Genetic and epigenetic defects at the GNAS locus cause different forms of pseudohypoparathyroidism

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ScienceDirect www.sciencedirect.com Annales d’Endocrinologie 76 (2015) 92–97

Journées Klotz 2015

Genetic and epigenetic defects at the GNAS locus cause different forms of pseudohypoparathyroidism Des altérations génétiques et épigénétiques du locus GNAS sont responsables de différentes formes de pseudohypoparathyroïdie Harald Jüppner Endocrine Unit and Pediatric Nephrology Unit, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 02114 Boston, United States

Keywords: Calcium; Phosphate; PTH; PTHrP; PTH/PTHrP receptor; Pseudohypoparathyroidism type Ia and Ib; Pseudopseudohypoparathyroidism; GNAS; Stimulatory G protein (Gs␣); Imprinting; Syntaxin 16 (STX16); Parent-specific DNA methylation; Genetic disease; cAMP signaling pathway; Albright hereditary osteodystrophy (AHO) Mots clés : Calcium ; Phosphate ; PTH ; PTHrP ; Récepteur de PTH/PTHrP ; Pseudohypoparathyroïdies de type Ia and Ib ; Pseudopseudohypoparathyroïdisme ; GNAS ; Protéine G stimulante (Gs␣) ; Empreinte ; Syntaxine 16 (STX16) ; Méthylation du DNA parent-specifique ; Maladie génétique ; Voie de signalisation de l’AMPc ; Ostéodystrophie héréditaire d’Albright (OAH)

1. English version The GNAS locus on chromosome 20q13.3 gives rise to several, alternatively spliced transcripts, including the alphasubunit of the stimulatory G protein (Gs␣) [1–3]. This ubiquitously expressed signaling protein mediates the actions of numerous G protein-coupled receptors (GPCR) and is thus of broad biological importance. GNAS undergoes parent-specific methylation at four differentially methylated regions (DMR). As a result, three transcripts are derived only from the nonmethylated paternal GNAS allele, including XL␣s (the large splice variant of Gs␣), A/B (a presumably non-translated transcript), and AS (a large antisense transcript). In contrast, NESP55 (a neuroendocrine secretory protein) is derived only from the non-methylated maternal GNAS allele (Fig. 1). The promoter for Gs␣ does not undergo parent-specific methylation and the Gs␣ transcript is therefore derived in most tissues from both parental alleles. However, in some tissues such as proximal renal tubules, thyroid, pituitary, certain parts of the central nervous system (CNS), and brown fat (BAT), Gs␣ is transcribed predominantly from the maternal allele [4–6]; expression from the paternal allele is “silenced” through as-of-yet unknown mechanisms.

E-mail address: [email protected] http://dx.doi.org/10.1016/j.ando.2015.03.011 0003-4266/© 2015 Published by Elsevier Masson SAS.

Because of the complex nature of the GNAS locus, the parent-specific methylation of several promoters and reduced paternal Gs␣ expression in some tissues, inactivating mutations on either the maternal or the paternal allele result in very different diseases. Inactivating GNAS mutations affecting one of the 13 Gs␣ exons on the maternal allele are the cause of pseudohypoparathyroidism type IA (PHP1A), a disease characterized by PTH resistance in the proximal renal tubules and thus hypocalcemia and hyperphosphatemia. In addition, affected patients frequently reveal resistance towards other hormones, such as thyroid-stimulating hormone (TSH) and growth hormone-releasing hormone (GHRH), leading to hypothyroidism and impaired growth, respectively [1,3,7]. However, deficient signaling down-stream of several GPCRs cannot be explained by maternal Gs␣ mutations alone. It was therefore postulated that paternal Gs␣ expression is “silenced” in certain tissues, including proximal renal tubules, thyroid, and pituitary. Although the underlying mechanisms are largely unknown, they appear to involve in mice active transcription from the promoter for Gnas exon 1a [8,9], but it remains to be determined whether the same can be observed for GNAS exon A/B, the human equivalent of murine Gnas exon 1a. Predominantly maternal Gs␣ expression was also postulated for certain CNS regions, which contributes to the development of obesity, but is likely to affect also to other functions leading to impaired neurodevelopment and thus the variable degrees of intellectual and cognitive insufficiencies that are observed

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cen

tel

4.2-kb 24.6-kb 4.4-kb 3.0-kb

1 1a

23 456 7

Gs exons

4.0/4.7-kb 18.9-kb

8

STX16 Control 3.0/4.4/24.6/18.9-kb del. 4.0/4.2/4.7-kb del. patUPD20q

5 NESP 4 3 2 1

XL

A/B

P + M P + M +/P + M +/-

+ +

+ +

+ -

-

-

-

P P

-

-

-

+ +

PHP1B due to GNAS methylation changes

1

2 3 N1 4 5 6 7

13

PHP1A/PPHP due to mutant Gs

Fig. 1. GNAS locus: parent-specific methylation and locations of heterozygous mutations that cause different forms of pseudohypoparathyroidism (PHP). Maternally inherited mutations in the Gs␣-encoding exons 1-13 cause PHP1A, while paternally inherited mutations lead to the related disorders PPHP and POH. Autosomal dominant PHP1B is caused either by maternal deletions within STX16 or GNAS; these disease variants are associated either with loss of GNAS methylation restricted to exon A/B alone (light green horizontal bars) or with methylation changes at multiple GNAS exons (dark yellow horizontal bars). Paternal uniparental isodisomy for chromosome 20q (patUPD20q) is a rare cause of sporPHP1B, but most sporadic cases have not yet been defined at the molecular level. Boxes, exons; connecting lines, introns; P: paternal; M: maternal; methylated (+); non-methylated (–); transcriptional direction (black arrows, paternal; orange arrows, maternal; red arrows, biallelic). Locus GNAS : méthylation parent-spécifique et emplacements des mutations hétérozygotes qui sont responsables des différentes formes de pseudohypoparathyroïdie (PHP). Les mutations à transmission maternelle au niveau des exons codant Gs␣ 1-13 déterminent la PHP1A, alors que les mutations à transmission paternelle conduisent aux manifestations analogues des PPHP et POH. La PHP1B à transmission autosomique dominante est causée soit par des délétions maternelles dans STX16 ou GNAS ; ces variantes de la maladie sont soit associées à la perte de la méthylation de GNAS restreinte seulement à l’exon A/B l (barres horizontales vert clair) soit à des changements de méthylation de plusieurs exons de GNAS (barres horizontales jaune foncé). L’isodisomie uniparentale paternelle pour le chromosome 20q (patUPD20q) est une cause rare de sporPHP1B, mais la plupart des cas sporadiques n’ont pas encore été définis au niveau moléculaire. Boîtes, exons ; lignes de connexion, introns ; P : paternel ; M : maternel ; méthylés (+) ; non méthylés (–) ; direction transcriptionnelle (flèches noires, paternel ; flèches orange, maternel ; flèches rouges, bialléliques). Modified from [41].

in PHP1A patients [5]. In addition, these individuals develop characteristic skeletal abnormalities, particularly a shortening of metacarpals and -tarsals that are caused by a premature closure of growth plates as evidenced by an accelerated bone age. The skeletal and developmental defects observed in PHP1A are collectively referred to as Albright’s hereditary osteodystrophy (AHO). PHP1A patients are typically obese during early childhood, but not at birth, and during adult life overweight is less prominent [10,11]. The obesity phenotype is caused, at least in part, by a lack of maternal Gs␣ expression in the CNS, where GNAS mutations, in combination with silenced paternal Gs␣ expression, lead to little or no Gs␣ protein [5,12,13]. In addition, it is conceivable that Gs␣ deficiency in BAT contributes significantly to the accumulation of visceral fat. Mutations affecting the paternal GNAS exons are the cause of a very different phenotype, namely pseudopseudohypoparathyroidism (PPHP) [1–3]. Patients affected by this disorder are characterized by the presence of AHO features, including short stature, but they show

no intellectual impairment and no obesity [10]. Some of these patients show elevated PTH levels during infancy, but no evidence for hormonal resistance later in life (for review of these findings see [6]). Interestingly, patients who were later diagnosed with PPHP show severe intrauterine growth retardation and are thus small at birth [11,14,15]. Fetal development appears to be particularly impaired with paternal mutations affecting GNAS exons 2-13, which would affect not only expression of Gs␣ but also of XL␣s, raising the possibility that the extra-large Gs␣ variant is particularly important for normal intrauterine development [11]. This conclusion is supported by findings in mice lacking Gnas exons XL or E2 that are both small at birth; note that E2 exon is shared by Gs␣ and XL␣s 12,16. Furthermore, humans with maternal uniparental isodisomy involving chromosome 20q (matUPD20q) are small [17–19]. MatUPD20q patients are predicted to show biallelic methylation of GNAS exon XL and thus no XLs expression, just like mice with ablation of exons XL or E2. The lack of XL could thus be

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the cause of impaired intrauterine growth and reduced birth weights. Ever since the first description of PHP1B patients, the pathogenesis of this variant of pseudohypoparathyroidism was thought to be unrelated to that of PHP1A [1–3,20,21]. This assumption was largely based on the fact that most PHP1B patients develop only PTH-resistant hypocalcemia and hyperphosphatemia, but usually no evidence for resistance towards other hormones and no AHO features. However, through genetic linkage studies using several large multigenerational families, it eventually became apparent that PHP1B is also caused by maternal GNAS mutations, namely small deletions within or close to the GNAS locus [22–28]; the same deletions on the paternal allele do not appear to lead to any biochemical abnormality. Furthermore, it was shown that patients affected PHP1B can show resistance towards hormones other than PTH and that some develop AHO features, although most of these abnormalities are less pronounced than in PHP1A or PPHP patients [29–31]. The deletions identified in PHP1B patients are associated with methylation changes affecting either GNAS exon A/B alone (STX16 deletions [23,25,28] or a deletion comprising only GNAS exon NESP [27]) or all four differentially methylated GNAS regions (GNAS deletions comprising exon NESP and/or antisense exons 3 and 4 [24,26]). In association with the lack of methylation at the maternal GNAS exon A/B, little or no Gs␣ is made from the maternal allele; the underlying mechanisms are unknown, but may require active transcription from the exon A/B promoter [8,9]. In those tissues where Gs␣ expression from the nonmethylated, paternal GNAS allele is normally silenced, particularly in the proximal renal tubules, virtually no Gs␣ is thought to be made when an inactivating mutation affects maternal GNAS exons 1-13 (as in PHP1A patients) or when a loss of methylation occurs at GNAS exon A/B (as in PHP1B patients). Because of the Gs␣ deficiency resulting from these genetic or epigenetic abnormalities, PTHstimulated synthesis of 1,25(OH)2 vitamin D is impaired in the renal proximal tubules thus leading to reduced intestinal calcium absorption. In addition, there is insufficient PTH-mediated down-regulation of the two sodium dependent phosphate transporters, NPT2a and NPT2c, and consequently impaired urinary phosphate excretion. Taken together, these changes in the proximal renal tubules explain the PTH-resistant hypocalcemia and hyperphosphatemia that occurs in PHP1A and PHP1B. The tremendous importance of GNAS methylation for maintaining Gs␣ expression became particularly obvious in patients with paternal uniparental isodisomy affecting chromosome 20q (patUPD20q), who lack a genetic mutation in this region, yet show the paternal methylation pattern on both GNAS alleles [32–35]. GNAS methylation changes alone are thus sufficient to cause hormonal resistance. However, even though GNAS methylation abnormalities are present at birth, these epigenetic changes do not cause an elevation in PTH levels until the age of 2–3 years, with symptomatic hypocalcemia not developing until the second decade of life [6,25,36]. Furthermore, some PHP1B patients never develop severe PTH-resistance [22,36] and some seem to “out-grow” their resistance. The reason for this variability in disease severity is most likely related to the

fact that silencing of Gs␣ expression from the paternal allele varies not only over time, but also from tissue-to-tissue and from patient-to-patient. As indicated above, the nature of the mechanisms resulting in silencing of Gs␣ expression from the non-methylated paternal GNAS allele is only incompletely understood [8,9,16], but it is obviously of tremendous biological importance. Silencing is most effective in the proximal renal tubules where the presence of maternal GNAS mutations or deletions, as in PHP1A and PHP1B, respectively, cause PTH-resistant hypocalcemia and hyperphosphatemia, despite the fact that the paternal allele carries no genetic mutation. However, some PHP1B patients present with hypothyroidism [7,32,37–39], in some cases well before PTH-resistance becomes apparent [40]. This indicates that silencing of Gs␣ expression from both non-methylated parental alleles can also be encountered in the thyroid of PHP1B patients, as previously suggested [7,38]. Silencing of paternal Gs␣ expression may also contribute to the obesity observed in PHP1A patients, not only through the lack of Gs␣ signaling in the CNS, but possibly in part because of Gs␣-deficiency in BAT and the generation of excess visceral fat. Disclosure of interest The author declares that he has no conflicts of interest concerning this article. 2. Version franc¸aise Le locus GNAS situé en 20q13.3 donne lieu, par épissage alternatif, à plusieurs transcrits, incluant la sous-unité alpha de la protéine G stimulante (Gs␣) [1–3]. Cette protéine d’expression ubiquitaire médie les actions de nombreux récepteurs couplés à la protéine G (GPCR), et apparaît par conséquent d’une grande importance biologique. GNAS subit une méthylation parentspécifique dans quatre régions différemment méthylées (DMR). Ainsi, trois transcrits proviennent uniquement de l’allèle paternel non méthylé de GNAS, incluant XL␣s (le grand variant épissé de Gs␣), A/B (un transcrit vraisemblablement non translaté) et AS (un large transcript antisens). En revanche, NESP55 (une protéine neuroendocrine sécrétoire) dérive uniquement de l’allèle maternel non méthylé de GNAS (Fig. 1). Le promoteur de Gs␣ ne subit pas la méthylation parent-spécifique et le transcript Gs␣ est donc dérivé dans la plupart des tissus des deux allèles parentaux. Toutefois, dans certains tissus comme le tubule rénal proximal, la thyroïde, l’hypophyse, certaines parties du système nerveux central (SNC) et le tissu adipeux brun (TAB), Gs␣ est transcrit majoritairement à partir de l’allèle maternel [4–6] ; l’expression de l’allèle paternel est « mise en silence » par le biais de mécanismes encore inconnus. En raison de la nature complexe du locus GNAS, de la méthylation parent-spécifique de plusieurs promoteurs et de la réduction de l’expression de Gs␣ dans plusieurs tissus, les mutations inactivatrices, soit sur l’allèle maternel, soit l’allèle paternel sont responsables de maladies vraiment différentes. Les mutations inactivatrices de GNAS affectant l’un des treize exons de Gs␣ sur l’allèle maternel sont la

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cause de la pseudohypoparathyroïdie de type IA (PHP1A), une maladie caractérisée par une résistance à la PTH au niveau des tubules rénaux proximaux, et responsable de ce fait d’hypocalcémie et d’hyperphosphatémie. En outre, les patients atteints révèlent fréquemment une résistance envers d’autres hormones, telles l’hormone thyréotrope (TSH) et la somatolibérine (GHRH), ce qui est responsable respectivement d’hypothyroïdie et d’altération de la croissance [1–3,7]. Cependant, des déficits de la signalisation en aval de plusieurs RCPG ne peuvent s’expliquer seulement par des mutations maternelles de Gs␣. On a donc postulé que l’expression de Gs␣ paternel est « mise en sourdine » dans certains tissus, comprenant l’hypophyse, la thyroïde et le tubule rénal proximal. Bien que les mécanismes sous-jacents soient largement méconnus, ils semblent impliquer chez la souris, la transcription active à partir du promoteur de l’exon 1a de Gnas [8,9], mais il reste encore à déterminer si la même chose peut être observée pour l’exon A/B de GNAS, équivalent humain de l’exon 1a de Gnas de la souris. La prédominance maternelle de l’expression de Gs␣ a été également postulée pour certaines des régions du système nerveux central, contribuant au développement de l’obésité, mais susceptibles d’affecter également d’autres fonctions, conduisant à une déficience neurologique et donc à des degrés variables de déficience intellectuelle et cognitives, telles qu’elles sont observés chez les patients atteints de PHP1A [5]. En outre, ces individus développent des anomalies squelettiques caractéristiques, notamment un raccourcissement des métacarpes et des métatarses, causé par une maturation prématurée des cartilages de croissance comme en témoigne l’accélération de l’âge osseux. Les altérations squelettiques et du développement sont dans leur ensemble rapportées sous le nom de l’ostéodystrophie héréditaire d’Albright (AHO). Les patients atteints de PHP1A sont généralement obèses au cours de la petite enfance, mais non à la naissance, et à l’âge adulte le surpoids apparaît moins prononcé [10,11]. Le phénotype obésité est lié, au moins en partie, à un manque d’expression maternelle de Gs␣ dans le SNC, où les mutations GNAS, en combinaison avec la mise en sourdine de l’expression paternelle de Gs␣, conduisent à l’absence ou à une faible quantité de protéine Gs␣ [5,12,13]. En outre, on peut concevoir que le déficit en Gs␣ dans la graisse brune contribue de manière significative à l’accumulation de graisse viscérale. Les mutations affectant les exons paternels de GNAS sont la cause d’un phénotype très différent, dénommé la pseudopseudohypoparathyroïdie (PPHP) [1–3]. Les patients atteints de ce trouble se caractérisent par la présence des signes de l’AHO, y compris la petite taille, mais ils ne montrent aucune déficience intellectuelle et pas d’obésité [10]. Certains de ces patients révèlent des niveaux élevés de PTH durant la petite enfance, mais sans preuve de résistance hormonale plus tard dans la vie (pour la revue des informations, voir [6]). Fait intéressant, les patients qui plus tard se révèleront atteints de PPHP ont un retard de croissance intra-utérin sévère et sont donc petits à la naissance [11,14,15]. Le développement du fœtus semble être particulièrement altéré lorsque les mutations paternelles affectent les exons 2-13 de GNAS ; ceux-ci affecteraient non seulement l’expression de Gs␣, mais aussi de XL␣s, suggérant que le variant extralarge

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de Gs␣ est particulièrement important pour le développement intra-utérin normal [11]. Cette conclusion est étayée par les résultats chez les souris sans exons XL ou E2 de Gnas qui sont toutes deux petites à la naissance ; il faut noter que l’exon E2 est partagé par Gs␣ et XL␣s [12,16]. En outre, les êtres humains ayant une isodisomie maternelle uniparentale impliquant le chromosome 20q (matUPD20q) sont petits [17–19]. On pressent que les patients MatUPD20q devraient montrer une méthylation biallélique de l’exon XL de GNAS et ainsi aucune expression de XL␣s, à l’instar des souris ablatées pour les exons XL ou E2. L’absence de XL pourrait donc être la cause du retard de croissance intra-utérin et de la réduction du poids à la naissance. Depuis la première description des patients PHP1B, la pathogénie de cette variante de pseudohypoparathyroïdie était considérée comme sans rapport avec celle de la PHP1A [1–3,20,21]. Cette hypothèse était en grande partie fondée sur le fait que la plupart des patients PHP1B développent seulement une résistance à la PTH avec hypocalcémie et hyperphosphatémie, mais habituellement sans aucun signe de résistance envers les autres hormones et aucune des caractéristiques de l’AHO. Cependant, à partir des études de liaison génétique au sein de plusieurs grandes familles multigénérationnelles, il est devenu évident que la PHP1B est aussi causée par des mutations maternelles de GNAS, nommément de petites délétions au sein ou à proximité du locus GNAS [22–28] ; les mêmes délétions sur l’allèle paternel ne semblent entraîner aucune anomalie biologique. En outre, il a été démontré que les patients atteints de PHP1B peuvent montrer une résistance envers d’autres hormones que PTH, et que certains développent des traits de l’AHO, bien que ces anomalies soient moins prononcées que chez les patients atteints de PHP1A ou PPHP [29–31]. Les délétions identifiées chez des patients atteints de PHP1B sont associées à des modifications de la méthylation affectant soit seulement l’exon A/B de GNAS (délétions de STX16 [23,25,28] ou délétion comportant seulement l’exon NESP 27 de GNAS) ou toutes les quatre régions différemment méthylées de GNAS (délétions de GNAS comportant l’exon NESP et/ou les exons antisens 3 et 4 [24,26]). En liaison avec l’absence de méthylation de l’exon maternel A/B de GNAS, il y a peu ou pas de Gs␣ produit par l’allèle maternel ; les mécanismes sous-jacents sont inconnus, mais pourraient requérir une transcription active à partir du promoteur de l’exon A/B [8,9]. Dans les tissus où l’expression de Gs␣ à partir de l’allèle paternel non méthylé de GNAS est normalement mise en silence, particulièrement dans le tubule rénal proximal, en pratique on pense qu’aucune Gs␣ n’est produite lorsqu’une mutation inactivatrice affecte les exons 1-13 de GNAS (comme chez les patients atteints de PSPH1A) ou lorsqu’une perte de méthylation se produit au niveau de l’exon A/B de GNAS (comme dans la PHP1B). En raison du déficit de Gs␣ résultant de ces anomalies génétiques ou épigénétiques, la synthèse de 1,25-(OH)2 vitamine D que stimule la PTH est altérée au niveau du tubule proximal, ce qui conduit à la réduction de l’absorption intestinale du calcium. En outre, se produit une insuffisance de la down-regulation PTHmédiée des deux transporteurs de phosphate sodium-dépendant, NPT2a et NPT2c, avec pour conséquence une altération de

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l’excrétion urinaire de phosphate. Tout cela, explique pourquoi ces modifications au niveau des tubules rénaux proximaux concourent à l’hypocalcémie et à l’hyperphosphatémie résistantes à la PTH, survenant dans les PHP1A et PHP1B. L’importance énorme de la méthylation de GNAS pour le maintien de l’expression de Gs␣ est devenue particulièrement évidente chez les patients avec isodisomie uniparentale affectant le chromosome 20q (patUPD20q), qui n’ont pas de mutation génétique dans cette région, et pourtant montrent encore le modèle de méthylation paternel sur les deux allèles de GNAS [32–35]. Les seules modifications de méthylation de GNAS suffisent donc pour déterminer la résistance hormonale. Cependant, même si des anomalies de méthylation de GNAS sont présentes à la naissance, ces modifications épigénétiques ne provoquent pas d’élévation des taux de PTH avant l’âge de 2 ou 3 ans, et aucune hypocalcémie symptomatique ne se développe jusqu’à la deuxième décennie de vie [6,25,36]. En outre, certains patients PHP1B ne développeront jamais de résistance sévère à la PTH [22,36], et certains semblent out-grow leur résistance. La raison de cette variabilité dans la gravité de la maladie est probablement liée au fait que la mise en silence de l’expression de Gs␣ de l’allèle paternel varie non seulement avec le temps, mais aussi de tissu à tissu et de patient à patient. Comme il a été indiqué plus haut, la nature des mécanismes aboutissant à la mise en silence de l’expression de Gs␣ de l’allèle non méthylé paternel de GNAS n’est qu’incomplètement comprise [8,9,16], mais apparaît à l’évidence d’une énorme importance biologique. La mise en silence est plus efficace dans le tubule rénal proximal où la présence des mutations ou délétions maternelles de GNAS, comme respectivement dans les PHP1A et PHP1B, déterminent hypocalcémie et hyperphosphatémie résistant à la PTH, malgré le fait que l’allèle paternel ne porte aucune mutation génétique. Cependant, certains patients atteints de PHP1B présentent une hypothyroïdie [7,32,37–39] dans certains cas bien avant que la résistance à la PTH ne devienne apparente [40]. Ceci indique que la mise en silence de l’expression de Gs␣ des deux allèles parentaux non méthylés de GNAS peut être également rencontrée dans la thyroïde des patients avec PHP1B, comme déjà suggéré [7,38]. La mise en silence de l’expression paternelle de Gs␣ peut également contribuer à l’obésité observée chez les patients atteints de PHP1A, non seulement en raison du manque d’expression de Gs␣ dans le SNC, mais possiblement aussi en partie à cause de la carence en Gs␣ dans la graisse brune et de la constitution d’un excès de graisse viscérale.

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Déclaration d’intérêts L’auteur déclare ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.

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