Génotypage d'Aspergillus fumigatus : principes des méthodes et applications

G I NOTYPAG E D'ASPERGILL US F U M I G A TUS : PRINCIPES DES MI THODES ET APPLICATIONS

Emmanuelle Bart-Delabesse a, Stephane Bretagne a,*

Rdsume

Summary

Le genotypage des isolats d'Aspergillus fumigatus a ete entrepris dans le but d'identifier d'eventuels lieux de contamination, identification qui permettrait de prevenir la survenue d'aspergillose invasive chez les patients immunodeprimes et de determiner si un isolat part/culler pouvait etre source d'epidemie. Trois techniques principales ont ainsi ete developpees par differentes equipes : la technique RFLP (restriction fragment length polymorphism) avec hybridation avec une sonde specifique, et deux techniques basees sur la PCR, & savoir la technique dire RAPD (random amplified polymorphic DNAs) et I'analyse du polymorphisme de marqueurs microsatellites. La comparaison de ces trois techniques sur 67 isolats a montre que la technique RFLP et le polymorphisme des microsatellites donnent des resuttats congruents, au contraire de la technique RAPD. La technique RFLP est actuellement la plus discriminante mais de real/sat/on Iongue. A l'inverse, I'analyse du polymorphisme des marqueurs microsatellites est rap/de et peut constituer un premier choix. En revanche, la technique RAPD ne semble pas adaptee & I'analyse du polymorphisme des isolats d'A. fumigatus. Les etudes de genotypage ont montr6 I'enorme biodiversite d~. fumigatus avec la possibilite de persistance d'un genotype donne dans des endroits divers sur de Iongues per/odes. Ainsi, s'il est possible de fortement suspecter te caractere nosocomial d'une aspergillose Iorsque le genotype/sole du patient est identique & celui retrouve dans son environnement hospitalier, il est impossible de dire ou et quand le patient a ere infecte. L'autre point marquant est I'impossibilite de differencier les isolats responsables d'infections de ceux retrouves dans I'environnement, montrant ainsi que tout isolat est potentiellement pathogene. Gebotypage

- RFLP

- RAPD

- marqueurs

microsatellites.

The genotyping of Aspergillus fumigatus isolates has been developed for identifying contaminating areas in order to prevent invasive aspergiflosis and to identify a specific isolate possibly responsible for a given epidemic. Three techniques have been used by different teams: RFLP (restriction fragment length polymorphism) with hybridization with an A. fumigatus specific probe; and two techniques based on PCR, RAPD (random amplified polymorphic DNAs) and microsatellite markers. These three techniques were compared for their ability to genotype 67 A. fumigatus isolates. The results were congruent between RFLP and microsateflite markers. In contrast, RAPD gave divergent results and does not seem adapted for typing A. fumigatus isolates. Currently, RFLP is the most discriminant technique but is time-consuming. Microsatellites markers are rapidly obtained and should be regarded as a first-line technique. The genotyping studies have shown the huge biodiversity of A. fumigatus populations. A given genotype can persist in different places for a long period of time. Thus, it is possible to ascertain that the isolate from a patient is identical to a given isolate from the environment but, unfortunately, it is impossible to say when and where the patient has been infected. The second major point is the impossibility to differentiate clinical isolates from environmental isolates. This results shows that every isolate is potentially pathogenic. Genotyping

- RFLP

- RAPD

- microsatellite

markers,

1. I n t r o d u c t i o n A

a Laboratoirede parasitologie-rnyco[ogie H6pital Henri Mondor 51, av. de Lattre-de-Tassigny 94010 Creteil cedex *Correspondanoe. article regu le 29 novembre 1999, accepte le 8 fevrier 2000.

© Elsevier,Paris. RevueFranqaisedes Laboratoires,fevrier/mars2000, N° 320

spergillus fumigatus est le principal agent responsable de I'aspergillose invasive [1 2]. Ce champignon se propage par I'intermed/a/re de spores, ou con/dies, de 2 & 3 pm de diametre, issues en grand nombre de la tete aspergillaire. Oes con/dies sont vehiculees par I'air, et donc facilement remises en suspension Iors de travaux. Leur presence dans I'atmosphere est pratiquement constante tout au long de I'annee meme si des variations sont possibles en fonction des conditions m6teorologiques, le biotope de ce champignon etant la mat/ere organique en decomposition. Ainsi, tout un chacun inhale en permanence des con/dies qui sont rejetees par le tapis muco-ciliaire de I'arbre respiratoire. Cependant, I'aspergillose invasive ne se developpe que si le systeme macrophagique alveolaire et les polynucleaires neutrophiles sont defaillants. Les patients particulierement & risque sont donc ceux ayant beneficie 71

Dossier scientifique Epidemiologie mol~culaire

kb

a b c d

e

f g

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i

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kl

mn

des cas groupes d'aspergillose survenant Iors de travaux. Le but etait de developper des mesures preventives pour les patients & risque. Les methodes phenetypiques dependent des milieux de culture et sont soit peu discriminantes, soit de realisation delicate et peu reproductibles [12, 18]. A I'inverse, les methodes genotypiques presentent a priori de meilleures caracteristiques pour ce genre d'etude, & savoir un polymorphisme attendu eleve, une certaine facilite d'execution et une bonne reproductibilit¢. Trois methodes ont ere particulierement developpees pour le typage d'A. fumigatus : I'analyse par RFLP (restriction fragment length polymorphism) avec hybridation avec une sonde specifique, la technique dire RAPD (random amplified polymorphic DNAs), et I'analyse du polymorphisme de marqueurs microsatellites.

2. Technique RFLP Cette m~thode est basee sur la presence ou non de sites d'enzymes de restriction. Apres extraction de I'ADN, celui-ci est digere par une enzyme et les fragments obtenus separes les uns des autres par migration electrophoretique en gel d'agarose. La simple coloration de ce gel par du bromure d'ethidium permet d'objectiver certaines differences sur la presence ou I'absence de bandes, correspondant & des fragments d'ADN. Cette differenciation des fragments est cependant insuffisante [12]. C'est pourquoi, apres transfert sur une membrane, le polymorphisme est mieux appr~cie apres hybridation avec une sonde specifique. Cette sonde specifique etant radio-marquee, son hybridation avec certains fragments peut etre visualisee. Est ainsi obtenue une serie de bandes de Iongueur variable, dont I'ensemble definit un profil. Le profil d'un isolat peut alors #tre compare & celui d'un autre isolat.

Pistes a, g e t n : marqueurs de taille. Pistes c, e, f, f, k, [et m : isofats de profils /dentiques. Pistes d, h et j : isolats de profils identiques diff#rents des precedents. Piste b: isotat unique. La presence de bandes constantes permet une normalisation des proills et leur comparaison ~ i'aide d'un fogiciet informatique (photographie aimablement fournie par J.P. Latg& Institut Pasteur, Paris,).

d'une greffe de moelle osseuse ou d'une transplantation d'organe. Le risque d'inhaler des conidies d'A. fumigatus pour ces patients immunod~primes est constant tant qu'ils ne sont pas dans u n e chambre & flux laminaire. Le pronostic de cette infection reste actuellement particulierement sombre, en particulier chez les greffes de moelle avec une mortalit~ proche de 90 O/o,malgre le developpement de nouvelles molecules antifongiques [10]. Par analogie avec 1'etude d'autres agents infectieux, le typage des isolats d'A. fumigatus a ere envisage pour connaftre o~ et quand un patient a ete contamine, ou pour savoir si le meme isolat etait responsable 72

Bien qu'il existe plusieurs sondes possibles [1], une seule a jusqu'& maintenant ete utilisee avec succes & grande echelle pour I'etude du polymorphisme des isolats d'A. fumigatus. II s'agit de la sonde lambda 3.9 constituee d'une sequence repetee AFUT1, correspondant a un r6trotransposon defectif de 6,9 kifobases flanque de deux LTR (Long Terminal Repeats), insere dans un phage lambda [16]. Sa caracterisation a necessite un travail initial de criblage d'une banque aliA. fumigatus [11 ]. Awes digestion de I'ADN de I'isolat & tester par I'enzyme EcoR1, la migration est effectuee dans des gels d'agarose de 30 cm, ce qui permet une bonne separation des fragments d'ADN. Apres transfertet hybridation avec la sonde lambda 3.9, les bandes revelees sont lues avec un scanner. Apr¢s traitement informatique pour aligner les gels entre eux sur la presence de bandes constantes, les bandes variables permettent de comparer les profils entre eux [9]. Ainsi, deux isolats sont consider~s differents quand il existe au moins une bande de difference (figure 1). Les avantages de la technique RFLP sont son haut degre de polymorphisme, sa grande reproductibilite et la possibilite d'effectuer une lecture informatisee. Ses principaux inconvenients sont la necessite d'obtenir une grande quantit6 d'ADN, d'ou la culture des iselats avant extraction de I'ADN, et I'impossibilite de differencier un melange accidentel d'isolats. Sa realisation complete necessite donc plusieurs jours. I'emploi de la radioactivite presente egalement un desavantage. Un emploi en routine devrait lui faire preferer des marquages non-radioactifs.

3. Technique RAPD La technique RAPD utilise la PCR (polymerase chain reaction) et presente I'avantage sur la technique RFLP de ne pas avoir besoin d'une grande quantite d'ADN. Son principe repose sur des hybridations plus ou moins specifiques de courtes amerces sur de I'ADN sans qu'aucune connaissance prealable du genome & amplifier ne soit n~cessaire. Pour favoriser ces hybridations non specifiques, les amorces sont Revue Fran?aise des Laboratoires, fevrier/mars 2000, N ° 320

courtes, en general inferieures & 10 paires de base, et les temperatures d'hybridation pendant les cycles d'amplification, basses, inferieures & 45°C. Les produits d'amplification sent ensuite separes en gel d'agarose et I'ADN colore par le bromure d'ethidium. La presence ou I'absence de bandes permet de caracteriser un isolat par rapport & un autre (figure 2). Uintensite variables des bandes n'est en general pas integree dans I'analyse. De nombreuses ~quipes ont utilis6 cette technique et ont detecte un polymorphisme important des isolats [2, 7, 13, 17, 19, 20]. Cependant, la comparaison avec les autres methodes de typage jette quelques ombres sur I'interpretation de ce polymorphisme (voir plus loin). L'avantage de cette technique est sa simplicite d'ex~cution. En effet, aucune connaissance pr~alable des sequences & amplifier n'est necessaire et le thermocycleur n'est pas tres coQteux. Cette technique necessite neanmoins de s'assurer que I'isolat est bien pur et que I'ADN est extrait d'une fagon homogene pour eviter que sa qualite n'interf~re sur la reproductibilite des amplifications. Le probleme majeur de cette technique est en effet sa reproductibilite. Les amplifications etant realisees dans des conditions peu stringentes, il est difficile d'obtenir des profils reproductibles & partir d'un meme isolat. En particulier, I'intensite des bandes a. analyser est particulierement complexe car elle depend de I'efficacite des premiers cycles d'amplification qui ne peut etre garantie dans ces conditions. De plus, la Iongueur des gels est souvent courte, de 10-15 cm, ne permettant pas une individualisation nette des bandes & analyser. Certains laboratoires, au prix de precautions draconiennes, arrivent & obtenir des resultats reproductibles mais la reproductibilite interlaboratoire est pratiquement impossible car I'extraction de I'ADN, le type de thermocycleur, I'enzyme Taq polymerase, la qualite de la coloration au bromure d'ethidium, sent autant de parametres qui entraF neront des modifications des r6sultats. Pour eviter ces problemes de reproductibilite, certains auteurs ont utilise la technique dite de SSDP (sequence-specific DNA primers) [14, 19]. Des fragments d'ADN amplifie par la technique RAPD sent recuperes et sequences. Des amerces specifiques sent alors choisies et les amplifications realisees dans des conditions de haute stringence, augmentant ainsi la specificite des amplifications. Cependant, pour chaque isolat et pour une amplification donnee, on obtient un systeme binaire a.type de presence ou absence de bande. Cette strategie oblige & pratiquer un nombre considerable de reactions avec des couples d'amorces differentes, allant & I'encontre du benefice attendu par I'emploi de la PCR.

kb

1 2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 1 2 1 3 1 4 1 5

Les produ/ts de PCR ont ~t# obtenus avec I'amorce 5'-GCTGGTGG-3' apr6s 40 cycles d'ampfification (30 sec a 90°C; 2 min. 4 28°C ; 2 rain a 72°C) et analys~s apres migralion pendant 1 heure ~ 9 0 V en gel d'agarose et coloration au bromure d'~thidium. P[stes 1 et 15 : marqueurs de taille. L'ana/yse des profils fait essentiellement appel I'c~i! de I'examinateur (photographie aimablement fournie par A. Carlotti, Facuft~ de Pharmacie, Lyon).

4. Analyse des microsatellites Les microsatellites sent des sequences d'ADN constituees de r6petition de motifs di-tri-tetra ou pentanucleotidiques. Le polymorphisme du hombre de repetition de ces motifs peut 6tre facilement explore par PCR et cette technique est largement utilisee en genetique humaine [22]. Deux amerces sent choisies en dehors du microsatellite a. tester, dans les regions flanquantes constantes, quel que soft I'isolat. Apres amplification, la Iongueur du fragment peut 6tre analysee apres migration en gel et les isolats peuvent etre ainsi compares les uns aux autres. Chaque locus amplifie fournit plusieurs alleles, chacun avec une Iongueur specifique (figure 3). Pour A. fumigatus, quatre microsatellites ont ete caracterises, (CA)9(GA)25, (CA)2O(CA)23, (CA) 8 et (0A)21 [5]. Quatre couples d'amorces ont ere choisis pour chaque locus. A. fumigatus etant hapldlde, chaque couple d'amorces fournit un allele pour un isolat donne. Ainsi, chaque isolat est caracterise par une serie de quatre alleles (figure 4). En analysant 102 isolats independants, les quatre loci ont fourni respectivement 12, 11, 10 et 23 alleles differents. En combinant ces quatre marqueurs, la technique a un pouvoir discriminant de 0,994 sur ces 102 Revue Frangaise des Laboratoires, fevrier/mars 2000, N ° 320

% fes produ/ts sent analyses dana un gel de sequence. Chaque puits contient ~ifle (couleur rouge) qui permet de calculer /a tailfe des fragments ampfifi~s. s alleles attendus est voisine,/'emploi de deux fluorochromes ditf#rents permarqueurs dans le m#me puits (ex : puits 5 avec un afl~le en bleu pour un tellite at un al/61e en.laune pour un autre rnarqueur microsatelh'te ). Quand /es our deux marqueurs m/erosatelfites dffferents ne se recouvrent pas, le m~me ! ~tre utifis# (ex : pu/ts 4). Cette technique pr~sente donc f'avantage d'une 'analyse du polymorph/sme de taifle des produits ampfifi~s [5].

73

Dossier scientifique ~-pid~miologie mol~culaire

necessaire d'inclure dans chaque serie d'amplification des souches d'A. fumigatus dont les alleles sont connus et dont la Iongueur a ete verifiee par sequengage.

A

Locus i

I

C

B I

I

I

1~8pb

116pb

I

I

D I

167pb

i

i

5. C o m p a r a i s o n des trois m e t h o d e s I

94 pb

isel~t A~60

17~]~b

108 pb

llSpb

Isolat A422 ._Jl.

.

La fluorescence produite par los produits amplifies est ana/ysee et la taifle automatiquement determince par rapport au marqueur de taifle. Le nornbre fait r#f~rence ~ la ta/fle du produit amplill# qui definit ainsi un al/#fe. Chaque isolat est ensuite caract~ris# par un jeu de quatre afl~/es. Soul le dernier pic de fluorescence, fe plus ~leve, est incfus dans I'analyse.

isolats independants. Ces microsatellites sont stables en fonction du temps, une meme souche conservant les m¢mes marqueurs awes plus de 15 ans de repiquages successifs. De plus, le sequengage des produits amplifies a montre que les differences de Iongueur des alleles sont bien dues & des variations du nombre de repetition des microsatellites et non b, des mutations dans les regions flanquant ces microsatellites. I 'avantage de cette technique est sa rapidite, due a. t'emploi de la PCR. Par ailleurs, comme les amplifications sont courtes, inferieures & 200300 pb, et realisees dans des conditions stringentes, il n'est pas necessaire de partir d'ADN purifie. Un simple choc thermique de conidies obtenues & partir d'une colonie fournit assez d'ADN pour obtenir une amplification. De plus, la region & amplifier est connue et un seul allele est attendu pour un locus donne. La presence de plusieurs alleles permet de detecter les melanges eventuels d'isolats, ce que ne peuvent pas faire les autres techniques. Si I'analyse des produits amplifies est realisee par un sequenceur automatique, le marquage d'amorces avec plusieurs fluorochromes differents permet d'effectuer plusieurs PCR simultanement dans le m¢me tube, ce qui augmente la capacite de traitement des echantillons (figure 3). L'utilisation d'un sequenceur automatique permet egalement une lecture automatique et objective de la taille des produits amplifies gr&ce & I'emploi systematique d'un marqueur de taille dispose dans chaque puits Iors de la migration sur gel (figure 3). Un inconvenient de cette technique est la necessite de partir d'une certaine connaissance du genome & etudier pour dessiner les amorces dans les regions adjacentes aux microsatellites. II est parfois facile d'obtenir ces sequences & partir de banques de donnees pour des microorganismes tres etudies comme Candida albicans [6]. Pour A. fumigatus, il a ere necessaire dans un premier temps de realiser puis de cribler une banque genomique d'ADN d'A. fumigatus [5]. Le second inconvenient est la necessite d'analyser les fragments obtenus sur des gels & haute resolution, type gel de sequence, pour pouvoir distinguer entre deux alleles differents seulement de deux paires de bases. Cela est au mieux realise avec un sequenceur automatique qui reste actuellement co~teux. II est egalement important de connaftre la survenue possible d'artefacts de PCR. En raison du nombre parfois eleve de repetitions pour un microsatellite, la polymerase peut ,, glisser,, et donner des pics artefactuels plus courts que ceux attendus. II est donc 74

Les trois methodes decrites ci-dessus presentent chacune des inconvenients et des avantages. II etait donc important de savoir si les resultats des trois techniques etaient concordants et d'etablir eventuellement une strategie de typage en fonction des possibilites techniques. Ce travail a ere effectue en typant 67 isolats, 27 isolees de patients et 40 de £environnement, par les trois techniques. Le typage a ete effectue independamment par chaque laboratoire avec la technique qui lui etait familiere. La technique RFLP avec hybridation par la sonde lambda 3.9 est celle decrite ci-dessus [9], de meme pour la technique microsatellite [5]. Pour la technique RAPD, deux couples d'amorces ont ere utilisees : ERIC-I/ERIC-2 et RAPD1 281/RAPD-1 283 [13]. Les profils issus de deux amplifications independantes ont ete lues par deux personnes independantes. Une seule bande de difference permettait de considerer les isolats comme differents. Uintensite des bandes n'a pas ere prise en compte pour typer les isolats. Chaque laboratoire a ainsi defini ses propres codes, et ce sont ces codes qui ont ere compares entre eux. Le resultat a ere une tres bonne concordance de la methode RFLP avec celle des microsatellites (coefficient de concordance -- 0,91 ). Comme la technique RFLP donnait un plus fort pourcentage de proills uniques que celle des microsatellites, il est raisonnable de proposer une premi4~re approche avec les microsatellites, de realisation plus rapide, et, en cas d'identite, de la verifier par RFLP avec hybridation avec la sonde lambda 3.9. II est possible qu'& terme, de nouveaux microsatellites polymorphes soient identifies clans le genome d'A. fumigatus, restreignant le recours & la technique RFLR A I'inverse, la technique RAPD a montre une tres mauvaise congruence aussi bien avec la technique RFLP qu'avec les marqueurs microsatellites. Certes, cette technique a permis d'identifier comme unique certains isolats et d'en rassembler d'autres, mais il est surprenant qu'aucun recoupement avec les autres techniques n'ait ete possible. Les problemes techniques de reproductibilite et de lecture ont ete detailles plus haut. II est possible egalement que la taille du genome d'A. fumigatus ne se prete pas & I'etude par RAPD alors que des genomes plus simples de bacteries s'y pr6teraient mieux. La nature qui soutend le polymorphisme observe par RAPD est en effet completement inconnue et, devant la multiplicite des evenements possibles, son utilisation en phylogenie doit rester prudente [3].

6. P o l y m o r p h i s m e s des isolats d'A. fumigatus I 'etude la plus complete b. ce jour a et¢ realisee par la technique RFLP avec hybridation par la sonde lambda 3.9 [8, 9]. Plus de 2 000 isolats provenant de differents h6pitaux, collectes sur plus de deux ans, et d'isolats provenant d'autres continents ont ete testes [8]. Le resultat est une extreme diversite genetique des isolats avec 850/o des isolats d'un hepital detectes une seule fois sur deux ans. Les 15 % restants peuvent ~tre isoles & plusieurs occasions mais & plusieurs mois d'intervalle, ou au meme moment mais en des endroits differents. Aucun genotype particulier n'a ete systematiquement associe & un lieu precis. De plus, I'accroissement de I'echantillonnage n'a pas sature le hombre de profils detectes. Les isolats testes ne representent donc qu'une partie seulement de la population d'A. fumigatus et la diversite genetique est probablement encore plus importante que ne le Revue Frangaise des Laboratoires, fevrier/mars 2000, N ° 3 2 0

montrent ces etudes. En utilisant les microsatellites comme marqueurs, les r@sultats ont et@ identiques sur une plus petite serie [4]. Le deuxieme point marquant de ces etudes est qu'il n'existe pas de profil genetique propre aux isolats issus de patients [5, 8]. En effet, il n'a pas ete possible de grouper les genotypes isoles de patients pour les opposer & ceux de I'environnement. De m6me, Iors d'epidemie ou de survenue de cas groupes d'aspergiIIose, les isolats avaient des genotypes diff6rents, excluant la possibilite d'une epid6mie & partir d'un genotype particulier [1 2]. Tout isolat est donc potentiellement pathogene. S'il est possible, en raison du pouvoir discriminant 61ev6 des techniques utilisees, de dire qu'un patient a bien ete contamine avec I'isolat retrouve dans rh6pital, suggerant fortement une contamination nosocomiale, il est impossible de dire ou et quand. La consequence est qu'il faut maintenir les mesures pour prevenir la remise en suspension des conidies et donner un air le plus pur possible a. tout patient risque. Un autre point interessant est la constatation qu'au cours d'une aspergillose invasive, il est possible d'isoler plusieurs genotypes differents chez un m~me patient. Un patient peut donc s'infecter avec plusieurs isolats soit simultanement, soit sequentiellement. Cependant, le plus souvent un seul genotype est retrouve Iors d'une aspergillose invasive. A I'inverse, les patients atteints de mucoviscidose, dont les bronches

sont souvent colonisees par A. fumigatus, presentent souvent plusieurs genotypes, montrant bien que ces patients se surinfectent continuellement avec de nouveaux isolats [15, 21]. Cependant, un genotype donne peut etre retrouve consecutivement Iors des examens des expectorations, montrant qu'un genotype peut s'installer durablement dans les bronches d'un patient atteint de mucoviscidose [15, 21].

7. C o n c l u s i o n

p

our le genotypage d'A. fumigatus, deux techniques sont actuellement disponibles : la technique RFLP avec hybridation avec la sonde specifique lambda 3.9, et I'analyse du polymorphisme de marqueurs microsatellites. La deuxieme technique est de realisation plus aisee sous reserve qu'un sequenceur automatique soit disponible pour I'analyse informatique des resultats. Actuellement, la technique RFLP reste plus discriminante mais est tres exigeante en temps. II ne semble pas que la technique RAPD puisse 6tre recommandee pour I'analyse d'A. fumigatus. Le principal resultat des premiers travaux de genotyo page est la grande biodiversite d'A. fumigatus avec la possibilite de persistance d'un genotype donne dans des endroits tres divers et I'absence de gdnotypes particuliers associes & une certaine virulence, tous les isolats pouvant 6tre pathog~nes.

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