- Email: [email protected]
Evolution des thymidine et thymidylate kinases au cours du cycle cellulaire dans les cellules KB
Brkves communications
BIOCHIMIE, 1976, 58, t135-113'9.
Evolution des thymidine et thymidylate kinases au cours du cycle cellulaire dans les cellules KB. Influence du mode de synchronisation sur l'activit6 (*). T. OOKA. D~parlement de Biologie gdndrale el appliqude, Unioersit~ Claude Bernard Lyon-I, It3, Boulevard du 11 Novembre 1918, 69621 Villeurbanne --- 1,'rance. (12-3-1976). INTRODUCTION. P o u r les d t u d e s q u i d e m a n d e n t de g r a n d e s q u a n t i t g s de c e l l u l e s s y n c h r o n e s , o n u t i l i s e c o n r a m m e n t d e s m 6 t h o d e s de s y n c h r o n i s a t i o n f o n d g e s s u r le b l o e a g e d e s c e l l u l e s , e n d g b u t de p h a s e S, p a r d e s i n h i b i t e u r s de l a s y n t h 6 s e d u DNA t e l s q u e la t h y m i d i n e [1] la 5 - f l u o r o d e o x y u r i d i n e [2], l ' a m g t h o p t 6 r i n e [3] o u l ' h y d r o x y u r g e [4]. T o u t e f o i s , o n a p n d g m o n t r e r q n e ces p r o d u i t s p r o v o q u e n t d e s a l t 6 r a t i o n s de la r~plic a t i o n d e s DNAs c e l l n l a i r e s [5, fi, 7] et e n r a i s o n de leur mode d'action, nous nons sommes demand6 s'ils n ' e n t r a i n e n t p a s a u s s i d e s m o d i f i c a t i o n s de l ' g v o l u t i o n , a n c o n r s d u cycle c e l l u l a i r e , de l ' a c t i v i t g d e s e n z y m e s impliqu6es dans la biosynth6se des d~oxynucl6otides t r i p h o s p h a t e s , le d T T P e n p a r t i c u l i e r . B i e n q u e de n o m b r e u x t r a v a u x a i e n t 6t5 effectu6s s u r ]es v a r i a t i o n s d ' a c t i v i t 6 d e s t h y m i d i n e et t h y m i d y l a t e k i n a s e s p e n d a n t le cycle c e l l u l a i r e [8, 9, 10], a u c u n d ' e n t r e e u x n e p r e n d r g e l l e m e n t en c o m p t e l ' i n f l u e n c e p o s s i b l e de l ' i n h i b i t e u r u t i l i s 6 c o m m e a g e n t de s y n c h r o n i s a t i o n , pnisque m~me lorsqu'elle est suspeetde (par exemple L i t t l e f i e l d [9]), les r 6 s u l t a t s o b t e n u s n ' o n t p a s ~t6 c o m p a r 6 s avec d e s d o n n 6 e s r e c u e i l l i e s p a r a l l 6 1 e m e n t sur des cellules synchronis~es naturellement. E n r a i s o n de cette l a c u n e , n o u s a v o n s d~cid6 d ' e x a m i n e r eette q u e s t i o n c a r n o u s e m p I o y o n s f r ~ q u e m m e n t [11, 13] la t h y m i d i n e c o m m e a g e n t de s y n c h r o n i s a t i o n . I1 a 6t6 c o n s t a t 6 q u ' e l l e e s t s a n s effet n o t a b l e s u r l ' a c t i v i t 6 d e s D N A p o l y m 6 r a s e s [1:3]. Le p r 6 s e n t a r t i c l e e s t c o n s a c r 6 h la t h y m i d i n e k i n a s e et a u x t h y m i d y l a t e k i n a s e s . L ' a c t i v i t 6 de ces e n z y m e s a 6t6 m e s u r 6 e d a n s des c u l t u r e s s y n c h r o n i s 6 e s s o i t p a r l a t h y m i d i n e , s o i t p a r u n e m 6 t h o d e de s61ection des c e l l u l e s e n p o s t - m i t o s e . Nos r ~ s u l t a t s r6v61ent q u e si le b l o cage p a r la t h y m i d i n e n ' e n t r a i n e p a s de m o d i f i c a t i o n s e n s i b l e d e s v a r i a t i o n s e n f o n c t i o n d u cycle de l ' a c t i vit6 d e s e n z y m e s ~tudi~es, e n r e v a n c h e , il d 6 t e r m i n e u n n i v e a u d ' a c t i v i t 6 n e t t e m e n t p l u s 61ev6 p o u r l e s d e u x e n z y m e s darts les c e l l u l e s a y a n t 6t6 e n c o n t a c t a v e c la t h y m i d i n e : celles-ci o u t , e n effet, des a c t i v i t d s 5 h 8 f o i s ( s e l o n les p h a s e s d u cycle) p l u s ~lev6es q u e les cellules synchronis~es sans utilisation du nucl6otide. MATERIEL ET TECHNIQUES.
I. Cultures de cellules. L e s c e l l u l e s KB s o n t e u l t i v 6 e s s o i t e n s u s p e n s i o n , soit e n f l a c o n s de R o u x d a n s le m i l i e u M.E.M. m o d i f i 6 Abr6viations : TMD T h y m i d i n e m o n o p h o s p h a t e . TDP Thymidine diphosphate. TTP Thymidine triphosphate. (*) Ce t r a v a i l a (~t~ r~alis6 '~ l ' U n i t 6 de V i r o l o g i e , I.N.S.E.R.M. ( L y o n ) .
p a r J o k l i k c o n t e n a n t 5 p. 100 de s g r u m de c h e v a l , darts des c o n d i t i o n s d 6 j h d g e r i t e s [12]. II. Synchronisalion. D e u x t e c h n i q u e s de s y n c h r o n i s a t i o n e x p o s S e s a i l l e u r s [12, 13, 14] o u t ~t6 u t i l i s g e s . D a n s le c a s d u b l o c a g e p a r l a t h y m i d i n e [13] l o r s q u e le n u c l g o t i d e e s t r e t i r 6 d u m i l i e u , les c e l l u l e s e n t r e n t e n p h a s e S (fig. 2B). Celle-ci d u r e e n v i r o n 6 h e u r e s ; l e s m i t o s e s c o m m e n c e n t h la 7e h e u r e et se t e r m i n e n t h la 10 e : la p h a s e GI p r e n d p l a c e e n s u i t e . L o r s q u ' o n op6re p a r s61ection d e s c e l l u l e s e n p o s t - m i t o s e , ceIles-ci s o n t collectSes e n d d b u t de p h a s e G1 [12, 14]. La p h a s e S s ' g t e n d de la 6 ~ h Ia 17 ~ h e u r e et les m i t o s e s se p r o d u i s e n t de 13 ~t 23 h e u r e s (fig. 2A). L a s y n c h r o n i s a t i o n e s t a i n s i m o i n s b o n n e q u e p a r l ' e m p l o i de la t h y m i d i n e , m a i s elle e s t c e p e n d a n t u t i l i s a b l e [13]. III. Prdparation de l'extrait cytoplasmique. L ' a c t i v i t 6 d e s t h y m i d i n e et t h y m i d y l a t e k i n a s e s n ' a 6t6 m e s u r ~ e q u e d a n s l ' e x t r a i t c y t o p l a s m i q u e c a r il n ' a p a s ~tg ddteci5 d ' a c t i v i t 6 m e s u r a b l e d a n s l e s p r e p a r a t i o n s n u c l 6 a i r e s , e n a c c o r d avee les a u t r e s t r a v a u x [15, 116] h l ' e x c e p t i o n de c e l u i d ' A d a m s [17]. L ' e x t r a i t c y t o p l a s m i q u e e s t p r 6 p a r 6 e o m m e d~crit p r 6 c 6 d e m m e n t [13]. A p r 6 s 6 1 i m i n a t i o n d e s n o y a u x , la f r a c t i o n c y t o p l a s m i q u e s o l u b l e d a n s le t a m p o n T K M B [0,25 M - s a c c h a r o s e , 10 mM-KC1, 1 m M MgCI:, 1 m M ~ - M e r c a p t o 6 t h a n o l et 50 m M Tris-HC1 (pH 7,5)] e s t r e c u e i l l i e a p r 6 s u n e c e n t r i f u g a t i o n h 105.000 g p e n d a n t 60 m n . IV. Mesure de l'acliuit~ des enzymes. On dvalue l'activit~ en thymidine kinase des extraits p a r la q u a n t i t ~ de T M P f o r m d h p a r t i r de t h y m i d i n e et, p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e , p a r la q u a n t i t d de T D P et T T P f o r m , s h p a r t i r de TMP. I1 f a u t n o t e r que, d a n s n o s e s s a i s , c o m m e d ~ m o n t r 6 p a r a i l l e u r s [18, 19], la q u a n t i t 6 de d T D P e s t t o u j o u r s n 6 g l i g e a b l e e n r a i s o n de la p r e s e n c e e n e x e c s de l ' a c t i v i t ~ de T D P k i n a s e [20, 21J. N o u s a v o n s p u d i s t i n g u e r ces d e u x a c t i v i t ~ s g r a c e a u f a i t q u e ces r 6 a c t i o n s o u t d e s o p t i m a e n Mg2+ tr6s d i f f 6 r e n t e s : 1 m M p o u r l a t h y m i d i n e k i n a s e c o n t r e 20 m M p o u r la t h y m i d y l a t e k i n a s e (fig. 1), ce q u i a d6jh dt~ o b s e r v ~ p a r d ' a u t r e s a u t e u r s [22, 23, 24]. Le m 6 l a n g e r ~ a c t i o n n e l e o m p r e n d , d a n s u n v o l u m e final de 250 i~l : 50 .~1 d ' e x t r a i t c y t o p l a s m i q n e ; 25 u m o l e s de Tris-HC1 (pH 8,0 p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e et p H 7,5 p o u r l a t h y m i d y l a t e k i n a s e ) ; 2,5 ~xmoles d ' A T P ; 3 ~ m o l e s de p h o s p h o g l y c ~ r a t e de p o t a s s i u m ; 0,25 ~ m o l e s o u 5 u m o l e s de MgC12 ; 1,25 n m o l e s de t h y m i d i n e (soit 0,5 :~Ci de t h y m i d i n e ZH, A m e r s h a m ) p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e o u 0,625 n m o l e s de t h y m i d i n e m o n o p h o s p h a t e (soit 2,5 ~Ci de TMPZH, A m e r s h a m ) p o u r la t h y m i d y l a t e k i n a s e . A p r 6 s I5 r a i n d ' i n c u b a t i o n h 37°C, la r 6 a c t i o n e s t a r r ~ t 6 e p a r c h a u f f a g e au bain-marie bouillant pendant 2 mn.
T. Ooka.
1136
N ' a y a n t p a s d i a l y s 6 les e x t r a i t s o b t e n u s e n r a i s o n de la g r a n d e f r a g i l i t $ de l a t h y m i d y l a t e ,kinase, n o u s a v o n s proedd6, afin de t e n i r c o m p t e , 6 v e n t u e l l e m e n t
14-
A
TABLEAU I. v
E u
Activitds thymidine kinasiques mesurdes en pr& sence de mdlanges d'extraits prdpards dt des phases diffdrentes du cycle cellulaire dans les cellules KB synchronis~eS sdlection de post-mitose [A] ou par la thymidine (~ff.
g_
[Al TTP TMP
2o.z~o~ i
2
4
3
5
2()
t4-
mM
Les extraits prdlev6s h des m o m e n t s diff6rents du cycle cellulaire (figure 2 A) Phase S-Ge (activit6 maximale)
Phase Gt activit6 minimale
10 ~.1 0 0 0 10 10 10
0 I0 7.1 2O 4O 10 20 40
Phosphorylation obtenue (en cpm) en t5 mn avec les extraits incub6s Valeurs . exp6rimentales
Valeurs attendues
B
.~8-
.} •
c o m m e m a r q u e u r s ) s o n t d 6 p o s d s s u r des f e u i l l e s de p a p i e r de D E A E - c e l l u l o s e . U n e c h r o m a t o g r a p h i e d e s c e n d a n t e e s t effectude a v e c le s o l v a n t : H C O O H 98-100 p~ 100, 15,83 m l ; N H 4 O H 25 p. 100, 0,7'5 m l ; e a u d i s till6e, v o l u m e cornpldt6 h 100 m l . L a r a d i o a c t i v i t 6 li6e a u x diffdren~s n u c l 6 o t i d e s t h y m i d i l i q u e s a i n s i s 6 p a r 6 s
P
741 I
205 536 851 991 1347 1589
946 1277 1592
.
[B] Les extraits pr61ev~s h des m o m e n t s diff6rents du cycle cellulaire (figure 2 B)
2-
~,g 10 1'5 2o 2'5
[MgC,,I
40
5'0mM
FIG. 1. - - Influence de la concentration en MgCI~ sur l'actioitd de la thymidine ]cinase (A) et des t h y m i d g late ~kinases (B). Les a c t i v i t 6 s s o n t e x p r i m 6 e s e n c.p.m, de t h y m i d i n e [3HI o u de T M P - [ 3 H ] p h o s p h o r y l d s p a r 200 × 103 c e l l u l e s p e n d a n t 15 m i n d ' i n c u b a t i o n h 37°C (of. M a t e r i e l et T e c h n i q u e s ) .
des v a r i a t i o n s des p o o l s n u e l 6 o t i d i q u e s , h d e s m e s u r e s d ' a c t i v i t 6 darts d e s m 6 1 a n g e s d ' e x t r a i t s p r o v e n a n t d e s c e l l u l e s p r d l e v 6 e s h d i f f d r e n t s m o m e n t s d u cycle. C o m m e le m o n t r e le t a b l e a u I, o n o b t i e n t t o u j o u r s d e s v a l e u r s a d d i t i v e s , ce q u i i m p l i q u e q u e les q u a n t i t 6 s 6 v e n t u e l l e m e n t v a r i a b l e s de n n c l S o t i d e s f r o i d s p r e s e n t s n ' a f f e c t e n t p a s s e n s i b l e m e n t les v a l e u r s m e s u r ~ e s . D a n s le c a s de l ' a c t i v i t 6 t h y m i d i n e k i n a s e , d e s a l l q u o t e s de 50 ~1 de l ' i n c u b a t s o n t d i r e c t e m e n t d~pos$es s u r d i s q u e s de p a p i s t DEAE-81 q u i s o u r i m m d d i a t e m e n t i m m e r g 6 s da:ns u n e s o l u t i o n de f o r m i a t e d ' a m m o n i u m t raM, l a r d s 3 l o i s a v e c . c e t t e s o l u t i o n , et s~ch6s p a r l ' d t h a n o l [25]. L e s n u c l ~ o t i d e s r e t e n u s s u r les d i s q u e s s o n t c o m p t 6 s p a r s c i n t i l l a t i o n l i q u i d e . Darts le c a s de l ' a c t i v i t 6 t h y m i d y l a t e k i n a s e , 30 I~1 d ' i n c u b a t et d i v e r s c o m p o s 6 s t h y m i d i l i q u e s <> ( u t i l i s 6 s
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 9.
D6but S Phase S-G2 (apr6s sup- Phase G1 (activit6 (activit6 pression maximale) de second minimale) blocage) 10 ~1 0 0 0 0 0 0 10 10 10 10 10 10 0 0 0
0 10 ~I 20 40 0 0 0 10 20 40 0 0 0 10 10 10
0 0 0 0 10 20 40 0 0 0 10 20 40 10 20 40
Phosphorylation obteuue (en cpm) en 15 m n avec les extraits incub6s Valeurs exp6rimentMes
Valeurs attendues
2541 916 1850 3765 526 1006 222O 3492 4451 6515 3107 3632 5619 1658 1923 3056
3458 4392 6307 3068 3548 4762 1542 2022 3236
C o n c e n t r a t i o n e n e x t r a i t s : 1@ ~1 c o r r e s p o n d h 140 ,'<, 103 c e l l u l e s p o u r [A] et 61 × 103 c e l l u l e s p o u r [B]. D u r ~ e d ' i n c u b a t i o n : 15 ran. Composition du milieu d'incubation : voir Matdriel et T e c h n i q u e .
1137
Thgmidine et lhgmidylate kinases duns les cellules KB. est mesurge en scintillation liquide apr~s dgcoupage d e s c h r o m a t o g r a m m e s e n b a n d e s de s u r f a c e rSguli~re. RESULTATS. D a n s les d e u x chronis6es l'une (fig. 2 A et B), o n l'activit6 (exprim6
t y p e s de c u l t u r e s , c ' e s t - h - d i r e s y n o u l ' a u t r e d e s m 6 t h o d e s d6crites observe, pour chaque enzyme, que p o u r 106 c e l l u l e s ) 6 v o l u e de f a q o n
ol +°:+
•
:~051
"
oJ
~ 515
+
"5.
o
s i m i l a i r e e n f o n c t i o n d u cycle. M i n i m a l e a u m o m e n t o h c o m m e n c e l ' e x p 6 r i e n c e (G~ o u d ~ h u t de S), elle d e v i e n t m a x i m a l e e n fin de p h a s e S e t m 6 m e e n d d b u t de G~ p o u r a t t e i n d r e u n n i v e a u m i n i m u m a p r ~ s la m i t o s e s . E n o u t r e , si a u x v a l e u r s m i n i m a l e s , les a c t i vit6s d e s e n z y m e s s o n t d u m ~ m e o r d r e , l ' a e t i v i t 6 m e s u r g e a u m a x i m u m p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e e s t 2 f o i s p l u s 61evSe q u e celle q u i e s t e n r e g i s t r ~ e p o u r l a t h y m i d y l a t e k i n a s e ( t a b l e a u II, l i g n e s 1 et 2). E n f i n , l ' a c t i -
/
/
o
°
II .~
io
;5 Heur~s
2b 2'5 3b
B+ -~
.
x~
//
~.~
% . ; ' ~ - ] ~ [ "
/' I
-1 q
2
~
+TdR ~--TdR
6
8
;b
¢2
I ;~
16
Heures
FIe. 2. - - E v o l u t i o n de l'actioitd des t h y m i d i n e et t h y m i d y l a t e kinases au cours du cycle cellulaire. L e s c e l l u l e s s y n c h r o n e s o n t 6t5 p r 6 p a r 6 e s , soit p a r s d l e c t i o n d e s c e l l u l e s e n p o s t - m i t o s e (A), s o i t p a r b l o cage & la t h y m i d i n e (B) (cf Mat6riel et T e c h n i q u e s ) . L ' a c t i v i t 6 t h y m i d i n e k i n a s e (~r . . . . . ~r) c x p r i m ~ e e n n m o l e s de t h y m i d i n e p h o s p h o r y l d e e n d T M P / 15 ran/106 c e l l u l e s et l ' a c t i v i t 6 t h y m i d y l a t e k i n a s e (~r "k) e x p r i m d e e n n m o l e s de d T M P p h o s p h o r y l 6 e n d T T P / 1 5 m n 106 c e l l u l e s o n t dr6 d d t e r m i n 6 e s c o m m e d~crit darts le texte. Le d 6 n o m b r e m e n t de c e l l u l e ((3 ©) e s t effectu6 & l ' a i d e d ' u n <>. L a s y n t h 6 s e d u DNA (@ @) e s t repSr6e p a r m a r q u a g e h la t h y m i d i n e - [ Z H ~ : des a l i q u o t e s de 1 m l s o n t prc~lev6es d a n s les c u l t u r e s a u x t e m p s i n d i q u 6 s , p u i s m a r q u e e s p a r la t h y m i d i n e - m 6 t h y l - [ 3 H ] (2 ~ C i / m l , A m e r s h a m ) p e n d a n t 20 m n & 37°C. L a f r a c t i o n a c i d o - i n s o l u b l e e s t o b t e n u e p a r p r 6 c i p i t a t i o n h l ' a c i d e t r i c h l o r o a c 6 t i q u e (5 p. cent) et la r a d i o a c t i v i t 6 m e s u r ~ e c o m m e d6crit p r 6 c 6 d e m m e n t [12]. TABLEAU II. Activitds k i n a s i q u e s m a x i m a l e s el m i n i m a l e s m e s u r d e s dans des cellules s y n chronis#es, soit par sdlection des cellules p o s f - m i t o f i q u e s (A), soit p a r blocage par la t h y m i d i n e (B). T h y m i d i a e kinase (n moles de TMP form~ l06 cellules)
Techniques Phases
T h y m i d y l a t e kinases (n moles de TTP form6 /106 cellules)
A
B
B/A
A
B
B/A
S-Go (Activit6 m a x i m a l e )
0,610
4,966
8,l
0,299
2,554
8,5
Seconde G+ (Activit4 m i n i m a l e
0,159
0,800
5,0
0,162
1,021
G+ S-G~ (p" c e n t )
(a) 26 p. eent[16 p. cenl
_
6_ , 3
54 p. c e n t 4 0 p. c e n t
(a) P o u r c e n t a g e d ' a e t i v i t 6 k i n a s i q u e t r o u v ~ e d a n s les c e l l u l e s e n s e c o n d e p h a s e G~ p a r r a p p o r t h l ' a c t i v i t 6 m a x i m a l e (en S-G~) e n r e g i s t r 6 e a v a n t la d i v i s i o n cellulaire. BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 9.
T. Ooka.
11 38
vit6 de la t h y m i d y l a t e k i n a s e e s t g l o b a l e m e n t s t a b l e , p u i s q u e , a p r 6 s la m i t o s e , les n o u v e l l e s c e l l u l e s c o n t i e n n e n t 40 h 50 p. c e n t de l ' a c t i v i t ~ m a x i m a l e d u cycle prdc~dent, t a n d i s q u e ces v a l e u r s t o m b e u t h 16 et -96 p. c e n t p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e ( t a b l e a u II, l i g u e 3). Ii n e p a r a i t p a s c e r t a i n q u e les d i f f e r e n c e s n o t 6 e s , e n t r e les d e u x t y p e s d e c u l t u r e , s o i e n t s i g n i f i c a t i v e s , a u s s i p e u t - o n c o n c l u r e que, q u a n t i t a t i v e m e n t , le t r a i t e m e n t p a r la t h y m i d i n e n ' i n t r o d u i t p u s de m o d i f i c a t i o n n o t a b l e . L a d 6 c r o i s s a n c e c o n s i d d r a b l e de l ' a c t i v i t ~ de t h y m i d i n e k i n a s e n ' e s t p a s d u e h la p r 6 s e n c e o u h l ' a b s e n c e d ' i n h i b i t e u r s , s p 6 e i f i q u e s de c e r t a i n e s p h a s e s d u cycle e e l l u l a i r e , c o m m e o n a p u l e v~rifier e n m ~ l a n g e a n t d e s e x t r a i t s p r 6 p a r 6 s e n p h a s e G~ (activit6 m i n i m a l e ) et e n p h a s e S-G~ (aetivit6 m a x i m a l e ) . I1 e s t d o n e v r a i s e m b ] a b l e q u e la d i m i n u t i o n de t h y m i d i n e k i n a s e c o r r e s p o n d e h u n e d ~ g r a d a t i o n de l ' e n z y m e . E n r e v a n c h e , si l ' o n c o n s i d 6 r e les n i v e a u x d ' a c t i v i t ~ , o n c o n s t a t e q u e Ies c e l l u l e s a y a n t 6t6 e n c o n t a c t a v e c la t h y m i d i n e , o n t d e s c a p a c i t ~ s p h o s p h o r y l a t i v e s n e t t e m e n t p l u s ~lev~es q n e les a u t r e s : le t a b l e a u II (lig n e s 1 et 2) n m n t r e , e n effet, q u e l ' a c t i v i t 6 d e s c e l l u l e s s y n c h r o n i s ~ e s p a r la t h y m i d i n e e s t 5 h 8 f o i s p l u s ~lev~e p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e et 6 h 8,5 p o u r la t h y m i d y l a t c k i n a s e , s e l o n q u e l ' o n c o n s i d ~ r e le m i n i m u m et le m a x i m u m d ' a c t i v i t ~ , r e s p e c t i v e m e n t .
DISCUSSION. L ' o b j e c t i f de ee t r a v a i l ~tait de r S p o n d r e h l a q u e s t i o n : l ' e m p l o i d ' i n h i b i t e u r s de l a s y n t h 6 s e d u DNA - e n l ' o c c u r e n c e , la t h y m i d i n e - - c o m m e a g e n t de s y n c h r o n i s a t i o n e n t r a i n e - t - i l des p e r t u r b a t i o n s d a n s l ' a c t i vit6 d e s e n z y m e s i m p l i q u ~ e s d a n s la p r o d u c t i o n d e s d~soxyribonucl6otides triphosphates, en particulier dn d T T P ? P o u r ce f a i r e , n o u s a v o n s e o m p a r ~ l ' d v o l u t i o n d e s a c t i v i t ~ s t h y m i d i n e et t h y m l d y l a t e k i n a s e s d a n s d e s c e l l u l e s KB s y n e h r o n i s d e s , s o i t p a r la t h y m i d i n e , s o i t p a r s d l e c t i o n d e s c e l l n l e s e n p o s t - m i t o s e . L e s r~s u l t a t s o b t e n u s i n d i q u e n t que, e n f o n c t i o n d u cycle e e l l u l a i r e , les a c t i v l t ~ s e x a m i n e e s 6 v o l n e n t de f a g o n s i m i l a i r e m a i s q u e , d a n s les c e l l u l e s t r a i t 6 e s p a r la t h y m i d i n e , c e s a c t i v i t 4 s s o n t 5-8 f o i s p l u s dlcv~es q u e d a n s les c e l l n l e s s y n c h r o n i s ~ e s s a n s h ] o c a g e de la d u p l i c a t i o n d u DNA. Ce d e r u i e r r 6 s u l t a t e s t d d e r i t p o u r l a p r e m i e r e l o i s , m a i s il f a u t n o t e r u n e i n c e r t i t u d e p o s s i b l e de l a s i g n i f i c a t i o n de m e s d o s a g e s c a r l e s n u c l 6 o t i d e s f r o i d s p e u v e n t dtre e n c o n c e n t r a t i o n v~rit a b l e d a n s les e x t r a i t s s e l o n q u e c e u x - e i p r o v i e n n e n t de c e l l u l e s trait&es o u n o n p a r la t h y m i d i n e . A n s s i , Adam,s [~6], a v e c d e s c e l l n l e s L (de s o n r i s ) e n m a j o rlt6 e n p h a s e G~, e o u s t a t e q u e l ' a d d i t i o n de t h y m i d i n e f r o i d e h l a c o n c e n t r a t i o n de 5, raM, p r o v o q u e n t u n e a u g m e n t a t i o n de 12 f o i s , p a r r a p p o r t a n x c u l t u r e s t~m o i n s , de la q u a n t i t ~ de d T T P p r ~ s e n t e darts l e s cell u l e s a p r 6 s l ' a d d i t i o n d u n u c l ~ o s i d e . D u n s ces c o n d i t i o n s , o n p e u t e r a i n d r e q u e les c e l l u l e s KB s y n c h r o n i s d e s p a r la t h y m i d i n e a l e u t u n p o o l de d T T P b i e n s n p 6 r i e u r a u x c e l l u l e s s y n e h r o n i s ~ e s s a n s blocage. C o m m e n t cette d i f f 6 r e n e e p r o b a b l e p e u t - e l l e i n t e r f ~ r e r avee les m e s u r e s d ' a c t i v i t ~ s k i n a s i q u e s in v i t r o ? C o m m e n o u s o b s e r v o n s , s a n s d i a l y s e , u n e activit~ p l u s ~lev~c d a n s les c e l l u l e s t r a i t 6 e s p a r la t h y m i d i n e q u e d a n s les a u t r e s , et q u ' o n s a l t q u ' u n e c o n c e n t r a t i o n 6levee e n d T T P p e u t i n h i b e r l ' a e t i v i t 6 in v i t r o d e s t h y m i d y l a t e s k i n a s e s et s u r t o u t de la t h y m i d i n e k i n a s e [17, 19, 20], n o u s c r o y o n s p o u v o i r a f f i r m e r q u e la synchronisation par la thymidine provoque r~ellement n n e a u g m e n t a t i o n de l ' a e t i v i t ~ ]~inasique, p a r r a p p o r t B I O C H I M I E , 1976, 58, n ° 9.
aux cellules non trait6es, augmentation ~tre m ~ m e s o u s - e s t i m 6 e .
qui est pent-
D ' a i l l e u r s , o n s a l t que, e n s y s t 6 m e a s y n c h r o n e , l ' a d d i t i o n de t h y m i d i n e a u m i l i e u de c u l t u r e d 6 t e r m i n e u n a c c r o i s s e m e n t d ' a c t i v i t 6 de la t h y m i d i n e k i n a s e de l ' o r d r e de 2-3 f o i s [2'7, 28]. E n o u t r e , S t u b b l e f i e l d et M u r p h e e [29], a v e c d e s c e l l u ] e s s y n c h r o n i s ~ e s , c o n s t a t e n t q u e l ' a d d i t i o n de la t h y m i d i n e e n G1 d 6 t e r m i n e u n e a u g m e n t a t i o n de l ' a c t i v i t 6 t h y m i d i n e k i n a s e de l ' o r d r e de 2 fois. L e s a u t e u r s i n t e r p r 6 t e n t cette a u g mentation eomme r6sultant d'un ph6nom6ne d'induet i o n [30] ou de p r o t e c t i o n [31, 32] des e n z y m e s c o n cern6es. I1 e s t p o s s i b l e q n e n o s r 6 s u l t a t s a i e n t la m S m e s i g n i f i c a t i o n , c e p e n d a n t , o n d o l t s o u l i g n e r que, d u n s u o s c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s , l'effet o b s e r v 6 p e r s l s t e l o n g t e m p s a p r 6 s q u e la t h y m i d i n e a i r dt6 s u p p r i m 6 e : a p r S s q u ' e l l e s a i e n t p a r c o u r u les p h a s e s S-C2 et M, l e s c e l l u l e s o n t e n c o r e , d a n s la G1 s u i v a n t e , l a m S m e a c t i vit~ q u ' h la fin d u blocage. Nos r d s u l t a t s s n r l ' ~ v o l u t i o n d e s e n z y m e s e n r e l a t i o n a v e c les p h a s e s d u cycle s o n t e n a c c o r d a v e c les a u t r e s t r a v a n x se r a p p o r t a n t a u m ~ m e s u j e t [8, 9, 10, 33, 34]. I1 e s t h n o t e r t o u t e f o i s q u e s e u l l e t r a v a i l de B r e n t et coll. [33], s u r c e l l u l e s H e L a , e o n s i d ~ r e s i m u l t a n 6 m e n t t h y i n i d i n e et t h y m i d y l a t e k i n a s e s . D a n s t o u s les eas, o n o b s e r v e u n e f o r t e c o r r 6 1 a t i o n e n t r e la s y n t h ~ s e d u DNA et l ' a u g m e n t a t i o n d e s a c t i v i t ~ s e n z y m a t i q u e s , avec ceci de p a r t i c u l i e r q n e le m a x i m u m de p h o s p h o r y l a t i o n e s t a t t e i n t e n fin de S d 6 b u t de G.,. Ce d6calage e s t a u s s i o b s e r v 6 p o u r d ' a u t r e s e n z y m e s e o m m e l a t h y m i d y l a t e s y n t h 6 t a s e ['35] et l a d C M P d 6 a m i n a s e [:34, 316] q u i p a r t i c i p e n t h la p r o d u c t i o n des n u c l ~ o t i d e s t h y m i d y l i q u e s . Ces f a i t s c o n d u i s e n t h s o u l i g n e r q u e la c o o r d i n a t i o n e n t r e d u p l i c a t i o n d u DNA et p r o d u c t i o n d e s d ~ s o x y n u c l 6 o t i d e s e s t a s s e z l ~ e h e e o m m e l ' i n d i q u e n t les t r a v a u x de S t u b b l e f i e ] d et coll. [29] et B r e n t [37] q u i m o n t r e n t l ' e x i s t e n e e d ' u n d6c o u p l a g e e n t r e d u p l i c a t i o n et a c t i v i t 6 k l n a s i q u e . L e s q u e l q u e s d o n n 6 e s q u e l ' o n p o s s 6 d e s u r les p o o l s de d 6 s o x y n u c l 6 o t i d e s t r i p h o s p h a t e s c o n f i r r u e n t eette hypoth6se, puisqu'ils atteindraient leur maximum en fin de S d 6 b u t G~ [;38-41] s a n s 8tre t r 6 s f a i b l e s a p r 6 s ]a m i t o s e [38-40]. O n ne p e n t d o n c g u 6 r e i m a g i n e r q n e l e s p r ~ c u r s e u r s d u DNA p u i s s e n t e x e r e e r n n c o n t r S l e r ~ g a t i f s u r la d u p l i c a t i o n e l l e - m ~ m e q u e ce s o i t a u n i v e a u de l ' i n i t i a t i o n o n h c e l u i de la t e r m i n a i s o n . D'ailleurs, nous avons constat6 que l'activit6 thymid y l a t e ~ i n a s e e s t m a i n t e n u e s t a b l e ~ t r a v e r s Ge, M e t d ~ b u t de G~, p u i s q u e a p r 6 s la m i t o s e l ' a c t i v i t 5 p o u r 106 c e l l u l e s e s t ~gale o u h p e i n e i n f ~ r i e u r e h la m o i t i ~ de l ' a c t i v i t ~ m e s u r ~ e e n G2. Ii n ' e n v a p a s de m S m e p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e , p u i s q u e l ' a c t i v i t 6 m e s u r ~ e a p r b s la m i t o s e e s t 3,86 f o i s p l u s f a i b l e q u e d a n s les c e l l u l e s e n G_o. I1 s e m b I e d o n e que, d a n s la p 6 r i o d e G~-M-G~, cette e n z y m e s o i t f o r t e m e u t d(~grad~e s a n s ~tre t o t a l e m e n t r e m p l a c ~ e a v a n t q u e les c e l l u l e s e n t r e n t e n p h a s e S. Cette 6 v o l u t i o n de la t h y m i d i n e k i n a s e - - p l u s s t r i c t e m e n t li~e h la p h a s e S - - p o s e d ' a i l l e u r s d e s p r o b l 6 m e s diffieiles si l ' o n c o n s i d 6 r e q u ' e l l e n ' e s t p a s i n d i s p e n s a b l e h la s y n t h 6 s e d u D N A p u i s q n e l a t h y m i dine n'est pas considSr6e eomme nn pr~eurseur phys i o l o g i q u e d u d T M P et q u e d ' a i l l e u r s , les m u t a n t s T K c o n n u s n e p r 6 s e n t e n t p a s de p e r t u r b a t i o n s d a n s la d u p l i c a t i o n [~2, 43]. D u n s p r e s q u e t o u s l e s t i s s u s o u c e l l u l e s de m a m m i f ~ r e s e x a m i n e s , l a t h y m i d i n e k i n a s e a u n e a c t i v i t 4 tr~s
Thymidine
et t h y m i d y l a t e
sup~rieure h celle des e n z y m e s de la vole endog~ne de p r o d u c t i o n d u dTMP [44] c m n m e le d ~ m o n t r e "~ n o u v e a u ce travail, en ce qni concerne l'activit~ t h y m i d y late l~inase. L ' h y p o t h ~ s e qui e n v i s a g e E45] que les cellules t u m o r a l e s a i e n t u n exc~s de t h y m i d i n e k i n a s e en r a i s o n de l ' a u g m e n t a t i o n d u n o m b r e de c h r o m o s o m e s E 17 (qui p o r t e n t le g~ne c o r e r s p o n d a n t [46, 47]) ne p a r a i t gu~re s o u t e n a b l e . Quoi qu'il en soit, ]a fonet i o n de la t h y m i d i n e k i n a s e reste encore h 51ucider.
Remerciements. Je s u i s tr~s r e c o n n a i s s a n t a u P r o f e s s e u r Daillie des conseils qu'il m ' a donn~s a u cours de m e s recherches et de la r~daction de ce travail. Je r e m e r c i e sinc~rem e n t M ne A. L a r a m a p o u r sa c o l l a b o r a t i o n t e c h n i q u e . BIBLIOGRAPHIE. 1. B o o t s m a , D., Budke, L. a Vos, O. (1964) Exptl. Cell Res., 33, 301-309. 2. Eidinoff, M. L. ~ Rich, M. A. (1959) Cancer P,es., 19, 52:1-524. 3. Rueckert, R. R. ,¢ Mueller, G. C. (1960) Cancer Res., ~9, 1584-1591. 4. Sainclair, W. K. (1965) Science, 1.50, 1729-1731. 5. Comings, D. E. a Okada, T. A. (1973) J. Mol. Biol., 75, 609-618. 6. P a i n t e r , R. B. & Shaefer, A. W. (1971) J. MoL Biol., 58, 289-295. 7. Pica-Mattocia, L. ~ Attardi, G. (1972) J. Mol. Biol., .64, 465-484. 8. Stubblefield, E. ~ Mueller, G. C. (1'965) Biochem. Biophys. Res. Commun, 20, 535-538. 9. Littlefield, J. ~V. (196~) Biochem. Biophys. Acta, 114, 398-403. 10. Bello, L. J. (1974) Exptl. Cell Res., 89, 263-274. 11. Ool~a, T., Girgis, A. ~& Daillie, J. (1973) ExptL Cell Res., 81, 207-213. 12. Ooka, T. a Daillie, J. (1974) Exptl. Cell Res., 84, 219-222. 13. Ooka, T. ~ Daillie, J. (1975) Biochimie, 57, 235-246. 14. Ooka, T. (1976) Methods in cell Biology (D. E. Prescott, ed.) Academic Press. N e ~ - Y o r k , vol u m e 14. 15. B a u g n e t - M a h i e u , L., Groutier, R. & Semal, M. (1968) Europ. J. Biochem., 4, 323-328. 16. Taylor, A. T., Stafford, M. A. a Jones, O. W. (1972) J. Biol. Chem., 247, 1930-1935. 17. A d a m s , R. L. P. (1969) Exptl. Cell R e s , ~6, 49-54. 18. Valotaire, Y. a Duval, J. (1972) Biochem. Biophys. Acta, 268, 663-673. 19. W e i n s t o c k , I. M..a Dju, Y. M. (1971) Biochem. Biophys. Acta, 232, 5-13.
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 9.
k i n a s e s d a n s les c e l l u l e s K B .
1139
20. Ive, D. H. (1965) J. Biol. Chem., 240, 819-824. 21. Bianchi, P. A., F a r i n a , M. V. a Polli, E. (1964) Biochim. Biophys. Acta, 91, 323-325. 22. Ive, D. H., Morse, P. A. & Potter, V. R. (1963) J. Biol. Chem., 238, 1467-1474. 23. Seifert, J. z~ R i m a n (1967) Neoplasma, 14, 225-235. 24. T u r e n n e , M. de ,~ Daillie, J. (1973) Biochimie, 55, 1439-1447. 25. Bresnick, E. & K a r j a l a , R. J. (1964) Cancer Res., 24, 841-846. 26. A d a m s , R. L. P., B e r r y m a n , S. ,~ T h o m s o n , A. (1971) Biochem. Biophys. Acta, 24~, 455-462. 27. Eker, P. (1968) J. Biol. Chem., 243, 1979-1984. 28. Olsen, I. & Harris, G. (1975) Biochem. J., 14J6, 489496. 29. Stubblefield, E. ,~ Murphee, S. (1967) Exptl. Cell Res., 48, 652-656. 30. W e i s s m a n , S. M., Smellie, R. M. S. ~ Paul, J. (1960) Biochem. Biophys. Acta, 45, 11)1-110. 31. Littlefied, J. W. (1965) Biochem. Biophys. Acta, 95, 14-2,2. 32. B o j a r s k i , J. B. & Hiatt, H. H. (1960) Nature, 188, 1112-1114. 33. Brent, T. P., Butler, J. A. V. ~ C r a t h o r n , A. R. (1965) Nature, 207, 176-177. 34. M i t t e r m a y e r , C., B o s s e l m a n n , R. ,~ B r e m e r s k o v , V. (1968) Europ. J. Biochem., 4, 487-489. 35. Conrad, A. H. (1971) J. Biol. Chem., 2416, 1318-1323. 36. Gelbard, A. S., Kim, J. H. • Perez, A. G. (1969) Biochem. Biophys. Acta, 182, 564-566. 37. Brent, T. P. (1971) Cell Tissue kinet, 4, 297-305. 38. Bray, G. ~ Brent, T. P. (1972) Biochem. Biophys. Acta, 269, 184-191. 39. A d a m s , R. L. P., B e r r y m a n , S. ~ T h o m s o n , A. (1971) Biochem. Biophys. Acta, 240, 455-462. 40. Skoog, K. L., N o r d e n s j h l d , B. A. ~ B j u r s e l l , K. G. (1973) Europ J. Biochem., 33, 428-442. 41. W a l t e r s , R. A., Tobey, R. A. a Ratliff, R. L. (1973) Biochem. Biophys. Acta, 319, 336-34-7. 42. Dubbs, D. R. ~ Kit, S. (1964) Exptl. Cell Res., 33, 19-28. 43..Kit, S., Dubbs, D. R. ~ F r e a r s o n , P. M. (1966) Int. J. Cancer, 1, 19-30. 44. 'Weber, G., Queener, S. I. a F e r d i n a n d u s , J. A. (1971) Advances in Enzyme regulation (Pergam o n Press), 9, 63-95. 45. D u a f a l a , T. (1969) La'wrance R a d i a t i o n L a b o r a t o r y , U n i v e r s i t y of California, L i v e r m o r e , Rept. UCRL - - 50571, 1-30. 46. Miller, O. J., Allderdice, P. W., Miller, D. A., Breg, "W. R. ~ Migeon, B. R. (1971) Science, 173, 244245. 47. Mc Dougall, J. K., K u c h e r ] a p a t i , R. ~ Ruddle, F. H. (1973) Nature N. B., 245, 173-175.
BIOCHIMIE, 1976, 58, t135-113'9.
Evolution des thymidine et thymidylate kinases au cours du cycle cellulaire dans les cellules KB. Influence du mode de synchronisation sur l'activit6 (*). T. OOKA. D~parlement de Biologie gdndrale el appliqude, Unioersit~ Claude Bernard Lyon-I, It3, Boulevard du 11 Novembre 1918, 69621 Villeurbanne --- 1,'rance. (12-3-1976). INTRODUCTION. P o u r les d t u d e s q u i d e m a n d e n t de g r a n d e s q u a n t i t g s de c e l l u l e s s y n c h r o n e s , o n u t i l i s e c o n r a m m e n t d e s m 6 t h o d e s de s y n c h r o n i s a t i o n f o n d g e s s u r le b l o e a g e d e s c e l l u l e s , e n d g b u t de p h a s e S, p a r d e s i n h i b i t e u r s de l a s y n t h 6 s e d u DNA t e l s q u e la t h y m i d i n e [1] la 5 - f l u o r o d e o x y u r i d i n e [2], l ' a m g t h o p t 6 r i n e [3] o u l ' h y d r o x y u r g e [4]. T o u t e f o i s , o n a p n d g m o n t r e r q n e ces p r o d u i t s p r o v o q u e n t d e s a l t 6 r a t i o n s de la r~plic a t i o n d e s DNAs c e l l n l a i r e s [5, fi, 7] et e n r a i s o n de leur mode d'action, nous nons sommes demand6 s'ils n ' e n t r a i n e n t p a s a u s s i d e s m o d i f i c a t i o n s de l ' g v o l u t i o n , a n c o n r s d u cycle c e l l u l a i r e , de l ' a c t i v i t g d e s e n z y m e s impliqu6es dans la biosynth6se des d~oxynucl6otides t r i p h o s p h a t e s , le d T T P e n p a r t i c u l i e r . B i e n q u e de n o m b r e u x t r a v a u x a i e n t 6t5 effectu6s s u r ]es v a r i a t i o n s d ' a c t i v i t 6 d e s t h y m i d i n e et t h y m i d y l a t e k i n a s e s p e n d a n t le cycle c e l l u l a i r e [8, 9, 10], a u c u n d ' e n t r e e u x n e p r e n d r g e l l e m e n t en c o m p t e l ' i n f l u e n c e p o s s i b l e de l ' i n h i b i t e u r u t i l i s 6 c o m m e a g e n t de s y n c h r o n i s a t i o n , pnisque m~me lorsqu'elle est suspeetde (par exemple L i t t l e f i e l d [9]), les r 6 s u l t a t s o b t e n u s n ' o n t p a s ~t6 c o m p a r 6 s avec d e s d o n n 6 e s r e c u e i l l i e s p a r a l l 6 1 e m e n t sur des cellules synchronis~es naturellement. E n r a i s o n de cette l a c u n e , n o u s a v o n s d~cid6 d ' e x a m i n e r eette q u e s t i o n c a r n o u s e m p I o y o n s f r ~ q u e m m e n t [11, 13] la t h y m i d i n e c o m m e a g e n t de s y n c h r o n i s a t i o n . I1 a 6t6 c o n s t a t 6 q u ' e l l e e s t s a n s effet n o t a b l e s u r l ' a c t i v i t 6 d e s D N A p o l y m 6 r a s e s [1:3]. Le p r 6 s e n t a r t i c l e e s t c o n s a c r 6 h la t h y m i d i n e k i n a s e et a u x t h y m i d y l a t e k i n a s e s . L ' a c t i v i t 6 de ces e n z y m e s a 6t6 m e s u r 6 e d a n s des c u l t u r e s s y n c h r o n i s 6 e s s o i t p a r l a t h y m i d i n e , s o i t p a r u n e m 6 t h o d e de s61ection des c e l l u l e s e n p o s t - m i t o s e . Nos r ~ s u l t a t s r6v61ent q u e si le b l o cage p a r la t h y m i d i n e n ' e n t r a i n e p a s de m o d i f i c a t i o n s e n s i b l e d e s v a r i a t i o n s e n f o n c t i o n d u cycle de l ' a c t i vit6 d e s e n z y m e s ~tudi~es, e n r e v a n c h e , il d 6 t e r m i n e u n n i v e a u d ' a c t i v i t 6 n e t t e m e n t p l u s 61ev6 p o u r l e s d e u x e n z y m e s darts les c e l l u l e s a y a n t 6t6 e n c o n t a c t a v e c la t h y m i d i n e : celles-ci o u t , e n effet, des a c t i v i t d s 5 h 8 f o i s ( s e l o n les p h a s e s d u cycle) p l u s ~lev6es q u e les cellules synchronis~es sans utilisation du nucl6otide. MATERIEL ET TECHNIQUES.
I. Cultures de cellules. L e s c e l l u l e s KB s o n t e u l t i v 6 e s s o i t e n s u s p e n s i o n , soit e n f l a c o n s de R o u x d a n s le m i l i e u M.E.M. m o d i f i 6 Abr6viations : TMD T h y m i d i n e m o n o p h o s p h a t e . TDP Thymidine diphosphate. TTP Thymidine triphosphate. (*) Ce t r a v a i l a (~t~ r~alis6 '~ l ' U n i t 6 de V i r o l o g i e , I.N.S.E.R.M. ( L y o n ) .
p a r J o k l i k c o n t e n a n t 5 p. 100 de s g r u m de c h e v a l , darts des c o n d i t i o n s d 6 j h d g e r i t e s [12]. II. Synchronisalion. D e u x t e c h n i q u e s de s y n c h r o n i s a t i o n e x p o s S e s a i l l e u r s [12, 13, 14] o u t ~t6 u t i l i s g e s . D a n s le c a s d u b l o c a g e p a r l a t h y m i d i n e [13] l o r s q u e le n u c l g o t i d e e s t r e t i r 6 d u m i l i e u , les c e l l u l e s e n t r e n t e n p h a s e S (fig. 2B). Celle-ci d u r e e n v i r o n 6 h e u r e s ; l e s m i t o s e s c o m m e n c e n t h la 7e h e u r e et se t e r m i n e n t h la 10 e : la p h a s e GI p r e n d p l a c e e n s u i t e . L o r s q u ' o n op6re p a r s61ection d e s c e l l u l e s e n p o s t - m i t o s e , ceIles-ci s o n t collectSes e n d d b u t de p h a s e G1 [12, 14]. La p h a s e S s ' g t e n d de la 6 ~ h Ia 17 ~ h e u r e et les m i t o s e s se p r o d u i s e n t de 13 ~t 23 h e u r e s (fig. 2A). L a s y n c h r o n i s a t i o n e s t a i n s i m o i n s b o n n e q u e p a r l ' e m p l o i de la t h y m i d i n e , m a i s elle e s t c e p e n d a n t u t i l i s a b l e [13]. III. Prdparation de l'extrait cytoplasmique. L ' a c t i v i t 6 d e s t h y m i d i n e et t h y m i d y l a t e k i n a s e s n ' a 6t6 m e s u r ~ e q u e d a n s l ' e x t r a i t c y t o p l a s m i q u e c a r il n ' a p a s ~tg ddteci5 d ' a c t i v i t 6 m e s u r a b l e d a n s l e s p r e p a r a t i o n s n u c l 6 a i r e s , e n a c c o r d avee les a u t r e s t r a v a u x [15, 116] h l ' e x c e p t i o n de c e l u i d ' A d a m s [17]. L ' e x t r a i t c y t o p l a s m i q u e e s t p r 6 p a r 6 e o m m e d~crit p r 6 c 6 d e m m e n t [13]. A p r 6 s 6 1 i m i n a t i o n d e s n o y a u x , la f r a c t i o n c y t o p l a s m i q u e s o l u b l e d a n s le t a m p o n T K M B [0,25 M - s a c c h a r o s e , 10 mM-KC1, 1 m M MgCI:, 1 m M ~ - M e r c a p t o 6 t h a n o l et 50 m M Tris-HC1 (pH 7,5)] e s t r e c u e i l l i e a p r 6 s u n e c e n t r i f u g a t i o n h 105.000 g p e n d a n t 60 m n . IV. Mesure de l'acliuit~ des enzymes. On dvalue l'activit~ en thymidine kinase des extraits p a r la q u a n t i t ~ de T M P f o r m d h p a r t i r de t h y m i d i n e et, p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e , p a r la q u a n t i t d de T D P et T T P f o r m , s h p a r t i r de TMP. I1 f a u t n o t e r que, d a n s n o s e s s a i s , c o m m e d ~ m o n t r 6 p a r a i l l e u r s [18, 19], la q u a n t i t 6 de d T D P e s t t o u j o u r s n 6 g l i g e a b l e e n r a i s o n de la p r e s e n c e e n e x e c s de l ' a c t i v i t ~ de T D P k i n a s e [20, 21J. N o u s a v o n s p u d i s t i n g u e r ces d e u x a c t i v i t ~ s g r a c e a u f a i t q u e ces r 6 a c t i o n s o u t d e s o p t i m a e n Mg2+ tr6s d i f f 6 r e n t e s : 1 m M p o u r l a t h y m i d i n e k i n a s e c o n t r e 20 m M p o u r la t h y m i d y l a t e k i n a s e (fig. 1), ce q u i a d6jh dt~ o b s e r v ~ p a r d ' a u t r e s a u t e u r s [22, 23, 24]. Le m 6 l a n g e r ~ a c t i o n n e l e o m p r e n d , d a n s u n v o l u m e final de 250 i~l : 50 .~1 d ' e x t r a i t c y t o p l a s m i q n e ; 25 u m o l e s de Tris-HC1 (pH 8,0 p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e et p H 7,5 p o u r l a t h y m i d y l a t e k i n a s e ) ; 2,5 ~xmoles d ' A T P ; 3 ~ m o l e s de p h o s p h o g l y c ~ r a t e de p o t a s s i u m ; 0,25 ~ m o l e s o u 5 u m o l e s de MgC12 ; 1,25 n m o l e s de t h y m i d i n e (soit 0,5 :~Ci de t h y m i d i n e ZH, A m e r s h a m ) p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e o u 0,625 n m o l e s de t h y m i d i n e m o n o p h o s p h a t e (soit 2,5 ~Ci de TMPZH, A m e r s h a m ) p o u r la t h y m i d y l a t e k i n a s e . A p r 6 s I5 r a i n d ' i n c u b a t i o n h 37°C, la r 6 a c t i o n e s t a r r ~ t 6 e p a r c h a u f f a g e au bain-marie bouillant pendant 2 mn.
T. Ooka.
1136
N ' a y a n t p a s d i a l y s 6 les e x t r a i t s o b t e n u s e n r a i s o n de la g r a n d e f r a g i l i t $ de l a t h y m i d y l a t e ,kinase, n o u s a v o n s proedd6, afin de t e n i r c o m p t e , 6 v e n t u e l l e m e n t
14-
A
TABLEAU I. v
E u
Activitds thymidine kinasiques mesurdes en pr& sence de mdlanges d'extraits prdpards dt des phases diffdrentes du cycle cellulaire dans les cellules KB synchronis~eS sdlection de post-mitose [A] ou par la thymidine (~ff.
g_
[Al TTP TMP
2o.z~o~ i
2
4
3
5
2()
t4-
mM
Les extraits prdlev6s h des m o m e n t s diff6rents du cycle cellulaire (figure 2 A) Phase S-Ge (activit6 maximale)
Phase Gt activit6 minimale
10 ~.1 0 0 0 10 10 10
0 I0 7.1 2O 4O 10 20 40
Phosphorylation obtenue (en cpm) en t5 mn avec les extraits incub6s Valeurs . exp6rimentales
Valeurs attendues
B
.~8-
.} •
c o m m e m a r q u e u r s ) s o n t d 6 p o s d s s u r des f e u i l l e s de p a p i e r de D E A E - c e l l u l o s e . U n e c h r o m a t o g r a p h i e d e s c e n d a n t e e s t effectude a v e c le s o l v a n t : H C O O H 98-100 p~ 100, 15,83 m l ; N H 4 O H 25 p. 100, 0,7'5 m l ; e a u d i s till6e, v o l u m e cornpldt6 h 100 m l . L a r a d i o a c t i v i t 6 li6e a u x diffdren~s n u c l 6 o t i d e s t h y m i d i l i q u e s a i n s i s 6 p a r 6 s
P
741 I
205 536 851 991 1347 1589
946 1277 1592
.
[B] Les extraits pr61ev~s h des m o m e n t s diff6rents du cycle cellulaire (figure 2 B)
2-
~,g 10 1'5 2o 2'5
[MgC,,I
40
5'0mM
FIG. 1. - - Influence de la concentration en MgCI~ sur l'actioitd de la thymidine ]cinase (A) et des t h y m i d g late ~kinases (B). Les a c t i v i t 6 s s o n t e x p r i m 6 e s e n c.p.m, de t h y m i d i n e [3HI o u de T M P - [ 3 H ] p h o s p h o r y l d s p a r 200 × 103 c e l l u l e s p e n d a n t 15 m i n d ' i n c u b a t i o n h 37°C (of. M a t e r i e l et T e c h n i q u e s ) .
des v a r i a t i o n s des p o o l s n u e l 6 o t i d i q u e s , h d e s m e s u r e s d ' a c t i v i t 6 darts d e s m 6 1 a n g e s d ' e x t r a i t s p r o v e n a n t d e s c e l l u l e s p r d l e v 6 e s h d i f f d r e n t s m o m e n t s d u cycle. C o m m e le m o n t r e le t a b l e a u I, o n o b t i e n t t o u j o u r s d e s v a l e u r s a d d i t i v e s , ce q u i i m p l i q u e q u e les q u a n t i t 6 s 6 v e n t u e l l e m e n t v a r i a b l e s de n n c l S o t i d e s f r o i d s p r e s e n t s n ' a f f e c t e n t p a s s e n s i b l e m e n t les v a l e u r s m e s u r ~ e s . D a n s le c a s de l ' a c t i v i t 6 t h y m i d i n e k i n a s e , d e s a l l q u o t e s de 50 ~1 de l ' i n c u b a t s o n t d i r e c t e m e n t d~pos$es s u r d i s q u e s de p a p i s t DEAE-81 q u i s o u r i m m d d i a t e m e n t i m m e r g 6 s da:ns u n e s o l u t i o n de f o r m i a t e d ' a m m o n i u m t raM, l a r d s 3 l o i s a v e c . c e t t e s o l u t i o n , et s~ch6s p a r l ' d t h a n o l [25]. L e s n u c l ~ o t i d e s r e t e n u s s u r les d i s q u e s s o n t c o m p t 6 s p a r s c i n t i l l a t i o n l i q u i d e . Darts le c a s de l ' a c t i v i t 6 t h y m i d y l a t e k i n a s e , 30 I~1 d ' i n c u b a t et d i v e r s c o m p o s 6 s t h y m i d i l i q u e s <
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 9.
D6but S Phase S-G2 (apr6s sup- Phase G1 (activit6 (activit6 pression maximale) de second minimale) blocage) 10 ~1 0 0 0 0 0 0 10 10 10 10 10 10 0 0 0
0 10 ~I 20 40 0 0 0 10 20 40 0 0 0 10 10 10
0 0 0 0 10 20 40 0 0 0 10 20 40 10 20 40
Phosphorylation obteuue (en cpm) en 15 m n avec les extraits incub6s Valeurs exp6rimentMes
Valeurs attendues
2541 916 1850 3765 526 1006 222O 3492 4451 6515 3107 3632 5619 1658 1923 3056
3458 4392 6307 3068 3548 4762 1542 2022 3236
C o n c e n t r a t i o n e n e x t r a i t s : 1@ ~1 c o r r e s p o n d h 140 ,'<, 103 c e l l u l e s p o u r [A] et 61 × 103 c e l l u l e s p o u r [B]. D u r ~ e d ' i n c u b a t i o n : 15 ran. Composition du milieu d'incubation : voir Matdriel et T e c h n i q u e .
1137
Thgmidine et lhgmidylate kinases duns les cellules KB. est mesurge en scintillation liquide apr~s dgcoupage d e s c h r o m a t o g r a m m e s e n b a n d e s de s u r f a c e rSguli~re. RESULTATS. D a n s les d e u x chronis6es l'une (fig. 2 A et B), o n l'activit6 (exprim6
t y p e s de c u l t u r e s , c ' e s t - h - d i r e s y n o u l ' a u t r e d e s m 6 t h o d e s d6crites observe, pour chaque enzyme, que p o u r 106 c e l l u l e s ) 6 v o l u e de f a q o n
ol +°:+
•
:~051
"
oJ
~ 515
+
"5.
o
s i m i l a i r e e n f o n c t i o n d u cycle. M i n i m a l e a u m o m e n t o h c o m m e n c e l ' e x p 6 r i e n c e (G~ o u d ~ h u t de S), elle d e v i e n t m a x i m a l e e n fin de p h a s e S e t m 6 m e e n d d b u t de G~ p o u r a t t e i n d r e u n n i v e a u m i n i m u m a p r ~ s la m i t o s e s . E n o u t r e , si a u x v a l e u r s m i n i m a l e s , les a c t i vit6s d e s e n z y m e s s o n t d u m ~ m e o r d r e , l ' a e t i v i t 6 m e s u r g e a u m a x i m u m p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e e s t 2 f o i s p l u s 61evSe q u e celle q u i e s t e n r e g i s t r ~ e p o u r l a t h y m i d y l a t e k i n a s e ( t a b l e a u II, l i g n e s 1 et 2). E n f i n , l ' a c t i -
/
/
o
°
II .~
io
;5 Heur~s
2b 2'5 3b
B+ -~
.
x~
//
~.~
% . ; ' ~ - ] ~ [ "
/' I
-1 q
2
~
+TdR ~--TdR
6
8
;b
¢2
I ;~
16
Heures
FIe. 2. - - E v o l u t i o n de l'actioitd des t h y m i d i n e et t h y m i d y l a t e kinases au cours du cycle cellulaire. L e s c e l l u l e s s y n c h r o n e s o n t 6t5 p r 6 p a r 6 e s , soit p a r s d l e c t i o n d e s c e l l u l e s e n p o s t - m i t o s e (A), s o i t p a r b l o cage & la t h y m i d i n e (B) (cf Mat6riel et T e c h n i q u e s ) . L ' a c t i v i t 6 t h y m i d i n e k i n a s e (~r . . . . . ~r) c x p r i m ~ e e n n m o l e s de t h y m i d i n e p h o s p h o r y l d e e n d T M P / 15 ran/106 c e l l u l e s et l ' a c t i v i t 6 t h y m i d y l a t e k i n a s e (~r "k) e x p r i m d e e n n m o l e s de d T M P p h o s p h o r y l 6 e n d T T P / 1 5 m n 106 c e l l u l e s o n t dr6 d d t e r m i n 6 e s c o m m e d~crit darts le texte. Le d 6 n o m b r e m e n t de c e l l u l e ((3 ©) e s t effectu6 & l ' a i d e d ' u n <
Techniques Phases
T h y m i d y l a t e kinases (n moles de TTP form6 /106 cellules)
A
B
B/A
A
B
B/A
S-Go (Activit6 m a x i m a l e )
0,610
4,966
8,l
0,299
2,554
8,5
Seconde G+ (Activit4 m i n i m a l e
0,159
0,800
5,0
0,162
1,021
G+ S-G~ (p" c e n t )
(a) 26 p. eent[16 p. cenl
_
6_ , 3
54 p. c e n t 4 0 p. c e n t
(a) P o u r c e n t a g e d ' a e t i v i t 6 k i n a s i q u e t r o u v ~ e d a n s les c e l l u l e s e n s e c o n d e p h a s e G~ p a r r a p p o r t h l ' a c t i v i t 6 m a x i m a l e (en S-G~) e n r e g i s t r 6 e a v a n t la d i v i s i o n cellulaire. BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 9.
T. Ooka.
11 38
vit6 de la t h y m i d y l a t e k i n a s e e s t g l o b a l e m e n t s t a b l e , p u i s q u e , a p r 6 s la m i t o s e , les n o u v e l l e s c e l l u l e s c o n t i e n n e n t 40 h 50 p. c e n t de l ' a c t i v i t ~ m a x i m a l e d u cycle prdc~dent, t a n d i s q u e ces v a l e u r s t o m b e u t h 16 et -96 p. c e n t p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e ( t a b l e a u II, l i g u e 3). Ii n e p a r a i t p a s c e r t a i n q u e les d i f f e r e n c e s n o t 6 e s , e n t r e les d e u x t y p e s d e c u l t u r e , s o i e n t s i g n i f i c a t i v e s , a u s s i p e u t - o n c o n c l u r e que, q u a n t i t a t i v e m e n t , le t r a i t e m e n t p a r la t h y m i d i n e n ' i n t r o d u i t p u s de m o d i f i c a t i o n n o t a b l e . L a d 6 c r o i s s a n c e c o n s i d d r a b l e de l ' a c t i v i t ~ de t h y m i d i n e k i n a s e n ' e s t p a s d u e h la p r 6 s e n c e o u h l ' a b s e n c e d ' i n h i b i t e u r s , s p 6 e i f i q u e s de c e r t a i n e s p h a s e s d u cycle e e l l u l a i r e , c o m m e o n a p u l e v~rifier e n m ~ l a n g e a n t d e s e x t r a i t s p r 6 p a r 6 s e n p h a s e G~ (activit6 m i n i m a l e ) et e n p h a s e S-G~ (aetivit6 m a x i m a l e ) . I1 e s t d o n e v r a i s e m b ] a b l e q u e la d i m i n u t i o n de t h y m i d i n e k i n a s e c o r r e s p o n d e h u n e d ~ g r a d a t i o n de l ' e n z y m e . E n r e v a n c h e , si l ' o n c o n s i d 6 r e les n i v e a u x d ' a c t i v i t ~ , o n c o n s t a t e q u e Ies c e l l u l e s a y a n t 6t6 e n c o n t a c t a v e c la t h y m i d i n e , o n t d e s c a p a c i t ~ s p h o s p h o r y l a t i v e s n e t t e m e n t p l u s ~lev~es q n e les a u t r e s : le t a b l e a u II (lig n e s 1 et 2) n m n t r e , e n effet, q u e l ' a c t i v i t 6 d e s c e l l u l e s s y n c h r o n i s ~ e s p a r la t h y m i d i n e e s t 5 h 8 f o i s p l u s ~lev~e p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e et 6 h 8,5 p o u r la t h y m i d y l a t c k i n a s e , s e l o n q u e l ' o n c o n s i d ~ r e le m i n i m u m et le m a x i m u m d ' a c t i v i t ~ , r e s p e c t i v e m e n t .
DISCUSSION. L ' o b j e c t i f de ee t r a v a i l ~tait de r S p o n d r e h l a q u e s t i o n : l ' e m p l o i d ' i n h i b i t e u r s de l a s y n t h 6 s e d u DNA - e n l ' o c c u r e n c e , la t h y m i d i n e - - c o m m e a g e n t de s y n c h r o n i s a t i o n e n t r a i n e - t - i l des p e r t u r b a t i o n s d a n s l ' a c t i vit6 d e s e n z y m e s i m p l i q u ~ e s d a n s la p r o d u c t i o n d e s d~soxyribonucl6otides triphosphates, en particulier dn d T T P ? P o u r ce f a i r e , n o u s a v o n s e o m p a r ~ l ' d v o l u t i o n d e s a c t i v i t ~ s t h y m i d i n e et t h y m l d y l a t e k i n a s e s d a n s d e s c e l l u l e s KB s y n e h r o n i s d e s , s o i t p a r la t h y m i d i n e , s o i t p a r s d l e c t i o n d e s c e l l n l e s e n p o s t - m i t o s e . L e s r~s u l t a t s o b t e n u s i n d i q u e n t que, e n f o n c t i o n d u cycle e e l l u l a i r e , les a c t i v l t ~ s e x a m i n e e s 6 v o l n e n t de f a g o n s i m i l a i r e m a i s q u e , d a n s les c e l l u l e s t r a i t 6 e s p a r la t h y m i d i n e , c e s a c t i v i t 4 s s o n t 5-8 f o i s p l u s dlcv~es q u e d a n s les c e l l n l e s s y n c h r o n i s ~ e s s a n s h ] o c a g e de la d u p l i c a t i o n d u DNA. Ce d e r u i e r r 6 s u l t a t e s t d d e r i t p o u r l a p r e m i e r e l o i s , m a i s il f a u t n o t e r u n e i n c e r t i t u d e p o s s i b l e de l a s i g n i f i c a t i o n de m e s d o s a g e s c a r l e s n u c l 6 o t i d e s f r o i d s p e u v e n t dtre e n c o n c e n t r a t i o n v~rit a b l e d a n s les e x t r a i t s s e l o n q u e c e u x - e i p r o v i e n n e n t de c e l l u l e s trait&es o u n o n p a r la t h y m i d i n e . A n s s i , Adam,s [~6], a v e c d e s c e l l n l e s L (de s o n r i s ) e n m a j o rlt6 e n p h a s e G~, e o u s t a t e q u e l ' a d d i t i o n de t h y m i d i n e f r o i d e h l a c o n c e n t r a t i o n de 5, raM, p r o v o q u e n t u n e a u g m e n t a t i o n de 12 f o i s , p a r r a p p o r t a n x c u l t u r e s t~m o i n s , de la q u a n t i t ~ de d T T P p r ~ s e n t e darts l e s cell u l e s a p r 6 s l ' a d d i t i o n d u n u c l ~ o s i d e . D u n s ces c o n d i t i o n s , o n p e u t e r a i n d r e q u e les c e l l u l e s KB s y n c h r o n i s d e s p a r la t h y m i d i n e a l e u t u n p o o l de d T T P b i e n s n p 6 r i e u r a u x c e l l u l e s s y n e h r o n i s ~ e s s a n s blocage. C o m m e n t cette d i f f 6 r e n e e p r o b a b l e p e u t - e l l e i n t e r f ~ r e r avee les m e s u r e s d ' a c t i v i t ~ s k i n a s i q u e s in v i t r o ? C o m m e n o u s o b s e r v o n s , s a n s d i a l y s e , u n e activit~ p l u s ~lev~c d a n s les c e l l u l e s t r a i t 6 e s p a r la t h y m i d i n e q u e d a n s les a u t r e s , et q u ' o n s a l t q u ' u n e c o n c e n t r a t i o n 6levee e n d T T P p e u t i n h i b e r l ' a e t i v i t 6 in v i t r o d e s t h y m i d y l a t e s k i n a s e s et s u r t o u t de la t h y m i d i n e k i n a s e [17, 19, 20], n o u s c r o y o n s p o u v o i r a f f i r m e r q u e la synchronisation par la thymidine provoque r~ellement n n e a u g m e n t a t i o n de l ' a e t i v i t ~ ]~inasique, p a r r a p p o r t B I O C H I M I E , 1976, 58, n ° 9.
aux cellules non trait6es, augmentation ~tre m ~ m e s o u s - e s t i m 6 e .
qui est pent-
D ' a i l l e u r s , o n s a l t que, e n s y s t 6 m e a s y n c h r o n e , l ' a d d i t i o n de t h y m i d i n e a u m i l i e u de c u l t u r e d 6 t e r m i n e u n a c c r o i s s e m e n t d ' a c t i v i t 6 de la t h y m i d i n e k i n a s e de l ' o r d r e de 2-3 f o i s [2'7, 28]. E n o u t r e , S t u b b l e f i e l d et M u r p h e e [29], a v e c d e s c e l l u ] e s s y n c h r o n i s ~ e s , c o n s t a t e n t q u e l ' a d d i t i o n de la t h y m i d i n e e n G1 d 6 t e r m i n e u n e a u g m e n t a t i o n de l ' a c t i v i t 6 t h y m i d i n e k i n a s e de l ' o r d r e de 2 fois. L e s a u t e u r s i n t e r p r 6 t e n t cette a u g mentation eomme r6sultant d'un ph6nom6ne d'induet i o n [30] ou de p r o t e c t i o n [31, 32] des e n z y m e s c o n cern6es. I1 e s t p o s s i b l e q n e n o s r 6 s u l t a t s a i e n t la m S m e s i g n i f i c a t i o n , c e p e n d a n t , o n d o l t s o u l i g n e r que, d u n s u o s c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s , l'effet o b s e r v 6 p e r s l s t e l o n g t e m p s a p r 6 s q u e la t h y m i d i n e a i r dt6 s u p p r i m 6 e : a p r S s q u ' e l l e s a i e n t p a r c o u r u les p h a s e s S-C2 et M, l e s c e l l u l e s o n t e n c o r e , d a n s la G1 s u i v a n t e , l a m S m e a c t i vit~ q u ' h la fin d u blocage. Nos r d s u l t a t s s n r l ' ~ v o l u t i o n d e s e n z y m e s e n r e l a t i o n a v e c les p h a s e s d u cycle s o n t e n a c c o r d a v e c les a u t r e s t r a v a n x se r a p p o r t a n t a u m ~ m e s u j e t [8, 9, 10, 33, 34]. I1 e s t h n o t e r t o u t e f o i s q u e s e u l l e t r a v a i l de B r e n t et coll. [33], s u r c e l l u l e s H e L a , e o n s i d ~ r e s i m u l t a n 6 m e n t t h y i n i d i n e et t h y m i d y l a t e k i n a s e s . D a n s t o u s les eas, o n o b s e r v e u n e f o r t e c o r r 6 1 a t i o n e n t r e la s y n t h ~ s e d u DNA et l ' a u g m e n t a t i o n d e s a c t i v i t ~ s e n z y m a t i q u e s , avec ceci de p a r t i c u l i e r q n e le m a x i m u m de p h o s p h o r y l a t i o n e s t a t t e i n t e n fin de S d 6 b u t de G.,. Ce d6calage e s t a u s s i o b s e r v 6 p o u r d ' a u t r e s e n z y m e s e o m m e l a t h y m i d y l a t e s y n t h 6 t a s e ['35] et l a d C M P d 6 a m i n a s e [:34, 316] q u i p a r t i c i p e n t h la p r o d u c t i o n des n u c l ~ o t i d e s t h y m i d y l i q u e s . Ces f a i t s c o n d u i s e n t h s o u l i g n e r q u e la c o o r d i n a t i o n e n t r e d u p l i c a t i o n d u DNA et p r o d u c t i o n d e s d ~ s o x y n u c l 6 o t i d e s e s t a s s e z l ~ e h e e o m m e l ' i n d i q u e n t les t r a v a u x de S t u b b l e f i e ] d et coll. [29] et B r e n t [37] q u i m o n t r e n t l ' e x i s t e n e e d ' u n d6c o u p l a g e e n t r e d u p l i c a t i o n et a c t i v i t 6 k l n a s i q u e . L e s q u e l q u e s d o n n 6 e s q u e l ' o n p o s s 6 d e s u r les p o o l s de d 6 s o x y n u c l 6 o t i d e s t r i p h o s p h a t e s c o n f i r r u e n t eette hypoth6se, puisqu'ils atteindraient leur maximum en fin de S d 6 b u t G~ [;38-41] s a n s 8tre t r 6 s f a i b l e s a p r 6 s ]a m i t o s e [38-40]. O n ne p e n t d o n c g u 6 r e i m a g i n e r q n e l e s p r ~ c u r s e u r s d u DNA p u i s s e n t e x e r e e r n n c o n t r S l e r ~ g a t i f s u r la d u p l i c a t i o n e l l e - m ~ m e q u e ce s o i t a u n i v e a u de l ' i n i t i a t i o n o n h c e l u i de la t e r m i n a i s o n . D'ailleurs, nous avons constat6 que l'activit6 thymid y l a t e ~ i n a s e e s t m a i n t e n u e s t a b l e ~ t r a v e r s Ge, M e t d ~ b u t de G~, p u i s q u e a p r 6 s la m i t o s e l ' a c t i v i t 5 p o u r 106 c e l l u l e s e s t ~gale o u h p e i n e i n f ~ r i e u r e h la m o i t i ~ de l ' a c t i v i t ~ m e s u r ~ e e n G2. Ii n ' e n v a p a s de m S m e p o u r la t h y m i d i n e k i n a s e , p u i s q u e l ' a c t i v i t 6 m e s u r ~ e a p r b s la m i t o s e e s t 3,86 f o i s p l u s f a i b l e q u e d a n s les c e l l u l e s e n G_o. I1 s e m b I e d o n e que, d a n s la p 6 r i o d e G~-M-G~, cette e n z y m e s o i t f o r t e m e u t d(~grad~e s a n s ~tre t o t a l e m e n t r e m p l a c ~ e a v a n t q u e les c e l l u l e s e n t r e n t e n p h a s e S. Cette 6 v o l u t i o n de la t h y m i d i n e k i n a s e - - p l u s s t r i c t e m e n t li~e h la p h a s e S - - p o s e d ' a i l l e u r s d e s p r o b l 6 m e s diffieiles si l ' o n c o n s i d 6 r e q u ' e l l e n ' e s t p a s i n d i s p e n s a b l e h la s y n t h 6 s e d u D N A p u i s q n e l a t h y m i dine n'est pas considSr6e eomme nn pr~eurseur phys i o l o g i q u e d u d T M P et q u e d ' a i l l e u r s , les m u t a n t s T K c o n n u s n e p r 6 s e n t e n t p a s de p e r t u r b a t i o n s d a n s la d u p l i c a t i o n [~2, 43]. D u n s p r e s q u e t o u s l e s t i s s u s o u c e l l u l e s de m a m m i f ~ r e s e x a m i n e s , l a t h y m i d i n e k i n a s e a u n e a c t i v i t 4 tr~s
Thymidine
et t h y m i d y l a t e
sup~rieure h celle des e n z y m e s de la vole endog~ne de p r o d u c t i o n d u dTMP [44] c m n m e le d ~ m o n t r e "~ n o u v e a u ce travail, en ce qni concerne l'activit~ t h y m i d y late l~inase. L ' h y p o t h ~ s e qui e n v i s a g e E45] que les cellules t u m o r a l e s a i e n t u n exc~s de t h y m i d i n e k i n a s e en r a i s o n de l ' a u g m e n t a t i o n d u n o m b r e de c h r o m o s o m e s E 17 (qui p o r t e n t le g~ne c o r e r s p o n d a n t [46, 47]) ne p a r a i t gu~re s o u t e n a b l e . Quoi qu'il en soit, ]a fonet i o n de la t h y m i d i n e k i n a s e reste encore h 51ucider.
Remerciements. Je s u i s tr~s r e c o n n a i s s a n t a u P r o f e s s e u r Daillie des conseils qu'il m ' a donn~s a u cours de m e s recherches et de la r~daction de ce travail. Je r e m e r c i e sinc~rem e n t M ne A. L a r a m a p o u r sa c o l l a b o r a t i o n t e c h n i q u e . BIBLIOGRAPHIE. 1. B o o t s m a , D., Budke, L. a Vos, O. (1964) Exptl. Cell Res., 33, 301-309. 2. Eidinoff, M. L. ~ Rich, M. A. (1959) Cancer P,es., 19, 52:1-524. 3. Rueckert, R. R. ,¢ Mueller, G. C. (1960) Cancer Res., ~9, 1584-1591. 4. Sainclair, W. K. (1965) Science, 1.50, 1729-1731. 5. Comings, D. E. a Okada, T. A. (1973) J. Mol. Biol., 75, 609-618. 6. P a i n t e r , R. B. & Shaefer, A. W. (1971) J. MoL Biol., 58, 289-295. 7. Pica-Mattocia, L. ~ Attardi, G. (1972) J. Mol. Biol., .64, 465-484. 8. Stubblefield, E. ~ Mueller, G. C. (1'965) Biochem. Biophys. Res. Commun, 20, 535-538. 9. Littlefield, J. ~V. (196~) Biochem. Biophys. Acta, 114, 398-403. 10. Bello, L. J. (1974) Exptl. Cell Res., 89, 263-274. 11. Ool~a, T., Girgis, A. ~& Daillie, J. (1973) ExptL Cell Res., 81, 207-213. 12. Ooka, T. a Daillie, J. (1974) Exptl. Cell Res., 84, 219-222. 13. Ooka, T. ~ Daillie, J. (1975) Biochimie, 57, 235-246. 14. Ooka, T. (1976) Methods in cell Biology (D. E. Prescott, ed.) Academic Press. N e ~ - Y o r k , vol u m e 14. 15. B a u g n e t - M a h i e u , L., Groutier, R. & Semal, M. (1968) Europ. J. Biochem., 4, 323-328. 16. Taylor, A. T., Stafford, M. A. a Jones, O. W. (1972) J. Biol. Chem., 247, 1930-1935. 17. A d a m s , R. L. P. (1969) Exptl. Cell R e s , ~6, 49-54. 18. Valotaire, Y. a Duval, J. (1972) Biochem. Biophys. Acta, 268, 663-673. 19. W e i n s t o c k , I. M..a Dju, Y. M. (1971) Biochem. Biophys. Acta, 232, 5-13.
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 9.
k i n a s e s d a n s les c e l l u l e s K B .
1139
20. Ive, D. H. (1965) J. Biol. Chem., 240, 819-824. 21. Bianchi, P. A., F a r i n a , M. V. a Polli, E. (1964) Biochim. Biophys. Acta, 91, 323-325. 22. Ive, D. H., Morse, P. A. & Potter, V. R. (1963) J. Biol. Chem., 238, 1467-1474. 23. Seifert, J. z~ R i m a n (1967) Neoplasma, 14, 225-235. 24. T u r e n n e , M. de ,~ Daillie, J. (1973) Biochimie, 55, 1439-1447. 25. Bresnick, E. & K a r j a l a , R. J. (1964) Cancer Res., 24, 841-846. 26. A d a m s , R. L. P., B e r r y m a n , S. ,~ T h o m s o n , A. (1971) Biochem. Biophys. Acta, 24~, 455-462. 27. Eker, P. (1968) J. Biol. Chem., 243, 1979-1984. 28. Olsen, I. & Harris, G. (1975) Biochem. J., 14J6, 489496. 29. Stubblefield, E. ,~ Murphee, S. (1967) Exptl. Cell Res., 48, 652-656. 30. W e i s s m a n , S. M., Smellie, R. M. S. ~ Paul, J. (1960) Biochem. Biophys. Acta, 45, 11)1-110. 31. Littlefied, J. W. (1965) Biochem. Biophys. Acta, 95, 14-2,2. 32. B o j a r s k i , J. B. & Hiatt, H. H. (1960) Nature, 188, 1112-1114. 33. Brent, T. P., Butler, J. A. V. ~ C r a t h o r n , A. R. (1965) Nature, 207, 176-177. 34. M i t t e r m a y e r , C., B o s s e l m a n n , R. ,~ B r e m e r s k o v , V. (1968) Europ. J. Biochem., 4, 487-489. 35. Conrad, A. H. (1971) J. Biol. Chem., 2416, 1318-1323. 36. Gelbard, A. S., Kim, J. H. • Perez, A. G. (1969) Biochem. Biophys. Acta, 182, 564-566. 37. Brent, T. P. (1971) Cell Tissue kinet, 4, 297-305. 38. Bray, G. ~ Brent, T. P. (1972) Biochem. Biophys. Acta, 269, 184-191. 39. A d a m s , R. L. P., B e r r y m a n , S. ~ T h o m s o n , A. (1971) Biochem. Biophys. Acta, 240, 455-462. 40. Skoog, K. L., N o r d e n s j h l d , B. A. ~ B j u r s e l l , K. G. (1973) Europ J. Biochem., 33, 428-442. 41. W a l t e r s , R. A., Tobey, R. A. a Ratliff, R. L. (1973) Biochem. Biophys. Acta, 319, 336-34-7. 42. Dubbs, D. R. ~ Kit, S. (1964) Exptl. Cell Res., 33, 19-28. 43..Kit, S., Dubbs, D. R. ~ F r e a r s o n , P. M. (1966) Int. J. Cancer, 1, 19-30. 44. 'Weber, G., Queener, S. I. a F e r d i n a n d u s , J. A. (1971) Advances in Enzyme regulation (Pergam o n Press), 9, 63-95. 45. D u a f a l a , T. (1969) La'wrance R a d i a t i o n L a b o r a t o r y , U n i v e r s i t y of California, L i v e r m o r e , Rept. UCRL - - 50571, 1-30. 46. Miller, O. J., Allderdice, P. W., Miller, D. A., Breg, "W. R. ~ Migeon, B. R. (1971) Science, 173, 244245. 47. Mc Dougall, J. K., K u c h e r ] a p a t i , R. ~ Ruddle, F. H. (1973) Nature N. B., 245, 173-175.