIMER P.P. - GACPAT HIV 1 + 2: a simple, inexpensive assay to screen for, and discl'iminate between, anti-HIV 1 and anti-HIV 2. J Med Virol. 1995; 45 : lO-6. 27. OZANNE G., FAUVEL M, - Perl5rmance and reliability of five commercial enzyme-linked inmmnosorbent assay kits in screening lbr antihuman immunodeficieney virus antibody in high-risk subjects. J Clin Microbiol. 1988; 26 : 1496-5II0. 28. DOPEL S.H,, SCHUBERT U., GP,UNOW R., PAS P., RONSPECK W., PAULI G., PORSTMANN T. - Comparison of four anti-HIV screening assays which belong to different test generations. Eur J Clin Chem Clia Biochem. I991; 29 : 331-7. 29. WINDHEUSER M,G., WOOD C. - Characterization of imnmnoreactive epitopes of the HIV-I p41 envelope protein using fusion proteins synthesized in Escherichia coll. Gone. 1988; 64 : It17-19, 30. KIENY M,P,, RAUTMANN G., SCI-[MITT D., DOTT K., WAIN-HOBSON S., ALIZON M,, GIRARD M., CHAMARET S., LAURENT A., MONTAGNIER L., LECOCQ J.P. - AIDS virus env protein expressed from a recombinant vaccinia virus. Biotechnology, 1986; 4 : 790-5. 31. JOHNSON I.E. - Detection of human immunodeficiency virus type I antibody by using commercially available whole-cell viral lysate, synthetic peptide, and recombinant protein enzyme immunoassay systems. J Clin Microbiol. 1992; 30 : 216-8. 32. RACE E.M,, RAMSEY K.M., LUCIA H.L., CLOYD M.W. - Human immunodeficiency virus infection elicits early antibody not detected by standard tests: implications for diagnostics and viral immunology. Virology. 1991; 184 : 716-22. 33. NEURATH A.R, - B cell antigenic site mapping nf HIV-1 glycoproteins. In E. No~Tby, "lmmunechemistry of AIDS". Basel, Krager, 1993 : 34-60. 34. ZAAIJER H.L., VAN EXEL-OEHLERS P., KRAAIJEVELD T., ALTENA E., LELIE P.N. - Early detection of antibodies to HIV-I by third-generation assays. Lancet, 1992; 340 : 770-2. 35, GURTLER L. - Difficulties and strategies of HIV diagnosis. Lancet, 1996; 348 : 176-9. 36, SCHOPPER D., VERCAUTEREN G. - Testing I'r HIV at home: what are the issues ? AIDS. 1996; 10 : 1455-65. 37. CHARNEAU P., BORMAN A.M., QUILLENT C,, GUETARD D., CHAMARET S., COHEN J., REMY G., MONTAGNIER L., CLAVEL F. - Isolation and envelope sequence ot'a highly divergent HIV-1 isotate: defirdtion of a new HIV- 1 group. Virology, 1994; 205 : 247-53, 38. JANSSENS W., BUVE A., NKENGASONG J.N. - The puzzle of HIV-1 subtypes in Africa. AIDS. 1997; 11 : 705-12. 39. MYERS G,, KORBER B., FOI,EY B., JEANG K.T., MELLORS J.W., WAIN-HOBSON S. - Human Retroviruses and AIDS 1996. A compihtion and analysis of nucleic acid and amino acid sequences. Theoretical

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46. 47.

48.

49.

50.

51.

52. 53.

54.

55.

56.

57. 58, 59. 6(1.

4,

504

Biology and Biophysics Group, Los Alamos Natinnal Laboratory, Los Alamos, I996. McALPINE L., PARRY J.V., SHANSON D., MORTIMER P,P. - False negative results in enzyme linked immunosorbent assays using synthetic HIV antigens. J Clin P,.thol. 1995; 48 : 490-3. APETREI C, LOUSSERT-AJAKA I., DESCAMPS D., DAMOND F., SARAGOSTI S., BRUN-VEZINET F., SIMON F. - Lack of screening test sensitivity during HIV-1 non-subtype B seroconversions. AIDS. 1996; 10 : F57-60. SIMON F., LOUSSERT-AJAKA I., DAMOND F., SARAGOSTI S., BARIN F., BRUN-VEZINET F. - HIV type 1 diversity in northern Paris, France. AIDS Res Hum Retroviruses. 1996; 12 : 1427-33. BRODINE S.K., MASCOLA J.R., WEISS P.J., ITO S.I., PORTER K.R., ARTENSTEIN A.W,, GARLAND F.C., McCUTCHAN F.E., BURKE D.S. - Detection of diverse HIV-1 genetic subtypes in the USA. Lancet. 1995, 346:1198-9, LOUSSERT-AJAKA I., LY T.D., CHAIX M.L,, INGRAND D., SARAGOSTI S,, COUROUCE A.M., BRUN-VEZINET P., SIMON F. - HIVI/HIV-2 seronegativity in HIV-1 subtype O infected patients. Lancet. 1994; 343 : 1393-4. SIMON F., LY T.D., BAILLOU-BEAUFILS A., FAUVEAU V., DE SAINT-MARTIN J., LOUSSERT-AJAKA I., CHAIX M.L., SARAGOSTI S., COUROUCE A.M., INGRAND L, JANOT C., BRUN-VEZINET F. - Sensitivity of screening kits for anti-HIV-I subtype O antibodies. AIDS. 1994; 8 : 1628-9. LY T.D., SARAGOSTI S., SIMON F. - VIH-I groupe O, Spectra Biol. 1995; 95/6 : 28-32, MOUILLOT L., COUROUCE A.M., SIMON F., MAUCLERE P., MAISONNEUVE P., J A N O T C. - R66valuation de la sensibilit~ de r~actifs de ddpistage des amicorps anti-VIH vis-i>vis du sous-type O. Spectra Biol, 1996:15 : 47-9. COHEN J.H,, GUETARD D., PHILBERT F., CHAMARET S,, TABARY T., D E L E Y S R., M O N T A G N I E R L . - Atypical HIV serological profile of novel HIV-I variant distinct l'rom subtype O. Lancet. 1995; 345 : 856, MEYOHAS M , C , MORAND-JOUBERT L., VAN DE WIEL P., MARIOTTI M., LEFRERE J.J. - Time to HIV serocoaversion after needlestick injury. Lancet. 1995; 345 : 1634-5. CONNELL J.A., PARRY J.V., MORTIMER P.P., DUNCAN J. - Novel assay for the detection of immunoglobnlin G antihuman immunodeficiency virus in untreated saliva and urine. J Meal Virol. 1993; 41 : 159-64. GALLO D., GEORGE J.R., FITCHEN J.H., GOLDSTEIN A.S., HINDAHL M . S . - Evaluation of a system using oral mucosal transudate for HIV-I antibody screening and confirmatory testing. JAMA. 1997; 277 : 254-8. FRERICHS R.R. - Accuracy of a saliva test for HIV antibody. J Acquir Immune Defie Syndr. 1995; 10 : 484-5. SAVILLE R.D., CONSTANTINE N.T., HOLM-HANSEN C., WISNOM C,, DEPAOLA L., FALKLER W,A,Jr. - Evaluation of two novel immunoassays designed to detect HIV antibodies in oral fluids. J Clin Lab Anal. 1997; 11 : 63-8. URNOVITZ H.B,, MURPHY W.H., GOTTFRIED T.D., FRIEDMANKIEN A.E. - Urine-based diagnostic technologies. Trends Biotechnol. 1996; 14 : 361-4. PHILLIPS J., Q U R E S H I N., B A R R C., H E N R A R D D . R . - Low level o f cell-free virus detected at high frequency in saliva from HW-l-infected individuals. AIDS. 1994; 8 : 1011-2. URNOVITZ H.B., CLERIC[ M., SHEARER G.M., GOTTFRIED T.D., ROBINSON D.J., LUTWICK L.L, MONTAGNIER L., LANDERS D.V. - HIV-I antibody serum negativity with urine positivity. Lancet. 1993; 342 : 1458-9, BAYER R., STRYKER J,, SMITH M.D. - Testing for HIV infection at home. N Engl J Med. 1995; 332 : 1296-9. MERSON M.H., FELDMAN E.A,, BAYER R,, STRYKER J. - Rapid self testing for HIV infection. Lancet. 1997:349 : 352-3. PHILLIPS K.A., FLATT S.J., MORRISON K , R , COATES T.J. - Potential use of home H1V testing. N Engl J Med. 1995; 332 : 1308-10. FRANK A.P., WANDELL M.G., READINGS M.D,, CONANT M.A., WOODY G E., MICHEL C. - Anonymous HIV testing using home collection and telemedicine counseling. A multicenter ew~luation. Arch Intern Med. 1997; 157 : 309-14.